專利名稱：：Rna最佳注射配方的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在制備用于增加寄助物內(nèi)RNA轉(zhuǎn)移到寄助物和/或RNA翻譯的RNA注射液時，RNA和包含鈉鹽、鈣鹽、可選的鉀鹽和可選的乳酸鹽的水性注射緩沖液的使用。
背景技術(shù)：
：在許多疾病的治療和預(yù)防中，例如基因治療和遺傳接種等分子醫(yī)學(xué)方法，起著重要的作用。這些方法的基礎(chǔ)是將核酸引入到病人的細(xì)胞或組織中，然后處理引入的核酸所編碼的信息，也就是說，翻譯成所需的多肽或蛋白質(zhì)。DNA和RNA都可考慮作為被引入的核酸。在20世紀(jì)90年代早期，注射入裸露的質(zhì)粒DNA的遺傳接種方法首先在大鼠上得到證實(shí)。然而，臨床I/II期研究顯示，在人類身上，此技術(shù)不能達(dá)到在對老鼠的研究中所引起的期望、許多基于DNA的遺傳接種和引入DNA到細(xì)胞中的方法(包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、聚戊二烯轉(zhuǎn)染法、原生質(zhì)體融合法、電穿孔法、顯微注射法、脂質(zhì)體法等，使用DNA病毒作為DNA載體)已經(jīng)被研究出來。15年前，Wolff等研究顯示了向大鼠中以質(zhì)粒DNA(pDNA)或mRNA的形式注入裸露的遺傳信息可引起蛋白質(zhì)表達(dá)2。對這些結(jié)果的跟蹤研究顯示裸露的pDNA可用于接種3—5。然而，直到20世紀(jì)90年代末期，用mRNA來接種才略為引起人們的注意，當(dāng)時被證實(shí)將mRNA轉(zhuǎn)移到樹突狀細(xì)胞(dendriticcells)可觸發(fā)免疫反應(yīng)6。然而，直接注射裸露的mRNA來接種仍然不被重視，并且僅僅在三個不同的研究小組的四篇論文中給予討論7-1Q。這種情況的一個重要原因是mRNA的由于其被核酶迅速降解所導(dǎo)致的不穩(wěn)定性以及與此有關(guān)的mRNA作為體內(nèi)的遺傳工具的有限效果。然而，同時，現(xiàn)有技術(shù)中己經(jīng)有許多方、法用來穩(wěn)、定mRNA，例如，EP曙A-1083232、WO99/14346、US5580859禾口US6214804。RNA作為用于遺傳載體的核酸具有比DNA更多的優(yōu)勢，包括i)引入到細(xì)胞中的RNA并不結(jié)合到基因組中(而DNA在一定程度上結(jié)合到基因組中，并且因此插入到寄主細(xì)胞(hostcell)的基因組的完整基因中，因此此基因可能變異并且可導(dǎo)致遺傳信息的全部丟失或誤傳)。ii)RNA的有效轉(zhuǎn)錄不需要例如啟動子(promoters)等的病毒序列(而引入到細(xì)胞中的DNA的表達(dá)需要強(qiáng)的啟動子(例如，病毒CMV啟動子))。啟動子結(jié)合到寄主細(xì)胞的基因組中可導(dǎo)致基因表達(dá)調(diào)控中不希望的改變。iii)引入的RNA的降解發(fā)生在有限的時間內(nèi)(幾個小時)u'12，因此有可能實(shí)現(xiàn)瞬時基因表達(dá)，其在需要的治療期過后可停止(而這在引入到基因組中的DNA的情況下是不可能的)。iv)RNA不會在病人身上引起致病的抗-RNA抗體的誘導(dǎo)(而抗-DNA抗體的誘導(dǎo)據(jù)知可引起不希望的免疫反應(yīng))。v)RNA廣泛可用——任何所需的感興趣的蛋白的RNA可在短時間內(nèi)制備出來以用于接種，甚至是基于個體病人的?？傊?，仍然應(yīng)注意到，mRNA代表了所有有機(jī)體中的編碼遺傳信息的過渡副本，作為合成蛋白質(zhì)的模型，并且，不像DNA，其代表了制備合適的用于體內(nèi)外源性遺傳信息轉(zhuǎn)移的遺傳媒介(vector)的所有必要先決條件。所描述的將核酸轉(zhuǎn)移到寄助物(尤其在哺乳動物中)的獨(dú)特的合適程序是注射。為此類注射用的DNA—般在水、NaCl或PBS注射緩沖液中稀釋，而RNA—般只在注射緩沖液中稀釋。作為RNA注射緩沖液使用的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液有例如磷酸鹽緩沖液，尤其是PBS和HEPES緩沖鹽溶液(HBS)。在轉(zhuǎn)移mRNA的情況下，這樣的RNA注射液最好在注射前進(jìn)行短時間的加熱來去除mRNA的二級結(jié)構(gòu)。使用這樣的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液用于RNA注射液的的缺點(diǎn)是皮下RNA的轉(zhuǎn)移是很低效率的。另一個缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移的RNA的翻譯率非常低。另一個缺點(diǎn)是，在這樣的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中，RNA常常形成二級結(jié)構(gòu)(例如，所謂的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpinstructure)),其可大大降低RNA被吸收到細(xì)胞溶質(zhì)中的效率。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的是提供一種系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)，一方面皮下RNA到寄助物中的轉(zhuǎn)移得到改善，另一方面轉(zhuǎn)移的RNA的翻譯率得到提高。此目標(biāo)在權(quán)利要求中加以特征化的本發(fā)明的各實(shí)施例中得以實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的一個實(shí)施例提供在制備用于增加RNA轉(zhuǎn)移到寄助物和/或寄助物內(nèi)RNA翻譯的RNA注射液時RNA和水性注射緩沖液的用途，所述水性注射緩沖液包含鈉鹽，優(yōu)選為至少50mM的鈉鹽；鈣鹽，優(yōu)選為至少0.01mM的牽丐鹽；和可選的鉀鹽，優(yōu)選為至少3mM的鉀鹽。本發(fā)明的另一方面還提供一種如此制備的注射液。所述注射液是由注射緩沖液和溶解在注射緩沖液中的RNA得到的。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施例，包含在注射緩沖液中的鈉鹽、鈣鹽和可選的鉀鹽是以鹵化物的形式存在，例如，氯化物、碘化物或溴化物，或以它們的氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽或硫酸鹽的形式存在。此處提到的例子是對于鈉鹽有NaCl，Nal,NaBr,Na2C03,NaHC03,Na2S04;對于可選的鉀鹽有KC1，KI，KBr,K2C03，KHC03，K2S04;對于轉(zhuǎn)鹽有CaCl2,Cal2,CaBr2,CaC03，CaS04,Ca(OH)2。上面所提到的陽離子的有機(jī)陰離子也可包含在注射緩沖液中。根據(jù)本發(fā)明RNA和注射緩沖液的的用途的特別優(yōu)選實(shí)施例，根據(jù)本發(fā)明的注射緩沖液包含氯化鈉(NaCl),氯化鈣(CaCl》和可選的氯化鉀(KC1)，除了氯化物之外還可以出現(xiàn)其他的陰離子。這些鹽在注射緩沖液中的典型濃度是至少50mM的氯化鈉(NaCl),至少3mM的氯化鉀(KC1)和至少O.OlmM的氯化轉(zhuǎn)(CaCl2)。根據(jù)本發(fā)明的注射緩沖液可以是高滲的或等滲的或低滲的注射緩沖液。結(jié)合本發(fā)明，注射緩沖液是高滲的或等滲的或低滲的，與不同的參考媒質(zhì)有關(guān)，就是說，本發(fā)明的注射緩沖液相比于各個參考媒質(zhì)具有較高的、相等的或較低的鹽含量，上述的鹽的優(yōu)選濃度是不會由于滲透作用或其它濃度效果對細(xì)胞造成損害的那些濃度。此處的參考媒質(zhì)是，例如，在"體內(nèi)"處理過程中產(chǎn)生的液體，例如，血液、淋巴液、細(xì)胞溶質(zhì)液或其它在體內(nèi)出現(xiàn)的液體，或現(xiàn)有的在"體外"("眾V7'&0")處理過程中使用的液體或緩沖液。這些液體和緩沖液為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知悉。注射緩沖液可包含有另外的成分，例如，糖類(單糖、二糖、三糖或多糖)，尤其是葡萄糖或甘露醇。然而，在優(yōu)選實(shí)施例中，用于本發(fā)明的用途所采用的注射緩沖液中不會出現(xiàn)糖類。本發(fā)明的緩沖液中最好也不包含任何不帶電荷的成分，例如，糖類。本發(fā)明的緩沖液一般僅包含金屬陽離子，尤其是來自堿金屬或堿土金屬的陽離子，以及陰離子，尤其是上面所述的陰離子。本發(fā)明的注射緩沖液的優(yōu)選pH值是1到8.5，優(yōu)選的是3到5，更優(yōu)選的是5.5到7.5，尤其最佳的是5.5到6.5。該注射緩沖液還可選地包含有緩沖系統(tǒng)，將注射緩沖液固定到緩沖后的pH值。這樣的系統(tǒng)可以是，例如，磷酸緩沖系統(tǒng)、HEPES或Na2HP04/NaH2P04。然而，很特別的優(yōu)選是根據(jù)本發(fā)明使用的注射緩沖液不含有上面所述的任何緩沖系統(tǒng)或者根本就沒有緩沖系統(tǒng)。如前所述，根據(jù)本發(fā)明使用的注射緩沖液包含鈉鹽、鈣鹽和可選的鉀鹽，在該注射緩沖液中鉀和納一般以一價陽離子(Na+,K+)的形式存在，鈣以二價陽離子(Ca2+)的形式存在。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，除了根據(jù)本發(fā)明的包含在或可選地包含在注射緩沖液中的一價和二價陽離子之外還可以有二價陽離子，尤其是堿土金屬族的陽離子，例如，鎂(Mg2+)，或也包括鐵(Fe2+);和一價陽離子，尤其是堿金屬離子，例如，鋰(Li+)。這些一價陽離子優(yōu)選以它們的鹽的形式存在，例如，以鹵鹽的形式，例如，氯化物、碘化物或溴化物，或以它們的氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽或硫化物的形式存在。例如，在此可列舉的例子有對于鋰鹽有LiCl,Lil,LiBr，Li2C03,LiHC03,Li2S04;對于鎂鹽有MgCl2,Mgl2，MgBr2,MgC03，MgS04和Mg(OH)2;對于鐵鹽有FeCl2,FeBr2:Fel2,FeF2,Fe203,FeC03,FeS04,Fe(OH)2。也包括上述的二價和/或一價陽離子的結(jié)合。因此，根據(jù)本發(fā)明的注射緩沖液可僅包含二價陽離子，或僅有一價陽離子，或同時包含二價和一價陽離子。根據(jù)本發(fā)明的注射緩沖液還可僅包括一種類型的二價離子或一價離子，尤其優(yōu)選的是，例如，僅包含C^+或鈣鹽，例如，CaCl2。根據(jù)本發(fā)明，在制備注射液時，在注射液中使用堿金屬或堿土金屬的不同于Ca2，n1^1+的二價或一價陽離子或不同的二價陽離子和陰離子來全部替代或部分替代C,或Na、寸，在注射緩沖液中，也可以考慮上面所提到的Ca2+(作為二價離子)和Na^(作為一價離子)的摩爾濃度(也就是說，一般濃度是至少50mM的Na+,至少0.01mM的Ca2+，可選的至少3mM的K+)。