專利名稱：：腫瘤的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總體上涉及生物技術(shù)，更具體地涉及利用肽例如3聚體、4聚體、5聚體、6聚體、7聚體影響腫瘤生長(zhǎng)的方法以及用肽和含所述肽的藥物組合物治療對(duì)象的方法。
背景技術(shù)：
：癌癥是人類死亡的第2大病因，僅次于冠狀動(dòng)脈疾病。全世界每年有數(shù)百萬人死于癌癥。美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)報(bào)道，單在美國(guó)每年就有超過50萬人死于癌癥，每年有超過120萬例的新診斷病例。一些癌癥在全世界都是主要的致死性癌癥。具體地，肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、和卵巢癌代表了主要的癌癥死亡原因。這些癌癥和所有其他的癌癥事實(shí)上都具有共同的致死性特征。除了非常少的例外情況，癌癥造成的轉(zhuǎn)移性病變都是致死性的。此外，甚至對(duì)于那些最初從他們的原發(fā)癌癥中存活下來的癌癥對(duì)象，普遍的經(jīng)驗(yàn)已經(jīng)顯示出他們的生活受到了極大的改變。許多癌癥對(duì)象都有著因?yàn)閾?dān)心復(fù)發(fā)或治療失敗的可能性而帶來強(qiáng)烈的焦慮。許多癌癥對(duì)象在治療期間或之后也都出現(xiàn)體力虛弱。此外，許多癌癥對(duì)象都會(huì)出現(xiàn)癌癥復(fù)發(fā)。由于現(xiàn)有癌癥治療的復(fù)發(fā)率和副作用，提高癌癥治療在社會(huì)上有著極大的需求。優(yōu)選地，這些治療是小分子，它們是容易被人體吸收的、廉價(jià)的、和容易生產(chǎn)的、有效的、和不具有現(xiàn)有癌癥治療相關(guān)的多種副作用的小分子。
發(fā)明內(nèi)容雖然通常都認(rèn)為蛋白質(zhì)的最小降解產(chǎn)物本身沒有特異的生物學(xué)功能，但是現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)機(jī)體可以利用正常的蛋白質(zhì)裂解性降解過程生成重要的化合物。具體地，hCG的某些短的降解產(chǎn)物(即可以被容易合成并用于藥物組合物中的短肽、衍生物、或功能類似物)可以用于限制腫瘤的進(jìn)展。本發(fā)明涉及了解和/或預(yù)測(cè)機(jī)體應(yīng)答于小分子的內(nèi)在途徑，并基于PCT國(guó)際申請(qǐng)W099/59617、WO01/72831、和WO03/29292所報(bào)道的發(fā)現(xiàn)，在此通過引用將這些文件的全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。這些申請(qǐng)描述了孕婦體內(nèi)小的基因調(diào)節(jié)肽，這些肽來源于胎盤促性腺激素如hCG的蛋白裂解性降解。這些降解產(chǎn)物的長(zhǎng)度常常只有約3到6個(gè)氨基酸，并且表現(xiàn)出具有通過調(diào)節(jié)編碼炎癥介質(zhì)如細(xì)胞因子的基因的表達(dá)所實(shí)現(xiàn)的非凡的免疫活性。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)hCG的降解作用提供了一系列有助于保持孕婦的免疫穩(wěn)態(tài)的肽。這些肽平衡免疫系統(tǒng)，確保母親保持免疫健康，同時(shí)她的胎兒在妊娠期間不會(huì)過早地受到排斥，直至安全地懷孕到出生時(shí)刻。本領(lǐng)域也已知具有人絨毛膜促性腺激素(hCG)的抗原結(jié)合活性的其他肽。見例如Herron的美國(guó)專利5,380,668(1995年l月10日)，在此通過引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。其中所述的寡肽一般用于診斷方法。其他專利和專利申請(qǐng)也涉及調(diào)控生物學(xué)系統(tǒng)的短肽的用途。例如，Gallo等的專利和申請(qǐng)(例如美國(guó)專利5,677,275(對(duì)應(yīng)于WO96/04008Al)、美國(guó)專利5,877,148(也對(duì)應(yīng)于WO96/04008Al)、WO97/49721Al、美國(guó)專利6,319,504(對(duì)應(yīng)于WO97/49373)、美國(guó)專利申請(qǐng)2003/0049273Al(也對(duì)應(yīng)于WO97/49373)、美國(guó)專利5,968,513(對(duì)應(yīng)于WO97/49418)、美國(guó)專利5,997,871(對(duì)應(yīng)于WO97/49432)、美國(guó)專利6,620,416、美國(guó)專利6,596,688、WO01/11048A2、WO01/10907A2、和美國(guó)專利6,583,109)都闡述了各種寡肽以及它們?cè)诶?抑制HIV感染"、"治療或預(yù)防HIV感染"、"治療或預(yù)防癌癥"、"治療或預(yù)防病理性血管生成相關(guān)性病變"、"治療或預(yù)防造血缺陷"、"體外基因治療"、"體外擴(kuò)增血細(xì)胞"、禾Q/或"給對(duì)象提供血細(xì)胞"等中的用途。在示例的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種方法，其用于鑒定一種或多種肽；和/或確定一種或多種肽的活性，包括例如篩選肽，以便確定出肽的活性；分析結(jié)果；和/或鑒定出一種或多種具有抗腫瘤活性的肽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以生成抗腫瘤肽的衍生物或功能類似物。本發(fā)明提供了用于通過給對(duì)象施用包括藥用有效量的至少一種抗腫瘤肽或其衍生物或功能類似物以及可藥用稀釋劑的藥物組合物來減慢腫瘤生長(zhǎng)的方法。特別有用的可藥用稀釋劑是無菌水或等張鹽水例如0.9%生理鹽水或磷酸緩沖鹽(PBS)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通過給對(duì)象黏膜施用，優(yōu)選地口服施用包括藥用有效量的兩種或多種抗腫瘤肽或其衍生物或功能類似物以及可藥用稀釋劑的藥物組合物治療患有或被認(rèn)為患有癌癥的對(duì)象的治療方法。本發(fā)明因此提供了將抗腫瘤肽藥物組合物施用于對(duì)象以縮小腫瘤大小和/或抑制腫瘤進(jìn)展的用途。這種抗腫瘤肽的有用實(shí)例可以選自寡月太LQG、LAG、LQGV、AQGV、LAGV、VLPALP和其功能類似物或衍生物?？梢栽趤碜栽袐D的尿液部分或hCG的商品化制劑(至少那些含有大量hCG降解產(chǎn)物的商品化制劑)中找到功能類似物。本發(fā)明的藥物組合物所含的抗腫瘤肽的優(yōu)選大小是不超過15個(gè)氨基酸，優(yōu)選地不超過7個(gè)氨基酸，而長(zhǎng)度為3、4、5、或6個(gè)氨基酸的更小的分子是特別有效的。本發(fā)明也提供了小于30個(gè)氨基酸的肽在生產(chǎn)治療患有或被認(rèn)為患有癌癥的對(duì)象的藥物組合物中的用途。所述肽優(yōu)選地小于15個(gè)氨基酸。當(dāng)重復(fù)地使用肽時(shí)，例如在此所述被用于癌癥治療時(shí)，從安全性的角度看，所述肽優(yōu)選地小于7個(gè)氨基酸，這些肽通常不會(huì)與MHC受體結(jié)合，因此降低了通過抗所施用的肽的免疫應(yīng)答觸發(fā)自身免疫發(fā)生的危險(xiǎn)性?；加邪┌Y的對(duì)象將會(huì)受益于一些在此所鑒定到的小肽的抗炎癥性能，但是令人驚訝的是，大多數(shù)受益都來自于小肽的抗細(xì)胞周期活性，特別是劑量超過lmg/kg、優(yōu)選的超過5mg/kg、更優(yōu)選的超過10mg/kg體重的3聚體和4聚體肽?？