專利名稱：：用于遺傳免疫的載體和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及真核表達(dá)質(zhì)粒家族和免疫策略，用于獲得改良的遺傳免疫，并且更特別地，用于定制和提高對(duì)質(zhì)粒編碼的抗原的免疫反應(yīng)。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明為用于遺傳免疫的真核表達(dá)質(zhì)粒家族和免疫策略。供使用的這種分子和方法用于生物技術(shù)、基因治療、癌癥和農(nóng)業(yè)。著眼于本發(fā)明，進(jìn)行了現(xiàn)有技術(shù)的研究。DNA疫苗(遺傳疫苗)是潛在的突破性技術(shù)，其提供了使用完全基于基因并由生物自身細(xì)胞表達(dá)的物質(zhì)來免疫人(或動(dòng)物)的新方法的希望，制成了理想的細(xì)胞內(nèi)抗原模擬物。本領(lǐng)域描述了提高對(duì)DNA疫苗質(zhì)粒免疫反應(yīng)的方法。例如，通過與共刺激質(zhì)粒(例如IL12)共免疫來調(diào)節(jié)反應(yīng)類型(THl與TH2偏移)；細(xì)胞死亡抑制劑或增強(qiáng)劑；或者遞送的最優(yōu)化(例如，電穿孔與基因槍)，可以根據(jù)系統(tǒng)或黏膜免疫或者根據(jù)癌、變態(tài)反應(yīng)、細(xì)菌、細(xì)胞內(nèi)寄生物或病毒的目標(biāo)來進(jìn)一步提高或調(diào)節(jié)DNA疫苗的效力。一些這類方法和分子描述于Lemieux,P.2002五x/^Wi^v松c"'w^1:85-93,TokaFN，PackCD,RouseBT.2004/m腿朋/og/ca/rev/e薦199:100-112,和GurunathanS,KlinmanDM,SederRA.2000iev./m附w朋/.18:927-974,并通過引用結(jié)合入本文。DNA接種還可能涉及在初次免疫和加強(qiáng)免疫(intheprimeandtheboost)中使用不同的遞送系統(tǒng)(如BuchanS，GronevikE.MaTHlesenI,KingC,StevensonFK,RiceJ.2005/mww"o/.174:6292-6298所教導(dǎo)的)或不同的注射部位(如PavlakisGN,GragerovA,FelberBK.2004美國(guó)專利申請(qǐng)2004/0241140所教導(dǎo)的)。DNA接種將顯著提高DNA疫苗快速部署應(yīng)用，因?yàn)镈NA疫苗的開發(fā)時(shí)間顯著短于那些用于蛋白質(zhì)或病毒載體系統(tǒng)的疫苗。目前的阻礙僅使用DNA接種已經(jīng)在人類和其他靈長(zhǎng)類中廣泛獲得了保護(hù)性免疫。使用與異源蛋白、滅活的生物或病毒載體加強(qiáng)相結(jié)合的DNA疫苗，已經(jīng)獲得了靈長(zhǎng)類效力。當(dāng)混合并共注射質(zhì)粒DNA和經(jīng)純化的蛋白(相應(yīng)于質(zhì)粒中編碼的蛋白質(zhì))(DalemansW.,VanMechelenMV,BrackC,FriedeM.2003美國(guó)專利6,500,432;CarreraSD，GrilloJM，deLeonLALP,LasaAM,FeytRP，RodriguezAV,ObregonJCA，RiveroNADonatoGM200"0(M0ZM54:3;和Imoto，KonishiE.2005Kra//附w麗o/.18:205-212)或滅活病毒(RangarajanPN,SrinivasanVA,BiswasL,ReddyGS.2004美國(guó)專利申請(qǐng)2004/0096462)時(shí)，已經(jīng)報(bào)道了提高的免疫反應(yīng)。然而，使用在疫苗中與滅活生物、蛋白質(zhì)或病毒載體相結(jié)合的質(zhì)粒(或者作為混合物，或者以初次-加強(qiáng)連續(xù)地)，消除了DNA接種的大部分益處，包括提高的安全性、降低的成本和快速部署?？梢酝ㄟ^下述方法逐步改良DNA疫苗it^4S:本領(lǐng)域教導(dǎo)了DNA接種的一個(gè)局限性是抗原表達(dá)通常很低。提高抗原表達(dá)的載體修飾(例如，基因的密碼子優(yōu)化、內(nèi)含子的加入、強(qiáng)的組成型CMV或CAGG啟動(dòng)子的使用(相對(duì)于較弱的或細(xì)胞系特異性啟動(dòng)子))與提高的免疫反應(yīng)(綜述于ManojS，BabiukLA,DmnenSV,enHurkLV.2004OWca/WevC//"￡S41:l-39)高度相關(guān)。具有5倍至10倍提高的表達(dá)的雜交CMV啟動(dòng)子(CMV/R)提高了小鼠和非人靈長(zhǎng)類中針對(duì)HIV的DNA疫苗的細(xì)胞免疫反應(yīng)(BarouchDH,YangZY,KongWP,Korioth-SchmitzB,S腿idaSM,TruittDM,KishkoArthurJC,MiuraA,MascolaJR,LervinNL,NabelGJ.2005/Kra/.79:8828-8834)。含有土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(600bp元件，其增加了穩(wěn)定性和核外轉(zhuǎn)運(yùn)(導(dǎo)致用于翻譯的mRNA的水平升高))的質(zhì)粒增強(qiáng)了小鼠中的抗原表達(dá)和針對(duì)HA的保護(hù)性免疫(GargS，OranAE,HonH，JacobJ.2002J/mmw"o/.173:550-558)。這些研究教導(dǎo)了表達(dá)的提高(超越目前基于CMV的載體)通?？梢蕴岣呷祟惖拿庖咴?。本領(lǐng)域教導(dǎo)了質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞核是獲得抗原表達(dá)的限制因素。通過加入NFkB結(jié)合位點(diǎn)或SV40增強(qiáng)子來提高質(zhì)粒的核定位，提高了抗原在體外和體內(nèi)的表達(dá)；推測(cè)這歸因于NFKB的結(jié)合，其然后肩負(fù)(piggybacks)質(zhì)粒至細(xì)胞核(DeanDA，DeanBS,MullerS,SmithLC.1999五xpen'附ewto/CW/ie^arc/z253:713-722)。然而，NFkB—般集中于細(xì)胞質(zhì)，而向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移是既是有限的又是組織特異性的，并且依賴于刺激信號(hào)。這限制了NFkB核尋靶以改良DNA4妻種的應(yīng)用。4'7V2偏移本領(lǐng)域教導(dǎo)將針對(duì)DNA疫苗表達(dá)病毒或其他抗原的免疫反應(yīng)從TH2轉(zhuǎn)至TH1是期望的，以提高體液和細(xì)胞反應(yīng)；對(duì)于其他應(yīng)用，例如變態(tài)反應(yīng)，認(rèn)為偏于TH2的反應(yīng)是最佳的。例如，CpG序列(其促進(jìn)THl反應(yīng))提高了抗體和CTL對(duì)流感血凝素(HA)的反應(yīng)，和CIL對(duì)IM注射的流感核蛋白DNA疫苗的反應(yīng)(Lee和Sung,1998)。與IL12或IL15的TH1佐劑的共免疫提高了T細(xì)胞對(duì)HA的反應(yīng)(ChattergoonMA,SaulinoV,ShamesJP,SteinJ,MontanerLJ,WeinerDB.2004&c">7e22:1744-1750;RutzlerMA,RobinsonTM,ChattergoonMA,ChooDK,ChooAY,ChoePY,RamamathanMP,ParkinsonR,KudchodkarS,TamuraY,SidhuM,RoopchandV,KimJJ，PavlakisGN,FelberBK,WaldmannTA，BoyerJD,WeinerDB.2005J/m附朋o/175:112-123)和抗體介導(dǎo)的保護(hù)(OperschallE,PavlovicJ，NawrathM,MoilingK.2000/"妙v/ra/43:322-330)。^^為Z濃炎W:已經(jīng)鑒定了許多通過Toll樣受體(TLR)結(jié)合而激活先天免疫的微生物特異性基序，例如，三?；?TLR-1/TLR2)肽聚糖(TLR-2)、dsRNA(TLR3)、細(xì)菌HSP60或脂多糖(LPS;TLR-4)、鞭毛蛋白(TLR5)、二?；?TLR-6)ssRNA(TLR-7，TLR-8)未甲基化的CpGDNA(TLR-9)。已經(jīng)鑒定了誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)的富含U或富含U/G的ssRNATLR7/8j敫動(dòng)劑(HeilF,HemmiH,HochreinH,AmpenbergerF,KirschningC,AkiraS，LipfordQWagnerH,BauerS.20045W朋ce303:1526-1529;DieboldSS,KaishoT，HemmiH,AkiraS,eSousaCR.20045W露e303:1529-1531;BarchetW,KrugA,CellaM,NewbyC,FischerJAA，DzionekA,PekoszA,ColonnaM.2005五w/附mwwo/.35:236-242)以及通過TLR-7誘導(dǎo)來自人類和小鼠漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的干擾素生成的序列特異性siRNA(HornungV,Guenthner-BillerM,BourquinC,AblasserA,SchleeM,UematsuS，NoronhaA，ManoharanM,AkiraS，deFougerollesA,EndresS,HartmannG.2005A^.MW.11:263-270)。