專利名稱：活性劑向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的鼻內(nèi)施用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
在此描述的主題涉及活性劑向哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的鼻內(nèi)施用的方法。
背景 盡管在藥物遞送和藥物向腦遞送的機制認識方面有新的發(fā)展，藥物向中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的遞送仍然是個挑戰(zhàn)。例如，由于血腦屏障(BBB)，CNS目標難以從外周循環(huán)接近，血腦屏障為大多數(shù)、特別是極性的藥物從循環(huán)血液進入腦部提供了有效屏障。繞過與BBB相關(guān)的難題將藥物遞送到CNS的嘗試包括1)設(shè)計親油性分子，作為具有低于600Da分子量、容易擴散通過屏障的脂質(zhì)可溶藥物；2)將藥物結(jié)合到轉(zhuǎn)運蛋白分子，所述轉(zhuǎn)運蛋白分子通過可浸透轉(zhuǎn)運系統(tǒng)跨越BBB，例如轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、IGF-1和leptin；和3)將藥物結(jié)合到聚陽離子分子，例如帶正電荷的蛋白質(zhì)，其優(yōu)先地結(jié)合帶負電的內(nèi)皮表面(參見，例如Ilium，Eur.J.Pharm.Sci.111-18(2000)andreferences therein；W.M.Partridge.″Blood-brain barrier drug targetingthefuture of brain drug development″，Mol Interv.3(2)90-105(2003)；.W.M.Partridge等人，″Drug and gene targeting to the Brain withmolecular Trojan horses″，Nature Reviews-Drug Discovery 1131-139(2002))。
已經(jīng)探索了鼻內(nèi)途徑作為非侵入性方法來繞過BBB用于藥物向CNS的轉(zhuǎn)運。雖然對于許多小分子和某些肽和較小的蛋白質(zhì)，已經(jīng)證明了向CNS的鼻內(nèi)遞送，很少有證據(jù)表明蛋白質(zhì)大分子通過鼻內(nèi)途徑向CNS遞送，推測是由于更大的尺寸以及對于每種大分子或大分子種類獨特的可變理化性質(zhì)，其可能阻礙直接的鼻-腦遞送。
鼻內(nèi)遞送的最初的物理障礙是鼻的呼吸性和嗅上皮。已經(jīng)顯示了在體內(nèi)緊密連結(jié)的上皮的透過性是可變的，并且一般限于流體動力學半徑低于3.6A的分子；對于具有大于15A的半徑的球狀分子，透過性被認為是可忽略的。(B.R.Stevenson等人，Mol.Cell.Biochem.83，129-145(1988))。因而，要施用的分子的大小被認為是實現(xiàn)大分子向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的鼻內(nèi)轉(zhuǎn)運的一個重要因素。具有20kD的葡聚糖分子量、熒光素標記的葡聚糖可以從大鼠鼻腔遞送到腦脊液，然而40kDa葡聚糖不能(Sakane et al，J.Pharm.Pharmacol.47，379-381(1995))。還報道了傳染性的有機體，例如病毒，可以通過鼻子的嗅區(qū)進入腦(S.Perlman etal.，Adv.Exp.Med.Biol.，38073-78(1995))。在迄今為止公開的遞送研究中，向CNS的鼻內(nèi)遞送效力是非常低的，大的球狀大分子，例如抗體和它們的片段的遞送還未被證明。然而，由于對于治療具有CNS靶點的病癥，例如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、多發(fā)性硬化、中風、癲癇癥和代謝與內(nèi)分泌病癥，抗體、抗體片段和抗體融合分子是潛在有用的療法，希望的是提供一種將這些大分子非血管地遞送到CNS的方法。
相關(guān)技術(shù)和與之相關(guān)的限制的上述實例是說明性的而非排除性的。在閱讀說明書和附圖的研究時，相關(guān)技術(shù)的其他限制對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯而易見。
發(fā)明概述 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的是，球狀蛋白質(zhì)分子，例如與治療肽或蛋白相連的抗體片段，可以直接遞送到哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而繞過血腦屏障。因而，提供了向哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)遞送治療組合物的方法。上述方法在治療各種疾病或狀況中是有益的。因而還提供了治療方法。
在第一方面，提供了向哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)遞送治療組合物的方法。所述方法包括向哺乳動物鼻內(nèi)地施用治療組合物，其中所述治療組合物包括治療有效量的抗體片段和多肽。在一個實施方式中，所述抗體片段與所述多肽連接。
在一個實施方式中，鼻內(nèi)施用通過跨越鼻上皮組織，例如嗅上皮的吸收提實現(xiàn)了治療組合物的攝取，用于經(jīng)由嗅覺和或三叉神經(jīng)途徑的治療組合物遞送。
在另一個方面，提供了通過將多肽連接到抗體或抗體片段以形成融合多肽、鼻內(nèi)施用所述融合多肽來將多肽靶向CNS的方法。在一個實施方式中，所述多肽是生物學活性的，并且提供了治療效益。在另一個實施方式中，除了具有對內(nèi)源靶點，例如細胞或組織的結(jié)合親和性之外，抗體或抗體片段是生物學活性的并提供了治療效益。
在第三個方面，提供了治療方法，其中所述治療組合物的鼻內(nèi)施用提供了對狀況的治療，所述狀況響應(yīng)于或需要治療化合物向CNS的遞送。
根據(jù)此處的說明書、附圖和序列，這些和其他方面以及實施方式將是顯而易見的。
附圖的簡要說明 附

圖1是一圖表，顯示了在鼻內(nèi)施用125I-α-MSH模擬抗體之后25分鐘(空心柱)和5小時(斑點柱)在大鼠中125I-α-黑素細胞刺激素(125I-α-MSH)的分布，如實施例1中更完整描述的。
附圖2是一圖表，顯示了在125I-α-MSH模擬抗體向大鼠鼻內(nèi)(菱形)或靜脈內(nèi)(正方形)施用之后，作為按分鐘的遞送后時間的函數(shù)，以nmol為單位的125I-α-MSH模擬抗體的血液濃度，如實施例1中更完整地描述的。
附圖3是一圖表，比較了在鼻內(nèi)(空心柱)或靜脈內(nèi)(斑點柱)施用125I-α-MSH模擬抗體之后大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍組織中125I-α-MSH的分布，如實施例1中更完整描述的。
附圖4A-4D顯示了在鼻內(nèi)(附圖4A、4C)或靜脈內(nèi)(附圖4B、4D)施用125I-α-MSH模擬抗體之后25分鐘大鼠腦的冠狀面的計算機生成的放射自顯影。
附圖5是一圖表，顯示了在以nmol為單位的變動的劑量用α-MSH模擬抗體鼻內(nèi)治療之后24小時，在大鼠中按照克的累積的食物攝取的降低。
附圖6是一圖表，顯示了在2.5nmol(菱形)、6.25nmol(正方形)、25nmol(三角形)或50nmol(圓圈)的劑量用α-MSH模擬抗體鼻內(nèi)處理之后，按照小時作為時間的函數(shù)，在大鼠中累積的食物攝取的百分比降低。
附圖7一柱形圖，顯示了在用鼻內(nèi)施用的α-MSH模擬抗體(空心柱)或鹽水(斑點柱)處理之后指定的時間，在大鼠中按照克數(shù)的累積的食物攝取。
發(fā)明詳述 為了促進理解此處的主題的目的，現(xiàn)在將參考優(yōu)選的實施方式，使用專門的語言來描述相同的內(nèi)容。盡管如此要理解的是，不意圖限制本發(fā)明的范圍，主題的這些改變和進一步的修改，在此說明的原則的這些進一步的應(yīng)用是預(yù)期的，是所述主題相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常將想到的。