紤]到小肽(即那些3到4個(gè)氨基酸的肽)的低免疫原性，其劑量最大可達(dá)100mg/kg，在一些治療需要被認(rèn)為是非常急的情況中，結(jié)合所需治療對(duì)象的條件，最高到200mg/kg、500mg/kg或甚至lg/kg的劑量都是可能的。此外，特別有用的是現(xiàn)在可以經(jīng)皮下或肌肉內(nèi)注射來治療需要癌癥治療的對(duì)象，據(jù)此容許通過自動(dòng)注射器進(jìn)行自我治療或由未受訓(xùn)練的人員或非醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行治療。通過在增殖檢測(cè)中測(cè)試抗細(xì)胞周期活性例如通過使用在此所提供的植物生長(zhǎng)檢測(cè)法可以找到其他的肽，特別是3或4聚體肽。在此特別提供了肽在用于生產(chǎn)治療患有或被認(rèn)為患有癌癥的對(duì)象的藥物組合物中的用途，其中所述肽包括2到6個(gè)氨基酸。從預(yù)防不良反應(yīng)例如過敏性休克的角度看，藥物組合物優(yōu)選地包括由2到6個(gè)氨基酸組成的肽，更優(yōu)選地是由3到5個(gè)氨基酸組成的肽，以及最優(yōu)選地是由3個(gè)或4個(gè)氨基酸組成的肽。如果僅僅從活性的角度看，根據(jù)活性隨著肽長(zhǎng)度的增加而變得更廣泛這一普遍認(rèn)識(shí)，如果僅僅想要(在施用后)耐受更長(zhǎng)時(shí)間的完全降解，而3個(gè)氨基酸長(zhǎng)度代謝產(chǎn)物仍具有活性，所述肽在此優(yōu)選地是由4個(gè)氨基酸組成的。用于生產(chǎn)用于癌癥治療的藥物組合物的一些有用的3聚體肽在此被鑒定為VVC、LAG、和AQG。本發(fā)明也提供了肽VVC、LAG、和AQG在生產(chǎn)用于癌癥治療，優(yōu)選地用于轉(zhuǎn)移癌治療的藥物組合物中的用途。利用3聚體肽的本發(fā)明的治療優(yōu)選地包括重復(fù)施用，優(yōu)選的每周3次或每?jī)商靗次，劑量為至少5mg肽/kg患者體重，更優(yōu)選的劑量為至少17mg肽/kg體重，更優(yōu)選的劑量為至少50mg肽/kg體重。同樣，一些用于癌癥治療的有用的4聚體肽是LQGV、QVVC、MTRV、AQGV、LAGV、LQAV、PGCP、VGQL、RVLQ、EMFQ、AVAL、FVLS、麗WD、LCFL、FSYA、FWVD、AFTV、LGTL、QLLG、YAIT、APSL、ITTL、QALG、GVLC、NLIN、SPIE、LNTI、LHNL、CPVQ、EVVR、MTEV、EALE、EPPE、LGTL、VGGI、RLPG、LQGA、和LCFL。用于癌癥治療的有用的5聚體肽是TLAVE、VEGNL、和LNEAL;用于癌癥治療的有用的6聚體肽是VLPALP、MGGTWA、LTCDDP;用于癌癥治療的有用的7聚體肽是VLPALPQ、VCNYRDV、和CPRGVNP;用于癌癥治療的有用的S聚體肽是QPLAPLVG;以及用于癌癥治療的有用的9聚體肽是DINGFLPAL。本發(fā)明也提供了LQGV、QVVC、MTRV、AQGV、LAGV、LQAV、PGCP、VGQL、RVLQ、EMFQ、AVAL、FVLS、固WD、LCFL、FSYA、FWVD、AFTV、LGTL、QLLG、YAIT、APSL、ITTL、QALG、GVLC、NLIN、SP正、LNTI、LHNL、CPVQ、EVVR、MTEV、EALE、EPPE、LGTL、VGGI、RLPG、LQGA、和LCFL在生產(chǎn)用于癌癥治療，優(yōu)選地用于轉(zhuǎn)移癌治療的藥物組合物中的用途。利用4聚體肽的本發(fā)明治療優(yōu)選地包括重復(fù)施用，優(yōu)選的每周3次或每?jī)商?次，劑量為至少5mg肽/kg患者體重，更優(yōu)選的劑量為至少17mg肽/kg體重，更優(yōu)選的劑量為至少50mg肽/kg體重。本發(fā)明也提供了TLAVE、VEGNL、或LNEAL在生產(chǎn)用于癌癥治療，優(yōu)選地用于轉(zhuǎn)移癌治療的藥物組合物中的用途。利用5聚體肽的本發(fā)明治療優(yōu)選地包括重復(fù)施用，優(yōu)選的每周3次或每?jī)商?次，劑量為至少5mg肽/kg患者體重，更優(yōu)選的劑量為至少17mg肽/kg體重，更優(yōu)選的劑量為至少50mg肽/kg體重。本發(fā)明也提供了VLPALP、MGGTWA、或LTCDDP在生產(chǎn)用于癌癥治療，優(yōu)選地用于轉(zhuǎn)移癌治療的藥物組合物中的用途。利用6聚體肽的本發(fā)明治療優(yōu)選地包括重復(fù)施用，優(yōu)選的每周3次或每?jī)商?次，劑量為至少5mg肽/kg患者體重，更優(yōu)選的劑量為至少17mg肽/kg體重，更優(yōu)選的劑量為至少50mg肽/kg體重。這種小于7個(gè)氨基酸(aa)大小的肽是特別優(yōu)選的，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)(當(dāng)比較源自人類的蛋白質(zhì)組和源自病原體(特別是病毒或細(xì)菌)的蛋白質(zhì)組(Burroughsetal"Imm腳genetics，2004,56:311-320))7aa大小的肽在自身和非自身之間只有3%的重疊。對(duì)于6aa大小的肽，人類自身和病原體非人類自身之間的重疊被確定為30%，對(duì)于5aa大小的肽，重疊為90%，對(duì)于4aa大小(以及更短的)肽，人類蛋白質(zhì)組中的肽和病原體蛋白質(zhì)組中的肽之間的重疊被確定為100%。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，現(xiàn)在認(rèn)識(shí)到當(dāng)不存在自身-非自身差異時(shí)，就極大地降低了不良免疫反應(yīng)例如過敏性休克的危險(xiǎn)，當(dāng)用本發(fā)明的肽實(shí)施的抗癌治療包括重復(fù)施用例如重復(fù)注射或每周3次注射一段時(shí)間，例如在此所示的3周時(shí)，這是特別的優(yōu)點(diǎn)。從預(yù)防不良反應(yīng)例如過敏性休克的角度看，因此肽優(yōu)選地是由2到6個(gè)氨基酸組成的，更優(yōu)選地是由3到5個(gè)氨基酸組成的，以及最優(yōu)選地是由3個(gè)或4個(gè)氨基酸組成的。從活性的角度看，根據(jù)活性隨著肽長(zhǎng)度的增加而變得更廣泛這一普遍認(rèn)識(shí)，如果僅僅想要耐受更長(zhǎng)時(shí)間的完全降解，而3個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的代謝產(chǎn)物仍具有活性，所述肽在此優(yōu)選地是由4個(gè)氨基酸組成的。非常適合用于本發(fā)明的癌癥治療的肽是VVC、LAG、AQG、LQGV、QVVC、MTRV、AQGV、LAGV、LQAV、PGCP、VGQL、RVLQ、EMFQ、AVAL、FVLS、雨WD、LCFL、FSYA、FWVD、AFTV、LGTL、QLLG、YAIT、APSL、ITTL、QALG、GVLC、NLIN、SP正、LNTI、LHNL、CPVQ、EVVR、MTEV、EALE、EPPE、LGTL、VGGI、RLPG、LQGA、LCFL、TLAVE、VEGNL、或LNEAL。本發(fā)明在此也提供了具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物。細(xì)胞周期是有序的事件組，最終造成細(xì)胞生長(zhǎng)并分裂成兩個(gè)子代細(xì)胞。細(xì)胞周期的階段為Gl-S-G2-M。Gl期代表"GAP1"。S期代表"合成"。這是發(fā)生DNA復(fù)制的階段。G2期代表"GAP2"。M期代表"有絲分裂"，這是發(fā)生核分裂(染色體分離)和細(xì)胞漿分裂(胞質(zhì)分裂)的階段。術(shù)語"抗細(xì)胞周期活性"在此表示肽能夠變更細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)。