已經(jīng)鑒定了新類別的免疫刺激核酸，即不需要TLR-3、7、8或9的單鏈CpGRNA(SugiyamaT7GursdM,TakeshitaF,CobanC，ConoverJ,KaishoT,AkiraS,KlinmanDM,IshiiKJ.2005J7m聽no/.174:2273-2279)。這些分子可用作佐劑以改進(jìn)DNA接種。然而，外源性應(yīng)用的佐劑增加了費(fèi)用，使管理批準(zhǔn)復(fù)雜(疫苗中增加的附加考察實(shí)體)，并因佐劑不是定向的而需要高劑量(即，影響除了含有DNA疫苗的細(xì)胞以外的多種細(xì)胞)；非定向的佐劑的高劑量還代表特別的安全性關(guān)注(例如，自身免疫、膿毒血癥)。未曱基化的CpG存在于微生物生成的質(zhì)粒的載體骨架中，并且放大(富含CpG的質(zhì)粒)可用以通過TLR-9刺激TH1反應(yīng)性先天免疫信號(hào)。不幸的是，這些作用僅在使用高劑量時(shí)發(fā)現(xiàn)，并且如TH2偏移的反應(yīng)所反映的，使用經(jīng)濟(jì)低量的抗原的高級(jí)遞送方法(例如基因槍)的CpG作用是最小的。而且，人類中針對(duì)DNA疫苗的總體差的免疫反應(yīng)已經(jīng)部分歸因于人類比小鼠顯著降低的TLR-9表達(dá)。載體編碼的蛋白質(zhì)TLR激動(dòng)劑將可能在低劑量下誘導(dǎo)先天免疫系統(tǒng)，因?yàn)閬碜赃@些元件的信號(hào)從載體被"放大"(不同于固定的載體組分，例如CpG)。鞭毛蛋白生成基因摻入載體骨架激活了先天免疫反應(yīng)并使TH1偏移和針對(duì)基因槍遞送的抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)成為可能。這證明了使用可放大的TLR激動(dòng)劑以使低劑量DNA接種成為可能的潛力(ApplequistSE,RollmanE，WareingMD,LidenM,RozellB，HinkulaJ,LjunggrenHG.2005乂/附附m"o/.175:3882-3891)。然而，對(duì)于在DNA疫苗載體骨架中加入先天免疫誘導(dǎo)物，應(yīng)該沒有相關(guān)的獲得性免疫反應(yīng)，因?yàn)檫@將限制重復(fù)使用并在群體中產(chǎn)生可變結(jié)果(歸因于具有在先暴露(預(yù)存免疫)的個(gè)體中的衰減反應(yīng))。例如甲病毒屬復(fù)制子載體(其生成dsRNA佐劑)或上述鞭毛蛋白生成載體含有一種或多種能夠誘導(dǎo)針對(duì)載體組分的獲得性免疫的蛋白質(zhì)，并不適合重復(fù)使用?？傊绢I(lǐng)域沒有教導(dǎo)如何獲得放大的TLR激動(dòng)劑的免疫刺激作用，且不需要載體骨架中導(dǎo)致獲得性免疫反應(yīng)的異源蛋白。本領(lǐng)域教導(dǎo)了細(xì)胞死亡可以增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫反應(yīng)。流感HA和NPDNA疫苗的肌肉注射共傳遞了促進(jìn)緩慢細(xì)胞死亡增強(qiáng)的T細(xì)胞反應(yīng)和細(xì)胞免疫的突變體半胱天冬蛋白酶(caspase)(SasakiS，AmaraRR,OranAE,SmithJM,RobinsonHL.20017VwS/ofec/wo/19:543-547)。使用誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的塞姆利基森林(Semlikiforest)曱病毒屬復(fù)制子(自殺)疫苗還顯著增強(qiáng)了(與DNA疫苗相比較)對(duì)HA和NP的免疫反應(yīng)(BerglundP,SmerdouC，F(xiàn)leetonMN,TubulekasI，LiljestromR1998TVart/re16:562-565);細(xì)胞死亡對(duì)于提高的免疫反應(yīng)是關(guān)鍵的。復(fù)制子載體含有多個(gè)病毒復(fù)制蛋白；針對(duì)這些蛋白的免疫反應(yīng)可以限制重復(fù)使用。已經(jīng)通過共施用Fas或突變半胱天冬蛋白酶2或3實(shí)現(xiàn)了程序性細(xì)胞死亡，其增強(qiáng)了CTL對(duì)肌肉注射的DNA疫苗的反應(yīng)。通過基因槍共施用的半胱天冬蛋白酶還提高了針對(duì)流感HADNA疫苗的免疫反應(yīng)(Sasaki等,肌肉或角質(zhì)化細(xì)胞(但非免疫細(xì)胞)(綜述于LeitnerWW,RestifoNP.2003JC7/"/wvew112:22-24)。使用組成型細(xì)胞死亡促進(jìn)劑是不可能的。程序性細(xì)胞死亡的抑制也可以提高免疫反應(yīng)，其中共施用抗細(xì)胞凋亡的Bcl-XL在基因槍施用后強(qiáng)力提高了T細(xì)胞反應(yīng)。這可以反映延長(zhǎng)樹突細(xì)胞壽命的益處。然而，細(xì)胞死亡抑制劑的使用可以使細(xì)胞易于轉(zhuǎn)化(在整合質(zhì)粒的情況下)并增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞質(zhì)dsRNA激活PKR和RIG-l，其誘導(dǎo)干擾素生成，抑制蛋白合成，從而減少抗原生成，最終導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡(綜述于WangQ,CarmichaelGG.2004M'".Mo/ec.腸/.觸68:432-452)。細(xì)胞死亡釋放了dsRNA，然后其可以由細(xì)胞吸收，并通過結(jié)合和刺激內(nèi)吞集中的TLR-3來進(jìn)一步誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)(綜述于SchroderM,BowieAG.2005TrendsImmunol.26:462-468)。本領(lǐng)域教導(dǎo)了該類型的dsRNA刺激隨甲病毒屬復(fù)制子疫苗而發(fā)生。曱病毒屬復(fù)制子(自殺)疫苗誘導(dǎo)了增強(qiáng)的免疫反應(yīng)，且抗原比標(biāo)準(zhǔn)DNA疫苗(通過肌肉注射)少100倍至1000倍。這些載體誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡，推測(cè)是通過刺激抗病毒途徑并最終導(dǎo)致程序性細(xì)月包死亡的dsRNA的生成(LeitnerWW,YingH，DriverDA,DubenskyTW,RestifoNR2000Omcw及e"^r/z60:51-55)。細(xì)胞死亡是提高的疫苗效力所需要的并由細(xì)胞質(zhì)復(fù)制子dsRNA所介導(dǎo)；細(xì)胞凋亡元件中的dsRNA可能被APC吞噬，并通過內(nèi)體TLR-3dsRNA識(shí)別途徑誘導(dǎo)先天免疫。盡管增加了抗原生成，但抗細(xì)胞凋亡基因(Bcl-XL)的共遞送減少了保護(hù)(LeitnerWW,HwangLN,Bergmann-LeitnerES,FinkelsteinSE,FrankS,RestifoNR2004Pbcc/"e22:1537-1544;LeitnerWW,HwangLN,DeVeerM，ZhouA，SilvermanRH,WilliamsBRGDubenskyTW,YingH，RestifoNP.2003淑匿9:33-39;MatsumotoS,MiyagishiM,AkashiH,NagaiR，TairaK.2005J傷o/C/zew280:25687-25696)。然而，細(xì)胞死亡信號(hào)和抗原的最佳生成之間需要遞送依賴平衡，因?yàn)樽詺NA疫苗使用基因槍遞送(其靶向樹突細(xì)胞)是無效的，除非包括抗程序性細(xì)胞死亡基因(KimTW,HungCF,JuangJ,HeL,HardwickJM，WuTC.200477^r11:336-342)。在,/g命通過使用靶向融合標(biāo)記改變細(xì)胞內(nèi)定位已經(jīng)部分解決了差的免疫原性。本領(lǐng)域已經(jīng)確定了改變抗原細(xì)胞內(nèi)定位(例如，從細(xì)胞質(zhì)到(綜述于Gurunathan等，同前2000)?？捎靡愿淖?nèi)诤系鞍准?xì)胞內(nèi)運(yùn)輸或抗原呈遞的分子是本領(lǐng)域已知的。幾種細(xì)胞內(nèi)耙向序列描述于WilliamsWV,MadaioM，WeinerDB.2001美國(guó)專利6248565Bl，并通過引用結(jié)合入本文。幾種4元原呈遞途徑草巴向分子描述于LeifertJA,Rodriguez-CarrenoMP,RodriguezF,WhittonJL2004/m膽wo/og/ca/v/ews199:40-53和Lemieux,同前2002，并通過引用結(jié)合入本文。其中一些總結(jié)于表3。