專利名稱：：用于治療癌癥的4-苯胺基-3-喹啉甲腈的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種f頓4-(2,4-二氯-5-甲氧基-苯氨基>6-甲氧基-7-[3-(4-甲基-哌眷l-基)-丙氧基]-喹脈3-甲腈(SKI-606)，式(I)化合物治療癌癥的方法和含有相同化合物的組合物。
背景技術(shù)：
：多種4-苯胺-3-喹啉甲腈衍生物顯示出具有抗腫瘤活性，這使得它們作為化療試劑用于治療多種癌癥，包括胰腺癌、淋巴癌和前列腺癌。美國專利6002008、6384051、6432979和6617333公開了一定的4-苯胺基-3-喹啉甲腈衍生物顯示出具有拋中瘤活性。酪氨酸蛋白激酶由功能上相關(guān)的受體和非受體組成，可M特定酪氨,基的磷酸化作用發(fā)信號給酶以調(diào)節(jié)細胞生長、活化、區(qū)分、發(fā)展和轉(zhuǎn)化。受體酪氨酸激酶，如表皮生長因子受體(EGFR)由細鵬卜配合體結(jié)合域、一個單獨的橫跨膜的領(lǐng)域和一個細胞內(nèi)酪氨酸激酶域組成。非受體酪氨酸激酶，如Src和Abl是可溶性細胞質(zhì)酶具有多重調(diào)整和蛋白-結(jié)合域。Src酪氨酸激酶家族是一組通過功能和序列相似度定義的非受體酪氨酸激酶。這個家族的三個成員被廣泛表達Src，Yes和FynB。其它6個成員，LcK，Lyn，F(xiàn)ynT，F(xiàn)gr，Hck和Blk，在造血細胞中顯著表達。對于非受體酪氨酸蛋白激酶的結(jié)構(gòu)和功能的深度評論和它們在人類癌癥中的相關(guān)性已經(jīng)被公開。Src非受體酪氨酸蛋白激酶是Src家族的原型。Src是由生長因子受體和G-蛋白耦合受體調(diào)節(jié)的路徑的下位組分，被認為可用于調(diào)整來自于這些不同路徑的信號。己知被Src家族激,粦酸化的細胞內(nèi)耙向蛋白的名單是巨大的并搟賣增長，包括粘連激酶、焦點粘連蛋白(FAK)和其它許多。Src在多數(shù)癌包括大多數(shù)的J3繊癌、黑素瘤、頭頸癌和卵巢癌中被向上調(diào)節(jié)。Src在前列腺腫瘤系中也被激活。SrcmRNA水平在人鄉(xiāng)思腺腫瘤中高于正常組織樣本。巴雷特^m和^m癌也過分皿src。既然c-Src酪氨酸激酶在大多數(shù)人類癌癥中是惡性細胞行為的決定因素，我們就試著去確定抑制c-Src在胰腺癌化學敏感性,的作用?；贘^H察，抑制Src的化合物可能在治療具有這些或其它癌癥的病人有效。4-(2,4-二氯-5-甲氧基-苯氨基)-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基-哌(^1-基>丙氧萄-Hfl^3-甲腈已經(jīng)被證實在預防、治療或抑制，原則的癌癥上有效。本發(fā)明涉及一種預防、治療或抑制癌癥的方法，所述方^括給予治自效量的式(I)化她4-(2,4-二氯-5_甲氧基-苯氨基>6-甲氧基-7-[3-(4-甲基-哌膝1-基)-丙氧基]-喹脈3-甲腈，或其藥學上可接受的鹽。本發(fā)明也涉及一種治療胰腺癌的方法，所述方法包括聯(lián)合纟^治療有效量的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽與吉西他濱或其藥學上可接受的鹽。本發(fā)明的另一方面是含有治療有效量的式(I)化，或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體的藥物組合物。圖l.顯示頭和頸系HN5對4-(2,4-二氯-5-甲氧基-苯氨基>6-甲氧基-7-[3-(4-甲基-哌膝l-萄-丙氧蜀4f(fr3-甲腈的反應(yīng)。術(shù)語"癌癥'指的是由異常和不可控制的細胞分裂所致的任何惡性增長劍中瘤。它可能通過淋巴系統(tǒng)或血流擴散到身體的其它部位。本申請描述的治療癌癥的方法的目的，癌癥包括胰腺、淋巴和前列腺癌。