提供了通過非全身的途徑，例如，通過除了遞送或影響整個身體的途徑以外的途徑，向哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)包括腦和脊髓遞送治療組合物的方法。因而遞送方法允許定位和靶向治療組合物通過鼻部通道向腦的遞送。因此，所述方法涉及通過除了靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、穿表皮、腹膜內(nèi)或通過例如血液循環(huán)系統(tǒng)遞送組合物的類似途徑之外的途徑來遞送組合物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的是，通過鼻內(nèi)地施用融合分子，結(jié)合或連接到治療多肽的抗體片段可以被遞送到哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括腦和脊髓。
如在此使用的，術(shù)語“多肽”是指氨基酸的聚合物，而不是指特定長度的氨基酸聚合物。因而，例如，術(shù)語肽、寡肽、蛋白和酶都包括在多肽的定義之內(nèi)。這個術(shù)語還包括多肽的表達后修飾，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等等。在有些情況下，術(shù)語蛋白、肽和多肽可互換地使用。
鼻內(nèi)地應(yīng)用所述組合物，從而所述組合將被直接的，例如通過非全身途徑轉(zhuǎn)運到腦中。因而，此處提供了向哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)遞送治療組合物的方法。還提供了治療病癥的方法，并在以下描述了，所述病癥對于通過治療組合物向哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的應(yīng)用的治療起反應(yīng)。
A.組合物成分 用于鼻內(nèi)遞送的治療組合物是包括多肽以及抗體或抗體片段的融合多肽。在一個實施方式中，所述多肽是生物學活性的，優(yōu)選的引起或?qū)е绿囟ǖ纳镄Ч?，治療效果。以下給出了各種多肽的實例。將多肽連接到針對內(nèi)源靶點的抗體或抗體片段。除了具有對細胞靶點的結(jié)合親和性之外，所述抗體或抗體片段可以是生物學活性的以引起治療效果。與所述多肽和連接的抗體或抗體片段一同包含治療化合物或治療融合多肽，其可以如鼻內(nèi)遞送所期望的來配制。以下將說明的，相對于單獨組分，所述融合多肽的提高的大小和/或親水性降低了所述多肽的血液生物利用率，而容許遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，因而改善了藥物靶向同時降低了全身性暴露和相關(guān)的副作用。
i.抗體或抗體片段 可以選擇治療融合化合物中的抗體或抗體片段來充當靶向劑，以提供生物學期望的效果，或兩者。所述抗體或抗體片段可以是多克隆或單克隆抗體，現(xiàn)在說明示范性的抗體和片段、其來源和制備。
通過將期望的抗原注射到個體，一般是例如小鼠的動物中，可以獲得多克隆抗體，這是本領(lǐng)域中很好地建立了的。根據(jù)要治療的病癥來選擇抗原。例如，在治療阿爾茨海默氏病時，抗原可以是β-淀粉樣蛋白質(zhì)或其肽。在治療癌癥時，抗原可以是腫瘤相關(guān)抗原，例如本領(lǐng)域已知的各種肽，包括，例如，白細胞介素-13受體-α(如Joshi，B.H.et a/.，Cancer Res.601168-1172(2000)中討論的用于惡性星形細胞瘤/多形性成膠質(zhì)細胞瘤)，BF7/GE2(微粒體環(huán)氧化物水解酶；mEH)(如Kessler，R.等人，Cancer Res.601403-1409(2000)中討論的用于具有異常mEH表達的腫瘤的治療)，酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2(TRP-2)(用于多形性成膠質(zhì)細胞瘤的治療)，MAGE-1、3或6(用于成神經(jīng)管細胞瘤)和MAGE-2(用于多形性成膠質(zhì)細胞瘤)(都在Scarcella，D.L.，et al.，Clin.Cancer Res.，5331-341(1999)中討論)和存活蛋白(用于Bodey，B.B.，In Vivo，18(6)713-718(2004)中描述的成神經(jīng)管細胞瘤)。對于神經(jīng)外傷的治療以在脊髓損傷和急性腦損傷中抑制炎癥，抗原可以是TNF-α和各種白細胞介素，包括白細胞介素-1□?？乖约白魟├绺ナ贤耆魟?，可以被皮下或腹膜內(nèi)地多次注射到個體中。
提供抗原的免疫原性的另一種方法是將抗原結(jié)合或連接到蛋白質(zhì)上，所述蛋白質(zhì)在將產(chǎn)生抗體的特定物種中是免疫原性的。例如，抗原可以結(jié)合到polytuftsin(TKPR40)，一種天然的免疫調(diào)節(jié)物tuftsin的合成聚合物，其已經(jīng)顯示了在小鼠中提高合成肽的免疫原性(Gokulan K.等人，DNA Cell Biol.18(8)623-630(1999))。連結(jié)的方法可以包括使用雙功能或衍生活性劑，例如用于通過半胱氨酸殘基連結(jié)的馬來酰亞胺苯甲?；蚧撬徵牾啺孵?，用于通過賴氨酸殘基連結(jié)的N-羥基琥珀酰亞胺，戊二醛或琥珀酸酐。
在初次注射的足夠時間之后，例如，約一個月，可以用原始數(shù)量的肽抗原的一部分，例如數(shù)量的1/10來強化，然后可以在月7到14天后放血，可以通過本領(lǐng)域已知的標準方法從所述動物的血液分離抗體，包括使用蛋白A或蛋白G瓊脂糖的親和層析；離子交換層析，羥磷灰石層析或凝膠電泳。例如，在Harlow，D.and Lane E.，UsingAntibodies A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor LaboratoryPress，Woodbury，NY(1998)；以及Subramanian，G.，AntibodiesProduction and Purification，Kluwer Academic/Plenum Publishers，NewYork，NY(2004)中可以找到抗體純化步驟。
可以通過各種方法將非人類抗體人源化。例如，如Jones等人，Nature，321522-525(1986)；Reichmann et al，Nature，332323-327(1988)以及Verhoeyen等人，Science，2391534-1536(1988)中所描述的，非人類抗體中的高變區(qū)序列可以被人類抗體的相應(yīng)系列替換。當抗體意圖用于人類治療時，優(yōu)選的是選擇人類可變區(qū)用于生產(chǎn)人源化抗體中的指導，以降低抗體的抗原性。為了實現(xiàn)這一點，可以針對已知的人類可變區(qū)序列庫來篩選非人類抗體的可變區(qū)序列。例如，如Sims et al，J.Immunol.，1512296-2308(1993)以及Chothia etai，J.Mol.Biol.，196901-917(1987)中所描述的，鑒定出與動物的可變區(qū)序列最緊密匹配的人類可變區(qū)序列，在人類抗體中利用其中的人類骨架區(qū)域。
抗體可以是全長抗體或片段。可以修改全長抗體或片段以容許抗體或片段的改善的穩(wěn)定性，以及調(diào)節(jié)效應(yīng)物功能，例如與Fc受體的結(jié)合。例如，這可以通過利用人類或鼠同種型，或這些分子的變體，例如具有Ala/Ala突變的IgG4來實現(xiàn)，以失去效應(yīng)物功能并仍然保持IgG結(jié)構(gòu)。抗體片段可以是單體或二聚體，包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fc或Fv片段。這些片段可以通過例如完整抗體的蛋白水解降解來產(chǎn)生。例如，用木瓜蛋白酶消化完整的抗體產(chǎn)生兩個Fab片段。用胃蛋白酶處理完整的抗體提供了F(ab′)2片段。F(ab′)2片段是Fab的二聚體，其是通過二硫鍵結(jié)合到VH-CH1的輕鏈。F(ab)′2可以在溫和條件還原來打斷絞鏈區(qū)中的二硫鍵，從而將(Fab′)2二聚體轉(zhuǎn)變成Fab′單體。Fab′單體基本上是具有絞鏈區(qū)部分的Fab片段(對于其他抗體片段的更詳細描述，參見，F(xiàn)undamentalImmunology，W.E.Paul，ed.，Raven Press，N.Y.(1993))。