例如，已經(jīng)證明，導(dǎo)向異源蛋白至各個(gè)細(xì)胞內(nèi)目的地改變或增強(qiáng)了免疫反應(yīng)，所述細(xì)胞內(nèi)目的地包括但不限于被分泌(例如TPA;ZhongmingL,HowardA,KelleyC,DeloguG,CollinsF,MorrisS.1999/"/e"/附羅".61:4780-4786)、膜錨定(例如人類堿性磷酸酶(PLAP;GerberL,KodukulaK，UdenfriendS.1992/5/o/O^m267:12168-12173)、內(nèi)體(例如人類Lampl;Wu,T,GuamieriFG，Staveley-O'CarrollKF,ViscidiRP,LevitskyHI,HedrickL,ChoKR,AugustJT,PardollDM.1995尸rac.Ato/.Jc^/.92:11671-11675)、蛋白體(例如小鼠泛素A76;DeloguQHowardA，CollinsFM,andMorrisSL.2000/w/e"./mmw".68:3097-3102)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(XuW，ChuY，ZhangR,XuH,WangYXiongS2005Wrafogy334:255-263)。內(nèi)體靶向促進(jìn)了II類MHC反應(yīng)，而去穩(wěn)定泛素分子(相對(duì)于天然泛素G76的泛素A76)用以增強(qiáng)進(jìn)入蛋白體降解途徑和I類MHC呈遞。本領(lǐng)域公知的是細(xì)胞內(nèi)靶向的效果是抗原特異性的，并且需要為各抗原經(jīng)驗(yàn)確定為生成期望免疫反應(yīng)的最佳的細(xì)胞內(nèi)目的地。盡管通過抗原至這類靶向序列的融合獲得免疫原性的提高，但已經(jīng)使用修飾抗原在人類或其他靈長(zhǎng)類獲得了效力。進(jìn)一步的增加的提高是使用DNA疫苗質(zhì)粒的混合物免疫，所述質(zhì)粒各自編碼不同形式的抗原。PavlakisGN,GragerovA和FelberBK.2004美國(guó)專利申請(qǐng)2004/0241140提出在不同部位和以不同次數(shù)使用的抗原制品可以增加保護(hù)性免疫，并且表明順序或結(jié)合但在不同部位使用不同形式的DNA可再現(xiàn)使用其他初次-加強(qiáng)疫苗組合獲得的提高的免疫原性。其教導(dǎo)了與相同部位注射的DNA載體混合物相比較，特別是在同一小鼠的不同部位注射時(shí)，表達(dá)不同形式抗原的載體組合顯示了提高的免疫原性。作者推測(cè)，DNA初次免疫的異源加強(qiáng)的效率可以歸因于異源載體或純化蛋白提供的不同抗原呈遞。作者使用了分泌、細(xì)胞質(zhì)和蛋白體降解的抗原形式，并且未教導(dǎo)使用其他靶向序列或使用載體家族或原理策略來幫助確定最佳免疫雞尾酒。其他考察者已經(jīng)報(bào)道了當(dāng)靶向抗原至細(xì)胞內(nèi)不同目的地的兩種質(zhì)粒結(jié)合免疫時(shí)提高的反應(yīng)。使用分泌和細(xì)胞質(zhì)定向抗原(PiechockiMP,PilonSA,WeiWZ.2001J/附mimo/.167:3367-3374)或者細(xì)胞質(zhì)和泛素結(jié)合形式的乳頭瘤病毒衣殼基因(LiuWJ,ZhaoKN,GaoFG，LeggattGR,FernandoGJP，F(xiàn)razerIH.2001F腦."e20:862-869;FrazerIH.2004美國(guó)專利申請(qǐng)2004/0241177])或者可溶的或膜錨定形式的HSV-2糖蛋白D(FloJ2003Facc/"e21:1239-1245)的組合的DNA疫苗免疫增強(qiáng)了免疫反應(yīng)。這些作者沒有教導(dǎo)使用其他靶向序列或者使用載體家族來確定最佳免疫雞尾酒。其他考察者已經(jīng)報(bào)道了當(dāng)靶向抗原至細(xì)胞內(nèi)不同目的地的兩種質(zhì)粒結(jié)合免疫時(shí)沒有提高反應(yīng)。例如，細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)體定向的p55Gag的結(jié)合沒有發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)的提高(MarquesETA,ChifchlikarP，deArrudaLB,LeaoICLuY,WongJ,ChenJS,ByrneB,AugustJT2003/歷o/.C7zem278:37926-37936)。然而，當(dāng)在初次-加強(qiáng)研究中使用靶向人類免疫缺陷病毒-1gag至細(xì)胞質(zhì)或內(nèi)體目的地的DNA疫苗質(zhì)粒時(shí)，內(nèi)體初次免疫、細(xì)胞質(zhì)加強(qiáng)所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)類似于或甚至強(qiáng)于內(nèi)體初次免疫和加強(qiáng)(并且比細(xì)胞質(zhì)初次免疫和加強(qiáng)要強(qiáng)的多)。作者(BarrosDeArrudaL,ChickhlikarPR,AugustJT，andMarquesETA.20047mmw"o/.112:126誦33)沒有提出或以其他方式教導(dǎo)使用具有相同抗原的不同靶向的2種質(zhì)粒初次-加強(qiáng)免疫的潛在益處。這些研究教導(dǎo)了為最佳免疫保護(hù)的最佳質(zhì)粒組合是抗原和遞送方法特異性的，并且將需要根據(jù)各個(gè)抗原來確定。預(yù)期最佳呈遞也是抗原和遞送特異性的。EP靶向肌細(xì)胞并可能通過至APC的交叉呈遞來遞送抗原用于免疫呈遞。這可能最佳需要在供體細(xì)胞中分泌和/或穩(wěn)定的蛋白質(zhì)連同細(xì)胞死亡以吸引和刺激APC。對(duì)于耙向樹突細(xì)胞的基因槍，直接初次免疫可以是優(yōu)勢(shì)抗原呈遞^^莫式，并且分別用于增強(qiáng)的MHCI或MHCII呈遞的蛋白體和/或內(nèi)體定向抗原可能是最佳的。為各模式最優(yōu)化的質(zhì)粒組合可能最終提供更好的保護(hù)。例如，表達(dá)天然的、樹突狀和蛋白體定向SIV抗原的載體組合在獼猴中提供了更好的保護(hù)(RosatiM,vonGegerfeltA,RothP,ALiceaC,ValentinA，Robert隱GuroffM,VenzonD,MontefioriDC:MarkhamP,FelberBK,PavlakisGN.2005/Wro/.79:8480-8492);使用編碼細(xì)胞質(zhì)和泛素結(jié)合的乳頭瘤病毒衣殼基因的混合質(zhì)粒觀察到了相似的增強(qiáng)(Liu等同前，2001)。本領(lǐng)域沒有教導(dǎo)確定最佳呈遞的合理方法。而且，本領(lǐng)域教導(dǎo)了現(xiàn)有混合質(zhì)粒免疫結(jié)果的解釋是不確定的，由于這些實(shí)例中使用的載體骨架之間的差異。沒有最佳設(shè)計(jì)允許靶抗原融合至不同細(xì)胞內(nèi)靶向序列的靶向載體(例如上述使用的那些，或者Williams等，同前，2001,和BuchtG，SjolanderKB,ErikssonS,LindgrenL,LundkvistA,ElghF.200119:3820-3829中描述的那些)以確定針對(duì)被靶向至各種細(xì)胞內(nèi)目的地的抗原的免疫反應(yīng)。首先，這些載體使用標(biāo)準(zhǔn)II型限制酶克隆位點(diǎn)用于導(dǎo)入所述抗原基因。本領(lǐng)域教導(dǎo)載體骨架之間的小序歹'J變化可以改變表達(dá)水平(HartikkaJ,SawdeyM,Comefert-JensenF,Marga她M,BamhartK,NolascoM,VahlsingHL,MeekJ，MarquetM,HobartP,NormanJ,ManthorpeM.1996i/wmGeweTTzer.7:1205-1217);已經(jīng)顯示了不同的表達(dá)水平影響生成的免疫反應(yīng)(ZinckgrafJW,SilbartLK2003^c"Ve21:1640-1649)。而且，即使是當(dāng)這些序列不含導(dǎo)向標(biāo)記時(shí)，從克隆位點(diǎn)或肽標(biāo)記添加小肽至重組蛋白可以改變蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位(RamanathanMP,AyyavooV,WeinerDB.2001D7VJCe〃傷o/20:101-105)。還使用標(biāo)準(zhǔn)II型限制酶克隆構(gòu)建了Williams等，同前，2001或Bucht等，同前，2001的靶向載體以及其他目前的DNA疫苗質(zhì)粒(例如VR1012)。該策略利用最近側(cè)翼有效限制位點(diǎn)來將片段移入載體，保證了最終的載體含有大量外源序列。這些載體不符合目前WHO和FDA關(guān)于外源物質(zhì)含量和清除的指導(dǎo)原則。例如，VR1012包括潛在有害的序列，例如作為克隆卡那霉素抗性基因的人工產(chǎn)物的潛在重組基因轉(zhuǎn)座子末端。已經(jīng)顯示質(zhì)粒中的寡嘧啶或寡。票呤序列增加了pUC質(zhì)粒中二聚體的形成，推測(cè)是通過罕見DNA結(jié)構(gòu)(例如三股螺旋)的形成(KatoM.1993Mo/傷o/18:183-187)。VR1012含有的序列例如用以結(jié)合兩個(gè)片段的polyGpolyC尾?？傊?，已經(jīng)顯示來自原核質(zhì)粒的細(xì)菌衍生序列中的許多元件負(fù)向影響真核細(xì)胞中的基因表達(dá)(LeiteJP,CousinC,HeysenA，D'HalluinJC.1989G麼.82:351-356;PetersonDO，BeifbssKK,Mo勿KL.1987Mo/ecCe〃編7:1563-1567)或者結(jié)合真核轉(zhuǎn)錄因子(TullyDB,CidlowskiJA.1987B/oc/zemB/op/z;^Cwwmw".144:1-10;GhersaP,WhelanJ,PesciniR,DeLamarterJF，HooftvanHuijsduvjnenR.1994151:331-332;KushnerPJ，BaxterJD，DuncanKG,LopezGN,SchaufeleF,UhtRM，WebbP,WestBL.1994Mo/8:405-407)，最終降低了載體的性能。