例如，這包括變更及增加或減少細(xì)胞分裂的頻率。在一個(gè)實(shí)施方式中，這表示抗增殖活性。在此提供了包括PGCP的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括VGQL的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括RVLQ的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括EMFQ的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括AVAL的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括FVLS的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括NMWD的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括LCFL的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括FSYA的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括FWVD的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括AFTV的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括LGTL的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括QLLG的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括YAIT的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括APSL的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括ITTL的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括QALG的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括GVLC的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括NLIN的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括SP正的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括LNTI的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括LHNL的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括CPVQ的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括EVVR的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括MTEV的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括EALE的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括EPPE的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括LGTL的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括VGGI的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括RLPG的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括LQGA的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括LCFL的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括TLAVE的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括VEGNL的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括LNEAL的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括MGGTWA的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括LTCDDP的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括YCNYRDV的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括CPRGVNP的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物、包括DINGFLPAL的具有用于癌癥治療的抗細(xì)胞周期活性的藥物組合物。雖然本說明書歸納了權(quán)利要求書以具體指出并清楚地要求保護(hù)被視為本發(fā)明的內(nèi)容，但是當(dāng)結(jié)合附圖閱讀時(shí)，從本發(fā)明的以下描述中可以更容易地知道本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。圖l:描述了經(jīng)示例的本發(fā)明的肽治療的小鼠的腫瘤體積。其中肽A到F分別對(duì)應(yīng)于肽LAG、LAGV、LQG、LQGV、AQGV、和VLPALP。圖2:描述了經(jīng)示例的本發(fā)明的肽治療的小鼠所攜帶的腫瘤重量。其中肽A到F分別對(duì)應(yīng)于肽LAG、LAGV、LQG、LQGV、AQGV、和VLPALP。圖3:經(jīng)強(qiáng)化劑量的肽LQGV治療的帶有Lewis肺癌的C57B16小鼠的腫瘤體積。測(cè)試了劑量1.7、5、17、50和170mg/kg。圖4:經(jīng)強(qiáng)化劑量的肽LQGV治療的所有單個(gè)小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線。圖5:在強(qiáng)化劑量試驗(yàn)期間，通過評(píng)價(jià)腎臟和肝臟功能和的血液標(biāo)記物和白細(xì)胞數(shù)目來評(píng)價(jià)LQGV的毒性。圖6:在強(qiáng)化劑量試驗(yàn)期間，通過監(jiān)測(cè)動(dòng)物體重來評(píng)價(jià)LQGV的毒性。具體實(shí)施方式在此，"純化或分離的"肽是己經(jīng)從天然的或生物技術(shù)的來源中純化出的肽，或者更優(yōu)選地是如在此所述合成的肽。"治療"不要求完全治愈。其表示至少減輕了潛在疾病的癥狀，和/或減輕或消除了一種或多種引起癥狀的潛在的細(xì)胞的、生理學(xué)的、或生物化學(xué)的病因或機(jī)制。要明白，減輕在此上下文中表示是相對(duì)于疾病狀態(tài)的減輕，包括疾病的分子狀態(tài)，而不僅僅是疾病的生理學(xué)狀態(tài)。"組合物"在此指的是包含或由肽或其衍生物或功能類似物組成的化合物。肽在被包含于組合物內(nèi)之前優(yōu)選地是分離的。組合物優(yōu)選地包括三個(gè)(3個(gè))到六個(gè)(6)個(gè)氨基酸，以及最優(yōu)選地包括三個(gè)(3)或四個(gè)(4個(gè))氨基酸。