雖然根據(jù)本發(fā)明，如上提及的在注射緩沖液中的C^+和N^+可完全用不同的二價或一價陽離子來替代，例如，被不同的二價陽離子的組合(替代Ca2+)和/或不同的一價陽離子的組合(替代Na")來替代(特別地，用堿金屬的不同一價陽離子的組合或堿土金屬的不同二價陽離子的組合)，優(yōu)選的是，部分地替代C,或N^+)，也就是說，在具有C,或Na1勺注射緩沖液中加入各自總摩爾濃度的至少20%、較好的是至少40%、更好的是至少60%、最好是至少80%的一價或二價陽離子。然而，根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的注射緩沖液只包含C^+作為二價陽離子和N^+作為一價陽離子，也就是說，C,占了二價陽離子的總摩爾濃度的100%，Na'+占了一價陽離子的總摩爾濃度的100%。注射緩沖液的制備最好在室溫(25°C)和大氣壓下進(jìn)行。制備可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的任何想要的處理過程來執(zhí)行。優(yōu)選地，其內(nèi)所包含的離子或鹽在水溶液中稀釋，所依據(jù)的濃度比是根據(jù)特定條件(RNA注射液將要注射到的寄助物，尤其是哺乳動物，寄助物的健康狀態(tài)、年齡等，溶解度和各成分的干擾、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等)來選擇的。包含在水性注射緩沖液中的鈉、鈣和氯離子和可選的鉀離子和可選的乳酸鹽(參見下面的實(shí)施例)各成分的濃度特別依賴于它們在水中的溶解度、各成分彼此之間的干擾以及在制備該注射液或制備RNA注射液時的反應(yīng)溫度和反應(yīng)壓力。根據(jù)本發(fā)明使用的注射緩沖液是基于水性溶液的，也就是，包含水和根據(jù)本發(fā)明的注射溶液中使用的鹽、和可選的乳酸鹽。在這樣的水性溶液中，上述鹽的一價或二價陽離子可以可選地是微溶的或甚至不溶的。鹽的溶解度可用溶度積計(jì)算得到。精確地確定溶度和溶度積的方法為所述領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。此水性溶液可包含高至30mol。/。的鹽，較好是25mo1。/。，再好是20mo1。/。，更好是15molM，再更好是10mo1。/。，再更好是5mol%，最好是2mol。/。的不溶或微溶的鹽。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，溶度積小于1()4的鹽認(rèn)為是微溶的。溶度積大于10—4的鹽認(rèn)為是可溶的。鹽或離子或離子化合物在水中的溶解性是依賴于它的晶格能和水合能，考慮到發(fā)生的熵效應(yīng)的話。術(shù)語"溶度積"也可更精確地指當(dāng)鹽或離子或離子化合物溶解在水里時建立的平衡。溶度積一般定義為在電解液飽和溶液中離子的濃度之積。例如，堿金屬(例如，Na+,K+)在水中的溶解度比堿土金屬(例如，Ca2+)的更大，就是說，堿金屬有更大的溶度積。也就是說，根據(jù)本發(fā)明包含在注射緩沖液的水性溶液中的鉀鹽和鈉鹽比鈣鹽更容易溶解。因此，在確定這些離子的濃度時，需要考慮鉀鹽、鈉鹽和鈣鹽之間的干擾等。根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用的一個優(yōu)選實(shí)施例，注射緩沖液中包含50mM到800mM、較優(yōu)為60mM到500mM、更優(yōu)為70mM到250mM、尤其較優(yōu)為60mM到110mM的氯化鈉(NaCl)，O.OlmM到100mM、較優(yōu)為0.5mM到80mM、更優(yōu)為1.5mM到40mM的氯化鈣(CaCl2)，以及可選地3mM到500mM、優(yōu)選為4mM到300mM、更優(yōu)地為5mMto200mM的氯化鉀(KC1)。除了上述的無機(jī)陰離子例如鹵素離子、硫酸根或碳酸根外，也可包括有機(jī)陰離子。這些陰離子可由琥珀酸鹽、乳糖醛酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、maleonate等形成，也可是這些物質(zhì)的組合。根據(jù)本發(fā)明使用的注射緩沖液最好還包括乳酸鹽，尤其最好在含有有機(jī)陰離子的注射緩沖液中，只包含有乳酸鹽作為有機(jī)陰離子。本發(fā)明的范圍內(nèi)的乳酸鹽可以是任何形式的乳酸鹽，例如L-乳酸鹽和D-乳酸鹽。結(jié)合本發(fā)明，乳酸鈉和/或乳酸鈣一般是以乳酸鹽的形式存在，尤其是在注射緩沖液中僅有Na+作為一價陽離子和C^+作為二價陽離子時。本發(fā)明應(yīng)用的一種優(yōu)選形式中，本發(fā)明的注射緩沖液優(yōu)選包含15mM到500mM的乳酸鹽，其中以包含15mM到200mM的乳酸鹽為較佳，最好包含15mM到100mM的乳酸鹽。本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)，具有上述成分且可選地含有或不含有乳酸鹽(下文中，"RL注射緩沖液"指不含乳酸鹽的緩沖液，而"含乳酸的RL注射緩沖液"指含乳酸鹽的緩沖液)的注射緩沖液用于RNA注射液(也就是，包含RNA且適于用來注射RNA的注射液)時，相對于現(xiàn)有技術(shù)中使用的注射緩沖液，明顯地增加了RNA到/在寄助物(哺乳類動物)細(xì)胞/組織中的轉(zhuǎn)移和翻譯。含有上述氯化鈉((NaCl)、氯化鈣(CaCl2)、乳酸鹽(特別是乳酸鈉)和可選的氯化鉀(KC1)成分的溶液又稱為"林格氏液"(Ringer'ssolution)或"林格氏乳酸鹽"(Ringer'slactate)。林格氏乳酸鹽是全結(jié)晶電解質(zhì)溶液，用于容積替代和作為載體溶液，例如，用于兼容藥劑。例如，在體液和電解質(zhì)丟失(由于嘔吐、腹瀉、腸梗阻或燒傷)的情況下，林格氏乳酸鹽可用作初級容積替代劑，尤其用于嬰兒和兒童，并且也用來維持外周和/或中心靜脈通路的開放。然而，本發(fā)明的用林格氏乳酸鹽來作為RNA注射液中的注射緩沖液，在現(xiàn)有技術(shù)中未曾有記載。本發(fā)明范圍內(nèi)的RNA是指任何形式的RNA，例如，mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、單鏈或雙鏈RNA、異源雙鏈核酸分子RNA等。所使用的RNA可用來編碼任何感興趣的蛋白質(zhì)。本發(fā)明使用的RNA優(yōu)選是裸露RNA，其中以mRNA較佳，最好是裸露mRNA。本發(fā)明所述的裸露RNA，特別是裸露mRNA，應(yīng)被理解為不復(fù)雜的RNA，例如，帶有聚陽離子分子的RNA。裸露RNA可以單鏈形式存在，但也可以雙鏈形式存在，也就是說，以二級結(jié)構(gòu)存在，例如，所謂的"發(fā)夾結(jié)構(gòu)"。這樣的雙鏈形式尤其在裸露RNA中發(fā)生，特別是當(dāng)分子中出現(xiàn)互補(bǔ)核苷酸時，在裸露mRNA中發(fā)生。然而，本發(fā)明所述的RNA，尤其是mRNA，也可以復(fù)雜形式存在。本發(fā)明中，由于RNA尤其是mRNA的復(fù)雜化/濃縮，通過將RNA與(多個)陽離子聚合物、多肽或蛋白質(zhì)聯(lián)合或綁定，RNA到有機(jī)體的需要治療的細(xì)胞中或組織中有效轉(zhuǎn)移將得到改善。這樣的RNA(mRNA)最好與至少一種陽離子或聚陽離子劑進(jìn)行復(fù)合或濃縮。所述陽離子或據(jù)聚陽離子劑優(yōu)選地為從以下一組中選出的試劑魚精蛋白(protamine)、聚左旋賴氨酸(poly-L-lysine)、聚左旋精氨酸(poly-L-arginine)、核仁素(nucleolin)、精胺(spermine)、和組蛋白(histone)、或組蛋白或魚精蛋白的衍生物。較佳的選擇是采用魚精蛋白來作為聚陽離子、核酸綁定的蛋白。穩(wěn)定RNA的程序在EP-A-1083232中有描述，其相關(guān)的揭示完整地結(jié)合在本發(fā)明中。本發(fā)明的RNA可進(jìn)一步修飾。這些改進(jìn)是為了增加RNA的穩(wěn)定性。優(yōu)選地，RNA有一種或多種(自然發(fā)生的或非自然發(fā)生的)修飾，尤其是化學(xué)修飾，例如，利于增加RNA在有機(jī)體中的半衰期，使mRNA比沒有經(jīng)過修飾的mRNA在細(xì)胞溶質(zhì)中的翻譯效率更高。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)過修飾的mRNA與沒有經(jīng)過修飾的mRNA在細(xì)胞溶質(zhì)中的翻譯效率相比，可提高至少10%，較佳的是提高至少20%，更佳的是提高至少40。Z，再更佳的可提高至少50%，再更佳的可提高至少60%，再更佳的可提高至少75%，再更佳的可提高至少85%，最高可提高至少100%。例如，經(jīng)修飾后的mRNA的編碼區(qū)的G/C含量可比相應(yīng)的野生型的mRNA的編碼區(qū)的G/C含量更多，優(yōu)選地，經(jīng)修飾后的mRNA的編碼氨基酸序列相對于野生型的mRNA的編碼氨基酸序列仍未改變。這一修飾基于如下事實(shí)mRNA的序列區(qū)對于mRNA的有效翻譯來說是重要的。各種核苷的成分和序列是非常重要的。特別是，具有較高的G(鳥苷)/C(胞核嘧啶)含量的序列比具有較高的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的序列更穩(wěn)定。因此，在保持翻譯的氨基酸序列不變的同時，改變密碼子，使之相對于野生型的mRNA有更多的G/C核苷，是有利的。由于幾個密碼子編碼同一氨基酸(所謂的"遺傳密碼的兼并")的事實(shí)，確定對穩(wěn)定性有利的密碼子是可能的，尤其具有最大G/C含量時。結(jié)果，注射緩沖液中的RNA的G/C含量優(yōu)選根據(jù)G/C含量的最大含量而提高至少30%，較佳是提高至少50%，更佳是提高至少70%，最好是提高至少80%(即，為了最大化G/C含量，在編碼區(qū)修飾了所有的可能的三聯(lián)密碼而不改變編碼的氨基酸序列之后的G/C含量)，并且，最好就是最大G/C含量，該最大G/C含量由G/C含量得到最大化而不未改變編碼的氨基酸序列的序列給出。根據(jù)將由修飾后的mRNA編碼的氨基酸序列，相比較于野生型序列，有各種修飾mRNA的可能。對于由僅含有G或C核苷的密碼子編碼氨基酸的情況，不需要修飾密碼子。這樣的例子是Pro(脯氨酸)(CCC或CCG)、Arg(精氨酸)(CGC或CGG)、Ala(丙氨酸)(GCC或GCG)和Gly(甘氨酸)(GGC或GGG)的密碼子。另一方面，包含A和/或U核苷的密碼子可用編碼同樣的氨基酸但不含A和/或U的密碼子來代替。下面是一些例子編碼Pro的密碼子可從CCU或CCA變成CCC或CCG;編碼Arg的密碼子可從CGU或CGA或AGA或AGG變成CGC或CGG;編碼Ala的密碼子可從GCU或GCA變成GCC或GCG;編碼Gly的密碼子可從GGU或GGA變成GGC或GGG。在某些情況下，雖然不可能從密碼子中去除A和U核苷，但可用具有較少的A和/或U核苷的密碼子來減少A和U的含量。