已經(jīng)顯示質(zhì)粒中chi位點(diǎn)的存在促進(jìn)二聚體形成(ZamanMM,BolesTC.1996J5acfenb/.178:3840-3845)。質(zhì)粒切割可能與"呼吸"并對(duì)內(nèi)源性單鏈核酸酶敏感的AT富集區(qū)相關(guān)聯(lián)。因?yàn)槭峭蚧蚍聪蛑貜?fù)序列和經(jīng)大腸桿菌宿主缺失或重排的ZDNA形成序列，回文序列是不穩(wěn)定的。罕見的二級(jí)結(jié)構(gòu)DNA包括連續(xù)的潛在ZDNA形成交替嘧"!t/嘌呤序列(例如CpG序列；BichamM，SchumacherS,andFuchsRP.1995140:897-907);可以形成四聯(lián)結(jié)構(gòu)的富含G的序列；和可以形成三聯(lián)DNA的寡嘧啶或寡噤呤序列。外源DNA的缺失是減少這種假結(jié)合位點(diǎn)的加入變化所必需的。然而，當(dāng)缺失了DNA時(shí)，其他問題可以產(chǎn)生。例如，真核復(fù)制易于在細(xì)胞巨化病毒(CMV)啟動(dòng)子中終止。當(dāng)起點(diǎn)的定向接近或平行于CMV啟動(dòng)子時(shí)，終止被增強(qiáng)。干擾可能歸因于二級(jí)結(jié)構(gòu)或細(xì)菌蛋白的意外結(jié)合。新的最小化DNA疫苗載體(例如pVAXl)含有CMV啟動(dòng)子和因?yàn)槌叽鐪p小而緊密接近的復(fù)制起點(diǎn)；該載體生成復(fù)制中間體，從而降低了細(xì)菌宿主中生成的質(zhì)粒的質(zhì)量(LevyJ.2003美國(guó)專利申請(qǐng)US2003180949)。IIS類限制酶提供了消化限制內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)外面的DNA分子的方法，使引入位點(diǎn)(通過PCR)并消化其成為可能，生成了在任何點(diǎn)具有特異性地址標(biāo)記的懸垂末端。通過將該特征與基因擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，PCR引物中的IIS類位點(diǎn)可以在任何位點(diǎn)消化DNA,提供了獨(dú)特的、非回文的懸垂末端或特異性地址標(biāo)記(LebedenkoEN,BirikhKR,PlutalovOV,BerlinYuA.1991A^c/e/cJc/A19:6757-61)?；蜃越M裝過程4吏用IIS類限制酶來生成獨(dú)特的非回文的懸垂末端，其可以連接至復(fù)合混合物中的例外。NatureTechnologyLincolnNE已經(jīng)開發(fā)了基因自組裝載體pWizBang，其可用以在一系列DNA分子(例如平末端限制片^:或PCR擴(kuò)增子)上生成獨(dú)特的非回文的地址標(biāo)記，允許許多片段(達(dá)32)即時(shí)連接入單個(gè)復(fù)合構(gòu)建體。該步驟允許模塊載體構(gòu)建，并清除了相繼的亞克隆。該技術(shù)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它是無縫的，即可以在任何堿基加入片段，且不需要在這些位置上的限制位點(diǎn)(Hodgson,C,Zink,MA，Xu,G.,美國(guó)專利6,410,220)，缺失了所有的外源序列。然而，IIS類載體開發(fā)方法還未應(yīng)用于生成優(yōu)化的DNA疫苗質(zhì)粒。即使考慮現(xiàn)有技術(shù)，其依然需要改良的載體，該載體被最小化以缺失外源DNA,被生物化以保證高質(zhì)量細(xì)菌質(zhì)粒產(chǎn)率和提高的體內(nèi)表達(dá)、提高的先天和獲得性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)，并被設(shè)計(jì)以促進(jìn)快速并合理評(píng)價(jià)混合質(zhì)粒免疫，以便該技術(shù)能夠用以滿足具有廣泛靶抗原的人類和其他哺乳動(dòng)物、鳥或魚中的效力閾。發(fā)明公開本發(fā)明涉及用于獲得提高的遺傳免疫的真核表達(dá)質(zhì)粒家族和免疫策略。公開了改良的DNA疫苗載體家族，具有相同的骨架以限制變異性和無縫的細(xì)胞內(nèi)靶向克隆盒，其已經(jīng)表明了比現(xiàn)有技術(shù)載體提高的表達(dá)。關(guān)鍵是，這些載體允許抗原被靶向于多個(gè)細(xì)胞內(nèi)目的地，且不改變側(cè)翼載體或基因序列。通過使用基因自組裝技術(shù)同時(shí)加入6個(gè)片段構(gòu)建了載體，所經(jīng)優(yōu)化和最小化了所有的質(zhì)粒元件，以符合FDA關(guān)于外源物質(zhì)的含量和清除的指導(dǎo)原則。所生成的載體比現(xiàn)有載體例如VR1012(5kb，與3-3.5kb的pDNAVACCUltra載體相比較)要小的多，并促進(jìn)較高水平的靶基因表達(dá)。優(yōu)化的kanR基因-pUC起始方向的加入以及新的合理設(shè)計(jì)的RNAII復(fù)制起始突變導(dǎo)致了2倍的提高的質(zhì)粒產(chǎn)率。這些載體被設(shè)計(jì)以促進(jìn)高通量克隆應(yīng)用，并允許同時(shí)克隆入多個(gè)載體，所述載體特征為蛋白產(chǎn)物不同的細(xì)胞內(nèi)靶向目的地。所述克隆不需要載體中存在額外堿基，例如限制酶位點(diǎn)。因此，消除了傳統(tǒng)克隆需要的其他堿基所賦予的載體之間的變異性。而且，所述載體可用于新免疫策略，例如"混合呈遞免疫"，其中通過質(zhì)粒雞尾酒免疫來提高針對(duì)靶抗原的免疫反應(yīng)，所述質(zhì)粒雞尾酒結(jié)合了2種或多種質(zhì)粒，各質(zhì)粒輩巴向抗原至不同的細(xì)胞內(nèi)目的地。而且，除了優(yōu)化的蛋白質(zhì)抗原表達(dá)元件以外，所述載體編碼表達(dá)的RNA序列(RNA元件)。這些表達(dá)的RNA序列為載體增加了其他的功能性，以定制和增強(qiáng)免疫反應(yīng)。例如，RNA元件可以是免疫刺激的，促進(jìn)或抑制程序性細(xì)胞死亡，將細(xì)胞死亡導(dǎo)向壞死途徑，增強(qiáng)質(zhì)粒核定位和啟動(dòng)子表達(dá)，或者以其他方式改變細(xì)胞表達(dá)。RNA元件可以編碼單鏈RNA、雙鏈RNA、發(fā)夾RNA、微RNA、RNA適體或核酶或其組合。由于RNA表達(dá)元件的小尺寸(100-500bp)，單個(gè)質(zhì)粒中可以包括多個(gè)元件。由于RNA不誘導(dǎo)針對(duì)自身的獲得性免疫反應(yīng)，對(duì)含有RNA的載體的反應(yīng)不依賴于患者的在先暴露，并因此能夠重復(fù)使用，且不誘導(dǎo)針對(duì)載體骨架的免疫反應(yīng)。而且，所述載體可用于新的免疫算法RapidVACC，以快速篩選可能的呈遞途徑，其提供了優(yōu)化的免疫刺激序列混合物、呈遞模式和適用保護(hù)的抗原。使用免疫刺激DNA疫苗質(zhì)粒的定向抗原呈遞用以提供提高的免疫反應(yīng)，所述疫苗質(zhì)粒為單獨(dú)使用或以最優(yōu)化用于MHCI和MHCII呈遞的質(zhì)粒組合(混合的呈遞免疫)使用。最佳的呈遞將是抗原和遞送途徑特異性的。最優(yōu)化用于各模式的質(zhì)粒組合可最終提供更好的保護(hù)。發(fā)明概述本發(fā)明的目的和/或目標(biāo)是提供DNA疫苗質(zhì)粒，用于通過DNA接種產(chǎn)生免疫反應(yīng)。另一公開內(nèi)容是改良的DNA疫苗質(zhì)粒組合物，其與本領(lǐng)域中確定的質(zhì)粒(VR1012、pVAXl、pVC0396、pCMVkm2或pCOR載體，或其衍生物)相比改良了通過加入新的嵌合SV40增強(qiáng)子-CMV啟動(dòng)子而提高的靶抗原真核表達(dá)；通過最優(yōu)化真核啟動(dòng)子上游元件而增加的真核表達(dá)；通過添加RNA輸出信號(hào)而增加的真核表達(dá)；通過缺失所有外源序列而較小的尺寸，所述外源序列例如添加的其他載體中存在的真核起始點(diǎn)或抗生素抗性基因的側(cè)翼序列。這些序列是作為使用最近的有效限制位點(diǎn)來生成載體的結(jié)果而存在于現(xiàn)有載體的。這包括去除存在于其他載體(例如VR1012)中的潛在重組基因轉(zhuǎn)座子末端；較小尺寸是通過生成新的短前導(dǎo)內(nèi)含子來取代大的CMV前導(dǎo)內(nèi)含子1;較小尺寸是通過生成新細(xì)菌生產(chǎn)過;呈中提高的產(chǎn)率和完整性是通過在原核^區(qū);翼加入轉(zhuǎn)錄終止子以對(duì)抗靶抗原表達(dá)；細(xì)菌生產(chǎn)過程中提高的完整性是通過去除其他序列，例如VR1012克隆片段中使用的polyGpolyC尾，其可以促進(jìn)細(xì)菌增殖過程中的二聚體或環(huán)狀體(concatamer)形成；細(xì)菌生產(chǎn)過程中提高的產(chǎn)率和完整性是通過最優(yōu)化卡那霉素抗性基因、復(fù)制方向的起始點(diǎn)；細(xì)菌生產(chǎn)過程中提高的產(chǎn)率是通過加入新的比pUC或pMMl起始點(diǎn)增強(qiáng)的復(fù)制起始點(diǎn)；沒有外源序列的抗原的精確克隆和表達(dá)是通過使用IIS型酶而非傳統(tǒng)的II型酶用于克隆；靈活定向抗原至各細(xì)胞內(nèi)目的地且無側(cè)翼載體或基因序列的干擾是通過使用IIS型酶用于克隆。