肽的"功能類似物"或"衍生物"在此包括針對(duì)參照肽所進(jìn)行的變異，其保留了與參照肽可識(shí)別的關(guān)系，包括通過肽掃描(pepscan)、甘氨酸掃描(ala-scanning)、取代凈分析、美國(guó)專利申請(qǐng)10/456,375所述的方法、以及非保守和/或保守取代針對(duì)參照序列例如MTRVLQGVLPALPQVVC所進(jìn)行的變異。衍生物也包括具有與肽所用的特定氨基酸相同的或等價(jià)的側(cè)鏈，并按與肽相同的次序有序排列的但經(jīng)非肽鍵(例如等排連接(isostericlinkages),如酮等排物(ketoisostere)、羥基等排物(hydroxyisostere)、二酮等排物(diketoisostere)、或酮-二氟亞甲基等排物(keto-difluoromethyleneisostere))連接在一起的化合物。一旦形成了衍生物，這種衍生物就是用于篩選、活性鑒定、數(shù)據(jù)庫(kù)采納、藥物生產(chǎn)等目的的肽。衍生物或功能類似物也包括肽模擬化合物，其在功能或結(jié)構(gòu)上類似于作為起點(diǎn)的原始肽，但是它是由非天然存在的氨基酸或聚胺組成的。"保守氨基酸取代"是一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)具有普遍相似性能(大小、疏水性、和/或電荷)的殘基所取代，使得具有這種取代的肽序列的總體功能不會(huì)受到嚴(yán)重影響。"非保守氨基酸取代"是一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)具有普遍不同性能(大小、疏水性、和電荷)的殘基所取代，使得具有這種取代的肽序列的總體功能受到了嚴(yán)重的影響。通過系統(tǒng)地變更參照肽的至少一個(gè)氨基酸也可以提供衍生物。例如通過甘氨酸掃描(AIa-掃描)和/或取代凈分析可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，其中依次用19種其他氨基酸(或21種，如果包括硒代半胱氨酸和吡咯賴氨酸)中的一種氨基酸取代每個(gè)氨基酸。通過這些方法可以生成多種不同的肽，其依據(jù)于原始的氨基酸序列，但是每個(gè)肽都含有至少一個(gè)氨基酸殘基的變異或取代。通過這種方式可以合成和/或酶地制備出原始氨基酸序列的多個(gè)位點(diǎn)變異。肽模擬物還包括具有原始氨基酸之間的肽鍵的代用品的假肽(見例如Soto-Jara的美國(guó)專利6,689,753)，這些肽鍵的代用品包括但不限于CH2、CH2CH2、CH=CH、C三C、CH2NH、COCH2、CH2S、CH2S02和NHCO。衍生物或功能類似物還包括己經(jīng)經(jīng)例如糖基化、PEG化、PEG垸基化、垸基化、乙酰基化、酰胺化、糖基-磷脂酰肌醇化、法尼基化、ADP-核糖基化、硫酸化、脂質(zhì)連接、羥基化和磷酸化化學(xué)修飾過的肽。通過用D-氨基酸殘基或其他非天然殘基取代L-氨基酸殘基也可以生成例如衍生物或類似物。這種取代可以提高氨基酸序列的性能，例如提供具有所有逆向反轉(zhuǎn)形式的D氨基酸的已知活性的肽序列，據(jù)此容許保留活性并增加半衰期值。通過生成多個(gè)原始氨基酸序列的位點(diǎn)變異(衍生物)以及篩選特異活性，可以鑒定并使用例如包括D氨基酸的本發(fā)明的改良肽。此外，在一個(gè)實(shí)施方式中，化合物可以是NTXaaXaa2Xaa3Xaa4CT其中N末端的NT選自H-、CH3-、?；⒒蛞话愕谋Ｗo(hù)性基團(tuán)的組；C末端的CT選自小肽(例如1到5個(gè)氨基酸)、-OH、-OR1、-NH2、-NHR1、-NRW或N(CH2)L6NR'R2的組，其中R1和R2獨(dú)立地選自H、垸基、芳基、(芳)垸基，以及其中W和R"可以彼此環(huán)形連接。這些修飾構(gòu)成了參照肽的衍生物。"烷基"在此優(yōu)選地是具有1到6個(gè)碳原子的飽和的分支的或不分支的碳?xì)浠衔?，例如甲基、乙基和異戊基?芳基"在此是芳香族碳?xì)浠衔?，?yōu)選地具有6到10個(gè)碳原子，例如苯基或萘基。"(芳)烷基"在此是芳烴基(同時(shí)具有脂肪族和芳香族部分)，優(yōu)選地具有7到13個(gè)碳原子例如芐基、乙基芐基、正丙基芐基、和異丁"肽"在此表示經(jīng)肽鍵連接在一起的具有3到約50個(gè)氨基酸的肽。"組合物"也包括例如寡肽或標(biāo)記肽的可接受的鹽。"可接受的鹽"在此指的是保留了肽或等價(jià)化合物的所需活性，且優(yōu)選地不會(huì)有害地影響使用肽的系統(tǒng)中的肽或其他組分的活性的鹽。這些鹽的實(shí)例是與無機(jī)酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成鹽。也可以與有機(jī)酸例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、延胡索酸、葡糖酸、枸櫞酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、鞣酸、巴莫酸、褐藻酸、聚谷氨酸等形成鹽。也可以與多價(jià)金屬陽離子如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳等或與由N,N，-芐乙撐二胺或乙二胺茶堿或其組合物形成的有機(jī)陽離子形成鹽(例如鞣酸鋅鹽)。可以體內(nèi)全身、局部、口服或局灶地施用或引入組合物?？梢园赐ㄟ^與無機(jī)酸(例如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、和磷酸)；或與有機(jī)酸(例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、oxahcacid、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、和延胡索酸)；或與無機(jī)堿(例如氫氧化鈉、氫氧化鋁、氫氧化鉀)；或與有機(jī)堿(例如單烷基、二烷基、三烷基或芳基胺和取代的乙醇胺)反應(yīng)所形成的可藥用的酸或堿加成鹽的形式施用組合物。肽也可以與糖、脂質(zhì)、其他肽、核酸和PNA綴合，以及作為綴合物在原位發(fā)揮功能或者在達(dá)到靶組織或器官后局灶地釋放出肽。用本領(lǐng)域已知的方法可以制備出本發(fā)明的化合物(見例如美國(guó)專利申請(qǐng)10/456,375)，例如通過本領(lǐng)域已知的肽合成方法包括合適的Na保護(hù)(如果存在反應(yīng)性側(cè)鏈，還包括側(cè)鏈保護(hù))。氨基酸衍生物或肽被活化并與溶液或固體支持物中的合適的羧基受保護(hù)的氨基酸或肽衍生物結(jié)合。a氨基保護(hù)可以利用酸敏感的叔丁氧羰基("Boc")、芐氧羰基("Z")或取代類似物或堿敏感的9-芴甲氧羰基("Fmoc")。通過催化氫化作用也可以去除Z基團(tuán)，其他合適的保護(hù)基團(tuán)包括Nps、Bmv、Bpoc、Aloe、MSC等。E.Gross和J.Meienhofer編著的"Thepeptides,Analysis,Syrithesis，Biology,Vol,3"(AcademicPress,NewYork,1981)纟合出了很好的關(guān)于氨基保護(hù)基團(tuán)的綜述。通過酯的形成例如堿敏感酯如甲酯或乙酯、酸敏感酯如叔丁酯或取代的、苯甲酯或加氫分解作用可以進(jìn)行羧基保護(hù)。利用上面提及的基團(tuán)可以進(jìn)行側(cè)鏈官能團(tuán)例如賴氨酸和谷氨酸或門冬氨酸基團(tuán)的保護(hù)。利用各種試劑例如在ThePeptides,Analysis,Synthesis,Biology;或在PureandAppliedChemistry,59(3),331-344(1987)中所述的試劑可以進(jìn)行巰基、胍基、醇基和咪唑基的保護(hù)(盡管并非一直需要)。