藥學上可接受的鹽，例如，衍生于有機和無機酸如M昔酸、乳酸、羧酸、檸檬酸、苯乙烯酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、扁桃酸、蘋果酸、酢漿草酸、丙酸、鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝石酸、硫酸、乙二醇酸、甲磺酸、乙附圖簡述發(fā)明詳述磺酸、甲苯磺酸、7jC楊酸、安息香酸和相似的已知可接受的酸。式a)化合物可口服，通ann內(nèi)、肌內(nèi)或靜脈注射、輸液、月旨質(zhì)體介導給予、局部、鼻、肛門、陰道、舌下、尿道、真皮、膜內(nèi)、眼睛或耳給予。為了獲得式(I)化合物的持續(xù)供應(yīng)，化合物是單元劑量形式。合適的單元劑量形式包括片劑、膠囊劑和在小袋或安瓿中的粉末。這些單元劑飄式可含有O.l至3OOmg式00化^J，tt^2至100mg。進一步,單元齊i遣形式含有50至150mg式(I)化合物。式(I)化合物可口服給予。一天給予1至6次，通常一天l至4次。有效量為本領(lǐng)職術(shù)人員己知；也將于化合物的形式。本領(lǐng)職術(shù)人員常規(guī)可艦經(jīng)驗活性觀賦來確定化合物在生物鑒定中的生物活性以此來確定給予的劑量。本發(fā)明也涉及一種含有治療有效量的44-(2,4-二氯-5-甲氧基-苯氨基》6-甲氧基_7_[3_(4_甲基_呢眷1_基)_丙氧蜀_頓^3_甲睛，式d)化合物，或其藥學上可接受的鹽，和藥學上可接受的載體的藥物組合物。載體可為，例如稀釋劑、氣霧劑、局部載體、水性溶液、非水性溶固體載體。載體可為聚合物^膏。本發(fā)明中的載體包含藥學上可接受的任意標準載體，如磷,緩沖溶液、醋酸鹽緩沖溶液、7K、乳劑如油/7jC乳劑或甘油三酸酯乳劑，多種潤濕劑，片劑，包衣片齊訴卩膠囊劑。含有式O)化合物的組合物可與常規(guī)輔料制劑，如填充劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、矯味劑色添加劑。當經(jīng)口或局部纟好時，這些化合物可Mil不同的載體給予個體。特別地，這些載體含有輔料如淀粉、奶、糖、特定種類的粘土、凝膠、硬脂酸、滑石、植物脂肪或油、樹脂或乙二醇。特定的載據(jù)需要的給予方式擇，如，磷Kk緩沖溶液(PBS)可用于靜脈或系統(tǒng)會^，植物脂肪、奶油、藥膏、油膏或^可用于局部<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式(I)化合物可與適當?shù)南♂屪シ栏ピ龇璴」、乳化劑、用于治療或預防腫瘤的輔料和/或載體一起給予。這些組合物是液體或凍干的或別的方式干燥的劑型并且包含含有多種衝中成分的輔料(例如，Tris-HCl、醋麟、磷Kk)，PH和離子纟賊，添加齊咖白蛋白或白;鵬以防止表面吸收，清潔劑(例如，吐溫20，吐溫80，普郎尼克F68，膽麟)，增翻U(例如，甘油，聚乙烯丙三醇)，抗氧化劑(例如抗壞血酸、鈉)，防腐劑(例如，噻滎撒、苯甲醇、)，膨脹齊蜮張力1封喊U(例如，孚L糖，甘露醇)，聚合物共價組合如聚乙二醇、配位金屬離子、或化合物引入水MK或脂質(zhì)體的微粒制劑，微乳，微囊、單層或多層囊，紅細胞血影或球芽。這些組合物將會影響化合物或組合物的物理狀態(tài)、溶解度、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放率和體內(nèi)清楚率。組合物的選擇將決定與可治療或預防腫瘤的化合物的物理和化學性質(zhì)。式O)化合物可通過在一段時間可持續(xù)釋放化合物的IM來局部給予。控釋或緩釋組合物包括在親脂性不為的制劑(例如，月旨肪酸、蠟、油)。本發(fā)明進一步提供了一種f，式(l)化^t/作為活性物質(zhì)預防、治療和/或抑制癌癥的方法?；赹現(xiàn)和得到的結(jié)果，SKI-606可用于預防、治療或抑制癌癥mt抑制惡性細胞的增殖。SKI-606抑制Src催化的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化和細胞增殖。