VR1012、pVAXl、pVC0396、pCMVkm2或pCOR載體不允許抗原靶向。本發(fā)明的另一目標(biāo)和/或目的是提高DNA接種效力的新免疫方法。本發(fā)明的載體用以提高DNA疫苗的效力，通過與本領(lǐng)域確定的DNA疫苗質(zhì)粒相比較增加靶基因表達(dá)；和促進(jìn)需要靈活靶向抗原至各細(xì)胞內(nèi)目的地的新免疫方法，例如確定用于DNA初次免疫的最佳抗原細(xì)胞內(nèi)靶向；確定用于DNA加強(qiáng)的最佳抗原細(xì)胞內(nèi)靶向；確定用于DNA初次免疫、DNA加強(qiáng)免疫的最佳抗原細(xì)胞內(nèi)靶向；確定用于DNA初次免疫的抗原細(xì)胞內(nèi)靶向質(zhì)粒的最佳組合；確定用于DNA加強(qiáng)的抗原細(xì)胞內(nèi)靶向質(zhì)粒的最佳組合；確定用于DNA初次免疫、DNA加強(qiáng)免疫的抗原細(xì)胞內(nèi)靶向質(zhì)粒的最佳組合。本發(fā)明的另一目標(biāo)和/或目的是提高DNA接種效力的新表達(dá)RNA-含有DNA的疫苗載體骨架。除了優(yōu)化的蛋白質(zhì)抗原表達(dá)元件，本發(fā)明的載體骨架還編碼表達(dá)的RNA序列。這些表達(dá)的RNA序列為所述載體增加了其他功能，例如免疫刺激RNA;促進(jìn)程序性細(xì)胞死亡的RNA;抑制程序性細(xì)胞死亡的RNA;促進(jìn)壞死細(xì)胞死亡的RNA;促進(jìn)質(zhì)粒核定位的RNA;促進(jìn)啟動(dòng)子表達(dá)的RNA;結(jié)合配體的RNA;鈍化基因的短發(fā)夾RNA;促進(jìn)抗原交叉呈遞的RNA;或者改變細(xì)胞表達(dá)以定制和增強(qiáng)免疫反應(yīng)的其他RNA。所述RNA元件可以編碼單鏈RNA、雙鏈RNA、發(fā)夾RNA、微RNA、RNA適體或核酶或其任意或所有組合。由于RNA表達(dá)元件的小尺寸(100-500bp),單個(gè)質(zhì)粒中可以包括多個(gè)元件；當(dāng)多質(zhì)粒免疫時(shí)，各質(zhì)粒上可包括不同的RNA元件。由于RNA不包括針對(duì)自身的獲得性免疫反應(yīng)，對(duì)含有RNA的載體的反應(yīng)不依賴于經(jīng)免疫的個(gè)體的在先暴露，并因此能夠重復(fù)使用，且不誘導(dǎo)針對(duì)載體骨架的免疫反應(yīng)?？偨Y(jié)，所述載體結(jié)合了減小的尺寸和序列含量(其提高了調(diào)節(jié)順應(yīng)性和效價(jià))與通過RNA元件提高的生產(chǎn)、轉(zhuǎn)錄、呈遞靶向、產(chǎn)率、完整性、基因組重組傾向(安全性)和調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)的性能。本發(fā)明進(jìn)一步的目的和優(yōu)點(diǎn)將參考附圖和隨后說明書而變得顯而易見。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了基因自組裝載體pWiz-Bang2.0。圖2顯示了pDNAVACCultra質(zhì)粒。圖3描述了用于定向擴(kuò)增和克隆cDNA序列入pDNAVACC載體的方法。圖4顯示了從pDNAVACC質(zhì)粒的體內(nèi)表達(dá)。圖5顯示了用于載體的填充(stuffer)序列。圖6顯示了4參入RNA元件的載體。圖7描述了免疫刺激DNA疫苗的應(yīng)用。圖8描述了RapidVACC算法流程圖。圖9描述了用于從序列化基因組中鑒定保護(hù)性抗原的RapidVACC算法流程圖。圖10顯示了可用以促進(jìn)或抑制程序性細(xì)胞死亡的RNA元件的靶。表1:pDNAVACC質(zhì)粒中起始組合物和定向的最優(yōu)化。表2:嵌合啟動(dòng)子的成纖維細(xì)胞活性。表3:抗原呈遞途徑靶向分子。表4:復(fù)制起始點(diǎn)。表5:RAW264.7細(xì)胞系中免疫刺激的RNA元件誘導(dǎo)的TNFa生成(轉(zhuǎn)染后36小時(shí))。表6:RAW264.7細(xì)胞系中免疫刺激的RNA元件誘導(dǎo)的TNFa生成(轉(zhuǎn)染后15小時(shí))。發(fā)明詳述現(xiàn)在參考附圖，圖1顯示了基因自組裝載體pWiz-Bang2.0的應(yīng)用。(a)設(shè)計(jì)引物以生成4bp重疊序列，擴(kuò)增構(gòu)件，克隆入線性載體，證實(shí)序列；和(b)使用消化釋放連接片段，通過單個(gè)步驟生成了最終的基因或構(gòu)建體。在圖2中，顯示了pDNAVACCultm質(zhì)粒骨架，(a)pDNAVACCultra5-EGFP的圖譜；(b)pDNAVACCultra2-SV40(NTC7142)的圖譜；(c)含有pDNAVACCultra5-EGFP-mU6RNA表達(dá)元件的質(zhì)粒圖譜；和(d)含有pDNAVACCultra5-EGFP-SV40-mU6RNA表達(dá)元件的質(zhì)粒圖譜。在圖3中，描述了用于定向擴(kuò)增并克隆cDNA序列進(jìn)入pDNAVACC載體的方法，(a)含有兩個(gè)獨(dú)特地址標(biāo)記的質(zhì)粒，通過使用位于切口之間的IIS類酶消化生成；和(b)通常的引物，含有IIS類酶識(shí)別信號(hào)(&pl)、至少一個(gè)插入核苦酸和與獨(dú)特的非回文序列重疊的區(qū)域(GGG該實(shí)施例中的地址標(biāo)記)。在圖4中，顯示了從pDNAVACC質(zhì)粒的體內(nèi)表達(dá)。由pDNAVACCultra-SEAP載體、pDNAVACCultra-SV40-SEAP載體或gWIZ-SEAP驅(qū)動(dòng)的SEAP體內(nèi)表達(dá)。在圖5中，描述了下述的高通量細(xì)胞內(nèi)靶向克隆位點(diǎn)(a)pDNAVACCultral(分泌-內(nèi)體)；(b)pDNAVACCultra2(分泌)；(c)pDNAVACCultra3(分泌-膜錨定)；(d)pDNAVACCultra4(蛋白體)；(e)pDNAVACCultra5(天然)；(f)pDNAVACCultra6(月莫4苗定)；(g)pDNAVACCultra7(內(nèi)體)；和(h)pDNAVACCultra8(分泌-交叉呈遞)。在圖6中，顯示了載體整合的RNA元件。在圖7中，描述了免疫刺激DNA疫苗的應(yīng)用。在圖8中，顯示了用于開發(fā)單抗原DNA疫苗的RapidVACC流程圖。在圖9中，描述了用于從序列化基因組鑒定保護(hù)性抗原的RapidVACC流程圖。在圖10中，顯示了可用以促進(jìn)或抑制程序性細(xì)胞死亡的RNA元件的靶。箭頭指示富集于骨骼肌中的ARC和FLIP。定義佐劑包括核酸佐劑(例如免疫刺激CpG序列，細(xì)胞因子、趨化因子或其他分子(例如細(xì)胞死亡啟動(dòng)子(例如皰滲胸腺嗜啶激酶))的表達(dá)載體)和化學(xué)佐劑，其是在與疫苗抗原一起施用時(shí)能夠增強(qiáng)、延長(zhǎng)或以其他方式調(diào)節(jié)抗原特異性免疫反應(yīng)的化合物。這些是本領(lǐng)域公知的并通過引用結(jié)合入本文(例如參見Williams等，2001)。APC:抗原呈遞細(xì)胞，例如朗格漢司細(xì)胞和樹突細(xì)胞。BAC:細(xì)菌人工染色體。ccc:共價(jià)閉合環(huán)狀。共刺激分子本領(lǐng)域已知的共剌激質(zhì)粒(例如IL12)或分子、細(xì)胞死亡抑制劑(例如抗細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì))或增強(qiáng)劑，并通過引用結(jié)合入本文。cmv:細(xì)月包巨化病毒。遞送方法本領(lǐng)域已知的遞送基因載體的方法(例如聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、ISCOM、脂質(zhì)體、非離子表面活性劑泡嚢(niosome)、病毒小體、殼聚糖和其他生物可降解的聚合物，電穿孔法，聲致穿孔法(sonoporation),超聲波，基因槍，無針頭生物注射器(needlefreebiojector),脂質(zhì)體，微粒，微球，納米顆粒，病毒小體，細(xì)菌外殼，細(xì)菌，減毒細(xì)菌等)，并通過引用結(jié)合入本文。ds脂A:雙鏈RNA?；蜃越M裝基因自組裝方法使用IIS類限制酶來生成獨(dú)特的非回文的垂懸末端，其可以連接至復(fù)合混合物中僅一個(gè)其他末端，從而保證各片孚殳以正確方向連^妄至其正確的配體而非其他。GPI:糖基磷脂酰肌醇。HA:血凝素。免疫反應(yīng)抗原反應(yīng)性細(xì)胞(例如，抗原反應(yīng)性T細(xì)胞)或抗體(例如抗原反應(yīng)性IgG)反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)靶向使用上述靶向序列(表3總結(jié)了非限制性名單)將靶抗原導(dǎo)向內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)目的地，或者上述抗原呈遞途徑?；旌铣蔬f免疫使用質(zhì)粒雞尾酒或質(zhì)粒-蛋白雞尾酒免疫，其結(jié)合2個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒，各質(zhì)粒使用上述靶向序列(表3總結(jié)了非限制性名單)將抗原導(dǎo)向內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)目的地，具有或沒有相應(yīng)的蛋白質(zhì)抗原。