下面是一些例子-編碼Phe(苯丙氨酸)的密碼子可從UUU變成UUC;-編碼Leu(亮氨酸)的密碼子可從UUA、UUG、CUU或CUA變成CUC或CUG;-編碼Ser(絲氨酸)的密碼子可從UCU或UCA或AGU變成UCC、UCG或AGC;-編碼Tyr(絡(luò)氨酸)的密碼子可從UAU變成UAC;-編碼Cys(胱氨酸)的密碼子可從UGU變成UGC;-編碼His(組氨酸)的密碼子可從CAU變成CAC;-編碼Gln(谷氨酸)的密碼子可從CAA變成CAG;-編碼Ile(異亮氨酸)的密碼子可從AUU或AUA變成AUC;-編碼Thr(蘇氨酸)的密碼子可從ACU或ACA變成ACC或ACG;-編碼Asn(酪氨酸)的密碼子可從AAU變成AAC;-編碼Lys(賴氨酸)的密碼子可從AAA變成AAG;-編碼Val(纈氨酸)的密碼子可從GUU或GUA變成GUC或GUG;-編碼Asp(門冬氨酸)的密碼子可從GAU變成GAC;-編碼Glu(谷氨酸)的密碼子可從GAA變成GAG，-終止密碼子UAA可變成UAG或UGA。上面所列出的替代可單獨(dú)使用或以所有可能的組合來使用，以使修飾后的mRNA的G/C含量比野生型的mRNA(原始序列)的G/C含量更高。上述的替代可能的各種組合，例如，可優(yōu)選使用如下用ACC(或ACG)替代原始序列(野生型的mRNA)中編碼Thr的所有密碼子，并且用UCC(或UCG或AGC)替代原始序列(野生型的mRNA)中編碼Ser的所有密碼子；用AUC替代原始序列中編碼lie的所有密碼子，并且用AAG替代原始序列中編碼Lys的所有密碼子，并且用UAC替代原始序列中編碼Tyr的所有密碼子。用GUC(或GUG)替代原始序列中編碼Val的所有密碼子，并且用GAG替代原始序列中編碼Glu的所有密碼子，并且用GCC(或GCG)替代原始序列中編碼Ak的所有密碼子，并且用CGC(或CGG)替代原始序列中編碼Arg的所有密碼子；用GUC(或GUG)替代原始序列中編碼Val的所有密碼子，并且用GAG替代原始序列中編碼Glu的所有密碼子，并且用GCC(或GCG)替代原始序列中編碼Ala的所有密碼子，并且用GGC(或GGG)替代原始序列中編碼Gly的所有密碼子,并且用AAC替代原始序列中編碼Asri的所有密碼子；用GUC(或GUG)替代原始序列中編碼Val的所有密碼子,并且用UUC替代原始序列中編碼Phe的所有密碼子，并且用UGC替代原始序列中編碼Cys的所有密碼子,并且用CUG(或CUC)替代原始序列中編碼Leu的所有密碼子,并且用CAG替代原始序列中編碼Gin的所有密碼子，并且用CCC(或CCG)替代原始序列中編碼Pro的所有密碼子；等等。編碼蛋白質(zhì)的修飾后的mRNA的編碼區(qū)G/C含量改變的情況下，該改變與編碼蛋白質(zhì)的野生型mRNA的編碼區(qū)G/C含量相比，為增加至少7。％，較佳是增加至少15。％，更佳是增加至少20%，最佳是增加30%。在此關(guān)系中尤其優(yōu)選的是相對于野生型的序列，將修飾后的mRNA尤其編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域內(nèi)的G/C含量增加到最大的范圍。進(jìn)一步優(yōu)選是增加修飾后的mRNA的核糖體結(jié)合點(diǎn)的編碼區(qū)內(nèi)的A/U含量，使之比相應(yīng)的野生型mRNA的核糖體結(jié)合點(diǎn)的編碼區(qū)內(nèi)的A/U含量更高。這一修飾增加了核糖體結(jié)合到mRNA的效率。核糖體有效地結(jié)合到核糖體結(jié)合點(diǎn)(Kozak序列GCCGCCACCAUGG，啟動子的AUG形式)將影響mRNA的有效翻譯。這一增加在于在結(jié)合點(diǎn)的編碼區(qū)引入了至少一個額外的A/U單位，一般至少3個，也就是說，從AUG啟動子的A開始的-20到+20。優(yōu)選的修飾與mRNA有關(guān)，其中mRNA的編碼區(qū)和/或修飾后的mRNA的5'-和/或3'-未翻譯區(qū)己經(jīng)相對于不含任何擾動序列元素的野生型mRNA而改變，修飾后的mRNA的編碼氨基酸序列相對于野生型的mRNA最好沒變。人們知道，擾動序列元素(DSE)在真核mRNA的序列中出現(xiàn)，擾動序列元素信號蛋白與其結(jié)合并調(diào)節(jié)體內(nèi)mRNA的酶降解。因此，本發(fā)明為了進(jìn)一步穩(wěn)定修飾后的mRNA，與野生型mRNA的對應(yīng)區(qū)域相比，可選地可在編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行一種或多種這樣的改變，從而就沒有或幾乎沒有擾動序列元素出現(xiàn)在其中。根據(jù)本發(fā)明，通過這樣的改變，可消除mRNA中出現(xiàn)在未翻譯區(qū)域(3'-和/或5'-UTR)的DSE。例如，這樣的擾動序列是含豐富的AU的序列("AURES")，其可在許多不穩(wěn)定的mRNA的3'-UTR部分出現(xiàn)(Caputetat.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1986,83:1670to1674)，也可以是被核酸內(nèi)切酶識別的序列模體(motif)(例如，Binderetal.,EMBOJ.1994,13:1969to1980)。同樣優(yōu)選地，經(jīng)修飾的mRNA具有5'-帽(5'-cap)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，本發(fā)明使用的帽結(jié)構(gòu)的例子是m7G(5')ppp，5'(A,G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G同樣優(yōu)選地，經(jīng)修飾的mRNA具有聚(A)尾部(ploy(A)tail)，較佳的是具有至少25個核苷，再較佳的是具有至少50個核苷，更較佳的是具有至少70個核苷，再較佳的是具有至少100個核苷，最好具有至少200個核苷。同樣優(yōu)選地，修飾了的mRNA具有至少一個IRES和/或至少一個5'-和/或3'-穩(wěn)定序列。根據(jù)本發(fā)明，一個或多個所謂的IRES("內(nèi)部核糖體進(jìn)入位""internalribosomeentryside")可引入到修飾了的mRNA當(dāng)中。因此，IRES可作為唯一的核糖體結(jié)合點(diǎn)，但它也可用來提供mRNA，通過核糖體("multicistronicmRNA"，多順反子mRNA)來編碼將彼此單獨(dú)翻譯的多個蛋白質(zhì)、肽或多肽。根據(jù)本發(fā)明的IRES序列的例子來自于小核糖核酸病毒(例如，F(xiàn)MDV)、瘟疫病毒(CFFV)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)、腦心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙肝病毒(HCV)、豬瘟病毒(CSFV)、鼠白血病病毒(MLV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、蟋蟀麻痺病毒(CrPV)。優(yōu)選地，修飾后的mRNA具有至少一個5'-和/或3'-穩(wěn)定序列。這些在5'-和/或3'未翻譯區(qū)的穩(wěn)定序列可使細(xì)胞溶質(zhì)中的mRNA的半衰期增長。這些穩(wěn)定序列與病毒、細(xì)菌、真核生物中自然存在的序列具有100%的同源性，但也可具有部分或完全的合成性質(zhì)。作為本發(fā)明的穩(wěn)定序列的一個例子是人類(/fo/7K碼D/'e/2^或非洲爪蟾(le/20/ws"ew;s)的球蛋白基因的未翻譯序列(UTR)。穩(wěn)定序列的另一個例子具有如下通式(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC，其包含在用于編碼a-球蛋白(a-globin)、(I)-膠原((I)-collagen)、15-脂氧酶(15-lipoxygenase)或酪氨酸羥化酶(tyrosine-hydroxylase)的很穩(wěn)定的mRNA的3'-UTR中(參見Holciketal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1997，94:2410to2414)。當(dāng)然，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，這樣的穩(wěn)定序列可單獨(dú)使用或彼此結(jié)合使用，以及與其他的穩(wěn)定序列組合起來使用。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，修飾了的mRNA包含自然存在的核苷的至少一個相似物。這個/這些相似物可進(jìn)一步穩(wěn)定修飾后的mRNA，這是基于如下事實(shí)細(xì)胞中存在的RNA降解酶優(yōu)先識別出自然存在的核苷來作為底物。通過引入核苷類似物到RNA中，從而RNA的降解變得更困難了，然而，這些類似物的引入，特別是引入到mRNA的編碼區(qū)內(nèi)，對翻譯效率有或正或負(fù)的影響。在此舉出本發(fā)明可用的核苷類似物的例子(但不限于這些)有氮基磷酸酉旨(phosphoramidates)、；^/(戈石粦酸酉旨類(phosphorothioates)、月太牛亥昔(peptidenucleotides)、甲基石粦酸酉旨(methylphosphonates)、7畫deazaguanosine、5國甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)和肌苷(inosine)。例如，根據(jù)專利號為US4，373，071、US4,401,796、US4,415,732、US4,458,066、US4，500，707、US4,668,777、US4,973,679、US5,047,524、US5,132,418、US5,153,319、US5,262,530禾BUS5,700,642的美國專利的相關(guān)介紹，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉這些類似物的制備。這些類似物可存在于修飾后的mRNA的未翻譯區(qū)和翻譯區(qū)。在本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，修飾后的mRNA還包含編碼信號肽的序列。編碼信號肽的序列優(yōu)選地長度是30到300個堿基，編碼10到100個氨基酸。較佳的，編碼信號肽的序列的長度是45到180個堿基，編碼15到60個氨基酸序列。通過示例的方式，下表1中的序列可用來修飾本發(fā)明使用的RNA。表1中也包括有優(yōu)選1到20個、較佳1到10個、最好是1到5個堿基的序列替代A、T、G、C，與表1中列出的一個序列相比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表l:信號肽序列的示例由第一類MHC或第二類MHC基因的第一外顯子編碼的氨基酸序列和髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知實(shí)現(xiàn)上述的修飾的各種處理方法。例如，對于根據(jù)本發(fā)明修飾了的mRNA中密碼子的替換，在相對短的編碼區(qū)的情況下，可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用化學(xué)地方法合成整個mRNA。