因此，給予人治療有效量的SKI-606可預防或抑制癌癥的形過抑制增殖，或可治療已得癌癥病AM;防止或抑庫鵬瘤的進一步增長和/或使腫瘤尺寸變小或根除。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"抑制"指的是延遲、阻止或停止惡性細胞增殖，推測M阻止或抑制Src催化的磷酸化作用。出于本發(fā)明的目的屬于"阻止"指的^iM:預防性治療轉(zhuǎn)移或阻止惡性或腫瘤性增長的持續(xù)，或阻止、抑制或終止疾病的進一步進行。出于本發(fā)明的目的屬于"治疔，指的是給予有需要的病人治療有效量的SKI-606以預防性地防止癌癥的發(fā)展，抑制或終止癌癥的進展，或惡性劍中瘤性生長，逆轉(zhuǎn)癌癥的發(fā)展，或惡性劍中瘤性生長，或根除癌癥，或惡性或腫瘤性生長。本發(fā)明進一步提供一種治療人類癌癥的方法，包括給予感染個體治療有效量的4-(2,4-二氯-5-甲氧基-苯氨基)-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基-哌眷l-基)-丙氧閨-喹脈3-甲腈，其藥學上可接受的鹽，或含有相同化合物的藥物組合物。提供給病人的齊U量4絵依據(jù)纟舒什么、舒的目的，纟舒的形式諸如此類而改變。"治療有效量"^^夠以治愈或改善癌癥癥狀的量。式O)化合物可單獨使用或與其它可用于治療癌癥的化合物合用。這些化合物包括但不限于甲磺酸伊馬替尼(GLEEVEC)、羥基脲、IFNA細胞毒害劑、化療試劑、NSAIDS，吉西他濱EGFR抑制劑、MEK抑制劑、法呢酰|移酶、吉西他濱、或avastin或渥曼青霉素或其藥學上可接受的鹽。本發(fā)明方法的一個優(yōu)選的實施例包括給予治療有效量的式(I)化合物與治療有效量的吉西他濱或avastin。更地式(1)化合物與吉西他濱一起給藥°本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選的實施例包括給予治療有效量的式(I)化合物與治療有效量的吉西他濱和avastin的聯(lián)^^合藥。本發(fā)明方法的另一個tt^的實施例包括聯(lián)合給予式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽與吉西他濱和avastin或其藥學上可接受的鹽以治療胰腺癌。一個實施本發(fā)明方法和/或用于本發(fā)明組合物的，化合物是4-(2,4-二氯-5-甲^^-苯氨基)-6-甲氧基-7-[3《4-甲基-哌(^1-基)-丙氧基]-[#^3-甲腈和其藥學上可接受的鹽。式0)化合物根據(jù)美國專利6002008的方法制備，這些方法在這里被引用作為參考。反應(yīng)在翻忡進行，該翻U適于4頓的試劑和原料以及進行的轉(zhuǎn)化作用。有機合成領(lǐng)域技術(shù)人員公知存在于分子中的多種功能必須與被提議的化學轉(zhuǎn)化作用相一致。當非特定時，合成步驟的順序、保護基團和去保護條件的選擇對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。此外，在一些例子中，起始原料的取代基與一定反應(yīng)^j牛不相容。與給定取代對目關(guān)的限就本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。適宜時反應(yīng)在惰性氣體斜牛下進行。式I化合物由7-(3-氯丙氧基)4-[(2,4-二氯-5-甲辯基)氨閨-6-甲^S-3-喹啉甲腈與N-甲基哌嗪在純的碘化鈉或在翻咖乙二醇二甲基醚的碘化鈉存在下反應(yīng)制得。這些化合物的制備己經(jīng)在文獻[Boschelli,D.H.,等人J.MedChem.,44,3965(2001)]被報道，在這里弓l用作為參考。附圖詳述圖l.頭和頸腫瘤系HN5對4-(2,4-二氯-5-甲氧基苯氨基>6-甲氧基-7-[3-(4-甲基-哌眷l-萄-丙氧基]-ftnt木-3-甲腈的反應(yīng)。缺乏血漿的HN5細胞用化合物處理4小時，之后加入EGF至50ng/ml，保持10併中。