通過疊氮、混合酸酐、活性酯、或碳二亞胺法，特別是通過加入催化的和抑制消旋的化合物如l-N-N-羥基苯并三唑、N-羥基琥珀酰亞胺、3-羥基-4-氧-3，4-二氫-l，2，3，-苯并三唑、N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亞胺(N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboxyimide)可以進(jìn)行對(duì)受合適保護(hù)的氨基酸或肽中的羧基的保護(hù)。也可以使用基于磷的酸的酸酐。見例如ThePeptides,Analysis,Synthesis,Biology,見上，禾卩PureandAppliedChemistry,59(3),331-344(1987)。通過Merrifield的固相法也可以制備出化合物。不同的固相支持物和不同的策略是己知的，見例如BaranyandMerrifieldinThePeptides,Analysis,Synthesis,Biology,Vol.2,E.GrossandJ.Meienhofer,eds.,(Acad.Press,NewYork,1980);Kneib-CordonierandMullenInt.J.PeptideProteinRes"30，705-739(1987)禾口FieldsandNobleInt.J.PeptideProteinRes.，35，161-214(1990)。利用先前所述的保護(hù)基團(tuán)和活化過程一般都可以進(jìn)行化合物的合成，其中肽鍵被等排物所取代。在文獻(xiàn)中描述了合成修飾的等排物的方法，例如合成一CH2—NH--等排物和一CO—CH2--等排物的方法。用本領(lǐng)域已知的方式(見例如ThePeptidesAnalysis,Synthesis,Biology(見上)系列中的巻3、5和9)可以進(jìn)行保護(hù)基團(tuán)的去除，對(duì)于固相肽合成而言還可以進(jìn)行與固相支持物的解離。另一種可能性是酶在合成這些化合物中的應(yīng)用；其綜述見于如H.D.JakubkeinThePeptides,Analysis,Synthesis,Biology,Vol.9,S.UdenfriendandJ.Meienhofer,eds.，(Acad.Press,NewYork,1987)。例如，通過修飾如糖基化、磷酸化和本領(lǐng)域已知的其他修飾。也可以用重組DNA法制備本發(fā)明的肽。這些方法包括通過在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)編碼一種或多種寡肽的重組多核苷酸序列的方式制備所需的肽。一般來說，方法包括向克隆載體(例如質(zhì)粒、噬菌體DNA、或其他能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的DNA序列)內(nèi)引入編碼特定寡肽或寡肽的DNA序列；將克隆載體引入到合適的真核或原核宿主細(xì)胞內(nèi)；和培養(yǎng)所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。當(dāng)使用真核宿主細(xì)胞時(shí)，化合物可以包括糖化蛋白質(zhì)部分。將含有在此所述的肽的藥物組合物施用給患有或被認(rèn)為患有癌癥的對(duì)象。在治療性應(yīng)用中，給對(duì)象施用量足以引起腫瘤退變、或至少部分阻止腫瘤生成和轉(zhuǎn)移的組合物。足夠?qū)崿F(xiàn)這一點(diǎn)的量在此被定義為"治療有效量"。治療有效量取決于例如肽的性能(特異活性等)、施用方式、癌癥的階段和嚴(yán)重度、對(duì)象的體重和一般健康狀況、和處方醫(yī)師的判斷?？梢詫?shí)施肽組合物的單次或多次施用，其劑量水平和模式由治療醫(yī)師決定。在所有情況中，藥物制劑都應(yīng)當(dāng)提供足以有效地治療對(duì)象的肽量。應(yīng)當(dāng)在出現(xiàn)不良細(xì)胞增殖的首個(gè)征象或在診斷后即可就開始施用組合物，并持續(xù)到癥狀基本緩解以及之后的一段時(shí)間。在明確診斷為癌癥的病例中，可能要求在負(fù)荷劑量后給予維持劑量。用于治療性治療的藥物組合物可以用于腸外、局部、口服或局灶施用。本發(fā)明提供了腸外施用的組合物，其包括抗腫瘤肽溶解或懸浮于可接受的載體(優(yōu)選的是水性載體)的溶液。可以使用各種水性載體例如水、緩沖水、0.4%鹽水、0.3%甘氨酸、透明質(zhì)酸等等。可以用傳統(tǒng)的、公知的滅菌技術(shù)對(duì)這些組合物進(jìn)行滅菌，或者可以進(jìn)行過濾滅菌。所形成的水溶液可以被分裝使用，或者被低壓凍干，在施用之前再組合凍干制劑和無菌溶液。組合物可以含有近似生理?xiàng)l件所需的可藥用的輔助物質(zhì)，例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、濕化劑等，例如醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、單月桂山梨聚糖、三乙醇胺油酸酯等。其他用于制備藥物組合物的方法對(duì)于本領(lǐng)域熟練人員是已知的或顯而易見的，例如在Remington'sPharmaceuticalScience,19thed.，MackPublishingCompany,Easton，Pa.(1990)中有著更為詳細(xì)的描述，在此通過引用將其內(nèi)容并入本申請(qǐng)。對(duì)于本發(fā)明肽的固體組合物，可以使用傳統(tǒng)的無毒的固體載體，其包括例如藥物級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。對(duì)于口服施用，通過摻和任何正常采用的輔料例如先前所列的載體以及一般10-95%的活性組分即一種或多種抗腫瘤肽(更優(yōu)選的為25%-75%濃度)可以形成可藥用的無毒組合物。本發(fā)明也包括藥品，其包括包含于包裝材料內(nèi)的至少一種藥物試劑。藥物試劑對(duì)于治療腫瘤是治療有效的，并且可以選自在此所述的肽的組。雖然大多數(shù)新的藥物都打算是口服施用的，但是基于肽的藥物可能受到不需要的降解，使得其他的轉(zhuǎn)運(yùn)方法例如鼻內(nèi)施用或經(jīng)皮施用是更合意的，但是甚至對(duì)于基于肽的藥物，口服轉(zhuǎn)運(yùn)仍是合意的(例如具有好的生物利用度)。如PCT國(guó)際申請(qǐng)WO03/029292A2(2003年4月10日發(fā)表)、PCT國(guó)際申請(qǐng)WO01/72831A2(2001年10月4日發(fā)表)和美國(guó)專利申請(qǐng)20020064501Al(2002年5月30日發(fā)表)、20030119720Al(2003年6月26日發(fā)表)、20030113733Al(2003年6月19日發(fā)表)、和20030166556Al(2003年9月4日發(fā)表)所述的那樣(在此通過應(yīng)用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng))，包含在此所述的純化的或分離的寡肽的組合物具有能用于治療膿毒癥和其他疾病狀態(tài)及病變的免疫調(diào)節(jié)活性。它們也具有基因調(diào)節(jié)活性。本發(fā)明包括篩選化合物的方法，所述化合物包含由序列MTRVLQGVLPALPQVVC的特定的4到8個(gè)氨基酸片段組成的純化的或分離的肽及其衍生物。通過治療經(jīng)腫瘤攻擊的小鼠并監(jiān)測(cè)腫瘤隨著時(shí)間的變化可以確定出抗腫瘤活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，氨基酸片段包括MTRVLQGVLPALPQVVC的四聚體序列部分(例如對(duì)應(yīng)于LQVG)，即X犯1Xa^Xaa3X膽4其中，是選自由Ala和Leu組成的組中的取代或未取代的非極性氨基酸；Xaa2是選自由Gln、Pro、和Ala組成的組中的取代或未取代的氨基酸；Xaas是選自取代或未取代的Gly;Xaa4是選自由Val和Ala組成的組中的取代或未取代的非極性氨基酸。