許多片段，包括具有Fc部分的那些，也可以通過本領(lǐng)域已知的DNA重組技術(shù)方法來產(chǎn)生。
各種各樣的抗體可以用來獲得抗體片段，所述抗體片段在此處描述的用于鼻內(nèi)遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組合物中使用。示范性的抗體包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。這些抗體的子類也可以用于獲得抗體片段。示范性的子類包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2?？贵w片段可以通過抗體的蛋白水解降解來獲得，所述抗體可以是如此前討論的產(chǎn)生的。在一個實施方式中，利用抗體片段來提高多肽的半衰期，抗體可以從沒有免疫的個體分離，可以通過先前在此描述的抗體分離步驟來分離。做為選擇，抗體片段可以通過先前在此描述的重組DNA方法來產(chǎn)生，以產(chǎn)生嵌合的或融合多肽。例如，利用編碼相應(yīng)蛋白質(zhì)以產(chǎn)生模擬抗體的質(zhì)粒，可以產(chǎn)生融合分子，其包括抗體片段和治療多肽。
抗體、抗體片段或與多肽連結(jié)的抗體片段、或其生物學活性部分，可以通過親和純化來純化，包括使用蛋白A柱和利用例如Superose柱的空間排阻層析。純化方法是本領(lǐng)域公知的。通過Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.，6511-519(1976)的技術(shù)和其改進與改良方法，可以制備特定的單克隆抗體。簡要地，這種方法包括能夠產(chǎn)生期望抗體的永生細胞系的制備。永生細胞系可以通過將選擇的抗原注射到動物中，例如小鼠，從所述動物的脾臟收獲B細胞，并將所述細胞與骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤來產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域的常規(guī)程序，根據(jù)它們分泌針對期望表位的高親和性抗體的能力來選擇和測試菌落。在選擇步驟之后，可以通過本領(lǐng)域已知的抗體純化步驟，包括先前在此描述的那些，從培養(yǎng)基或血清中分離單克隆抗體。
做為選擇，可以通過本領(lǐng)域已知的方法從表達庫重組地產(chǎn)生抗體。例如，從分離自淋巴細胞、優(yōu)選的分離自B淋巴細胞、優(yōu)選的分離自注射了期望抗原的動物的核糖核酸(RNA)來產(chǎn)生cDNA。cDNA，例如編碼各種免疫球蛋白基因的那些，可以通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增，并克隆到適合的載體，例如噬菌體展示載體中。這種載體可以添加到細菌懸浮液中，優(yōu)選的包括大腸桿菌(E.coli)的細菌懸浮液中，可以產(chǎn)生噬菌體或噬菌體顆粒，其展示了與所述噬菌體顆粒的表面相連的相應(yīng)抗體片段。通過本領(lǐng)域已知的方法，包括，例如，親和性純化技術(shù)，例如panning，通過篩選包括期望抗體的噬菌體顆粒，可以構(gòu)建子庫。然后可以利用子庫來分離來自期望的細胞類型，例如細菌細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞的抗體。在例如Griffiths，W.G.等人，Ann.Rev.Immunol.，12433-455(1994)；Marks，J.D.等人，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)；Winter，G.and Milstein，C，Nature，349293-299(1991)；以及Hoogenboom，H.R.and Winter，G.，J.Mol.Biol.，227(2)381-388(1992)中可以找到產(chǎn)生在此描述的重組抗體的方法以及其修改的方法。
人類抗體也可以在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生。例如，在嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈結(jié)合區(qū)(JH)基因的純合刪除引起了內(nèi)源抗體產(chǎn)生的完全抑制，從而轉(zhuǎn)移人類種系免疫球蛋白基因陣列到這種突變小鼠中引起了當用抗原免疫時人類抗體的產(chǎn)生。參見，例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551-2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362255-258(1993)；美國專利5,545,806；5,569,825；5,591,669；5,545,807和PCT公開WO 97/17852。
ii多肽 如上所述，抗體或抗體片段與多肽連結(jié)。優(yōu)選的，所述多肽是可以結(jié)合到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的區(qū)域的多肽。所述多肽進一步優(yōu)選的是對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有有益效果的多肽，并且包括對于由哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的功能，例如對于治療目的具有有益效果的多肽。通過結(jié)合到，例如，腦的各個區(qū)域中的細胞受體，所述多肽可以發(fā)揮它的效果。作為一個實例，為了α-黑素細胞刺激素(α-MSH)在體重降低中發(fā)揮它的效果，它結(jié)合到下丘腦中神經(jīng)元上的黑皮質(zhì)素4受體(MCR-4)。作為進一步的實例，為了促紅細胞生成素(EPO)、活性EPO片段或EPO類似物改善中風或急性腦損傷之后的神經(jīng)功能，它必須結(jié)合到例如海馬細胞、星形細胞或類似細胞上的神經(jīng)元受體。
可以使用各種各樣的蛋白或肽。所述多肽可以具有約200道爾頓到約200,000道爾頓的分子量，但一般約300道爾頓到約100,000道爾頓。
在一個實施方式中，在附著之后，所述多肽以及抗體或抗體片段具有大于約25kDa，更優(yōu)選的大于約30kDa，再更優(yōu)選的大于約40kDa的組合分子量。
在另一個實施方式中，所述多肽具有低于約25kDa的分子量，并且是疏水性的。
各種各樣的治療蛋白、或其生物學活性部分，可以連接或附著到在此處描述的方法中使用的抗體片段上。所述蛋白優(yōu)選的是肽的形式。選擇的特定治療肽將取決于要治療的疾病或狀況(總起來說稱為“病癥”)。對于神經(jīng)變性病癥，例如，阿爾茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷頓舞蹈病，或涉及運動或意識功能，例如記憶的損失的其他疾病，神經(jīng)保護性或親神經(jīng)性活性劑是優(yōu)選的。神經(jīng)保護性或親神經(jīng)性活性劑可以是促進神經(jīng)元存活、刺激神經(jīng)發(fā)生和/或突觸發(fā)生、從β-淀粉樣蛋白誘導的神經(jīng)毒性援救海馬神經(jīng)元和/或降低tau磷酸化的活性劑。適合于治療這些神經(jīng)變性病癥和神經(jīng)紊亂的活性劑的實例包括促黃體激素釋放(LHRH)和LHRH的激動劑，例如deslorelin；神經(jīng)營養(yǎng)因子，例如來自神經(jīng)營養(yǎng)素家族的那些，包括神經(jīng)生長因子(NGF)、腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3和神經(jīng)營養(yǎng)素-4/5；成纖維細胞生長因子家族(FGF)，包括酸性成纖維細胞生長因子和堿性成纖維細胞生長因子；神經(jīng)激肽家族，包括纖毛神經(jīng)營養(yǎng)因子、白血病抑制因素和促心臟激素-1；轉(zhuǎn)化生長因子β家族，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β-1-3(TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、生長/分化因子，例如生長分化因子5到15，膠質(zhì)細胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、neurturin、artemin活化素和persephin；表皮生長因子家族，包括表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-α和neuregulins；胰島素樣生長因子族，包括胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和胰島素樣生長因子-2(IGF-2)；垂體腺苷酸環(huán)化酶活化多肽(PACAP)/胰高血糖素超家族，包括PACAP-27、PACAP-38、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽，例如GLP-1和GLP-1、生長激素釋放因子、血管活性腸肽(VIP)、肽組氨酸甲硫氨酸、分泌和葡萄糖依賴性胰島素營養(yǎng)多肽；和其他神經(jīng)營養(yǎng)因子，包括活性-依賴性神經(jīng)營養(yǎng)因子和血小板衍生的生長因子(PDGF)。這種活性劑還適合于治療急性腦損傷、慢性腦損傷(神經(jīng)發(fā)生)和神經(jīng)心理學病癥，例如憂郁癥。