分析溶解產(chǎn)物的Stat3Y705、c-CblY731和Y774以及小窩蛋白Y14的磷酸化作用。結(jié)果證實小窩蛋白Y14、c-CblY731和Stat3Y705的磷酸化作用被4-(2,4-二氯-5-甲氧基-苯氨基)-6-甲氧基_7_[3_(4_甲基_呢膝1_基)_丙氧蜀4^1]^3-甲腈^>。,斤式(I)化合娜制耙向肽的Src催化的磷酸化作用。4-(2,4-二氯-5-甲氧基-苯氨基)-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基-哌嗪-1-基)~丙氧蜀-喹啉-3-甲腈抑制同類酶分析(FRET/Lance格式)中Src催化的磷酸化作用，具有IC50值為3.5nM。4-(2,4-二氯-5-甲氧基-苯氨萄-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基-哌^1-基》丙氧蜀-喹脈3-甲腈與多種酶的活性比M表1。Src和Abl激酶Lance分析重組人類Src酶得于PanVera(P3044)。相應(yīng)于Cdkl的6-20殘基的肽被用作src酶分析的底物(生物素-KVEKIGEGTYGVVYK-COOH)。野生型c-Abl和v-Abl分別購買于Panvera(P3049)和Calbiochem(#102555)。用于Abl激,析的肽得于Synpep(生物素-NH-KEEEAIYAAPFAKKK-COOH)。對Src和Abl激,析而言，同類熒光共振倉疆轉(zhuǎn)移激齢tH柳銪/APC檢觀賂式(LANCE,PerkinElmer)進行。Src酶(10ng)或Abl酶(2.5ngc-Abl,2.5ngv-Abl)與肽混合(對兩個底物月太最后濃度均為2pM)，50mMHepes(pH7.5),10mMMgCl2,20ug/mlBSA和0.001%Brij-35(Sigma)。加入化合物至最后DMSO濃度為1%，對Src在37°C培育70併巾，對Abl在27。C培育30併巾。反應(yīng)用EDTA終止，最后濃度為30mMEDTA/25mMHepes(pH7.5)/10pg/mlBSA?；旌衔锱cEu-標記抗體PT66(PerkinElmer,AD0068)和-APC(PerkinElmer,CR130-100)在50mMHepes(pH7.5)/20ug/mlBSA中結(jié)合，根據(jù)生產(chǎn)商的說明培育30射中。反應(yīng)用WallacVictor監(jiān)測，激發(fā)在340nm，釋放在665亂娜用LSW繊分析插件辦為Excel(Microsoft)分析。PKAPKC,S6激酶,CAMKHandp38激齢析分析用于PKA(Upstate#14-114),PKC(Upstate#14-232)和S6K(Upstate#14-333)的激,析。ELISA格式用于CAMK-n(Upstate#14-217和p38(重組蛋白在室內(nèi)生產(chǎn)和純化)SCINTIPLArE分析96孑LSACovScintiplate(#1450-551)板在酶分析實驗之前用PBS(0.1%TritonX100)沖洗4次。60Ml混合物*(見下表)20m1化合物C在10yoDMSO里)20倂中預培養(yǎng)20pi底物luM(見下表)下表所示4禍只用于96孔板9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>肽1323(LSP16Bio:Bio-RTPKLARQASIELPSM:LSP-1aa243-258.Ser252是磷酸化作用位點)肽1463(PKA底物Bio國GRTGRRNSI)肽1464(S6K底物Bio國RRRLSSLRA)底物加入時反應(yīng)開始。1-停止反應(yīng)根據(jù)表中所示的時間^ffl20nl的0.5MEDTA。在反應(yīng)開始以后持續(xù)培育板不S31—小時，如果是S6K則為805H中。2畫洗^(PBS+0.1。/。