然而，在借助現(xiàn)有的面向目標(biāo)的誘變的技術(shù)制備經(jīng)修飾的mRNA時，堿基的替代、增加或消除最好利用DNA豐莫豐反(matrix)來引入(參見例如Maniatisetal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,3rded.,ColdSpringHarbor,NY，2001)。在此過程中，相應(yīng)的DNA分子在體外被轉(zhuǎn)錄以便制備mRNA。此DNA模板有合適的啟動子，例如，用于體外轉(zhuǎn)錄的T7或SP6啟動子，接著是要制備的mRNA所需的核苷酸序列和體外轉(zhuǎn)錄的終止信號。形成要制備的RNA模板的DNA分子可通過發(fā)酵繁殖和隨后分離為細(xì)菌中的質(zhì)粒復(fù)制品的一部分來制備。所以，根據(jù)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員己知的分子生物學(xué)的方法，使用在分裂點(diǎn)具有短的單鏈過渡的短合成DNA寡核苷酸，或者使用通過化學(xué)合成制備的基因，可將所需的核苷序列克隆到合適的質(zhì)粒內(nèi)(參見前面提到的Maniatis等所著的文獻(xiàn))。然后，用限制性內(nèi)切酶消化的方法將在質(zhì)粒中的以一個副本形式存在的或多個副本形式存在的DNA分子從質(zhì)粒中切除。上述的RNA的修飾，尤其是mRNA的修飾，可在本發(fā)明的范圍內(nèi)單獨(dú)或相互組合起來進(jìn)行。類似地，一個或多個修飾可與上述的RNA的復(fù)雜化相結(jié)合，尤其是mRNA。本發(fā)明的目標(biāo)是增加寄助物中的RNA轉(zhuǎn)移和/或RNA翻譯。本發(fā)明范圍內(nèi)所指的寄助物可以理解為RNA可轉(zhuǎn)移入其細(xì)胞或組織并隨后在其中進(jìn)行翻譯的任何生物體。本發(fā)明范圍內(nèi)所指的寄助物特別是哺乳動物例如小鼠、大鼠、豬、牛、馬、狗、貓、猿，尤其是人。根據(jù)本發(fā)明，熒光素酶編碼的RNA，尤其是mRNA，稀釋在本發(fā)明的RL注射緩沖液(含或不含乳酸鹽)中，比稀釋在標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)的用來稀釋RNA的緩沖液例如HBS或PBS中具有明顯更好的翻譯率(參見圖1)。更進(jìn)一步，注射的mRNA的轉(zhuǎn)移和翻譯效率很大程度上取決于鈣離子的存在與否。在相應(yīng)的RL注射緩沖液(含或不含乳酸鹽)中含有/不含有鈣離子的對比測試中，不含鈣會大大地降低RNA的轉(zhuǎn)移率至與標(biāo)準(zhǔn)緩沖液PBS和HBS的轉(zhuǎn)移率相當(dāng)?shù)乃?參見圖2)。因此發(fā)現(xiàn)，首先，本發(fā)明的RL注射緩沖液(含或不含乳酸鹽)顯著地增加RNA轉(zhuǎn)移；其次，用含高達(dá)100mM的鈣濃度的RL注射緩沖液(含或不含乳酸鹽)是改進(jìn)RNA的轉(zhuǎn)移率的另一個因素。本發(fā)明的注射緩沖液最好與RNA注射液中的RNA相結(jié)合使用。因此本發(fā)明進(jìn)一歩提供了一種包含RNA的RNA注射液和一種包含至少50mM氯化鈉(NaCl)、至少O.OlmM氯化鈣(CaCl2)和可選的至少3mM氯化鉀(KC1)的注射緩沖液，用于增加細(xì)胞中的RNA轉(zhuǎn)移和/或RNA翻譯。本發(fā)明優(yōu)選的RNA注射液中，注射緩沖液包含有至少50mM到800mM的氯化鈉，較佳地含氯化鈉60mM到500mM，更佳地含氯化鈉70mM到250mM，尤其更佳的是含氯化鈉60mM到110mM;包含有至少O.OlmM到100nM的氯化l丐(CaCl2)，較佳地至少含氯化鈣0.5mM到80mM，更佳地含氯化鈣至少1.5mM到40mM;和可選的至少3mM到500mM的氯化鉀(KC1)，較佳地含氯化鉀至少4mM到300mM，更佳地含氯化鉀至少5mM到200mM。本發(fā)明的RNA注射液的注射緩沖液優(yōu)選地進(jìn)一步包含乳酸鹽。本發(fā)明的RNA注射液的注射緩沖液優(yōu)選地包含至少15mM的乳酸鹽。本發(fā)明的一種優(yōu)選RNA注射液中，注射緩沖液較佳地包含15mM到500mM的乳酸鹽，更佳地包含15mM到200mM的乳酸鹽，最好含15mM到100mM的乳酸鹽。RNA注射液可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的任何方法來制備。優(yōu)選地，RNA稀釋在RL注射緩沖液或含乳酸鹽的RNA注射緩沖液中。類似地，RNA可以干RNA的形式(例如，冷干的)使用，并且可加入RNA注射緩沖液或含乳酸鹽的RL注射液，可選地通過提高溫度、攪拌、超聲等來加速溶解。濃度比可根據(jù)特定條件來選擇(RNA注射液要注射入的寄助物，尤其是哺乳動物以及寄助物的健康狀態(tài)、年齡等)。本發(fā)明的RNA注射液中的RNA優(yōu)選是裸露RNA，較佳是mRNA，最好是如上所定義的裸露mRNA。如上所述，本發(fā)明的RNA注射液尤其可用來增加到/在寄助物內(nèi)的RNA轉(zhuǎn)移和RNA翻譯。因此，本發(fā)明還提供上述的RNA注射液用于增加到/在寄助物內(nèi)的RNA轉(zhuǎn)移和RNA翻譯的用途。RL注射緩沖液(含或不含乳酸)內(nèi)RNA的劑量(尤其是指臨床應(yīng)用的量和持續(xù)時間)也已經(jīng)進(jìn)行了研究。研究表明，隨著mRNA的量在小鼠中增加到0.1iig(100|Lil的注射體積中)，在人體中增加到3mg(150pl注射體積中)，瑩光素酶的表達(dá)也增加。mRNA的翻譯瞬時發(fā)生并且隨后被調(diào)節(jié)，因此，為了使外來分子(蛋白質(zhì))能夠持續(xù)、一致的表達(dá)，依據(jù)各種因素例如要表達(dá)的外來分子和傾向的活動、接受注射的有機(jī)體和其(健康)狀態(tài)，大約每3天要重復(fù)注射一次，甚至兩天重復(fù)注射一次或每天重復(fù)注射。RNA的量(同樣取決于上述的各種因素)可以是100)al的注射體積中包含0.01|ag到1000pg，較佳地包含1嗎到800嗎，更佳地包含2)ig到200嗎，再更佳地包含5|Lig到100嗎，再更佳地包含10昭到90fig，最好包含20嗎到80嗎。在100pl注射體積中，RNA的量特別優(yōu)選的是60(ig。因此，本發(fā)明提出的RNA和RL注射緩沖液或含乳酸鹽的RL注射緩沖液以及RNA注射液的用途，可用于例如癌癥或腫瘤疾病的治療和/或預(yù)防，或用于治療和/或預(yù)防癌癥或腫瘤疾病的藥劑的制備，該癌癥或腫瘤疾病指的是例如黑素瘤，比如，惡性黑素瘤、皮膚黑素瘤，癌，比如大腸癌、肺癌，比如小細(xì)胞肺癌、腺癌、前列腺癌、食管癌、乳腺癌、腎癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病，特別是AML(急性髓細(xì)胞白血病，acutemyeloidleukaemia)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、淋巴瘤和胚細(xì)胞瘤、敏感癥、自體免疫疾病，例如，多發(fā)性硬化癥、病毒和/或細(xì)菌感染。例如，本發(fā)明包括RNA和RL注射緩沖液或含乳酸鹽的RL注射緩沖鹽的用途，還包括RNA注射液的用途，用于基因治療和接種疫苗，例如，用于抗病毒或腫瘤接種，用于預(yù)防上述的疾病。本發(fā)明所述的"基因治療"是指引入功能基因到患病的細(xì)胞中恢復(fù)機(jī)體或細(xì)胞的失去了的功能，或通過相應(yīng)的遺傳信息抑制受損的功能。例如，對于腫瘤抑制基因，例如，丟失p53基因或其只有少量表達(dá)時，可以以其mRNA的形式引入細(xì)胞內(nèi)并插入到DNA中，并且最初表達(dá)不足的蛋白就能夠重新生成到生理上需要的量。本發(fā)明所述的腫瘤抑制基因的例子是p53TP53,RBl，APC,WT1,NF1,NF2，VHL,BRCA1，BRCA2,DCC，MEN1,MEN2，PTCH,p57/KIP2,MSH2,MLHl,FMSl,FMS2,MET,pl6/INK4a/CDKN2,CDK4，RET,EXTl,EXT2,EXT3，PTEN/MMAC1，ATM,BLM,XPB，XPD,XPA,XPG,FACC,FACA,SMAD4/DPC4,pl4Art(pl9Art),DPC4,E-CAD,LKB1/STK1,TSC2,PMS1,PMS2,MSH6,TGF-PtypeIIR,BAX，a-CAT,MADR2/SMAD2，CDX2，MKK4,PP2R1B,MCC,等等。本發(fā)明所述的接種是指以RNA的形式，尤其是以mRNA的形式，將遺傳信息引入到有機(jī)體中，特別是引入到有機(jī)體的一個/幾個細(xì)胞或組織中。如此給藥的mRNA在有機(jī)體中翻譯成目標(biāo)分子(例如，肽、多肽、蛋白質(zhì))，也就是說，由mRNA編碼的目標(biāo)分子被表達(dá)并觸發(fā)免疫反應(yīng)。人們知道，抗原遞呈細(xì)胞(APC)在觸發(fā)免疫反應(yīng)時起到專門的關(guān)鍵作用，因?yàn)樗鼈兪侨绱说奈ㄒ坏募?xì)胞類型當(dāng)激活后，所有的啟動抗原特異性免疫細(xì)胞的增殖所需的所有信號被觸發(fā)。本發(fā)明所述的接種可使用編碼抗原的RNA，特別是mRNA來進(jìn)行，所述的抗原在腫瘤免疫接種時是腫瘤抗原，在接種對抗外來病原體時是外來抗原。本發(fā)明所述的腫瘤抗原是T-細(xì)胞定義的腫瘤抗原，例如，"癌/睪丸"("c朋cer/te勸y'朋^^e/^)抗原，例如，MAGE、RAGE、NY-ESO陽l，分化抗原(d!/^re/^/W/b"朋^rezi9)，例如，MART-1/Melan-A、酪氨酸酶(tyrosinase)、gp100、PSA、CD20，變異基因的抗原決定基(a/^gCT/ce/w'topeso/zm^^/ge/es)，例如，CDK4,caspase畫8，或癌胚抗原(0/coi^a/a/^扭e")，例如，CEA、AF。其它的腫瘤抗原有，例如，存在于T-細(xì)胞和B-細(xì)胞淋巴瘤中的腫瘤抗原CD5和CAMPATH-l(CDw52)，存在于非霍奇金B(yǎng)-細(xì)胞淋巴瘤(non-Hodgkin，sB-celllymphomas)中的CD20，月中瘤抗原CEA(carcinoembryogenicantigen)，茅占液素，存在于實(shí)心腫瘤特別是上皮性腫瘤(乳腺、腸和肺)中的CA-125和FAP-a，TN蛋白(tenascin)，和還存在于成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(glioblastoma)中的金屬蛋白酶(metalloprotdnases)。進(jìn)一步的腫瘤抗原是，例如，腫瘤抗原EGF(表皮生長因子)，存在于肺、乳腺、頭部和頸部以及T-細(xì)胞和B-細(xì)胞腫瘤中的pl85HER2和IL-2受體，腫瘤抗原SV40等。RNA，特別是mRNA，也可編碼多個這樣的抗原。因此，黑素瘤、癌、AML或神經(jīng)膠質(zhì)瘤可有效地得到控制，因?yàn)樘囟[瘤的不同抗原的組合^r有極其廣泛的活動范圍。本發(fā)明的RNA特別是mRNA可進(jìn)一步編碼免疫原f生蛋白。