對于中風治療來說，治療劑可以是保護皮層神經(jīng)元免于氧化氮介導的神經(jīng)毒性、促進神經(jīng)元存活、刺激神經(jīng)發(fā)生和/或突觸發(fā)生和/或從葡萄糖剝奪援救神經(jīng)元的治療劑。這些治療劑的實例包括先前在此描述的神經(jīng)營養(yǎng)因子，其活性片段，以及促紅細胞生成素(EPO)、EPO的類似物，例如氨基甲酰化的EPO，和EPO的活性片段?？梢允褂玫腅PO類似物的實例包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，和在例如美國專利No.5,955,422和5,856,298中描述的。在本發(fā)明中有用的、針對例如EPO、粒細胞集落刺激因子(GCSF)的肽生長因子模擬物和拮抗劑可以如K.Kaushansky，Ann.NY Acad.Sci.，938131-138(2001)所綜述的和如Wrighton等人，Science，273(5274)458-450(1996)對EPO模擬肽配體所描述的來篩選。對于肽生長因子或在此描述的其他肽或蛋白質(zhì)的模擬物、激動劑和拮抗劑可以長度上短于所述模擬物、激動劑或拮抗劑基于的肽生長因子或其他多肽。
用于治療飲食病癥，例如用于體重減輕(厭食)和體重增加(肥胖)的保護的治療多肽包括黑皮質(zhì)素受體(MCR)激動劑和拮抗劑。適合的MCR激動劑包括α-黑素細胞刺激素(α-MSH)以及β和γ-MSH，和其衍生物，包括人類α-MSH的氨基酸1到13(SEQ ID NO1，SYSMEHFRWGKPV)和特異性受體結(jié)合氨基酸序列4-10，如促腎上腺皮質(zhì)激素中的(MSH/ACTH 4-10)，黑皮質(zhì)素受體-3(MCR3)或黑皮質(zhì)素受體4(MCR4)激動劑，例如melanotan II(MTII)，強力的非選擇性MCR激動劑，MRLOB-0001和所述肽或蛋白質(zhì)的活性片段。用于肥胖治療的其他肽包括激素肽YY(PYY)，特別是所述肽的氨基酸3到36，leptin和ghrelin，纖毛神經(jīng)營養(yǎng)因子或其類似物，胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)胰島素模擬物和/或敏化劑，leptin，leptin類似物和/或敏化劑，以及多巴胺生成性、去甲腎上腺素能劑和serotinergic劑。
調(diào)節(jié)體重穩(wěn)態(tài)的相應(yīng)MCR拮抗劑包括endocannabinoid受體拮抗劑，脂肪酸合成受體抑制物，ghrelin拮抗劑，黑色素濃縮激素受體拮抗劑，PYY受體拮抗劑和酪氨酸磷酸酶-1B抑制物(J.Korner等人，J.Clin.Invest，111565-570(2003))。MCR拮抗劑，例如內(nèi)源的MCR3和MCR4拮抗劑刺鼠信號蛋白(ASIP)和刺鼠相關(guān)蛋白質(zhì)(AGRP)，以及它們的類肽變體和模擬物可以用于控制體重穩(wěn)態(tài)和治療飲食病癥，例如厭食(YK Yang等人，Neuropeptides，37(6)338-344(2003)；DA Thompson et al，Bioorg Med Chem Lett，131409-1413(2003)；以及C.Chen et al，J.Med.Chem.，47(27)6821-30(2004))。
先前提及的結(jié)合黑皮質(zhì)素受體(MCR)的肽激素和其類似物對于控制炎癥和改善雌雄性別功能障礙也是有用的(A.Catania等人，Pharmacol Rev，56(1)1-29(2004))。
用于內(nèi)分泌病癥，例如糖尿病的治療的治療蛋白包括，例如，胰高血糖素樣肽1(GLP-1)；來自GLP-1家族的肽，包括垂體腺苷酸環(huán)化酶活化多肽(PACAP)、血管活性腸肽(VIP)、exendin-3和exendin-4；以及胰島素樣生長因子(IGF-1)、IGF結(jié)合蛋白3(IGFBP3)和胰島素，以及其活性片段。
用于睡眠病癥，例如失眠癥的的治療的治療多肽包括生長激素釋放因子、加壓素、和加壓素的衍生物，包括desmopressin、glypressin、ornipressin和ternipressin；包括的有與相同受體靶點結(jié)合、引起相同/相似或相反生物反應(yīng)的肽變體和模擬肽配體。用于自體免疫病癥，例如多發(fā)性硬化的治療的治療蛋白包括干擾素，包括β-干擾素和轉(zhuǎn)化生長因子β。
用于精神病癥，例如精神分裂癥的治療的治療多肽包括neuregulin-1、EPO、EPO的類似物，例如氨基甲?；腅PO，和先前在此描述的EPO的活性片段以及EPO模擬物。各種神經(jīng)營養(yǎng)因子和調(diào)節(jié)肽激素，例如腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDGF)和胰島素，可以用于治療憂郁癥，以及心理內(nèi)分泌學和代謝病癥。
用于腦的溶酶體保存病癥的治療的治療多肽包括，例如，溶酶體酶。
用于治療飲食病癥，例如用于厭食的治療多肽包括，例如黑皮質(zhì)素受體(MCR)拮抗劑，例如刺鼠信號蛋白(ASIP)和刺鼠相關(guān)蛋白(AGRP)。
所述治療多肽可以是人類多肽，而所述多肽可以來自其他物種或可以合成地或重組地產(chǎn)生。也可以修改或重新工程化原始的氨基酸序列，以改善效力或改善特異性(例如，消除與多個受體的結(jié)合)和穩(wěn)定性。
在此使用的治療多肽也可以是模擬物，例如與相同受體結(jié)合，但具有與內(nèi)源人類肽非同源的氨基酸序列的分子。例如，所述激動劑和拮抗劑，包括黑皮質(zhì)素受體、生長激素釋放因子受體、加壓素受體、激素肽YY受體、神經(jīng)肽Y受體或促紅細胞生成素受體的激動劑和拮抗劑，可以包括天然的氨基酸，例如L-氨基酸或非天然的氨基酸，例如D-氨基酸。所述多肽中的氨基酸可以通過肽鍵連接，或者在包括擬肽的修改的肽中，可以通過非肽鍵連接(J.Zhang等人，Org.Lett，5(17)3115-8(2003))。
多肽模擬物，以及受體激動劑和拮抗劑，可以利用本領(lǐng)域已知的高通量篩選根據(jù)特定生物學功能和受體結(jié)合來選擇和產(chǎn)生。這些方法的可用性容許快速篩選數(shù)百萬隨機產(chǎn)生的有機化合物和肽來鑒定用于進一步開發(fā)的先導化合物。用于篩選小分子和肽的庫的策略，以及在發(fā)現(xiàn)例如針對EPO、GCSF和促血小板生成素的模擬物和拮抗劑方面的成功，由K.Kaushansky，Ann.NY Acad.Sci.，938131-138(2001)綜述了。
針對連接氨基酸的酰胺鍵的各種修飾可以針對在此描述的激動劑和拮抗劑來進行，這種修飾是本領(lǐng)域公知的。例如，在一般性綜述，包括在Freidinger，R.M.″Design and Synthesis of Novel BioactivePeptides and Peptidomimetics″J.Med.Chem.，465553(2003)，以及Ripka，A.S.，Rich，D.H.″Peptidomimetic Design″Curr.Opin.Chem.Biol.，2441(1998)中，討論了這些修飾方法。設(shè)計許多修飾來通過限制構(gòu)象柔性來提高肽的效力。