TritonX100)洗6次(25(U/孔)3-計數(shù)(WallacTrilux計數(shù)器)IIELISA接下來是ELISAs中4頓的激酶的分析^[牛。P38用顯性的活性變種MKK6歡活。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>1738肽(MK2T334:Bio國QSTKVPQTPLHTSRVL)1895肽(胃泌素1國17:Bio-KKEGPWLEEEEEAYGWMD)激^^析預分析以相同的形式進行見戰(zhàn)步驟1至3。檢測板是TMuncMaxiSorb，用以l:400比例在PBS中的Amersham山羊抗-GST抗體以100^d/孔涂層2小時。反應(yīng)板是Costar板，在0.1%凝膠時用阻止緩沖液阻止2小時，毎孔200m1。如下準備ERK/ADB混合物每毫升ADB10m1GST-ERK2將60MlERK/ADB混合物加入陰性對照孔(12行)準備MEK/ERK/ADB混合物(MEA)M31添力卩活性MEK1在分析板中加入60-/孔MEA加入20m1cmpd10%DMSO準備5xATP/ADB艦加入500uMATPtoADB每孔20nlATP/ADB以開始反應(yīng)。30C培育1小時。每孔中加入200.5MEDTA停止反應(yīng)。4-含磷肽檢測抗體為了檢測磷酸化肽，親和力純化多克隆磷-特異抗體60521和64273分別代替1323和17384頓。為了分別檢測磷酸化1323和1738，加入100Ml終止性緩沖液，補充純化的60521(0.46mg/ml)l。/。BSAl:20000和抗兔子-Eu(PE弁AD0105)1:4000或純化的642731:4000和抗畫兔子隱Euat1:2000。為了檢測磷酸化的1895，加入100Ml終止性緩沖液，補充P/。BSA具有抗國含磷酪氨酸PT100(細胞信號#9411)1:1000和抗-小鼠-Eu(PE弁AD0124)。培育1小時RT(混合器)洗6x250m1PBS0.1%Tween20加入100nl提高溶液(WallacCa說1244-105)培育10分鐘RT(混合器)用Victorn讀(HTS銪草案在我們的閱讀機)緩沖液激酶緩沖液10X200mMHepespH7.5,100mMMgCl2ADBK:20mMMOPS7.2,25mMP-甘油磷酸，5mMEGT入1mM原磯酸鈉，20mMMgCl2,lmMDTT終止性緩沖液10mMMOPS7.5,150mMNaCl,0.05%Tween20,0.1%Gelatin,0.02%NaN3RafMEK激酶ELISA試抓sf9昆蟲細胞溶解產(chǎn)物含有全長6his-標簽的重組人類c-Raf。(特異活性~200U/ml)。人類一隨性Mek-l-GST和人類GST-MAP激酶(重組蛋白產(chǎn)于E.coli)。Rafl激酶階式分析步驟Raf-1(c-Raf)用于磷酸化和激活非活性GST-MEK1，然后可磷酸化和激活非活性p42GST誦MAPK接下鄉(xiāng)過購于Sigma(cat.#77439219041)的特異^l抗體來測量TEY序列(aa's202-204)的磷酸化作用。激酶分析草案原料溶液Raf分析1.分析稀釋緩沖液(ADB):20mMMOPS,pH7.2,25mM卩-磷靴油,5mMEGTA1mM原砜酸鈉,1mM二硫蘇糖醇2.辛勞ATP混合物500mM冷ATP和75mM氯化鎂在ADB中3.活性激酶人類活性c-Raf:在每個分析0.4U點4OT4.非活性GST-MEK1:在齡分析0.1嗎點^ffi5.非活性GST-p42MAP激酶在每個分析1%g點4頓ELISA1TBST-Tris(50載pH7.5),NaCl(150mM),Tween-20(0.05%)2.Superblock(Pierce)3.抗-GSTAb(Pharmacia)4.抗國PhosphoMAPK(Sigma)5.抗-小鼠Ab/銪綴合物(Wallac)分析步驟第一步GST-MEK和GST-MAPK的c-Raf，性活化1.^^分析物中加入20mlADB(例組96孑L板的每孔)2.在ADB中加入10ml0.5mM冷ATP和75mM氯化鎂3.