例如，肽可以選自由LQGV、衍生物AQGV、衍生物L(fēng)QGA、衍生物L(fēng)AGV、衍生物L(fēng)PGC組成的組。在另一個(gè)實(shí)施方式中，片段是6個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，并包括序列XaaiXaa2PrOAlaXaa2Xaa3其中，Xaal是取代或未取代的Val或Ala，其中Xaa2是獨(dú)立地選自取代或未取代的Leu或Ala，以及其中Xaa3是取代或未取代的Pro或Ala。在這個(gè)實(shí)施方式中，肽可以具有選自由VLPALP、衍生物ALPALP、衍生物VAPALP、衍生物ALPALPQ、衍生物VLPAAPQ、衍生物VLPALAQ、衍生物VLPALA、VLPALPQ、衍生物VLPALPA、衍生物GVLPALP、和衍生物VLAALP組成的組中的形式。在另一個(gè)實(shí)施方式中，組合物可以具有不超過8個(gè)氨基酸，并包括以下形式的氨基酸序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4其中，Xaa,是選自由Ala、Leu和Met組成的組中的取代或未取代的氨基酸；X^是選自由Gln、Thr、Ala和Pro組成的組中的取代或未取代的氨基酸；X^是選自取代或未取代的Gly或Arg;以及其中X^是選自由Cys、Ala、和Val組成的組中的取代或未取代的氨基酸。通過治療經(jīng)腫瘤攻擊的小鼠并監(jiān)測(cè)腫瘤隨著時(shí)間的變化可以確定出抗腫瘤活性。在這種實(shí)施方式中，序列可以選自由LeuGlnGlyVal、AlaGlnGlyVal、LeuGlnGlyAla、LeuAlaGlyVal、LeuProGlyCys、或MetThrArgVal、或其衍生物組成的組。在另一個(gè)實(shí)施方式中，片段可以是四聚體MTRV或QVVC或其衍生物。本發(fā)明還包括藥物組合物，其包含純化的或分離的肽、或其酸加成鹽，所述純化的或分離的肽具有抗腫瘤活性。本發(fā)明提供了用于鑒定能用于腫瘤治療的肽的方法，包括給被認(rèn)為需要這種治療的對(duì)象施用包括肽、其衍生物或功能類似物的組合物，所述肽、其衍生物或功能類似物是具有抗腫瘤活性的特異分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，組合物至少包括兩種肽或其衍生物。例如，每個(gè)肽都具有抗腫瘤活性。例如，至少兩種寡肽可以選自LQGV、AQGV、和VLPALP或經(jīng)在此所述方法所鑒定出的肽的組。本發(fā)明也提供了本發(fā)明的組合物在藥物組合物或藥品的制備和治療各種醫(yī)學(xué)病變例如免疫介導(dǎo)性疾病的方法中的用途。用下面的舉例說明的實(shí)施例進(jìn)一步地解釋說明了本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1材料和方法肽合成通過利用基于9-芴甲氧羰基(Fmoc)/叔丁基的方法學(xué)(Atherton，1985)以及2-氯三苯甲基氯(2-chlorotritylchloride)樹脂(Barlosetal.，Int.J.PeptideProteinres.,37:513-520(1991))作為固相支持物的固相合成法(R.B.Merrifield，J.Am.Chem.Soc,85:2149-2165(1963))制備出如在此所提及的肽例如LQG、AQG、LQGV、AQGV、LQGA、VLPALP、ALPALP、VAPALP、ALPALPQ、VLPAAPQ、VLPALAQ、LAGV、VLAALP、VLPALA、VLPALPQ、VLAALPQ、VLPALPA、GVLPALP、VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPWSYAVALSCQCAL、RPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPT、SKAPPPSLPSPSRLPGPS、LQGVLPALPQVVC、SIRLPGCPRGVNPWS、LPGCPRGVNPWS、LPGC、MTRV、MTR、禾卩VVC。用三苯甲基官能團(tuán)保護(hù)谷氨酰胺的側(cè)鏈。人工合成肽。每個(gè)偶合都由以下步驟組成(i)用二甲基酰胺(DMF)中的哌啶去除a氨基Fmoc保護(hù)；(ii)Fmoc氨基酸(3eq)和DMF/N-甲酸甲酯(NMP)中的二異丙基碳二亞胺(DIC)/1-羥基苯并三唑(HOBt)的偶合；(iii)用DMF/NMP中的乙酸酐/二異丙基乙胺(DIEA)給剩余的氨基官能團(tuán)加帽。在完成合成之后，用95:2.5:2.5比例的三氟乙酸(TFA)/1120/三異丙基甲硅烷(TIS)混合物處理肽樹脂。在30分鐘之后，加入TIS直到脫色。溶液在真空下脫水，用二乙醚沉淀肽。將粗肽溶解在水中(50-100mg/ml)，并用反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化。HPLC條件為柱VydacTP2181OC18(10x250mm);洗脫系統(tǒng)0.1。/。TFA水溶液v/v(A)和0.1%TFA乙腈溶液(CAN)v/v(B)的梯度系統(tǒng)；流速6ml/分鐘；在190-370nm處測(cè)定吸光度?？梢允褂貌煌奶荻认到y(tǒng)。例如對(duì)于肽LQG和LQGV:10分鐘100。/。A，隨后線性梯度0-10%50分鐘。例如對(duì)于肽VLPALP和VLPALPQ:5分鐘5%B，隨后線性梯度l。/。B/分鐘。通過40。C減壓下的旋轉(zhuǎn)膜蒸發(fā)可以將所收集到的部分濃縮成約5ml。通過用乙酸形式的陰離子交換樹脂(MerckII)洗脫柱兩次可以用乙酸交換出剩余的TFA。濃縮洗脫液并低壓凍干28個(gè)小時(shí)。隨后通過將肽溶解于PBS內(nèi)制備出所用的肽。實(shí)施例II動(dòng)物和腫瘤模型將同系Lewis肺癌(LLC)皮下移植于小鼠(C57B16)。治療方式在移植當(dāng)天開始用經(jīng)腹腔內(nèi)注射的小肽或?qū)φ瘴镏委熜∈?。在周一、周三和周五給小鼠進(jìn)行注射，直到試驗(yàn)結(jié)束。試驗(yàn)結(jié)束取決于腫瘤大小〉20mm、動(dòng)物痛苦、體重下降超過20%、潰瘍等。否則在開始治療后8周停止試驗(yàn)。有效性評(píng)價(jià)方法腫瘤應(yīng)答評(píng)價(jià)用測(cè)徑器測(cè)量法測(cè)定出兩個(gè)方向上的腫瘤直徑，并用公式V=0.4(A2xB)(其中B代表最大直徑，A代表與B垂直的直徑)計(jì)算出腫瘤體積(V)。腫瘤應(yīng)答的類型為疾病進(jìn)展(PD)，7天(開始治療后第3天和第IO天之間)內(nèi)腫瘤體積增加(>50%);疾病穩(wěn)定，腫瘤體積等于第3天體積(-25%到+25%的范圍之內(nèi))；部分緩解(R)，腫瘤體積為-25%至1」-90%;和完全緩解(CR)，在開始治療第56天時(shí)沒有可測(cè)定的腫瘤。當(dāng)腫瘤直徑得到20mm時(shí)，停止腫瘤生長(zhǎng)評(píng)價(jià)。副作用評(píng)價(jià)每日依照方案監(jiān)測(cè)副作用并分類。(A)每日監(jiān)測(cè)動(dòng)物的體重。(B)動(dòng)物的行為。(C)檢查動(dòng)物可能的副作用例如腹瀉。結(jié)果腫瘤應(yīng)答在植入LLC腫瘤后24個(gè)小時(shí)，通過腹腔內(nèi)注射肽來治療小鼠。在所有接受PBS的小鼠中，腫瘤都發(fā)生進(jìn)展，21天時(shí)的平均腫瘤體積達(dá)到了1600mm3。該時(shí)間點(diǎn)的腫瘤直徑近似為16mm。用沙利度胺作為陽性對(duì)照。觀察到21天時(shí)的平均腫瘤體積為340mm3，而3/6小鼠顯示出56天的完全腫瘤控制。