這樣的免疫原性蛋白可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的再激活。這樣的再^[活基于以下的發(fā)現(xiàn)幾乎每個有機(jī)體都有對某些外來分子(如蛋白質(zhì)，尤其是病毒蛋白、抗原)的所謂的"記'["乙免疫反應(yīng)"(memoryimmuneresponses)。這意卩未著，有機(jī)體在較早時已經(jīng)被這樣的外來分子感染過，并且，對此外來分子(例女口，病毒蛋白)的免疫反應(yīng)已經(jīng)通過此次感染被觸發(fā)，此免疫反應(yīng)就保存在""i己憶"中，也就是說被存儲起來。當(dāng)有機(jī)體再次被同樣的外來分子感染時，免疫反應(yīng)就被再次激活。根據(jù)本發(fā)明，這樣的免疫反應(yīng)的再激活可通過接種包含有至少一個免疫原性蛋白的編碼區(qū)的RNA特別是mRNA來實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的是編石馬一個或多個抗原并編碼一個或多個免疫原性蛋白的RNA，尤其是mRNA。本發(fā)明所述的免疫原性蛋白優(yōu)選地是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，特別是基質(zhì)蛋白、殼蛋白和脂膜的表面蛋白。這樣的病毒蛋白的其它例子是腺病毒蛋白、鼻病毒(rhinoviruses)蛋白、冠病毒(coronaviruses)蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酉每病毒(retroviruses)蛋白，特別優(yōu)選的是乙肝表面抗原(hepatitisBsurfaceantigen)(下面以"HBS抗原"代表)和流感基質(zhì)蛋白，特別是流感基質(zhì)Ml蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步涉及RNA和上述的RL注射緩沖液或含乳酸鹽的RL注身寸緩沖液、或上述的RNA注射液在"體外"處理時增加RNA轉(zhuǎn)移和/或RNA翻i牽的用途，例如，用于基因表達(dá)分析或用于體外篩選，例如，通過HTS(高吞B土量篩選)。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種方法，用于增加寄助物中的RNA轉(zhuǎn)移和/或RNA翻譯，例如，用于治療和/預(yù)防癌或腫瘤疾病，例如，黑素瘤，如良性黑素瘤、皮膚黑素瘤，癌如大腸癌、肺癌如小細(xì)胞肺癌、腺癌、前列腺癌、食管癌、乳腺癌、腎癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病，特別是AML(急性髓細(xì)胞白血病，acutemyeloidleukaemia)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、淋巴瘤和胚細(xì)胞瘤、敏感癥、自體免疫疾病，例如，多發(fā)性硬化癥、病毒和/或細(xì)菌感染，以及用于基因治療和/或接種，可選的用于抗病毒疫苗接種，用于上述疾病的預(yù)防，所述方法包括下述步驟a.)制備本發(fā)明的RNA注射液；b.)將步驟a得到的RNA注射液給藥到寄助物中。步驟a中RNA注射液的制備可按前述進(jìn)行，也就是說，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的l壬何方法進(jìn)行，優(yōu)選地，通過將RNA稀釋在RL注射緩沖液或含乳酸鹽的RL注射緩沖鹽中來實(shí)現(xiàn)。這里所述的濃度比率也依賴上述的條件來選擇(例如，RNA注射液要注射到的寄助物，特別是哺乳動物，以及寄助物的健康狀態(tài)、年齡等)。RNA注射液可用例如注身寸器(例如，Sub-Q,BectonDickinson,Heidelberg,Germany)以任何合適的方式給藥，例如，皮內(nèi)給藥、上皮內(nèi)給藥、皮下給藥、靜脈內(nèi)給藥、動脈內(nèi)給藥、腹腔給藥、腹膜內(nèi)給藥、結(jié)點(diǎn)內(nèi)給藥(例如，給藥到淋巴結(jié)中)等。本發(fā)明所述的寄助物最好是從下列選出的哺乳動物小鼠、大鼠、豬、牛、馬、狗、貓、猿，特別是人。根據(jù)本發(fā)明制備的注射液還可用于使用RNA特別是mRNA進(jìn)行的細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染。此體外轉(zhuǎn)染可適用于實(shí)驗(yàn)室使用或作為生物體外基因治療的一部分，也就是說，將細(xì)胞從病人身上移除，包含在本發(fā)明的注射液中的RNA的生物體外轉(zhuǎn)染，然后重新移植到病人身上。轉(zhuǎn)染可借助電穿孔的方法進(jìn)行，可選地還可借助電壓脈沖來實(shí)現(xiàn)，其場強(qiáng)不超過2到10kVcm—、并且脈沖持續(xù)時間是IO到200^is，電流密度至少有2Acm—2。然而，如果不是用來進(jìn)行轉(zhuǎn)染的話，也可用1到100ms的脈沖。如果本發(fā)明的注射溶液是用于實(shí)驗(yàn)室目的，所有的實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞系都能采用此方法用RNA轉(zhuǎn)染。對于生物體外基因治療來說，許多細(xì)胞類型可以用來轉(zhuǎn)染，尤其是初級人類血液細(xì)胞、多向潛能祖細(xì)胞和成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞或肌細(xì)胞，以上給出的是示例，而不是為了限制。本申請中引用的所有參考文獻(xiàn)均完整地包括在本申請中。下列的圖和例子是為了進(jìn)一步解釋本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進(jìn)行限制。圖1至圖5所示的試驗(yàn)中，每種情況所示的包含有編碼螢火蟲(Pi^^2M/jra/Zs)熒光素酶的mRNA(圖4中100filPBS中的pDNA)的100|il緩沖液(緩沖液的成分在下面的材料1.注射緩沖液中給出)，被皮內(nèi)注射到BALB/c小鼠13的耳翼。分析整個小鼠的耳的熒光素酶的活動。這以百萬熒光素酶分子表示。檢測范圍在圖中用標(biāo)有數(shù)字的粗線表示。圖上的每個點(diǎn)展示了單只耳朵上的熒光素酶表達(dá)。圖上的短橫杠表示各組的平均值。針對各組給出了p^:，明顯不同于其平均值(根據(jù)Mann-Whitney檢驗(yàn))。在圖1、2和5所示的實(shí)驗(yàn)中，注射后15小時，耳朵被切除。數(shù)據(jù)顯示每組有至少3個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。圖1比較了mRNA的不同注射緩沖液磷酸緩沖鹽(PBS)和HEPES-緩沖鹽(HBS)和含乳酸的RL注射緩沖液(RL)。lacZmRNA用作負(fù)控制。本發(fā)明顯示，稀釋在含乳酸的RL注射緩沖液中的mRNA具有比稀釋在HBS或PBS中的mRNA明顯更高的熒光素酶表達(dá)(pO.OOl)(圖1A)。圖2展示了RL注射緩沖液(含乳酸鹽和不含乳酸鹽，以及含轉(zhuǎn)或鉀和不含鈣或鉀)中不含鈣(-CaCl)、鉀(-KCl)、乳酸鈉(-NaLa)時對mRNA的吸收效率的影響。PBS和HBS與RL注射緩沖液或含乳酸鹽的注射緩沖液(含或不含鈣)之間的主要區(qū)別是不含乳酸鹽和鈣(在HBS或PBS中)。因此，研究一方面使用完全RL注射緩沖液(含乳酸鹽的RL注射緩沖液)，另一方面使用不含鈣或不含鉀或不含乳酸鹽的RL注射緩沖液配方，來比較編碼熒光素酶的mRNA的轉(zhuǎn)移和翻譯。這些研究顯示，不含乳酸鹽使熒光素酶的表達(dá)可與使用完全RL注射緩沖液(含乳酸鹽的RL注射緩沖液)時的表達(dá)相當(dāng)。但是，RL注射緩沖液或含乳酸鹽的RL注射緩沖液中不含鈣時，顯著地降低RNA的轉(zhuǎn)移效率(p=0.004)至與PBS和HBS相當(dāng)?shù)乃?。圖3和圖4展示了直接體內(nèi)mRNA翻譯的動力學(xué)。進(jìn)行了RNA在本發(fā)明的含乳酸鹽的RL中和DNA在PBS標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中的平行動力學(xué)實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行比較。mRNA(在含乳酸鹽的RL注射緩沖液中)(圖3)或pDNA(在PBS中)(圖4)在注射10天之后的翻譯被記錄下來并展示在圖中。在兩個測試(RNA和DNA)過程中，在活的小鼠上的熒光素酶活性被記錄下來。具有代表性的耳朵的結(jié)果在圖中示出。在注射(編碼熒光素酶)溶在含乳酸鹽的RL注射緩沖液中的mRNA之后檢測到的熒光素酶的表達(dá)很早就達(dá)到了其最大值(17個小時)，并且9天之后就再也檢測不到(圖3)。比較起來，在PBS中注射(編碼熒光素酶)pDNA可導(dǎo)致較晚的蛋白質(zhì)表達(dá)，注射3天后才達(dá)到其最大值并且持續(xù)到超過9天(圖4)。這些結(jié)果再次確認(rèn)了本發(fā)明的RL注射緩沖液的效率，而且確認(rèn)了RNA遠(yuǎn)比DNA更適合用作寄助物特別是哺乳動物中瞬時基因表達(dá)的載體。RNA—方面很快地表達(dá)，另一方面瞬時表達(dá)，這意味著目標(biāo)基因表達(dá)可被較早地觸發(fā)并持續(xù)有限的時間，相應(yīng)地以更有目標(biāo)和分化的方式。這些研究證實(shí)了成功的RNA轉(zhuǎn)移的增加以及隨后的有效翻譯。圖5展示了不同量的mRNA對熒光素酶表達(dá)的影響。這些實(shí)驗(yàn)是為了更精確的確定特別是在臨床應(yīng)用中使用的RNA在含乳酸鹽的RL注射緩沖液中的劑量，結(jié)合考慮量和持續(xù)時間。為此目的，增加的RNA量被注射到多個小鼠體內(nèi)。隨著mRNA的量增加到5昭(100pl注射體積)，檢測到熒光素酶表達(dá)的增加。超過5pg的劑量不能進(jìn)一步增加表達(dá)。在相應(yīng)的人體的實(shí)驗(yàn)中(圖中沒有示出)，使用了120嗎的mRNA的劑量，當(dāng)增加到200嗎時，導(dǎo)致表達(dá)增加。人體使用的200昭的mRNA，與小鼠的5昭劑量相比，可由注射部位的大小來獲得，即人體大約有小鼠的40倍大小。在解釋了背景和研究可能導(dǎo)致的后果和獲得同意之后，人體實(shí)驗(yàn)是在健康的志愿者身上進(jìn)行的。關(guān)于不同時間的劑量，應(yīng)該注意到，mRNA的翻譯是瞬時發(fā)生的(如圖3所示，在12小時后達(dá)到最大值并且在9天之后便檢測不到)并且因此被調(diào)節(jié)。因此，為了持續(xù)、均一地翻譯外來分子(蛋白質(zhì))，要大約每天、每兩天或每3天重復(fù)注射(取決于一些因素，如外來分子或mRNA要注射入的有機(jī)體)是合適的。圖6再次顯示了CaCl2對熒光素酶活性的影響。為此目的，制備了一系列的CaCl2熒光素酶溶解緩沖液(最終濃度在圖中示出)，并且相同量的重組熒光素酶蛋白被加到所有的樣本中(最終濃度大約是4.7pM)?