例如，所述激動劑和拮抗劑可以通過在酰胺鍵的氮或α-碳上包括其他烴基來修飾，例如Zuckerman等人的類肽策略，和例如Goodman，M.等人的α修飾(Pure Appl.Chem.，681303(1996))。酰胺氮和α碳可以連接在一起來提高額外的約束(Scott et al，Org.Letts.，61629-1632(2004))。
iii.連接 所述多肽連接到抗體或抗體片段來形成用于遞送的治療化合物。在一個實施方式中，抗體或抗體片段提高了多肽的穩(wěn)定性，從而提高了它的體內(nèi)半衰期，包括在哺乳動物的鼻腔和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。組合的多肽-抗體片段化合物在此還被稱為“模擬抗體”。在這個小節(jié)中，描述了連接兩個部分的方法。
抗體片段和多肽可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)，一般通過共價鍵來相互連接。連接或結(jié)合方法可以包括使用氨基酸接頭，包括使用甘氨酸和絲氨酸。通過本領(lǐng)域已知的和例如在Wong，S.S.，Chemistry ofProtein Conjugation and Cross-Linking，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1991)中討論的交聯(lián)或其他連接過程，片段和多肽可以被連結(jié)或連接。例如，可以通過本領(lǐng)域已知的同型雙功能和/或異型雙功能或多功能交聯(lián)接頭來結(jié)合多肽。交聯(lián)試劑的實例包括碳二亞胺，例如EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽)；亞氨基酯，N-羥基琥珀酰亞胺-酯，馬來酰亞胺，吡啶基二硫化物，酰肼和芳基疊氮化物?；钚詣┒嚯暮涂贵w片段之間的幾個附著點是預(yù)期的，包括肽的N-末端到抗體片段的C-末端的連接。做為選擇，多肽可以在其C-末端附著到抗體片段的N-末端。結(jié)合可以進一步經(jīng)由半胱氨酸或其他氨基酸殘基，或經(jīng)由抗體的碳水化物功能性部分。
iv.治療多肽-抗體化合物的制劑 在治療組合物中的活性劑多肽可以與藥學上可接受的載體或其他載體混合。載體可以是適合于例如作為滴鼻劑或作為鼻噴霧施用的液體，包括水、鹽水或其他含水或有機溶液，優(yōu)選的無菌溶液。所述載體可以是固體，例如粉未，凝膠或軟膏劑，可以包括無機填料，例如高嶺土、斑脫土、氧化鋅和二氧化鈦；粘度調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、pH值調(diào)節(jié)試劑、溶保護劑和其他穩(wěn)定性增強賦形劑，包括蔗糖、抗氧化劑、螯合劑；濕潤劑，例如甘油和丙二醇；以及其他添加劑，其可以根據(jù)需要和/或期望來摻入。
當治療化合物作為凝膠或軟膏劑來施用時，載體可以包括適合的固體，例如已知用于這些載體中的藥學上可接受的基礎(chǔ)材料，包括，例如，天然或合成聚合物，例如透明質(zhì)酸、海藻酸鈉、明膠、玉米淀粉、黃蓍樹膠、甲基纖維素、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、黃原膠、糊精、羧基甲基淀粉、聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、甲氧基乙烯順丁烯二酸酐共聚物、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮；油脂，例如蜂蠟、橄欖油、可可脂、芝麻油、豆油、山茶油、花生油、牛油、豬油和羊毛脂；白凡士林；石蠟；烴凝膠軟膏劑；脂肪酸，例如硬脂酸；醇類，例如十六醇和十八醇；聚乙二醇；和水。
當治療化合物作為粉未施用時，載體可以是適合的固體，例如環(huán)氧乙烷順丁烯二酸酐共聚物、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇；聚丙烯酸酯，包括鈉、鉀或聚丙烯酸銨；聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、羧乙烯基聚合物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇；纖維素，包括纖維素、微晶纖維素和α-纖維素；纖維素衍生物，包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和乙基羥基乙基纖維素；糊精，包括α-、β或γ-環(huán)糊精、二甲基-β-環(huán)糊精；淀粉，包括羥乙基淀粉、羥丙基淀粉、羧甲基淀粉；多糖，包括葡聚糖、糊精和藻酸；透明質(zhì)酸；果膠酸；碳水化物，例如甘露醇、葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖和；蛋白質(zhì)，包括酪蛋白、明膠、幾丁質(zhì)和殼聚糖；樹膠，例如阿拉伯樹膠、黃原膠、黃蓍膠和葡甘露聚糖；磷脂和其組合。
粉未的顆粒大小可以通過本領(lǐng)域中的標準方法來確定，包括通過適當大小的網(wǎng)孔來篩選或篩分。如果粒子大小太大，可以通過標準方法調(diào)節(jié)大小，包括鍘碎、切割、壓碎、研磨、碾磨和微粉化。粉未的顆粒大小一般從約0.05μm到約100μm。優(yōu)選的顆粒不大于約400μm。
組合物可以進一步包括改善組合物的粘液粘附性、鼻耐受性或流動性的試劑，粘液粘附劑、吸收增強劑、添味劑濕潤劑、和防腐劑。當在含水載體中提高組合物的流動性的適合的試劑包括，羧甲基纖維素鈉、透明質(zhì)酸、明膠、褐藻膠、角叉菜膠、卡伯姆、半乳甘露聚糖、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基葡聚糖鈉和黃原膠。適合的吸收增強劑包括膽汁鹽、磷脂、甘草酸鈉、癸酸鈉、酒石酸銨、γ氨基乙酰丙酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸和草酰乙酸。用于含水組合物的適合的濕潤劑包括，例如，甘油、多糖和聚乙二醇。適合的粘液粘附劑包括，例如，聚乙烯基吡咯烷酮聚合物。
B.鼻部遞送 包括與多肽連接的抗體或抗體片段的治療組合物，可以通過各種方式施用，以下提供了一些示范性的方法。一旦被導入鼻腔，融合多肽的吸收可以經(jīng)由跨越嗅上皮的吸收而發(fā)生，所述嗅上皮存在于鼻腔的上三之一。吸收也可以跨越鼻呼吸上皮而發(fā)生，其受三叉神經(jīng)支配，處于鼻腔的下三分之二中。三叉神經(jīng)還支配著關(guān)節(jié)、口腔粘膜和面部和頭部的真皮的某些區(qū)域，鼻內(nèi)的施用融合多肽之后從這些區(qū)域的吸收也可能出現(xiàn)。
融合多肽的鼻內(nèi)遞送的一個示范性的制劑是液體制品，優(yōu)選的是基于水的制品，適合于作為進入鼻腔的液滴來應(yīng)用。例如，通過向后充分仰頭并將液滴施加到鼻孔中，可以將滴鼻劑滴入鼻腔中。液體也可以吸入到鼻中。
做為選擇，液體制品可以置入適合的設(shè)備，使得它可以被霧化用于通過鼻腔吸入。例如，治療劑可以置于塑料瓶噴霧器中。在一個實施方式中，所述噴霧器被有益地配置，以容許相當數(shù)量的噴霧被導向鼻腔的上三分之一區(qū)域或部分。做為選擇，按一定方式從噴霧器施用噴霧，以容許相當數(shù)量的噴霧被導向鼻腔的上三分之一區(qū)域或部分?！跋喈敂?shù)量的噴霧”在此是指至少約50％，進一步的至少約70％，但優(yōu)選的至少約80％或更多的噴霧被導向鼻腔的上三分之一部分。
另外，液體制品可以被煙霧化并通過吸入器，例如計量劑量的吸入器來應(yīng)用。優(yōu)選的設(shè)備的一個實例是Djupesland的美國專利6,715,485中公開的那種，其涉及雙向的遞送理念。在使用設(shè)備時，將末端具有封閉噴嘴的設(shè)備插入一個鼻孔中，患者或個體向管口吹氣。在呼氣期間，軟腭由于正壓關(guān)閉，從而分隔鼻腔和口腔。閉合的軟腭和密閉噴嘴的組合產(chǎn)生了氣流，在氣流中藥物顆粒被釋放進入一個鼻孔，轉(zhuǎn)動180度通過連同途徑并通過另一個鼻孔出來，因而實現(xiàn)雙向流動。
如本領(lǐng)域已知的，融合多肽也可以以干粉的形式遞送。適合的裝置的實例是以名稱DirectHalerTM nasal銷售的干粉鼻部遞送裝置，其在PCT公開NO.96/222802中公開。這種裝置還允許在給藥遞送期間關(guān)閉鼻腔和口腔之間的通路。用于遞送干燥制品的另一種裝置是以商品明OptiNoseTM銷售的裝置。