NP:核蛋白。PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。pDNA:質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒質(zhì)粒、黏粒、細(xì)菌人工染色體(BAC)、噬菌體、病毒載體及其雜合體。pUC起始點(diǎn)pBR322-衍生的起始點(diǎn)，且具有G至A的轉(zhuǎn)變，其在升高的溫度下增加拷貝數(shù)。RapidVACC:疫苗開發(fā)方法，其涉及使用本文公開的靶向質(zhì)粒免疫方法并結(jié)合本領(lǐng)域已知的鑒定方法確定最佳質(zhì)粒骨架和/或保護(hù)性抗原的呈遞。RNA元件含有表達(dá)的RNA序列的表達(dá)盒。啟動(dòng)子可以是Poll、PolII或PolIII啟動(dòng)子，并且表達(dá)的RNA可以是單鏈RNA、雙鏈RNA、發(fā)夾RNA、微RNA、RNA適體或核酶。shRNA:短發(fā)夾RNA。siRNA:短抑制性RNA。ss脂A:單鏈腦A。耙抗原可以導(dǎo)致免疫反應(yīng)的免疫原性蛋白或肽表位，或蛋白質(zhì)和肽的結(jié)合。靶抗原可能衍生于用于傳染病應(yīng)用的病原體，或者衍生于用于例如癌癥、變態(tài)反應(yīng)或自身免疫疾病應(yīng)用的宿主生物。本領(lǐng)域中明確定義了靶抗原。一些實(shí)例公開于Williams等，2001，并通過引用結(jié)合入本文。耙向分子如上所述的細(xì)胞內(nèi)靶向序列和抗原呈遞途徑靶向分子，非限制性名單總結(jié)于表3。TH1:T輔助細(xì)月包1。TH2:T輔助細(xì)胞2。TLR:Toll樣受體。載體基因遞送載體，包括病毒(例如曱病毒屬、痘病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒等)和非病毒(例如質(zhì)粒、蠓(midge)、轉(zhuǎn)錄活性PCR片段、微環(huán)、噬菌體等)載體。這些是本領(lǐng)域公知的并通過引用結(jié)合入本文。本發(fā)明涉及用于蛋白質(zhì)表達(dá)和遺傳免疫的組合物和方法。本發(fā)明實(shí)施為在真核細(xì)胞中表達(dá)基因產(chǎn)物，用于遺傳免疫、基因治療、重組蛋白質(zhì)生成或其他生物技術(shù)應(yīng)用的目的。本發(fā)明用于ccc重組DNA分子的這種用途，所述ccc重組DNA分子例如質(zhì)粒、黏粒、BAC、噬菌體、病毒載體及其雜合體(本文共同稱為質(zhì)粒)。現(xiàn)有技術(shù)中描述的DNA疫苗質(zhì)粒不是最佳的(具有次佳的表達(dá)、其他非必需DNA),其也不促進(jìn)高通量方案或靈活靶向抗原至各細(xì)胞內(nèi)目的地。這些缺陷是關(guān)鍵的，因?yàn)檩d體中幾個(gè)增加的改良導(dǎo)致表達(dá)水平免疫反應(yīng)質(zhì)量和最終保護(hù)性免疫中的巨大差異。栽體構(gòu)建優(yōu)選實(shí)施方案在生成DNA疫苗質(zhì)粒的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用IIS型限制酶進(jìn)行克隆。這里，我們公開了先進(jìn)的基因自組裝載體pWizBang2.0的開發(fā)，該載體使用酶AH來生成4-堿基垂懸末端(圖1)。使用該方法可以清楚地加入達(dá)121個(gè)片段。我們已經(jīng)證明了該載體通過生成模塊DNA疫苗載體家族(圖2)而用于復(fù)雜克隆方案的應(yīng)用，所述疫苗載體被獨(dú)特設(shè)計(jì)以缺失所有外源序列，促進(jìn)高通量疫苗開發(fā)方案和靶抗原至細(xì)胞內(nèi)靶向序列的無縫融合?？寺〕晒β?〉90%)表明，pWizBang2.0可普遍用于高度復(fù)雜的克隆方案。在基因構(gòu)建之前測(cè)序輸入片段的能力保證了最終構(gòu)建體將不含經(jīng)由錯(cuò)誤寡核苦酸引物(常見)或PCR酶(罕見)引起的突變。該方法需要高度完整的寡核苷酸引物以及不增加多余堿基的高保真的聚合酶，例如尸>DNA聚合酶(如果使用基因擴(kuò)增)。把基因克隆優(yōu)選實(shí)施方案在關(guān)于將抗原克隆入DNA疫苗質(zhì)粒的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用IIS型限制酶進(jìn)行克隆。當(dāng)作例子，圖2顯示了pDNAVACCultra載體。該載體促進(jìn)通過使用IIS型酶克隆方法在期望的細(xì)胞內(nèi)靶向基因前導(dǎo)盒上游無縫克隆興趣基因或表位。克隆位點(diǎn)被設(shè)計(jì)用于高通量克隆應(yīng)用，并在多個(gè)載體間相容，實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)步驟制成幾種不同的細(xì)胞內(nèi)定向基因構(gòu)建體(圖3)DNA疫苗質(zhì)粒優(yōu)選實(shí)施方案在關(guān)于免疫的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用pDNAVACCUltra載體進(jìn)行免疫。當(dāng)作例子，圖2顯示了pDNAVACCultra載體。原核區(qū)(復(fù)制起始點(diǎn)和卡那霉素抗性基因)的側(cè)翼加上原核轉(zhuǎn)錄終止子，以提高廣泛靶基因的穩(wěn)定性和產(chǎn)率。在原核模塊側(cè)翼加上獨(dú)特的限制位點(diǎn)，以允許方便地修飾(即，用抑制劑滴定盒取代KanR盒)。所有的質(zhì)粒元件已經(jīng)被最優(yōu)化和最小化以符合目前WHO和FDA關(guān)于外源物質(zhì)含量和缺失的指導(dǎo)原則。所生成的載體比現(xiàn)有載體例如VR1012(5kb，與3-3.5kb的pDNAVACCUltra載體相比較)要小的多。通過使用pDNAVACC質(zhì)?；蛞幌盗匈|(zhì)粒交換(用來自VicalVR1012DNA疫苗載體的相應(yīng)元件取代各元件)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中瞬時(shí)表達(dá)水平的比較，已經(jīng)驗(yàn)證了各元件的功能性。與現(xiàn)有DNA疫苗質(zhì)粒相比較，質(zhì)粒的原核部分的方向和組成的多方面優(yōu)化意想不到地導(dǎo)致了細(xì)菌培養(yǎng)物中提高的生產(chǎn)率和穩(wěn)定性，以及體外和體內(nèi)表達(dá)的提高(表l,圖4)。表1:pDNAVACC質(zhì)粒中起始點(diǎn)組成和方向的優(yōu)化<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>*丁=轉(zhuǎn)錄終止子丁丁=串聯(lián)的雙轉(zhuǎn)錄終止子NA二未測(cè)定ND=未4企測(cè)到**相對(duì)于pDNAVACC-EGFP***真核細(xì)胞系中EGFP的表達(dá)，從最低+至最高+++++來自上述的最小化的和最優(yōu)化的單個(gè)元件在載體交換實(shí)驗(yàn)中顯示與來自VR1012載體的相應(yīng)區(qū)等價(jià)。從CMV和NVL-3啟動(dòng)子的表達(dá)水平意想不到地受卡那霉素抗性基因方向的影響，且當(dāng)卡那霉素基因啟動(dòng)子位于真核啟動(dòng)子遠(yuǎn)端時(shí)有顯著較高的表達(dá)(表1和2)。意想不到地，pDNAVACCUltra載體中這些最小化的和最優(yōu)化的元件的組合是協(xié)同的,導(dǎo)致了真核細(xì)胞中總體提高的質(zhì)粒表達(dá)(表1和2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>在關(guān)于免疫的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，使用了摻入嵌合啟動(dòng)子的pDNAVACCUltra載體。公開了新的嵌合啟動(dòng)子，其結(jié)合進(jìn)一步提高了靶抗原的表達(dá)(圖4)。意想不到地發(fā)現(xiàn)，新的嵌合啟動(dòng)子(其中SV40增強(qiáng)子在CMV啟動(dòng)子的上游融合)顯著增加了體內(nèi)表達(dá)(圖4)。不知道提高的表達(dá)是否緣于所述質(zhì)粒增加的轉(zhuǎn)錄活性和/或提高的核定位。后者是可能的，因?yàn)橐呀?jīng)證明SV40增強(qiáng)子的區(qū)域促進(jìn)DNA疫苗質(zhì)粒在肌細(xì)胞中的核定位，且具有顯著提高的靶蛋白表達(dá)(Dean等，同前，1999),如GraessmanM,MenneJ，LieblerM,GraeberI,和GraessmanA1989M/c/e/d.血17:6603-6612所預(yù)測(cè)的。NFkB的結(jié)合位點(diǎn)(MesikaA，GrigorevaI,Zohar，M,Reich,Z.2001Mo/ecw/"rJ77era;^3:653-657)和平滑肌特異性轉(zhuǎn)錄因子SRF(ZoharM,MesikaA,ReichZ.2001川o五^a"23:1176-1179)也調(diào)節(jié)該作用。然而，提高的表達(dá)必然比單獨(dú)的核定位更復(fù)雜，因?yàn)楫?dāng)整合入DNA疫苗質(zhì)粒時(shí)，NFkB-SV40-CMV增強(qiáng)子的構(gòu)建不如單獨(dú)SV40-CMV—樣好進(jìn)行。