；旌衔锏墓獍l(fā)射用光度計(jì)測量(加入ATP和熒光素后)。CaCl2濃度對熒光素酶活性的影響根據(jù)下式計(jì)算出%相對熒光素酶活性(RLA)=(具有確定的CaCl2濃度的樣本的RLA—純?nèi)芙饩彌_液的RLA)/(不含CaCl2的樣本的RLA—純?nèi)芙饩彌_液的RLA)X100%較高濃度的C,離子(大約2mM以上)的出現(xiàn)不能增加熒光素酶的活性。圖7再次展示了CaCl2濃度對mRNA在體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響。使用了各種濃度的含乳酸鹽的RL注射緩沖液，以制備具有相同量的用于編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA(20(ig)的RNA注射液(IOO|il)，但具有不同的同滲容摩(osmol.)。這些RNA注射液被注射到BALB/c小鼠的耳緣。15小時后，處死小鼠，制備耳的溶解產(chǎn)物。計(jì)算出的每只耳產(chǎn)生的熒光素酶分子總量、各組的平均值(帶數(shù)字的橫杠)、每組的大小(n)和測試的檢測范圍(帶數(shù)字的粗線)在圖中示出。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)的mRNA的有效轉(zhuǎn)移和接著的有效翻譯需要的最小濃度是170mOsm。圖8A-E展示了表達(dá)體內(nèi)補(bǔ)充的mRNA的細(xì)胞的特征。20ng用于編碼^&c力e/v'c力/aco//(大腸桿菌)(3-半乳糖苷酶((3-galactosidase)的mRNA，稀釋到包含100^1RL含有乳酸鹽的注射緩沖液的RNA注射液總量中，被注射到小鼠體內(nèi)，14小時后，處死小鼠，切除耳朵，制備冷凍切片。圖8A和8C至犯用顏色示出其特征。更進(jìn)一步，研究了注射緩沖液(含或不含乳酸鹽)中的RNA的直接表達(dá)。為此目的，定義了吸收并翻譯RL注射緩沖液(含或不含乳酸鹽)中轉(zhuǎn)移的外源性RNA的細(xì)胞類型(也參見例5，圖8A-E和類似的，圖11、12、16和17)。之后，在本發(fā)明的基于mRNA的免疫接種的范圍內(nèi)，分析了如何用轉(zhuǎn)移到免疫系統(tǒng)的確定的目標(biāo)細(xì)胞中的RL注射緩沖液(含或不含乳酸鹽)內(nèi)的外源性RNA來觸發(fā)免疫反應(yīng)。圖8A展示的實(shí)驗(yàn)中，每個第五樣本切片用含X-gal溶液染色。在連續(xù)的20)am厚的冰凍切片中檢測到多達(dá)10個P-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞。表達(dá)區(qū)域，也就是說，P-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞(箭頭所示)，覆蓋了耳的縱向和徑向的方向l至2毫米，并且位于耳肌肉的表皮層和軟骨層之間的較窄的層上。本發(fā)明也研究了APC是否用直接吸收和自體翻譯轉(zhuǎn)移的mRNA或吸收另外的細(xì)胞轉(zhuǎn)移的RNA的翻譯產(chǎn)物(所謂的"交叉遞呈(crosspresentation)")來檢測外來抗原。由于細(xì)胞的局部化、它們的形狀和它們的MHC第二類基因型，可能得出結(jié)論在注射部位吸收和表達(dá)外來的裸露的mRNA的主要是肌肉細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞(圖8A)。結(jié)果對應(yīng)于上述的被其他細(xì)胞翻譯的抗原的"交叉遞呈"。此程序可同樣用來解釋抗核酸疫苗編碼蛋白的抗體的形成。根據(jù)本發(fā)明，首次可能確定相應(yīng)的免疫反應(yīng)的觸發(fā)通過所謂的"交叉觸發(fā)"產(chǎn)生，在其中，肌肉細(xì)胞或真皮細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)吸收并表達(dá)轉(zhuǎn)移的RNA,并且APC是被這些細(xì)胞激活的。圖8B的柱狀圖展示了連續(xù)的切片中P-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞的數(shù)目。每個柱代表一個切片。圖8C到8E的實(shí)驗(yàn)中，每個第五樣本切片被染色，即用于MHC第二類表達(dá)(用Alexa546免疫熒光染色檢測出，綠色的)和P-半乳糖苷酶表達(dá)(用洋紅-gal(magenta-gal)染色檢測出，藍(lán)紫色的)。左邊一列的圖顯示了洋紅-gal染色單獨(dú)與藍(lán)紫色的P-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞二(深)暗區(qū)。中間和右邊的圖中，洋紅-gal染色(在中間和右邊圖中所示的感興趣的區(qū)域)和單獨(dú)的MHC第二類染色(桔色=中間圖中的亮區(qū))(綠色=右邊圖中的亮區(qū))的重疊。如圖所示的，絕大多數(shù)的(3-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞清楚地表現(xiàn)出是MHC第二類陰性的。圖9A-B展示了在小鼠和人體身上裸露mRNA的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。制備編碼熒光素酶的mRNA并將其溶解在含有RL注射緩沖液的RL注射液中。檢測范圍在圖中用帶數(shù)字的粗線表示。圖9A所示的實(shí)驗(yàn)中，總量100fi1、含有20|igmRNA的注射液注射到小鼠的耳部肌肉中。注射后14小時，處死小鼠，耳部細(xì)胞被溶解，并且研究溶解物的熒光素酶的表達(dá)。計(jì)算每只耳朵的熒光素酶分子數(shù)量(重組的熒光素酶用作標(biāo)準(zhǔn))。每組的數(shù)據(jù)來自至少3個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。圖9B所示的實(shí)驗(yàn)中，總量200^1、含相同mRNA(120|ig)的注射液注射到人的皮膚中(到志愿者的腿部)。16小時后，在局部麻醉下，取下直徑為2mm的活組織進(jìn)行檢查，也就是，從注射部位的中間("mRNA")和離注射點(diǎn)一定距離("假的(mock)")。熒光素酶的活性只能在注射點(diǎn)的中間檢測到。圖中示出了兩個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的一個。這些結(jié)果顯示，裸露的mRNA直接轉(zhuǎn)移到人的皮膚中。因此，本發(fā)明允許在人體進(jìn)行有效定向的基于mRNA的疫苗接種。圖10A-D展示了注射的含乳酸鹽的RL注射緩沖鹽中的mRNA的完整性和翻譯能力。其完整性用甲醛-瓊脂糖凝膠電泳來檢測(1.2%w/v)。為此目的，l嗎的編碼螢火蟲熒光素蛋白酶(luc,1.9kB,圖10A)或編碼大腸桿菌P-半乳糖苷酶(lacZ，3.5kB，圖10C)的mRNA被分離出來。沒有檢測到在各自的注射緩沖液(原料溶液)中稀釋之前(注射之前)和在各自的注射緩沖液稀釋之后的mRNA的完整性有何不同。相比而言，當(dāng)從注射器中收集RNA注射液的殘液進(jìn)行檢測時，可以檢測到mRNA的看得見的、完全的降解(在注射之后)。由于注射器與小鼠或人體組織的接觸，這些殘液顯然被核糖核酸酶所污染。注射的mRNA的翻譯能力用含10嗎的mRNA的BHK21細(xì)胞的電穿孔來檢測。用來控制lO嗎不相關(guān)的mRNA或非mRNA(假的)。這些細(xì)胞隨后被溶解且用光度計(jì)研究它們的熒光素酶活性(圖IOB)，或用X-gal染色并且用光學(xué)顯微鏡研究它們的熒光素酶活性(圖IOD)。圖ll展示了在細(xì)胞水平的mRNA轉(zhuǎn)移的識別。該圖展示了小鼠的圖片。圖中，外側(cè)(背側(cè))對觀察者可見。含乳酸的RL注射緩沖液中的mRNA被注射到小鼠的耳部肌肉。制備出耳朵的連續(xù)橫切面(1、2、3、4)。這些切面收集在各種裝置中(1、2、3、4)，在空氣中干燥并存儲在-20。C直到進(jìn)行各種染色操作。圖12A-C展示了在細(xì)胞水平的mRNA轉(zhuǎn)移。含乳酸鹽的RL注射緩沖液中的5pg編碼大腸桿菌P-半乳糖苷酶的mRNA被注射到小鼠耳朵部位。注射后15小時，耳朵被植入到TissueTekO.C.T介質(zhì)中，并制備60|im厚的冰凍切片。切片用X-gal染色一整夜。圖12A展示了mRNA轉(zhuǎn)移陰性耳朵的冰凍切片。沒有l(wèi)acZ陽性細(xì)胞是可檢測出的。圖12B展示了概貌。圖12C展示了mRNA轉(zhuǎn)移陽性耳朵的細(xì)節(jié)視圖。lacZ陽性細(xì)胞呈深藍(lán)色，用箭頭標(biāo)示出。圖13展示了AlexaFluor546信號與洋紅-gal陽性細(xì)胞的顏色的相容性。為了確定是否可能在洋紅-gal陽性細(xì)胞中檢測到AlexaFluor546，用eGFPmRNA(eGFP=enhancedgreenfluorescenceprotein,增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)或lacZmRNA的組合來轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞。下列的被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的組合被分析-僅用eGFPmRNA或lacZmRNA進(jìn)行單獨(dú)的轉(zhuǎn)染-如上的被單獨(dú)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(eGFP/lacZ)的混合物-被雙重轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(eGFP+lacZ)該細(xì)胞先用帶AlexaFluor546檢測的抗-eGFP的抗體染色，然后用洋紅-gal染色。經(jīng)洋紅-gal軟色的陽性細(xì)胞(表達(dá)lacZ)通過廣角光學(xué)顯微鏡檢測到(頂行)，經(jīng)AlexaFluor546染色的陽性細(xì)胞(表達(dá)eGFP)通過熒光顯微鏡檢測出(中間行)。為了得到細(xì)胞之間的相對位置的準(zhǔn)確結(jié)果，將以上兩種檢測的結(jié)果重疊(底行)，盡管此圖中的AlexaFluor546信號覆蓋了光學(xué)顯微鏡的圖象。不能排除提供給APC的mRNA的直接吸收和自體翻譯有發(fā)生并足夠引起免疫反應(yīng)。在某些APC中，輕微的或不完全的不能檢測到的翻譯可能己經(jīng)發(fā)生，并且(在不完全翻譯的情況下)可能影響外來抗原的處理和遞呈。圖14A-B展示了冰凍切片的第二類MHC染色的特征。總量為10(^1的含乳酸鹽RL注射液中的20(ig編碼大腸桿菌p-半乳糖苷酶的mRNA被注射到體內(nèi)。注射后14小時，處死小鼠，切除耳朵，制備冰凍切片。該冰凍切片首先用抗第二類MHC的抗體染色(圖14A)，或用對應(yīng)的同型對照抗體(isotypecontrolantibody)軟色(圖14B)，并通過用Alexa546進(jìn)行的免疫熒光染色檢驗(yàn)法進(jìn)行檢測。