C.治療方法 在又一個方面，提供了治療方法。可以有益地使用所述治療方法來治療哺乳動物中的病癥，所述病癥可以通過向中樞神經(jīng)系統(tǒng)，例如腦和/或脊髓施用治療劑來治療。也就是說，所述病癥是一種病癥，其中通過作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活性劑，癥狀降低或被消除，病癥發(fā)展的速度降低，和/或病癥被消除。
在一個實施方式中，方法包括向哺乳動物的鼻腔，例如向哺乳動物鼻腔中由上鼻甲占據(jù)的的區(qū)域或部分中的細胞和/或組織施用治療有效量的抗體片段，所述抗體片段連接或結(jié)合到多肽。
所述方法可以用于治療各種病癥。適合的病癥包括，例如，神經(jīng)病學和神經(jīng)變性病癥，例如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷頓舞蹈病，以及本領(lǐng)域已知的引起記憶喪失的其他病癥，例如多梗塞癡呆、Creutzfeldt-Jakob病、雷維小體病、正常壓力性腦積水和HIV癡呆；或引起運動喪失的，例如中風、肌萎縮性側(cè)索硬化、重癥肌無力和Duchenne營養(yǎng)不良；內(nèi)分泌的、代謝的或能量平衡病癥，例如肥胖、糖尿病和睡眠病癥，包括失眠癥；自體免疫病癥，例如多發(fā)性硬化；厭食和中風或脊髓損傷的急性損傷的治療。
在一個實施方式中，向哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)遞送治療組合物的方法包括施用組合物到哺乳動物鼻內(nèi)，優(yōu)選的到嗅覺和/或三叉神經(jīng)末端，位于上鼻甲的鼻腔區(qū)域中的細胞和鼻部上皮細胞。這個地帶或區(qū)域一般位于，但不限于，鼻腔的上三分之一部分。
雖然不限于本發(fā)明實現(xiàn)其有益結(jié)果的任何理論，根據(jù)在此描述的方法鼻內(nèi)應(yīng)用的活性劑可以通過細胞外或細胞內(nèi)途徑直接到達腦部。參見，例如，Thome，R.G.et al，Neuroscience，127481-496(2004)。細胞內(nèi)途徑包括通過嗅覺感覺神經(jīng)元轉(zhuǎn)運。這可以包括，例如，吸收性或受體介導的內(nèi)吞作用進入嗅覺感覺神經(jīng)元，隨后轉(zhuǎn)運到嗅球血管球。對于另一個實例，這種轉(zhuǎn)運可以包括在三叉神經(jīng)內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)轉(zhuǎn)運，從而組合物被遞送到三叉神經(jīng)節(jié)以及三叉神經(jīng)腦干核復合物的部分，例如subnucleus caudalis。在這種細胞內(nèi)途徑中，治療劑可以首先通過鼻粘膜轉(zhuǎn)運。雖然包括免疫球蛋白的Fc部分(恒定區(qū))的抗體片段也可以通過前述途徑之一來遞送，遞送途徑之一可以包括由具有新生Fc受體(FcRn)的鼻粘膜上皮細胞采用的，取決于機制，其可以促進或阻礙組合物跨越嗅上皮的轉(zhuǎn)運。
組合物經(jīng)由鼻腔進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞外途徑包括直接進入腦脊液，通過與嗅覺系統(tǒng)相關(guān)的通道、管道或區(qū)室進入CNS實質(zhì)，所述嗅覺系統(tǒng)例如外周的嗅覺系統(tǒng)，包括連接鼻部通道與嗅球和嘴腦區(qū)域的系統(tǒng)；以及通過與三叉神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的通道、管道或區(qū)室進入CNS實質(zhì)，所述三叉神經(jīng)系統(tǒng)例如周圍三叉神經(jīng)系統(tǒng)，包括連接鼻部通道與腦干和脊索的系統(tǒng)(Thome，R.G.等人，Neuroscience 127481-496(2004))。在此使用的直接轉(zhuǎn)運包括經(jīng)由在此描述一種或多種非全身性途徑的轉(zhuǎn)運。
通過一種或多種在此描述的機制直接向中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運組合物容許繞過血腦屏障，并且克服與活性劑向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的全身性轉(zhuǎn)運相關(guān)的挑戰(zhàn)和缺點。另外，通過在此描述的方法轉(zhuǎn)運組合物可以容許使用較少的組合物，同時更大比例的施用劑量到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶點。對于在治療的個體中內(nèi)源產(chǎn)生的活性劑施用來說，生理效果一般比得上內(nèi)源的活性劑劑。
提供了治療有效量的治療組合物。如在此使用的，組合物的治療有效量是實現(xiàn)特定治療效果所需的組合物的量。例如，所述數(shù)量一般是達到特定的或期望的臨床終點所需的，例如病癥進展的降低，病癥的癥狀的嚴重度的降低和/或病癥的消除。這種數(shù)量將取決于施用的時間、施用途徑、治療的持續(xù)時間、使用的特定組合物和患者的健康狀態(tài)，是本領(lǐng)域已知的。熟練的技術(shù)人員將能夠確定最佳的劑量。
通過在此描述的方法鼻內(nèi)施用組合物，要理解的是，與全身性施用，包括靜脈內(nèi)、口服、肌肉內(nèi)腹膜內(nèi)或穿表皮的，等等相比，可以施用更小數(shù)量的組合物。當如在此描述的鼻內(nèi)施用時，實現(xiàn)期望的臨床的終點或治療效果所需的活性劑和/或組合物的數(shù)量與全身性施用相比可以更少。另外，在此處描述的遞送和治療方法中鼻內(nèi)施用組合物時，與相同數(shù)量的全身性施用相比，可以獲得更低約5倍到約500倍，進一步的約1O倍到約100倍的全身性暴露。此外，與相同數(shù)量的全身施用相比，可以獲得更低至少約5倍、進一步的至少約10倍、優(yōu)選的至少約20倍、進一步的至少約50倍的全身性暴露。在確定組合物的治療有效性時，可以監(jiān)視特定病癥的本領(lǐng)域已知的臨床終點。例如，對于阿爾茨海默氏病的適合的臨床終點包括，例如，記憶損失、語言退化、意識模糊、不安和情緒搖擺的降低；以及如通過標準方法測定的精神上操作視覺信息的改善的能力。
亨廷頓舞蹈病的適合的臨床終點包括不受控制運動的降低，以及智力能力的改善或不進一步降低。
對于帕金森氏病的適合的臨床終點包括，例如，特別是當靜止時四肢的顫抖(發(fā)抖或搖動)的降低，運動的提高(幫助克服運動徐緩)，移動的改善的能力(幫助克服運動不能)，較少剛性的四肢，拖曳步態(tài)的改善和改善的姿勢(矯正特征性的彎腰姿勢)。通過標準方法可以觀察這些臨床終點。其他適合的臨床終點包括神經(jīng)細胞退化的降低和/或神經(jīng)細胞退化方面沒有進一步下降，可以通過腦顯象技術(shù)，包括計算機輔助斷層(CAT)掃描、磁共振成象方法，或本領(lǐng)域已知的類似方法觀察。
肥胖的適合的臨床終點包括，例如，體重、體脂肪、食物攝取或其組合的降低。
睡眠病癥，例如失眠癥的適合的臨床終點包括，例如，睡眠能力的改善，特別是改善的快速眼動(REM)睡眠。
自體免疫病癥例如多發(fā)性硬化的適合的臨床終點包括，例如，腦病變的數(shù)量的降低，提高的末端強度，或末端的顫抖或麻痹的降低。通過先前在此描述的腦顯象技術(shù)可以觀察到腦病變數(shù)量的降低。其他適合的臨床終點包括神經(jīng)組織的炎癥的降低，其可以通過例如本領(lǐng)域已知的腰椎穿刺技術(shù)和隨后的腦脊液分析來確定。
在經(jīng)歷了中風的個體中，適合的臨床終點包括在受影響的血管中血流的增加，如通過本領(lǐng)域已知的和例如在Nabavi，D.G.，等人，Radiology 213141-149(1999)中描述的計算機斷層照相方法所測定的。進一步的臨床終點包括面部、臂或腿中麻痹的降低；或與中風相關(guān)的頭疼強度的降低。又一個臨床終點包括由于中風的細胞、組織或器官損傷或死亡的降低。細胞或組織損傷中的這種降低可以通過先前在此描述的腦成像技術(shù)，或本領(lǐng)域已知的類似方法來評定。
在神經(jīng)心理病癥例如精神分裂癥中適合的臨床終點包括，例如，變態(tài)行為的改善和幻覺和/或錯覺的降低。
根據(jù)本發(fā)明的方法治療的患者或個體一般是需要這種治療的患者或個體，包括具有可通過這種方法治療的特定病癥的患者或個體?；颊呋騻€體一般是哺乳動物，例如人類，而其他哺乳動物也可以被治療。