肽LQG、LQGV、AQGV、和VLPALP的施用誘導(dǎo)了腫瘤生長(zhǎng)延遲(LQG和LQGV與沙利度胺相當(dāng))(表l)。肽LQGV的施用造成了很強(qiáng)的腫瘤生長(zhǎng)延遲。表1:在小肽治療期間和之后攜帶LLC腫瘤的小鼠體內(nèi)的腫瘤應(yīng)答。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在經(jīng)沙利度胺以及肽LQG治療的小鼠中，所有動(dòng)物都獲得了腫瘤應(yīng)答(表示7天內(nèi)腫瘤最大生長(zhǎng)不超過25%)。在經(jīng)肽LQGV和VLPALP治療的動(dòng)物中，6只小鼠中有5只顯示出應(yīng)答。由于動(dòng)物的樹木較少，在體積方面沒有觀察到顯著性。但是，與經(jīng)假治療的小鼠相比較，經(jīng)肽LQG、LQGV、禾nVLPALP以及沙利度胺(T)治療的動(dòng)物的應(yīng)答率都得到了明顯提高(LQG和T:p<0.002;LQGV禾卩VLPALP:p<0.015)。從這些結(jié)果中可以清楚地看到，肽的施用造成了腫瘤生長(zhǎng)延遲或腫瘤控制。如圖1所示，當(dāng)用抗腫瘤肽LQG和LQGV或沙利度胺治療小鼠時(shí)，獲得了相當(dāng)?shù)哪[瘤生長(zhǎng)曲線。副作用如圖2所示，在經(jīng)小肽治療的小鼠體內(nèi)沒有觀察到對(duì)體重的作用。也沒有觀察到所提及的其他副作用。通過引用將包括數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)、出版物、專利和專利申請(qǐng)等在此所弓I用的所有文獻(xiàn)并入本申請(qǐng)，如同已經(jīng)分別而具體地指出各個(gè)文獻(xiàn)均通過引用以其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)一樣。實(shí)施例III測(cè)試方法動(dòng)物和腫瘤模型將同系Lewis肺癌(LLC)皮下移植于小鼠(C57B16)。在移植24個(gè)小時(shí)后開始治療。動(dòng)物數(shù)為每組8只，以便增加研究的分量(power)。因?yàn)槲覀冮_始治療時(shí)還沒有可觸及的腫瘤，因此誤差變化要比已有腫瘤的研究更大。治療方式在移植后l天開始，用經(jīng)腹腔內(nèi)注射的小肽或假對(duì)照治療小鼠。周一、周三和周五給小鼠進(jìn)行注射，直到試驗(yàn)結(jié)束。試驗(yàn)結(jié)束取決于腫瘤大小〉20mm、動(dòng)物痛苦、體重下降超過20%、潰瘍等。否則在開始治療后8周停止試驗(yàn)。腫瘤應(yīng)答評(píng)價(jià)用測(cè)徑器測(cè)量法測(cè)定出兩個(gè)方向上的腫瘤直徑，并用公式V=0.4(A2xB)(其中B代表最大直徑，A代表與B垂直的直徑)計(jì)算出腫瘤體積(V)。腫瘤應(yīng)答的類型為疾病進(jìn)展(PD)，7天內(nèi)腫瘤體積增加(>25%);無變化(NC)，腫瘤體積等于治療開始時(shí)的體積(-25%到+25%的范圍之內(nèi))；部分緩解(PR)，腫瘤體積縮小-25%到-90%;和完全緩解(CR)，腫瘤體積小于10%初始體積。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到20mm時(shí)終止腫瘤生長(zhǎng)評(píng)價(jià)。副作用評(píng)價(jià)每日依照方案監(jiān)測(cè)副作用并分類。(A)每日監(jiān)測(cè)動(dòng)物的體重。(B)動(dòng)物的行為。(C)檢查動(dòng)物可能的副作用例如腹瀉。統(tǒng)計(jì)學(xué)用多組非參數(shù)檢驗(yàn)(KruskalWallis)分析腫瘤體積，以及用MannWhitney進(jìn)行不同組的配對(duì)比較。結(jié)果腫瘤應(yīng)答如材料和方法所述，用強(qiáng)化劑量的肽治療小鼠。在5mg/kg劑量時(shí)，觀察到了腫瘤生長(zhǎng)的延遲(圖1)。這種延遲在更高劑量組中表現(xiàn)更為顯著。特別地，施用50mg/kg強(qiáng)烈地抑制了腫瘤生長(zhǎng)。對(duì)照小鼠(陰性對(duì)照假)顯示出進(jìn)展性腫瘤生長(zhǎng)。經(jīng)沙利度胺治療的小鼠(陽性對(duì)照)僅僅顯示出部分腫瘤生長(zhǎng)延遲。圖4給出了單個(gè)腫瘤生長(zhǎng)曲線的概述。表2描述了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。表2:不同肽治療組中的腫瘤體積和腫瘤應(yīng)答的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。比較了第20天時(shí)的腫瘤體積。右上腫瘤體積。左下腫瘤應(yīng)答(見表3)。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表3:腫瘤應(yīng)答率<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>腫瘤應(yīng)答與計(jì)劃稍有不同地評(píng)價(jià)腫瘤應(yīng)答。因?yàn)槲覀冊(cè)谀[瘤應(yīng)答后不久就開始治療，因此不能得到腫瘤相對(duì)于治療前的縮小。此外，我們沒有觀察到腫瘤尺寸在其開始向外生長(zhǎng)后的縮小。評(píng)價(jià)了試驗(yàn)期框架內(nèi)的向外生長(zhǎng)(疾病進(jìn)展，PD)和腫瘤應(yīng)答(TR，腫瘤延遲直到第20天)。表3描述了應(yīng)答率。毒性在試驗(yàn)期間，通過監(jiān)測(cè)動(dòng)物體重(圖6)和通過評(píng)價(jià)腎臟和肝臟功能的血液標(biāo)記物和白細(xì)胞數(shù)目(圖5)來評(píng)價(jià)所施用肽的毒性。在所有劑量組中，都沒有觀察到對(duì)動(dòng)物體重的影響。肽的施用對(duì)白細(xì)胞數(shù)目也沒有影響，也不會(huì)影響肝臟和腎臟參數(shù)。重要的是，不僅要在組間進(jìn)行比較，還要在組內(nèi)的單個(gè)小鼠之間進(jìn)行比較。這些結(jié)果顯示肽施用對(duì)所有測(cè)試參數(shù)都沒有影響。實(shí)施例IV為了進(jìn)一步研究各種寡肽的抗細(xì)胞周期活性，進(jìn)行了擬南芥苗的增殖試驗(yàn)。目的是測(cè)試一組140種不同長(zhǎng)度寡肽對(duì)其中發(fā)生細(xì)胞分裂的快速生長(zhǎng)期內(nèi)的植物標(biāo)記物基因表達(dá)的影響。兩個(gè)標(biāo)記物基因都與細(xì)胞周期過程有關(guān)，其中高標(biāo)記物活性反映出高細(xì)胞周期活性，沒有標(biāo)記物活性反映出沒有細(xì)胞周期活性，因此反映出沒有增殖。方法將肽重懸于lx磷酸緩沖鹽(PBS)(pH8)，終濃度為5mg/ml。將所獲得的溶液分到96孔圓底板內(nèi)(CorningIncorporated),每孔40微升。在使用之前，將板在-200。C下存放4天。將擬南芥生態(tài)型Ws-0的種子在2%商品化的漂白劑(Glorix)中表面消毒10分鐘，并用無菌MQ水洗滌5次。然后將種子重懸于0.1%瓊脂內(nèi)，并鋪板到加有80mg/l卡那霉素的MS20板上。植物在40°C下放置2晚，然后將其轉(zhuǎn)移到210°C和16/8h光周期的溫室內(nèi)。在生長(zhǎng)4天之后，將苗轉(zhuǎn)移到含有肽溶液的96孔板內(nèi)(每孔4個(gè)苗)，并孵育4和8個(gè)小時(shí)。這個(gè)試驗(yàn)使用了攜帶有兩個(gè)與GUS融合的報(bào)告子基因的擬南芥純合子苗。