然后，該冰凍切片用洋紅-gal染色(用于(3-半乳糖苷酶表達(dá))。圖中顯示出了洋紅-gal染色(左列)，第二類MHC染色(中間列，lacZ陽性細(xì)胞的位置用輪廓線表示出來)，和兩種染色的重疊(右列，lacZ陽性細(xì)胞用輪廓線表示出來，第二類MHC陽性細(xì)胞在圖中用亮區(qū)表示)。圖15展示了X-gal染色和AEC染色陽性細(xì)胞的相容性。為了確定X-gal沉積是否與AEC陽性細(xì)胞相容，BHK細(xì)胞與eGFPmRNA和lacZmRNA共同轉(zhuǎn)染。細(xì)胞用AEC(紅色陽性細(xì)胞，表達(dá)eGFP)和X-gal溶液(藍(lán)綠色陽性細(xì)胞，表達(dá)lacZ)或用AEC和X-gal的組合來進(jìn)行抗-eGFP免疫染色。染色后的細(xì)胞用廣角顯微鏡來分析。雙陽性細(xì)胞呈黑色(黑色箭頭)。當(dāng)各次染色足夠強(qiáng)時，很難單獨(dú)地區(qū)分染色后的陽性細(xì)胞(綠色和紅色箭頭)，因而傾向于呈黑色。圖16A-B展示了第二類MHC陽性細(xì)胞和mRNA轉(zhuǎn)移陽性細(xì)胞的協(xié)同定位(co-localisation)。含20嗎編碼(3-半乳糖苷酶的mRNA的lOO)il含乳酸鹽RL注射液被注射到體內(nèi)。注射后14小時，處死小鼠，切除耳朵，制備冰凍切片。該冰凍切片首先用抗第二類MHC的抗體(圖16A+B)或用對應(yīng)的同型對照抗體(圖16C)(用Alexa546染色法檢測)進(jìn)行染色，然后用X-gal進(jìn)行染色(用于(3-半乳糖苷酶表達(dá))。對mRNA轉(zhuǎn)移為陽性的細(xì)胞呈現(xiàn)出藍(lán)綠色，對第二類MHC為陽性的細(xì)胞呈紅色，雙重陽性的細(xì)胞呈現(xiàn)出黑色。mRNA轉(zhuǎn)移陽性細(xì)胞用箭頭標(biāo)示出來，與第二類MHC表達(dá)無關(guān)。圖17展示了mRNA轉(zhuǎn)移和耳部肌肉的形態(tài)。含20pg編碼(3-半乳糖苷酶的mRNA的100^1含乳酸鹽RL注射液被注射到體內(nèi)。注射后14小時，處死小鼠，切除耳朵，制備冰凍切片。該冰凍切片首先用X-gal(用于p-半乳糖苷酶表達(dá))染色，然后用蘇木精和伊紅(四溴熒光素)染色。對于mRNA轉(zhuǎn)移為陽性的細(xì)胞用箭頭標(biāo)示出來，并靠近軟組織層。具體實(shí)施方式材料1、注射緩沖液使用了下述的緩沖液-2x磷酸緩沖鹽(PBS)(PBS:274mM氯化鈉，5.4mM氯化鉀，20mM磷酸一氫鈉，4mM磷酸二氫鉀，溫度20.8。C，pH7.3)-2xHEPES緩沖鹽(HBS)(HBS:300mM氯化鈉，20mMHepes,溫度20.8。C，pH7.4)-lxRL注射緩沖液(不含乳酸鹽)(如果沒有指出其它成分和濃度的話，含82.2mM氯化鈉，4.3mM氯化鉀，1.44mM氯化鈣)-lxRL注射緩沖液(含乳酸鹽)(如果沒有指出其它成分和濃度的話，含102.7mM氯化鈉，5.4mM氯化鉀，1.8mM氯化鈣，20mM乳酸鈉)-lxRL注射緩沖液(含乳酸鹽、不含氯化鈉)(如果沒有指出其它成分和濃度的話，含4.3mM氯化鉀，1.44mM氯化鈣，22.4mM乳酸鈉)-lxRL注射緩沖液(含乳酸鹽不含氯化鉀)(如果沒有指出其它成分和濃度的話，含82.2mM氯化鈉，1.44mM氯化鈣，22.4mM乳酸鈉)-lxRL注射緩沖液(含乳酸鹽不含氯化鈣)(如果沒有指出其它成分和濃度的話，含82.2mM氯化鈉，43mM氯化鉀，22.4mM乳酸鈉)當(dāng)使用2xPBS和2xHBS時，所有的成分溶解在水中，調(diào)節(jié)pH。焦碳酸二乙月旨(DEPC,Sigma,Schnelldorf,Germany)加至濃度為0.1%(v/v)。緩沖液在37"下放置1小時以上。然后將緩沖液高壓滅菌。含乳酸鹽的lxRL注射緩沖液用四種不同鹽(氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉)的20x儲備溶液來制備。類似地，lxRL注射緩沖液用三種不同鹽(氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣)的20x儲備溶液來制備。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，略去氯化鈉或氯化鉀或氯化鈣而不補(bǔ)償被降低的同滲容摩。這些含乳酸鹽不含氯化鈉、氯化鉀或氯化鈣的的RL注射緩沖液，也用20x儲備溶液來制備。除了乳酸鈉的外消旋酸鹽(Fluka，Schnelldoif,Germany)外，每種成分都經(jīng)DEPC和高壓滅菌處理，如對2xPBS和2xHBS所描述的那樣。所有的緩沖液和緩沖成分都通過將lx緩沖液中的lpgmRNA在37T:下培養(yǎng)2小時，來檢測核糖核酸酶的活性。用甲醛-瓊脂糖凝膠電泳的方法來分析mRNA時，使用沒有觀察到降解的緩沖液。2、小鼠所有的動物實(shí)驗(yàn)都根據(jù)實(shí)驗(yàn)室和國家指導(dǎo)方針來進(jìn)行。使用的年齡為8周到15周的雌性BALB/c小鼠來自于德國Sulzfeld州的査爾斯河(CharlesRiver,Sulzfeld,Germany)。在皮內(nèi)注射之前，小鼠被麻醉并且耳部肌肉用異丙醇進(jìn)行了處理。為了分析mRNA的吸收和翻譯，在特定的時間后處死小鼠，切除耳朵，用刀片剃去麻煩的毛發(fā)。3、人人體實(shí)驗(yàn)在健康的男性志愿者身上進(jìn)行，向他們介紹了研究的背景和可能的結(jié)果，并征得他們的同意。例l:制備核酸mRNA"加帽"的mRNA通過利用T7RNA聚合酶(T7-OptimRNAkits,CureVac,Ttibingen,Germany)進(jìn)《亍體夕卜"徑流轉(zhuǎn)錄(run-offtranscription)"來帝J備。此mRNA的編碼序列(從Acc.U02445克隆出的大腸桿菌P-半^^糖苷酶[lacZ]或從Acc.U47295克隆出的螢火蟲熒光蛋白酶[luc])在其3'端用a球蛋白未翻譯區(qū)和人工的聚A尾部(n=70)側(cè)面相接。小鼠實(shí)驗(yàn)中，mRNA用苯酚/氯仿/異戊基醇提取并用氯化鋰沉淀。然后將mRNA重新懸浮在水中，用分光光度計(jì)在260nm測量產(chǎn)量。最終，mRNA用醋酸銨沉淀并以無菌的方式重新懸浮在水中。pDNA不含內(nèi)毒素的pCMV-熒光素酶DNA用去內(nèi)毒索的質(zhì)粒提取試劑盒(EndoFreePlasmidMaxiKit)(Qiagen，Hilden，Germany)來制備。pDNA用醋酸銨沉積并最后以無菌方式重新懸浮在水中。pCMV-熒光素酶質(zhì)粒通過將來自pGL3(Acc.U47295)的XbaI-(用Klenow片段鈍化)HindIII片段插入到pCMV-HB-S(Acc.A44171)的NsiI-(用Klenow片段鈍化)HindIH-消4fc質(zhì)粒的方式來修飾。pDNA的報道基因受控于CMV啟動子。儲備溶液儲備溶液通過將mRNA或DNA稀釋在無菌水中來制得并用分光光度計(jì)(以260、280和320nm)來確定濃度和純度。質(zhì)量控制對于所有的核酸樣本，其濃度用分光光度計(jì)確定，并且其完整t生用甲醛-瓊脂凝膠電泳(mRNA)或限制性消化和TBE-瓊脂凝膠電泳(DNA)的方法來檢驗(yàn)(圖10)。除了完整性之外，所有核酸樣本的翻譯能力用電穿^^BHK21細(xì)胞來分析。為此目的，200fil的含10)Lig核酸的PBS中的1至3百萬個細(xì)胞在0.4cm試管中以300V和150pF進(jìn)行電穿孔。電穿孔后8到24小時后，用適當(dāng)?shù)姆椒?X-gal染色或熒光檢測)分析經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)(圖10)。對于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，只有在BHK21細(xì)胞中呈現(xiàn)了蛋白質(zhì)表達(dá)并在凝膠電泳中有合適的完整性的核酸樣本才被注射。例2:RNA注射溶液的制備對于HBS和PBS來說，mRNA在lx濃度的緩沖液中稀釋。對于含或不含乳酸鹽的RL注射緩沖液和其各種變化(不含Ca2+,K+,Na+中的一個)(成分和濃度參考材料l.注射緩沖液)，mRNA稀釋在0.8x濃度的緩沖液中。除非特別提到，否則含20)agmRNA的100注射緩沖液用于每只鼠耳。為了去除mRNA中的二級結(jié)構(gòu)，RNA注射緩沖液在8(TC加熱5分鐘。然后，將該溶液放在冰上5分鐘。最后，將RNA注射液吸到Sub-Q(BectonDickinson,Heidelberg,Germany)注射器中。每次注射用不同的注射器。質(zhì)粒DNA(pDNA)稀釋在lx濃度的PBS中。例3:體外檢測熒光素酶的活性為了體外檢測熒光素酶的活性，制備了組織溶解產(chǎn)物。為此目的，該組織用杵和研缽在液氮下粉碎，殘留的小塊用800nl溶解緩沖液(25mMTrisHC1,2mMEDTA,10%(w/v)甘油，1%(w/v)氚核X-100加上新加的2mMDTT和lmMPMSF)均勻化。在掌上離心機(jī)上離心(IO分鐘，13000轉(zhuǎn)/分,4。C)后得到勻漿上清液。llOpl此溶解產(chǎn)物的等分試樣在-80。C儲存。為了測量熒光素酶的活性，等分試樣在冰上解凍，50^1溶解產(chǎn)物的光發(fā)射用光度計(jì)(LB9507,Berthold，BadWildbad,Germany)測量15秒。測量之前，光度計(jì)自動加入300)al緩沖液A(25mM氨基乙酰氨基乙酸，15mM硫酸鎂，5mM新加入的ATP，pH7.8)和緩沖液B(250)iM水中的熒光素)到溶解產(chǎn)物中。為了標(biāo)準(zhǔn)化，在所有的測量中使用了一系列的重組熒光蛋白稀釋液(QuantiLum,Promega，Madison,USA)。用此標(biāo)準(zhǔn)方法，計(jì)算出每次單獨(dú)測量的熒光素酶分子的量。對于每份溶解產(chǎn)物，熒光素酶的活性在不同的曰期兩次測量，計(jì)算出熒光素酶的平均活性。在所有具有高于檢測極限的熒光素酶活性的溶解產(chǎn)物，熒光素酶分子的量的變化系數(shù)(n=4)低于10。％。此檢測極限(在圖中用帶數(shù)字的粗線表示)用溶解緩沖液的測量值加上這些值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值來計(jì)算(n=80)。例4:體內(nèi)生物發(fā)光檢測為了檢測活的動物體上注射的熒光素酶，在注射入核酸后一段特定時間后，麻醉小鼠。小鼠被分成3個不同的組在第I組小鼠中，100plRL注射緩沖液被注射到左耳，并且含在100)LilRL注射緩沖液中的20)ig編碼熒光素酶的mRNA被注射到左耳。在第II組小鼠中，含20iag編碼熒光素酶的mRNA的100plRL注射緩沖液被注射到左耳和右耳。在第III組中，lOOplRL注射緩沖液被注射到右耳，含在lOOjalRL注射緩沖液中的20pg編碼熒光素酶的mRNA被注射到左耳。然后小鼠被i.p.注射含20mg/ml熒光素(Synchem,Kassel,Germany)的200WPBS(過濾除菌的)。熒光素注射后5分鐘，收集20分鐘內(nèi)小鼠的光發(fā)射。