細(xì)菌生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的優(yōu)選實(shí)施方案在關(guān)于細(xì)菌生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒的元件方向被最優(yōu)化以保持細(xì)胞系的生存力。我們教導(dǎo)了新發(fā)現(xiàn)必須在質(zhì)粒優(yōu)化過程中評(píng)價(jià)低溫保藏生存力。使用整合有SV40增強(qiáng)子的質(zhì)粒，意想不到地觀察到甘油保藏中降低的生存力。這是質(zhì)粒特異性的，而這里開發(fā)的pDNAVACCUltra載體具有高的甘油保藏生存力。我們發(fā)現(xiàn)，本領(lǐng)域中沒有教導(dǎo)確定質(zhì)粒內(nèi)元件的最佳方向以保持細(xì)胞系生命力，而我們教導(dǎo)通過改變載體中元件方向并測(cè)試生存力來確定其。在關(guān)于細(xì)菌生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，質(zhì)粒中元件的方向被最優(yōu)化以保持或提高質(zhì)粒質(zhì)量。DNA質(zhì)量和產(chǎn)率受元件的組織以及所包括的特定元件(例如IRES、CMV啟動(dòng)子)所影響。我們這里證明了在治療性質(zhì)粒的開發(fā)過程中必須評(píng)價(jià)質(zhì)粒質(zhì)量。我們教導(dǎo)這種評(píng)價(jià)需要測(cè)定l)復(fù)制中間體2)二聚體形成和3)超螺旋對(duì)代數(shù)目的％,以便質(zhì)粒在生產(chǎn)過程中可以增殖。這里開發(fā)的pDNAVACCUltra載體具有高度的穩(wěn)定性和有關(guān)這些屬性的質(zhì)量。復(fù)制中間體:復(fù)制將在內(nèi)在核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)[例如腦炎心肌炎病毒(EMCV)ires]和真核增強(qiáng)子重復(fù)區(qū)[例如細(xì)胞巨化病毒(CMV)啟動(dòng)子或勞斯肉瘤病毒(RSV)LTR]內(nèi)終止。當(dāng)起始點(diǎn)的方向接近和平行于CMV啟動(dòng)子時(shí)，終止被增強(qiáng)。干擾可能歸因于二級(jí)結(jié)構(gòu)或細(xì)菌蛋白的意外結(jié)合。該現(xiàn)象僅發(fā)現(xiàn)于高拷貝質(zhì)粒；基于低拷貝質(zhì)粒的相同排列沒有形成可4企測(cè)的中間體(Levy,同前，2003)。輕易觀察到作為純化質(zhì)粒制品中額外的小譜帶的復(fù)制中間體的存在。由于失敗的復(fù)制循環(huán)，這些中間體降低質(zhì)粒產(chǎn)率(拷貝數(shù))、質(zhì)粒純度，并增加了去除該相關(guān)雜質(zhì)所必需的純化費(fèi)用。未能除去復(fù)制中間體將降低最終質(zhì)粒的純度和效價(jià)。pDNAVACCultra質(zhì)粒沒有將復(fù)制起始點(diǎn)置于靠近CMV啟動(dòng)子，生成了高質(zhì)量的超螺旋單體DNA,其沒有生成可檢測(cè)的復(fù)制中間體或環(huán)狀體。如果卡那霉素抗性基因的方向逆轉(zhuǎn)，則意想不到地觀察到了復(fù)制中間體。SV40增強(qiáng)子的加入也意想不到地增加了所生成的復(fù)制中間體的數(shù)目?，F(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)卡那霉素抗性基因在這些載體中的方向不應(yīng)該影響復(fù)制中間體的生成，并且使用任一方向都不應(yīng)該觀察到復(fù)制中間體。有關(guān)復(fù)制中間體生成的卡那霉素基因新方向依賴性的基礎(chǔ)是未知的。我們教導(dǎo)了，減少復(fù)制中間體的元件最佳方向在本領(lǐng)域中沒有被教導(dǎo)，并且可以通過改變?cè)谳d體中的方向并測(cè)試復(fù)制中間體而減少。二聚體形成序列:多數(shù)質(zhì)粒重組不依賴RecBCD,并通過RecF途徑介導(dǎo)，其需要RecA以及其他基因功能。RecBCD是大腸桿菌中負(fù)責(zé)降解線性DNA的主要酶。RecBCD降解在Chi位點(diǎn)停止。RecBCD導(dǎo)向的RecA至chi位點(diǎn)的募集刺激同源重組。已經(jīng)表明，質(zhì)粒中chi位點(diǎn)的存在還促進(jìn)在recJ+ACjB+(野生型)細(xì)胞中通過RecBCD途徑的不依賴RecF的重組(Zaman和Boles,同前1996)。質(zhì)粒中的寡嘧啶和寡噤呤序列已經(jīng)表明增加pUC質(zhì)粒中的二聚體形成，推測(cè)是通過罕見DNA結(jié)構(gòu)(例如三聯(lián)螺旋)的形成(Kato,同前1993)。pDNAVACCultra載體不含有這樣的序列，并顯示較低水平的二聚體形成。對(duì)質(zhì)粒質(zhì)量有害的序列:某些序列提高了差的超螺旋含量(即總質(zhì)粒的顯著百分含量是開環(huán)的)。不幸的是，質(zhì)粒中這種序列的存在需要經(jīng)驗(yàn)確定。切割可能與"呼吸"并對(duì)內(nèi)源性單鏈核酸酶敏感的AT富集區(qū)相關(guān)聯(lián)。由于是同向或反向重復(fù)序列和經(jīng)大腸桿菌宿主缺失或重排的ZDNA形成序列，所以回文序列是不穩(wěn)定的。罕見的二級(jí)結(jié)構(gòu)DNA包括潛在ZDNA形成連續(xù)的交替嘧啶/噤呤序列(例如CpG序列)；可以形成四鏈結(jié)構(gòu)的富含G的序列；和可以形成三聯(lián)DNA的寡嘧啶或寡嘌呤序列。pDNAVACCultra載體沒有促進(jìn)切割的序列。在關(guān)于細(xì)菌生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，質(zhì)粒中的元件方向被最優(yōu)化以增加質(zhì)粒拷貝數(shù)。我們教導(dǎo)同一載體骨架中原始起始點(diǎn)和kanR相對(duì)于彼此的方向意想不到并顯著地改變質(zhì)粒產(chǎn)率。通常，現(xiàn)有才支術(shù)教導(dǎo)需要防止復(fù)制起始點(diǎn)從相鄰基因通讀轉(zhuǎn)錄，以防止質(zhì)粒去穩(wěn)定或減少的拷貝數(shù)(Eastman，EM，DurlandRH.2000美國(guó)專利第6103470號(hào)；EngelsP,MeyerP.1993B/ofec/7w々w^s.14:324-325)。本文確定的最4圭方向通過起始點(diǎn)和kanR基因的分支轉(zhuǎn)錄以及在kanR基因后面加入雙轉(zhuǎn)錄終止子來防止起始點(diǎn)轉(zhuǎn)錄通讀。RNA生成的DNA疫苗的優(yōu)選實(shí)施方案在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，為提高免疫反應(yīng)，使用含有RNA元件的DNA疫苗載體(圖6)進(jìn)行免疫。如下所述，我們預(yù)期使用含有表達(dá)的(可擴(kuò)增的)ssRNA、shRNA和dsRNA序列的DNA疫苗載體來進(jìn)一步4是高表達(dá)和/或免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，RNA序列是免疫刺激的，是選擇性地前細(xì)胞凋亡或抗細(xì)胞凋亡的，或者作用以提高從質(zhì)粒的表達(dá)。含有shRNA和dsRNA的載體骨架將不誘導(dǎo)獲得性免疫反應(yīng)(即不受在先免疫暴露影響的可重復(fù)使用的載體)；這是相對(duì)替代載體(例如曱病毒屬復(fù)制子)疫苗而言顯著的優(yōu)點(diǎn)。該載體可以提供一系列的免疫刺激和細(xì)胞凋亡活性(圖7),理論上實(shí)現(xiàn)了使用RapidVACC選擇最佳(圖8);對(duì)于不同的遞送方法期望不同的最佳組合。這些載體形成RapidVACC疫苗開發(fā)平臺(tái)的第一步的基礎(chǔ)，其中細(xì)胞死亡和先天免疫刺激是最優(yōu)化的。RNA聚合酶I、II或m反應(yīng)性啟動(dòng)子也可用以制備RNA。優(yōu)選地，RNA元件使用RNA聚合酶III啟動(dòng)子用于表達(dá)?，F(xiàn)有技術(shù)沒有教導(dǎo)將RNA元件整合入DNA疫苗質(zhì)粒。RNA元件提供了對(duì)與DNA接種相關(guān)聯(lián)的差免疫反應(yīng)誘導(dǎo)的新的可能的解決方案，且不需要在質(zhì)粒骨架中包括免疫原性蛋白以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或先天免疫反應(yīng)(如生成曱病毒屬復(fù)制子或鞭毛蛋白的質(zhì)粒所具有的)。而且，RNA元件提供了對(duì)與疫苗異源的佐劑(例如免疫刺激RNA或細(xì)胞因子或趨化因子，或抑制合成siRNA的基因)的加入相關(guān)聯(lián)的宿主、調(diào)節(jié)和安全性問題的解決方案，因?yàn)槟壳斑@些可通過含有DNA疫苗質(zhì)粒(圖7)的細(xì)胞中的質(zhì)粒骨架嚴(yán)格地生成或誘導(dǎo)。RNA元件提供了空前的靈活性，因?yàn)檩d體可以含有多個(gè)RNA元件，可使用合理設(shè)計(jì)的算法(RapidVACC;圖8)為各抗原/遞送確定其最佳的組合。這些元件可結(jié)合使用以優(yōu)化免疫反應(yīng)。