所用的第一個(gè)報(bào)告子基因是細(xì)胞周期標(biāo)記物pCDG(Carmonaetal.,ThePlantJournal,1999,20(4)，503-508)，第二個(gè)是auxin應(yīng)答標(biāo)記物DR5::GUS(Ulmasovetal.,ThePlantCell,Vol.9，1963-1971)。在與化合物孵育之后，對(duì)苗進(jìn)行GUS染色。在含有10mMEDTA、10%DMSO、0.1%TritonX-畫、2mMX-Gluc、0.5mMK3Fe(CN)6和0.5mMK4Fe(CN)6的lOOmM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中、37°C下進(jìn)行染色反應(yīng)16個(gè)小時(shí)。為了終止GUS反應(yīng)并去除葉綠素，隨后用96%乙醇處理苗1個(gè)小時(shí)，并將苗存放在70%乙醇內(nèi)。在立體顯微鏡下觀察被染色的苗，用苗制備出顯示了化合物治療的作用的玻片。固定苗，并在水合氯醛溶液中進(jìn)行清洗，以便進(jìn)行更詳細(xì)的顯微鏡觀察，并在裝配有DIC光學(xué)系統(tǒng)的顯微鏡下拍照。結(jié)果測(cè)試了肽對(duì)快速生長(zhǎng)的擬南芥幼苗中標(biāo)記物基因表達(dá)的作用。通過不同器官中的GUS分布改變監(jiān)測(cè)這種作用，所述器官是根、根-下胚軸過渡區(qū)和子葉。在所測(cè)試的140種化合物中，總共有43種化合物顯示出對(duì)所測(cè)試的兩種標(biāo)記物表達(dá)的明顯作用。令人驚訝的是，作用與所測(cè)試的各種肽的長(zhǎng)度明顯相關(guān)。如下面的表4所示，短肽表現(xiàn)出了抗細(xì)胞周期活性，而超過9個(gè)氨基酸的肽都沒有獲得細(xì)胞周期活性的降低。在5到9個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽中，顯示出細(xì)胞周期活性降低了約22%，但是所測(cè)試的三聚體和四聚體顯示出細(xì)胞周期活性降低了50%以上。表4:在擬南芥細(xì)胞周期測(cè)試中所見的測(cè)試肽陽性分布頻率/肽長(zhǎng)度。存AA,太的氨基酸長(zhǎng)度；#=測(cè)試植物數(shù)目；#+=陽性數(shù)目；％+=陽性百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>從植物的細(xì)胞周期研究和小鼠細(xì)胞的體內(nèi)縮小腫瘤生長(zhǎng)的研究中，鑒定出了用于癌癥治療的有用的3聚體肽VVC、LAG、AQG。同樣，用于癌癥治療的有用的4聚體肽是LQGV、QVVC、MTRV、AQGV、LAGV、LQAV、PGCP、VGQL、RVLQ、EMFQ、AVAL、FVLS、畫WD、LCFL、FSYA、FWVD、AFTV、LGTL、QLLG、YAIT、APSL、ITTL、QALG、GVLC、NLIN、SP正、LNTI、LHNL、CPVQ、EVVR、MTEV、EALE;用于癌癥治療的有用的5聚體是TLAVE、VEGNL、LNEAL;用于癌癥治療的有用的6聚體是VLPALP、MGGTWA、LTCDDP;用于癌癥治療的有用的7聚體是VLPALPQ、VGNYEDV、CPRGVNP;用于癌癥治療的有用的8聚體是QPLAPLVG;以及用于癌癥治療的有用的9聚體是DINGFLPAL。權(quán)利要求1.用于治療患有或被認(rèn)為患有腫瘤的對(duì)象的藥物組合物，所述藥物組合物包括治療有效量的抗腫瘤肽或其功能類似物或衍生物以及可藥用稀釋劑。2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述肽小于15個(gè)氨基酸。3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述肽選自由VVC、LAG、AQG、LQGV、QVVC、MTRV、AQGV、LAGV、LQAV、PGCP、VGQL、RVLQ、EMFQ、AVAL、FVLS、雨WD、LCFL、FSYA、FWVD、AFTV、LGTL、QLLG、YAIT、APSL、ITTL、QALG、GVLC、NLIN、SP正、LNTI、LHNL、CPVQ、EVVR、MTEV、EALE、TLAVE、VEGNL、LNEAL、VLPALP、MGGTWA、LTCDDP、VLPALPQ、VCNYRDV、CPRGVNP、QPLAPLVG和DINGFLPAL組成的組。4.權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的組合物，其中所述肽小于7個(gè)氨基酸。5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述肽的長(zhǎng)度為從2到6個(gè)氨基酸。6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述肽的長(zhǎng)度為3或4個(gè)氨基酸。7.權(quán)利要求5的組合物，其中抗腫瘤肽是MTRVLQGVLPALPQVVC的3到6個(gè)氨基酸的片段。8.權(quán)利要求7的組合物，其中抗腫瘤肽是LQG或LQGV。9.肽在生產(chǎn)用于腫瘤治療的藥物組合物中的用途，包括將所述寡肽摻入到所述組合物內(nèi)。10.權(quán)利要求9的用途，其中所述肽小于15個(gè)氨基酸。11.權(quán)利要求9或10的用途，其中所述肽選自由VVC、LAG、AQG、LQGV、QVVC、MTRV、AQGV、LAGV、LQAV、PGCP、VGQL、RVLQ、EMFQ、AVAL、FVLS、雇WD、1XFL、FSYA、F群D、AFTV、LGTL、QLLG、YAIT、APSL、ITTL、QALG、GVLC、NLIN、SP正、LNTI、LHNL、CPVQ、EVVR、MTEV、EALE、TLAVE、VEGNL、LNEAL、VLPALP、MGGTWA、LTCDDP、VLPALPQ、VCNYRDV、CPRGVNP、QPLAPLVG和DINGFLPAL組成的組。12.權(quán)利要求9到11中任一項(xiàng)的用途，其中所述肽小于7個(gè)氨基酸。13.權(quán)利要求12的用途，其中所述肽的長(zhǎng)度為從2到6個(gè)氨基酸。14.權(quán)利要求13的用途，其中所述肽的長(zhǎng)度為3或4個(gè)氨基酸。15.權(quán)利要求13的用途，其中抗腫瘤肽是MTRVLQGVLPALPQVVC的3到6個(gè)氨基酸的片段。16.權(quán)利要求15的用途，其中抗腫瘤肽是LQG或LQGV。全文摘要雖然通常都認(rèn)為蛋白質(zhì)的最小降解產(chǎn)物本身沒有特異的生物學(xué)功能，但是現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)機(jī)體可以利用正常的蛋白質(zhì)裂解性降解過程生成重要的化合物例如基因調(diào)節(jié)化合物或抗腫瘤化合物。這些抗腫瘤化合物可以用于治療或預(yù)防腫瘤，并且可以被用作藥物組合物的一部分。本發(fā)明提供了用于治療患有或被認(rèn)為患有腫瘤的對(duì)象的藥物組合物，所述藥物組合物包括治療有效量的抗腫瘤肽或其功能類似物或衍生物以及可藥用稀釋劑，其中肽優(yōu)選地選自VVC、LAG、AQG、LQGV、QVVC、MTRV、AQGV、LAGV、LQAV、PGCP、VGQL、RVLQ、EMFQ、AVAL、FVLS、NMWD、LCFL、FSYA、FWVD、AFTV、LGTL、QLLG、YAIT、APSL、ITTL、QALG、GVLC、NLIN、SPIE、LNTI、LHNL、CPVQ、EVVR、MTEV、EALE、TLAVE、VEGNL、LNEAL、VLPALP、MGGTWA、LTCDDP、VLPALPQ、VCNYRDV、CPRGVNP、QPLAPLVG和DINGFLPAL。文檔編號(hào)A61K38/06GK101217971SQ200680024628公開日2008年7月9日申請(qǐng)日期2006年7月3日優(yōu)先權(quán)日2005年7月5日發(fā)明者G·溫斯沃特,N·A·漢,R·本納申請(qǐng)人:比奧滕普特公司