加入2mlc-Raf(0.4U/分析物)，與1.6ml非活性MEKl(0.4mg/分豐j^l講軛4.加入4ml非活性GST-p42MAP激酶(l.Omg/分析物)5.在震動培育器中3(TC培育60分鐘。6.轉(zhuǎn)移混合物至抗-GSTAb涂層的96孔板(GST涂層板，用HerceSupeiblock終止)7.在振動的培育器中在30。C培育60併中8.用TBST洗滌3次，加入抗-磷MAPK(Sigma)(1:3000)9.在振動的培育器中在30。C培育60併中10.用TBST洗滌3次，加入抗-小鼠Ab/銪綴合物(Wallac)(1:500)1l.在振動的培育器中在30°C培育60併中12.用TBST洗滌3次，在WallacVictor模式板閱讀器下讀板。KDR激柳斤原料1)NuncMaxiSorb96FELISAVWR62409-0242)肽底物聚(Glu4-Tyr),Sigma(P-0275):在水中準備5mg/ml原料3)TBS:BupHTBSPierce(#28376);25mMTrispH7.2,150mMNaCl最后4)TBST:沖洗緩沖液=TBS+0.05%Tween-20:對于500ml:TBS(Jd^)+2,5ml10%Tween(制于TBS)5)化合物制備于DMSO，存儲化合物在-80C6)5XKDR激酶緩沖液5XIX50ml的5X20mMHEPESpH7.44mMHEPES1ml1MHEPES5mMMnC12lmMMnC121.25ml200mMMnC12100uMNa3V0420uMNa3V040.1ml50mMNa3V047)酶稀釋液0.P/。BSA在4mMHEPES中,pH7.48)2.5XATP[10uM最后]/MgC12HEPES溶液2.5Xcone.rxn中的DC10ml的2.5X25uMAIP10uMATP0.25milmMATP25mMMgC1210mMMgC121ml250mMMgC1210mMHEPES4mMHEPES0.1ml1MHEPES4.45ml7K10)ATP(FW551):AmershamPharmacia#27-2056-01(25畫l):畫mM溶液11)250mMMgC12:SigmaM-8266,^7_K,FW95.21;1.19g/50ml水8.65ml水9)HEPES2.5X/MgC12溶液(沒有ATP):2.5Xconc.cm中的IX25mMMgC1210mMMgC1210mMHEPES4mMHEPES0.5ml250mMMgC120.05ml1MHEPES5ml2.5X12)分析緩沖液PerkinElmer1244-10613)Eu-抗-PY(PT66):PerkinElmerAD0040(50ug,Sigma克隆PT66,抗-^酪氨酸抗體)14)增加溶液PerkinElmer1244-105方法1.往NuncMaxiSorb板加入TBS的25ug/ml的100^1聚(Glu4-Tyr)肽.培育1-4小時在RT.[或者改變最后聚(Ghi4-Tyr)肽濃皿~1-50ug/ml;或使用聚(Ghi6-Ala3-Tyr)肽]2.沖洗含肽的孔3次，4OT200nlTBS3.往*孔中加入29m1kdr激酶混合物[=kdr-ic+5Xkdr沖液+水(混合1:1:0.9)]結(jié)合10純化的KDR-IC制齊i丄,的(ie,1:5to1:20根據(jù)制劑而定)在0.1%BSA/4mMHEPES+10m15XKDR>^[^沖液+9^1水PER反應(yīng)孔。如果4細較多或較少的化合物容積貝湘應(yīng)地調(diào)整水的容積。這些添加物可用Matrix多量吸管操作。4.往旨孔中加入lm1化合物(50xdmso溶液鑒于想要的最后的化合物濃衝(TV=30pi在這個點)5.在RT培育約15射中以使化合物與酶結(jié)合6.往樣品孔中加入20Ml2.5XATP/MgC12/HEPES溶液，對KDR而言，反應(yīng)的線性范圍是l-100nM，所以使用10uM[或者ATP最后的濃度可改變;在一些反應(yīng)中fOT沒有ATP的2.5XMgC12/HEPES，以確定^酶制劑可行的低端范圍]。7.