實施例 現(xiàn)在將參考特定的說明性實施例。要理解的是，提供了實施例來說明優(yōu)選的實施方式，不意圖由此限制范圍。另外，在此引用的所有文件是本領(lǐng)域技術(shù)水平的表現(xiàn)，通過以它們的整體引用而合并在此。
實施例1 鼻內(nèi)施用之后α-黑素細胞刺激素模擬抗體的腦分布 這個實施例顯示了，根據(jù)本發(fā)明的方法，在鼻內(nèi)施用后約25分鐘，α-黑素細胞刺激素模擬抗體(α-MSH模擬抗體)被轉(zhuǎn)運到腦中的各個區(qū)域并被檢測到，而降低了全身性暴露。該實施例進一步顯示了，遞送到腦的α-MSH模擬抗體在腦中至少保留直到遞送后5小時。
方法 制備α-MSH模擬抗體，充當模型和示范性的治療化合物來說明要求權(quán)利的方法。α-MSH模擬抗體是同型二聚融合分子，其由治療性的α-MSH多肽，在此確定為SEQ ID NO1，以及人免疫球蛋白G1(IgG1)單克隆抗體的Fc部分組成。使用重組DNA方法產(chǎn)生工程化的融合多肽。
α-MSH模擬抗體使用氯胺T方法通過Amersham Biosciences的碘-125委托標記服務(wù)來碘化。125I標記的α-MSH模擬抗體，與作為冷載體的未標記的α-MSH模擬抗體一同，鼻內(nèi)地或靜脈內(nèi)地施用給八只麻痹大鼠(Sprague Dawley，200-250g)。在通路滲透保護之后的通風櫥中進行鼻內(nèi)藥物施用。將每只大鼠背部置于具有37℃直腸探針的加熱板上，通過卷起的4×4紗布將大鼠的頭稍微抬高。溶于PBS中的未標記的模擬抗體摻入39μCi的125-I標記的α-MSH模擬抗體。含有大約13nmol或0.8mg α-MSH模擬抗體的100μl總體積，在15-20的時期內(nèi)每兩分鐘以10μl鼻滴液施用到交替的鼻孔中，施用到麻醉和備躺著的年輕雄性大鼠中。對于靜脈內(nèi)施用，通過尾靜脈以0.5ml的總體積(在鹽水中稀釋)作為彈丸注射來遞送125I標記的α-MSH模擬抗體。大鼠施用了完整劑量(與鼻內(nèi)的相等)或1/10的鼻內(nèi)劑量(含有39μCi的0.08mg或1.3nmol α-MSH模擬抗體)。每5分鐘直到25分鐘，采集血液樣品。在開始藥物施用之后約27分鐘或5小時，灌注大鼠來除去血液帶有的標記并固定。
在大鼠中鼻內(nèi)或靜脈內(nèi)遞送之后，評定CNS和外周器官中125I標記的α-MSH模擬抗體的分布。小心地切下來自腦、器官和外周組織的組織切片，稱重，以及γ計數(shù)。使用γ計數(shù)(定量分析)或通過冠狀腦切片的放射自顯影(定性分析)來評定α-MSH模擬抗體的濃度。每個組織切片和血液中的納摩爾濃度根據(jù)每份組織重量的計數(shù)數(shù)值以及放射性標記的蛋白質(zhì)的比活性來測定。
結(jié)果 如附圖1中所見，125I標記的α-MSH模擬抗體可以在施用后25分鐘之內(nèi)在鼻內(nèi)遞送到青年雄性大鼠之后在各個CNS組織中檢測到。附圖1進一步顯示了大多數(shù)125I標記的α-MSH模擬抗體在鼻內(nèi)遞送后5小時保持，表明α-MSH模擬抗體的半衰期大于5小時。更具體地可見的是125I標記的α-MSH模擬抗體到達下丘腦，α-MSH肽的作用的目標位點(結(jié)合到下丘腦神經(jīng)元上的MCR4)。此外，下丘腦(3nM模擬抗體)被鼻內(nèi)遞送靶向，而存在著對所有腦區(qū)域，特別是髓質(zhì)、橋腦和額葉皮層的顯著遞送。
表1進一步比較了鼻內(nèi)和靜脈內(nèi)施用的125I標記的α-MSH模擬抗體的分布。
表1 鼻內(nèi)和靜脈內(nèi)遞送之后α-MSH模擬抗體的分布。

靜脈內(nèi)遞送也靶向下丘腦。然而，盡管靜脈內(nèi)的施用有更高13.5倍的血液暴露(AUC)(參見表1，附圖1和2)，鼻內(nèi)施用產(chǎn)生了更大的CNS遞送。與靜脈內(nèi)施用相比，用鼻內(nèi)施用時肽對下丘腦、額葉皮層和髓質(zhì)的遞送分別是7.5、6.5和18倍高。表2顯示了通過比較各種比例的多肽組織濃度的鼻內(nèi)(i.n.)和靜脈內(nèi)(i.v.)遞送的相對有效性。具體地，對于鼻內(nèi)和靜脈內(nèi)遞送，遞送后25分鐘時在下丘腦中多肽濃度與在血液中多肽濃度的比例在表2中示出。對于鼻內(nèi)和靜脈內(nèi)遞送，遞送后25分鐘時在下丘腦中多肽濃度與在肝臟中多肽濃度的比例也在表2中示出。與靜脈內(nèi)遞送相比，將多肽遞送到下丘腦中，如48和75倍的比例所證明的，鼻內(nèi)遞送是顯著更有效的。
表2在靶向下丘腦時鼻內(nèi)和靜脈內(nèi)遞送的相對有效性 *i.n.鼻內(nèi)；i.v.＝靜脈內(nèi) 表1和附圖2中的數(shù)據(jù)還顯示了當鼻內(nèi)施用時，125I標記的α-MSH模擬抗體的全身性暴露是低的。根據(jù)血液AUC(靜脈內(nèi))/AUC(鼻內(nèi))比例，靜脈內(nèi)劑量的鼻內(nèi)十分之一數(shù)量產(chǎn)生了低13.5倍的全身性暴露，當靜脈內(nèi)給藥到鼻內(nèi)給藥時的肝臟蛋白濃度時，根據(jù)肝臟蛋白質(zhì)濃度的比例，產(chǎn)生了低10.5倍的暴露。進一步的，在14個動物中在嗅上皮中產(chǎn)生了一致的模擬抗體儲存(17.1+/-μM)，嗅覺和三叉神經(jīng)途徑的試驗蛋白質(zhì)濃度在鼻內(nèi)施用時是相似的，表明蛋白質(zhì)經(jīng)由嗅覺和三叉神經(jīng)途徑移動到CNS。比較相等的鼻內(nèi)和靜脈內(nèi)劑量，按照遞送到CNS和下丘腦的相等數(shù)量的蛋白質(zhì)，基于AUC(i.v.)/AUC(i.n.)比例，全身性暴露更低約96倍。
附圖3顯示了125I標記的α-MSH模擬抗體向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的遞送不可能是繼發(fā)通過血液的。例如，如附圖3中所見，當大鼠暴露于相比靜脈內(nèi)施用的10倍劑量鼻內(nèi)施用125I標記的α-MSH模擬抗體時，通過鼻內(nèi)施用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在更高的125I標記的α-MSH模擬抗體積累。
附圖4A-4D顯示了鼻內(nèi)(附圖4A，4C)或靜脈內(nèi)(附圖4B，4D)施用125I-α-MSH模擬抗體之后25分鐘，大鼠腦的冠狀面的計算機生成的放射自顯影。放射自顯影中的暗區(qū)相應(yīng)于高圖像亮度區(qū)域，其相應(yīng)于融合多肽遞送的區(qū)域。如附圖4A、4C中所見，其相應(yīng)于鼻內(nèi)治療的動物，在嗅束、下丘腦和額葉皮層中觀察到最高的圖像強度。這確認了定量測量的發(fā)現(xiàn)。
實施例2 在鼻內(nèi)施用α-MSH之后正常大鼠中累積的食物攝取的劑量依賴性降 低 這個實施例顯示了施用單劑量的N-乙?；摩?黑素細胞刺激素(Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2，SEQID NO1，由Phoenix Parmaceuticals，INC提供)足以實現(xiàn)劑量依賴性的藥效學響應(yīng)；具體地，累積的食物攝取的降低，在24小時的ED50為6-7nmol。
方法 組合了各九只大鼠的兩個組。在交叉設(shè)計中，一個組每周用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)載體給藥，另一個組用α-MSH肽給藥；接下來一周相反地向每個組施用治療。在研究之前，在2周的馴化周期內(nèi)慢慢地逆轉(zhuǎn)光循環(huán)。在每個實驗前24小時使小鼠禁食(水總是可獲得的)，在開始黑暗循環(huán)(或關(guān)燈的時間)之前30分鐘接受麻醉。類似于在實施例1中闡述的步驟，在大約20分鐘的麻醉期間，鼻內(nèi)施用2.5到50nmol的單劑量藥物或磷酸鹽水緩沖的載體對照。大鼠背部置于加熱板上，監(jiān)視直到它們變得活躍，然后置于具有預(yù)先稱重的食物量的籠中。在2、4、8、24、48和72小時進行食物攝取測量。在給藥后24小時和48小時測定水攝取和體重。
結(jié)果和結(jié)論 如附圖5中所見，鼻內(nèi)的α-MSH肽在24小時在2.5-25nmol之間劑量依賴性地降低了累積的食物攝入，EC50為6-7nmol。
如附圖6中所示，25-50nmol的單劑量在降低累積的食物攝取百分比中是最有效的。25nmol劑量降低了累積的采食量，在2小時降低了30％，在8小時降低了18％，在24小時降低了9％。水消耗和體重保持不變。這項研究顯示了在向哺乳動物鼻內(nèi)施用之后多肽的劑量依賴性藥效學效果。