為此目的，小鼠被放到預(yù)先加熱至37X:的黑盒子中(第I組在左側(cè)，第II組在中間，第III組在右側(cè))。盒子裝有Aequoria全景成像照相機(jī)(Hamamatsu，Japan)。光發(fā)射以假彩色圖象顯示，與小鼠在正常光線下的灰度圖象相重疊。類似地，還用含20嗎編碼熒光素酶的mRNA的含乳酸鹽RL注射緩沖液、不含氯化鈉而含乳酸鹽的RL注射緩沖液和不含氯化鈣而含乳酸鹽的RL注射緩沖液進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)。例5:卩-半乳糖苷酶活性和組織結(jié)構(gòu)刮干凈了的鼠耳被切除，植入在含Tissue-TekO.C.T化合物(Sakura,Zoeterwuode，Netherlands)的介質(zhì)中并儲存在-80。C。從這些小塊中切下的20個連續(xù)的20|am厚的橫向冰凍切片被分成五組放置在SuperFrost⑧+標(biāo)本固定器(Langenbrinck，Emmendingen,Germany)上(圖11)，一組內(nèi)兩個切片之間的垂直距離大約是100pm。然后切片在空氣中干燥并儲存在-2(TC，直到它們被染色。為了對轉(zhuǎn)移了的mRNA(編碼大腸桿菌P-半乳糖苷酶)已被吸收并已被翻譯的區(qū)域進(jìn)行第一次篩選，第一組切片用X-gal染色。為此目的，標(biāo)本固定器暴露在室溫中，用ImmEdge筆(Vektor,Burlingame，USA)勾出輪廓。然后，切片用含2%甲醛的PBS來固定15分鐘。然后用PBS將標(biāo)本固定器洗3次，2分鐘，接著在含X-gal染色溶液(1mg/ml剛加入的X-gal，5mM氰鐵酸鉀，5mM氰亞鐵酸鉀，1mM氯化鎂，15mM氯化鈉，60mMfl酸氫二鈉，40mM磷酸二氫鈉)的潮濕箱中37。C下染色一整夜。沖洗標(biāo)本固定器2次、2分鐘來終止染色，并用Hydro-Matrix(Micro-Tech-Lab，Graz,Austria,用水稀釋了二次)介質(zhì)來處理它們。為了得到有關(guān)組織形態(tài)的信息，對于另一組切片，X-gal染色與蘇木精-伊紅(HE)染色相結(jié)合進(jìn)行。為此目的，在X-gal染色之后，切片在PBS中沖洗3次，每次2分鐘，并再在雙蒸水里面洗5分鐘，然后，用Mayershaemalaun(Merck，Darmstadt,Germany)進(jìn)行二次染色。該染色處理在活水下進(jìn)行10分鐘，然后，在水中用0.1%伊紅Y(Sigma,Schnelldorf,Germany)進(jìn)行10分鐘的對比染色。然后在雙蒸水中快速地沖洗，終止染色，然后用遞增濃度的酒精脫水(2分鐘80%乙醇，2分鐘95%乙醇，2分鐘100%乙醇，5分鐘100%二甲苯)。最后，干燥了的切片用Roti⑧-Histokitt(Roth,Karlsruhe，Germany)介質(zhì)處理。.為了確定用威NA轉(zhuǎn)染的目標(biāo)細(xì)胞是否是抗原遞呈細(xì)胞，對MHC第II類分子(用APC表達(dá))和mRNA轉(zhuǎn)移(與(3-半乳糖苷酶的表達(dá)有關(guān))進(jìn)行雙染色。對MHC第II類分子進(jìn)行免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測。對于兩種方法，在所有的3個步驟之間，切片都用PBS沖洗3次，每次2分鐘。對于免疫組織化學(xué)檢測程序，切片用PBS內(nèi)1%(w/v)甲醛(Fluka)來固定。然后用純的丙酮浸泡30秒去除油脂。之后，立即在室溫下用含4%山羊血(VektorLaboratoriesInc.,Burlingame,CA)禾卩50|ag/ml抗生素蛋白的PBS進(jìn)行阻斷(blocking)。剩余的生物素結(jié)合位點(diǎn)用50lag/ml生物素(AppliChem,Darmstadt,Germany)阻斷，同時用單克隆抗體2G9(BectonDickinson,Heidelberg,Germany)或合適的同型對照抗體(大鼠IgG2a，R35-95,BectonDickinson,Heidelberg,Germany)染色MHC第II類分子，每種情況下都稀釋成l嗎/ml(均在PBS中)。之后，在室溫下用生物素化的山羊/抗大鼠IgG(3pg/ml)媒介和2X小鼠血清(CCPraNeustadt,Germany)在PBS中將切片培養(yǎng)30分鐘。然后加入ABC復(fù)合體(PBS中的1:100的反應(yīng)物A禾QB)(VektorLaboratoriesInc.,Burlingame，CA)，在室溫下維持30分鐘。用剛制備的已通過0.45pm過濾器過濾的3-氨-9-乙基咔吧唑(3-amino誦9-ethylcarbazole，AEC，Sigma)基質(zhì)溶液(0.5mg/mlAEC，0.015%過氧化氫,50mM醋酸鈉，pH5.5)來檢驗(yàn)MHC第II類分子染色的完成。底物反應(yīng)通過用水沖洗5分鐘兩次并用PBS沖洗5分鐘3次來終止。如上所述那樣，接著進(jìn)行X-gal染色。免疫熒光檢測也使用了類似的染色方法。在丙酮處理步驟之后，切片在室溫下在阻斷緩沖液(PBS中1%的牛血清白蛋白)中阻斷50分鐘。然后將切片用在阻斷緩沖液中稀釋至1pg/ml的原發(fā)抗體(2G9或同型對照抗體)培養(yǎng)40分鐘。然后，在室溫下用AlexaFluor546山羊/抗大鼠IgG(1:400，分子探針，Leiden，Netheriands)在阻斷緩沖液中培養(yǎng)40分鐘。最后，進(jìn)行洋紅色-gal染色。為此目的，染液中的X-gal用0.1mg/ml的洋紅色-gal(Peqlab,Erlangen,Germany)來代替。切片用帶有AxiocamHRc照相機(jī)和Axiovision4.0軟件的Zeiss(Oberkochen,Germany)Axioplan2顯微鏡來進(jìn)行分析，并線性調(diào)節(jié)照片的顏色和對比度。例6:人體的RNA轉(zhuǎn)移和翻譯此實(shí)驗(yàn)在健康的男性志愿者身上進(jìn)行。注射部位被刮去毛發(fā)，消毒并用RnaseZap(Ambion,Austin,USA)溶液進(jìn)行了處理。然后，在一組中注射0.8xRL注射緩沖液中的120嗎mRNA，總量為200pl。在其它組中，用下列RL注射緩沖液代替-不含氯化鈉含乳酸鹽的RL注射緩沖液，-不含氯化鉀含乳酸鹽的RL注射緩沖液，-不含氯化鈣含乳酸鹽的RL注射緩沖液。注射后15小時，局部麻醉狀態(tài)下取直徑4mm的活組織(模壓取出)?；罱M織在液氮中迅速冷凍，并如上描述的那樣進(jìn)行制備(例3)。研碎了的活組織重懸在600^1消化緩沖液中。統(tǒng)計(jì)評估兩個不同組的平均值采用"非參數(shù)曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)(non-parametricMann-Whitneyranksumtest)"來進(jìn)行比較。p值<0.05被認(rèn)為是顯著的差異，并且在圖中示出。例7:對各種染色處理的評價為了識別出在體內(nèi)吸收并表達(dá)mRNA的細(xì)胞類型，使用了組織學(xué)處理，使得可以將mRNA的檢測與細(xì)胞類型特異性染色相結(jié)合。因?yàn)閙RNA的轉(zhuǎn)移不能用熒光探針檢測出，因而執(zhí)行了一種處理，在其內(nèi)，編碼大腸桿菌P-半乳糖苷酶的mRNA與各種靛青染料(X-gal或洋紅-gal)相結(jié)合使用。1、B-半乳糖苷酶檢測系統(tǒng)的特別特征為了確保靛青染色處理中所有的細(xì)胞都在單層中呈現(xiàn)，制備了小鼠耳的薄切片。考慮到小鼠耳部肌肉的形態(tài)結(jié)構(gòu)(大約0.5mm至1mm厚的薄層)和只可用冰凍切片的事實(shí)(p-半乳糖苷酶在制備石蠟切片所需的某些步驟中被熱失活)，以及需要盡可能多的高質(zhì)量的切片的需求，制備這些切片事實(shí)上很困難。盡管如此，也可能制備出幾組厚度為20|am的高質(zhì)量的切片。兩種不同的染料用來檢測P-半乳糖苷酶的活性。X-gal(陽性細(xì)胞被染成藍(lán)綠色)的結(jié)果比用洋紅-gal(陽性細(xì)胞被染成紫羅蘭色)具有更好的對比度。然而，同時，非特定的背景染色，例如，由于毛囊引起的染色，在X-gal染色中很易見到。盡管如此，清楚地區(qū)分mRNA的轉(zhuǎn)移也是可能的。對于洋紅-gal染色來說，看不到非特定的背景染色。2、靛青和免疫組合染色的要求將mRNA轉(zhuǎn)移染色(靛青染料)和特定細(xì)胞特定的標(biāo)記物染色(特定抗體)相結(jié)合，需要對固定劑和組合染色(靛青染色包括在37"C下培育14小時)的順序進(jìn)行一些適應(yīng)性修飾。先用丙酮固定再用抗體染色，可得到最好的抗體染色結(jié)果(對第II類MHC分子)。相反，首先用甲醛和戊二酸的混合物固定在進(jìn)行靛青染色，可得到(3-半乳糖苷酶活性的最佳結(jié)果?？紤]到環(huán)境的各種變化，采用了如下步驟用甲醛固定但不用戊二醛，然后進(jìn)行抗體染色。不用戊二醛是因?yàn)殡m然它對靛青染色有輕微的影響，但它會大大地增加組織的自身熒光。用甲醛來固定是由于下列原因1、比用丙酮可更好地保護(hù)組織的形態(tài)；2、靈敏強(qiáng)烈的靛青染色需要用甲醛固定；并且3、用甲醛固定時抗-MHC第II類抗體染色的質(zhì)量仍然是可接受的。然后在純丙酮中進(jìn)行短暫的培養(yǎng)來去除油脂和脂肪。使用水溶性的介質(zhì)時，這可得到更好的質(zhì)量(很少或沒有氣泡)。最后，當(dāng)首先進(jìn)行此染色時，可得到高質(zhì)量的抗體染色。染色順序(甲酲固定)只對靛青染色的質(zhì)量有輕微的影響。3、在靛青和免疫組合染色中染料的相容性兩種不同染色的組合不僅需要兩種方法中各種步驟的相容性，也需要用于檢測的探針的相容性。原則上，免疫染色可使用沉淀染料(酶探針)或熒光染料(標(biāo)記的探針)。為了將靛青染料和沉淀染料組合起來，采用X-gal和AEC。雙陽性細(xì)胞在此染色中呈現(xiàn)出黑色(圖158)。很難區(qū)分高強(qiáng)度染色了的各個陽性細(xì)胞。因此，最好將洋紅-gal與熒光染料AlexaFluor546組合。用洋紅-gal來代替X-gal是基于兩個原因1、洋紅-gal染色的強(qiáng)度更弱(甚至當(dāng)染料加到飽和量時)，2、洋紅-gal陽性細(xì)胞的顏色與熒光染料AlexaFluor546發(fā)射的波長對應(yīng)得更好。兩個因素使AlexaFluor546熒光信號的淬熄(quenching)降到最低程度。此染料組合實(shí)際上允許兩個信號的檢測(圖13)，至少當(dāng)?shù)迩嗳旧皇翘珡?qiáng)時(這便是切片中mRNA轉(zhuǎn)移陽性細(xì)胞的情況)。參考文獻(xiàn)1.UlmerJ.B.,Oot:(9—.2001，4:192-1972.J.A.Wolffe"/"5c/e薦247,1465-1468(19卯).3.H.L.Robinson,L.A.Hunt,R.G.Webster,Wcc/he11,957-960(1993).4.J.B.Ulmere"/"5t/e刀ce259,1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