室溫培育40併中。[或者分析反應(yīng)30至60併中；或37C反應(yīng)、溫度，雖然這些與現(xiàn)在的KDR批次差異最小]8.用200m1TBST沖洗板3次9.加入在分析緩沖液中的1:2000的75nlEu-PY10.培育45-60mii^RT11.用200m1tbst沖洗板3次12.加入100m1的增加^液(與rt平衡)13.在VICTOR-TR-熒光板閱讀器下讀板天然銪(熒光)讀數(shù)轉(zhuǎn)換為百分比抑制和/或基于未，(不含化合物)對照孔的^fflExcel沖繊的IC50值表i4-(2,4-二氯-5-甲氧基-苯氨基)-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基哌眷1-萄-丙氧^j_pgfr3_甲臘抗各種醇的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>ICsf達到50%抑制的濃度細胞增殖式(I)化合物式一種Src激酶家族激獻口Abl激酶的選擇性抑制抓基于細胞的分析實驗液用于檢測4-(2,4-二氯-5-甲氧基-苯氨基)-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基-哌審l-基)"丙氧基]-喹脈3-甲腈的選擇性。大鼠纖維原細胞過，達一種致瘤形式的Src，其中人類c-Src的催化域被插入v-Src催化域以產(chǎn)生v-Src/人類c-Src融合蛋白。也可^(OTFynB,Lck^L，和Hck^其它Src家族成員進行相似的取代。此外，表繊瘤形式的v-Abl，對夷島素生長因子-I受體，纖維原細胞生長因子受體，血小板生長因子受體和Her2的相同細胞^M也被構(gòu)建。這些細胞中的化合物活性用固定-獨立生長分析來確定，基于通過鋭纖維原細胞的致瘤蛋白得到固定4te。在這些斜牛下的生長依賴于激酶的活性，激酶活性的抑庫噲阻止細胞的生長，以此反應(yīng)出細胞耙向蛋白磷酸化作用的抑制。表2顯示4-(2,4-二氯-5-甲氧基-苯氨基)-6-甲氧基-7-[3-(4-甲晷哌ni■l-基)丙氧基]-喹脈3-甲腈在這些^(牛下得到的增歹直。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>ICs(r50^抑制時的濃度頭和頸腫瘤系式(I)化合物;^l^iiSrc的頭和頸細胞線中腫瘤細胞增殖的潛在的抑制劑。一個具有代表性的增殖概圖是4-(2,4-二氯-5-甲氧基-苯氨基>6-甲氧基-7-[3_(4-甲基-哌膝1-基)-丙^^]-11§1^3-甲腈與朋5系，舒圖l，與下游耙蛋白磷酸化作用的抑制證據(jù)一起。生物測試禾旨的說明標7隹生長^j牛對于描述于表3中的實驗，在用于特定細胞線的標準生長培養(yǎng)基中，在第O天在96liffl胞培養(yǎng)盤的每一孔中放入1000個細胞。第1天加入化合物。相關(guān)的細胞數(shù)在第4天測定。細胞滴度測定-Glo方法細胞滴度測定-Glo發(fā)光細胞生存能力測試(Promega#G7573)，其中細胞用細胞濃度測定-Glo試劑溶解，短暫激動，在4吏用用于發(fā)光讀數(shù)的W^allac盤讀數(shù)器分析之前允許在室黼爐30她MTS分析一些分析借助于細胞濃度測定96分析來監(jiān)測(Promega#G3580)。這項分析，在第4天，檢測試劑被加入到96孑L板，490nN的吸光率被測量到。SRB分析SulforhodamineB(SRB;)分析用于一定黑素瘤系。在這項^M斤中，生長基中的血清濃度是5%和培養(yǎng)基體積是0.21111。在第4天，0.05ml50X的三氯乙酸加入到培養(yǎng)基中，板允許置于室溫l小時。培養(yǎng)基被輕輕倒出，板用水沖洗3次。洗后的板千燥，然后加入0.08ml的SRB試劑(購于Sigma;0.4%SRB在1%醋酸中)。室溫中IO射中后，板用1%的醋酸沖瓶到溶液中沒有自由的紅色殘留。結(jié)合的SRB試劑用0.15mll0mMTris(不加酸)溶解。在混合器中激活5併中后，吸收率為540nM。