實施例3 鼻內(nèi)施用α-MSH模擬抗體之后在正常大鼠中累積的食物攝取的降低 這個實施例顯示了單劑量25nmol(5mg/kg)的α-MSH模擬抗體的鼻內(nèi)施用足以在8和24小時顯著地降低累積的食物攝取。水消耗和體重保持不變。
方法 使用的研究方案和方法與實施例2中描述的相同。大鼠的總數(shù)是14只。
結(jié)果和結(jié)論 如附圖7所見，單劑量25nmol鼻內(nèi)遞送的α-MSH模擬抗體在8和24小時對于降低累積的食物攝取具有顯著效果，在48和72小時具有傾向于非統(tǒng)計學上顯著的趨勢。在較晚時點的顯著性可能損失，是由于在研究中使用的相對少的動物數(shù)量(n＝14)。研究顯示，62kDa的大蛋白質(zhì)，如α-MSH模擬抗體，可以經(jīng)由鼻給藥途徑遞送到CNS。
雖然以上已經(jīng)討論了許多示范性的方面和實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到一些修改、替換、添加和其亞組合。因而預(yù)期的是以下附隨的權(quán)利要求，以下引入的權(quán)利要求被解釋為包括所有這些修改、替換、添加和亞組合，處于它們的實質(zhì)和范圍之內(nèi)。
序列表
<110>Alza Corporation
Bentz，Hanne
Hill，Beth
Lucas，Catherine
Frey，William H.
<120>活性劑向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的鼻內(nèi)施用
<130>553258197WO0
<140>Not Yet Assigned
<141>Filed Herewith
<150>US 60/655,809
<151>2005-02-23
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>13
<212>PRT
<213>人類
<400>1
Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val
1 5 10
權(quán)利要求
1.一種向哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)遞送治療組合物的方法，所述方法包括鼻內(nèi)地施用治療有效量的組合物，所述組合物包含治療多肽和抗體片段。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物跨越鼻上皮細胞被吸收。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述多肽選自黑皮質(zhì)素受體激動劑、生長激素釋放因子受體激動劑、加壓素受體激動劑、激素肽YY激動劑、神經(jīng)肽Y受體激動劑和促紅細胞生成素受體激動劑。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述多肽選自黑皮質(zhì)素受體拮抗劑、生長激素釋放因子受體拮抗劑、加壓素受體拮抗劑、激素肽YY拮抗劑、神經(jīng)肽Y受體拮抗劑或促紅細胞生成素受體拮抗劑。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述黑皮質(zhì)素受體激動劑是黑素細胞刺激素肽，所述治療組合物被轉(zhuǎn)運到下丘腦中。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述多肽是黑皮質(zhì)素受體拮抗劑，所述治療組合物被轉(zhuǎn)運到下丘腦中。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體片段選自IgG片段、IgE片段、IgM片段、IgA片段和IgD片段。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述片段包含選自IgG、IgM、IgA、IgE和IgD的抗體的恒定區(qū)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述多肽與所述抗體片段連接。
10.一種將多肽靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的方法，所述方法包括將抗體或抗體片段附著到所述多肽上來形成融合多肽；和鼻內(nèi)地施用所述融合多肽。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述多肽是治療多肽。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述抗體或抗體片段是治療性抗體或抗體片段。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述多肽是疏水性的，并且具有低于約25kDa的分子量。
14.一種治療方法，所述方法包括向哺乳動物鼻內(nèi)地施用治療有效量的組合物，所述組合物包含與抗體片段連接的多肽。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述治療是針對可以通過向所述哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)施用組合物來治療的病癥。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述病癥是代謝或內(nèi)分泌病癥。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述病癥是肥胖或厭食。
18.權(quán)利要求14的方法，其中所述病癥是引起記憶損失或運動損失的病癥。
19.權(quán)利要求14的方法，其中所述病癥是神經(jīng)變性病癥。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述神經(jīng)變性病癥選自阿爾茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷頓舞蹈病。
21.權(quán)利要求14的方法，其中所述病癥是睡眠病癥，或者是由于急性腦損傷。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述睡眠病癥是失眠癥，所述急性腦損傷來自中風。
23.權(quán)利要求14的方法，其中所述組合物被吸收到鼻上皮組織中。
24.權(quán)利要求14的方法，其中所述鼻內(nèi)施用通過嗅覺途徑或通過三叉神經(jīng)的神經(jīng)途徑實現(xiàn)組合物向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的遞送。
25.權(quán)利要求14的方法，其中所述多肽選自黑皮質(zhì)素受體激動劑、生長激素釋放因子受體激動劑、加壓素受體激動劑、激素肽YY激動劑、神經(jīng)肽Y受體激動劑和促紅細胞生成素受體激動劑。
26.權(quán)利要求14的方法，其中所述多肽是黑皮質(zhì)素受體激動劑，所述組合物被轉(zhuǎn)運到下丘腦中。
27.權(quán)利要求14的方法，其中所述抗體片段選自IgG片段、IgE片段、IgM片段、IgA片段和IgD片段。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述片段包含選自IgG、IgE、IgM、IgA和IgD的抗體的恒定區(qū)。
29.一種治療方法，所述方法包括向哺乳動物鼻內(nèi)地施用治療組合物，所述治療組合物包含治療有效量的抗體或抗體片段。
全文摘要
提供了一種向哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)遞送多肽的方法。所述方法涉及將所述多肽附著到抗體或抗體片段上，并鼻內(nèi)地施用所述融合多肽，用于向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遞送。還提供了治療方法，其中治療有效量的組合物被遞送到哺乳動物的鼻腔。
文檔編號A61K38/00GK101184499SQ200680013667
公開日2008年5月21日 申請日期2006年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月23日
發(fā)明者H·本茨, B·希爾, C·盧卡斯, W·H·弗里 申請人:阿爾扎公司