體內(nèi)研究所有的動物研究都根據(jù)被認可的社會公共機構(gòu)動物照顧和使用委員會草案進行。腫瘤細胞敗懸浮至50百萬細膨ml，0.2ml細脫懸浮液被皮下注射至lj一只6-7周大的雌裸鼠的腰窩內(nèi)(CharlesRiver，Wilmington^MA)。一周后腫瘤大于200mm3的小鼠通aJH莫內(nèi)注射被纟好制劑或化^t/，劑量為在0.2ml制劑中含有0.5%的甲基纖維素和0.4%的聚山梨酸酯80(Tween80)。表3總結(jié)了對T-細胞白血病、前列腺癌、月繊癌、黑素瘤和頭頸腫瘤系用4-(2,4-二氯-5-甲氧基-苯氨基>6-甲氧基-7-[3-(4-甲基-哌窿1-基)-丙氧基]-喹啉-3-甲腈處理得到的增殖實驗結(jié)果。也顯示了給予的4-(2,4-二氯-5-甲氧基-苯氨基>6-甲氧基-7-[3>(4-甲基哌曝1-基)~丙氧基]-[1!#-3-甲腈在裸小鼠中艦A375黑素瘤皮下月中瘤異種抑制物的生長。表3_<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>權(quán)利要求1.一種預防、治療或抑制癌癥的方法，所述方法包括給予治療有效量的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽id="icf0001"file="S2006800223605C00011.gif"wi="111"he="40"top="61"left="39"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2.如^l利要求1所述的方法，其中預防、治療或抑制的癌癥是月M癌。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中預防、治療或抑制的癌癥是淋巴癌。4.如禾又利要求1所述的方法，其中預防、治療或抑制的癌癥是前列腺癌。5.如才又利要求1所述的方法，其中預防、治療或抑制的癌癥是頭頸癌。6.如權(quán)禾腰求1所述的方法，其中預防、治療或抑制的癌癥是黑素瘤。7.—種藥物組合物，所^^且合物含有治療有效量的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中化激斜刺頓或與其它一種或多種用于治療癌癥的化合物聯(lián)合施用。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中其它化合物選自甲磺酸伊馬替尼、羥基脲、IFN4、細胞毒害劑、genfitanib、吉西他濱、avastin和渥曼青霉素，或其藥學上可接受的鹽。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中其它化合物是吉西他濱。11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中其它化合物是吉西他濱和avastin。12.—種治療胰腺癌的方法，所述方法包括聯(lián)合給予治療有效量的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽與吉西他濱或其藥學上可接受的鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>13.如權(quán)利要求12所述的方法，所述方法進一步包括纟^avastin或其藥學上可接受的鹽。全文摘要本發(fā)明涉及一種使用式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽來預防、治療和/或抑制癌癥的方法。本發(fā)明還涉及含有式(I)化合物的藥物組合物。文檔編號A61K31/496GK101252931SQ200680022360公開日2008年8月27日申請日期2006年6月13日優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日發(fā)明者F·C·博謝利申請人:惠氏公司