所述RNA元件可以是免疫刺激的，促進(jìn)或抑制程序性細(xì)胞死亡，指導(dǎo)細(xì)胞死亡至壞死途徑，增強(qiáng)質(zhì)粒核定位和啟動(dòng)子表達(dá)，或者以其他方式改變細(xì)胞表達(dá)。RNA元件可以編碼單鏈RNA、雙鏈RNA、發(fā)夾RNA、微RNA、RNA適體或核酶或其組合。由于RNA表達(dá)元件的小尺寸(100-500bp)，單個(gè)質(zhì)粒中可以包括多個(gè)元件。由于RNA不包括獲得性免疫反應(yīng)，所以對(duì)含有載體的RNA的反應(yīng)不依賴于動(dòng)物或人類患者的在先暴露，并因此能夠重復(fù)使用，且不誘導(dǎo)針對(duì)載體骨架的免疫反應(yīng)。DNA疫苗骨架中加入RNA元件是針對(duì)差的抗原表達(dá)或免疫原性問題的新解決方案。雖然現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)了各種免疫刺激RNA可誘導(dǎo)干擾素和其他獲得性免疫反應(yīng)并提高對(duì)DNA疫苗的反應(yīng)，但未考慮在疫苗骨架中加入這種元件。而且，雖然通過加入載體表達(dá)的蛋白佐劑(例如鞭毛蛋白)、前細(xì)胞凋亡蛋白(曱病毒屬復(fù)制子或突變半胱天冬蛋白酶)或抗細(xì)胞凋亡蛋白改良了DNA疫苗，但這些方法是限制性的，因?yàn)檫@時(shí)的載體骨架誘導(dǎo)針對(duì)所編碼蛋白的獲得性免疫反應(yīng)，或者含有人類蛋白(安全性考慮)。而且，由于RNA元件的小尺寸，載體骨架中可以包括多個(gè)元件(功能性)，以提供免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中空前的靈活性，這是現(xiàn)有技術(shù)中未考慮或教導(dǎo)的。這種新穎的、新的和未啟示的元件組合(RNA元件與抗原表達(dá))實(shí)現(xiàn)了成本有效的、安全的、多用途DNA疫苗的開發(fā)，所述DNA疫苗提高和定制免疫反應(yīng)。以增強(qiáng)對(duì)DNA疫苗載體的免疫反應(yīng)的shRNA表達(dá)載體的使用也是新的，并在現(xiàn)有技術(shù)中未考慮。雖然設(shè)計(jì)用于基因沉默的shRNA質(zhì)粒已經(jīng)顯示誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)(PebernardS.IggoRD.2004D#e^7^^w72:103-111),并使用siRNA質(zhì)粒已經(jīng)觀察到了類似的免疫系統(tǒng)激活(MarquesJT,WilliamsBRG2005A^w23:1399-1405),但該現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)遠(yuǎn)離本發(fā)明，因?yàn)榭疾煺邔⑨槍?duì)siRNA或shRNA的先天免疫反應(yīng)視為關(guān)于基因擊倒(knockdown)載體商業(yè)化的問題。而且，顯然，本領(lǐng)域技術(shù)人員將不會(huì)預(yù)期該新開發(fā)，因?yàn)閬碜愿叨扰Ｔ椿腄NA疫苗和shRNA領(lǐng)域的廣泛現(xiàn)有技術(shù)都沒有教導(dǎo)使用RNA元件來改良DNA接種。一旦如本文^^開的來構(gòu)思，該先前未啟示的對(duì)DNA疫苗骨架的修飾(RNA元件連接入DNA疫苗骨架)教導(dǎo)了許多新的意想不到的結(jié)果，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是清楚的。例如，本發(fā)明解決了長(zhǎng)期渴望但未解決的需求，即提高針對(duì)DNA疫苗載體的免疫反應(yīng)，且不包括人類蛋白，例如質(zhì)粒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子(其存在自身免疫安全性考慮)、異源佐劑(安全性、調(diào)節(jié)和成本考慮)，同時(shí)保持載體的多用途能力(鞭毛蛋白或曱病毒屬復(fù)制子所限制的)。而且，該方法解決了在先僅DNA接種的不可操作性，因?yàn)樵谙燃夹g(shù)教導(dǎo)在靈長(zhǎng)類和人類中的DNA接種僅當(dāng)與異源載體加強(qiáng)(例如腺病毒、蛋白質(zhì)或滅活疫苗)或包括有效第二佐劑(例如IL12、IL1》或病毒蛋白(曱病毒屬)的時(shí)候才是有效的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將發(fā)現(xiàn)本發(fā)明現(xiàn)在將這些附加功能整合入了疫苗骨架。而且，現(xiàn)在，在單個(gè)載體中包括多個(gè)RNA元件的能力實(shí)現(xiàn)了將多個(gè)功能整合入疫苗的空前的意想不到的能力。而且，雖然有優(yōu)化質(zhì)粒元件以提高表達(dá)的廣泛在先技術(shù)，但現(xiàn)有技術(shù)還沒有考慮加入RNA元件來實(shí)現(xiàn)其。DNA疫苗質(zhì)粒中可以包括許多不同類型的RNA元件，以產(chǎn)生多種生物反應(yīng)。下面公開了許多RNA功能和應(yīng)用。其目的不是限制RNA元件應(yīng)用于這些具體實(shí)施例，而是這些實(shí)施例的討論是說明本發(fā)明的一般效用?；虮磉_(dá)的定向擊倒實(shí)現(xiàn)了靶細(xì)胞蛋白組的定制化。這可用以誘導(dǎo)TH1或TH2免疫刺激細(xì)胞因子或趨化因子生成、干擾素生成，提高蛋白體加工，改變壞死或細(xì)胞凋亡反應(yīng)，誘導(dǎo)質(zhì)粒DNA核定位，增強(qiáng)質(zhì)粒表達(dá)，或改變MHCI或MHCII決定子或其他細(xì)胞表面受體(例如Toll樣受體)的表達(dá)。例如，可以通過干擾素調(diào)節(jié)因子4(IRF-4)的shRNA擊倒來增強(qiáng)來自TLR的信號(hào)傳導(dǎo)，所述干擾素調(diào)節(jié)因子4負(fù)向調(diào)節(jié)經(jīng)由TLR的信號(hào)傳導(dǎo)，其需要銜接蛋白MyD88。TLR信號(hào)傳導(dǎo)途徑受TLR可誘導(dǎo)分子的負(fù)調(diào)節(jié)，所述TLR可誘導(dǎo)分子例如IRAK-M(IL-1受體(IL-1R)相關(guān)激酶M)、SOCSl(細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑1)、MyD88(MyD88短)、SIGIRR(單個(gè)免疫球蛋白IL-1R相關(guān)分子)和ST2。TLR的其他負(fù)調(diào)節(jié)子是P13K、TRIAD3A、Tollip、A20DAP12和RP105(TLR4抑制劑；綜述于LiewFY,XuD,BrintEK,O'NeillLAJ.2005A^wiev./附mw".5:446-458)。擊倒可以增強(qiáng)細(xì)胞因子對(duì)TLR反應(yīng)的強(qiáng)度。Cot可以是靶，因?yàn)槠渌坪踝饔脼镮L-12介導(dǎo)的TH1反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)子?？梢酝ㄟ^蛋白體的激活來增強(qiáng)MHCI上肽的展示。shRNA生成元件(例如鼠U6啟動(dòng)子為300bp)的小尺寸允許多個(gè)盒整合入單個(gè)質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)了理論上的靶細(xì)胞操縱。下面討-淪了該方法誘導(dǎo)定向程序性細(xì)胞死亡或質(zhì)粒核定位的實(shí)例應(yīng)用。增強(qiáng)質(zhì)粒表達(dá)的shRNA考慮了改變蛋白質(zhì)組以通過提高的質(zhì)粒穩(wěn)定性、核轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定性、mRNA加工和mRNA核輸出和/或抗原翻譯來提高抗原表達(dá)的shRNA。例如，質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞核是獲得抗原表達(dá)的限制性因素。通過加入NFKB結(jié)合位點(diǎn)或SV40增強(qiáng)子來提高質(zhì)粒的核定位，提高了抗原在體外和體內(nèi)的表達(dá)；推測(cè)這歸因于NFKB的結(jié)合，其然后肩負(fù)質(zhì)粒至細(xì)胞核(Dean等，同前，1999)。然而，NFkB—^:定位于細(xì)胞質(zhì)，而向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移是既是有限、組織特異性的，也依賴于刺激信號(hào)。這限制了NFkB核尋靶的應(yīng)用。靶向NFkB核定位的短半衰期抑制劑(例如Ik(3a、f3和e)的質(zhì)粒編碼shRNA將導(dǎo)致提高質(zhì)粒核停留的NFKB5的核定位。而且，將從NFkB反應(yīng)性啟動(dòng)子(CMV和SV40-CMV啟動(dòng)子)增強(qiáng)表達(dá)。預(yù)期該策略提高表達(dá)水平，并將在改良DNA疫苗以及用于治療的質(zhì)粒(例如生長(zhǎng)激素釋放因子質(zhì)粒療法)中具有應(yīng)用。誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的shRNA通過程序性細(xì)胞死亡來提高對(duì)DNA疫苗的免疫反應(yīng)。這已經(jīng)通過同時(shí)施用Fas或突變的半胱天冬蛋白酶2或3(其提高了CTL對(duì)肌肉注射的DNA疫苗的反應(yīng))來完成。共施用的半胱天冬蛋白酶也提高了對(duì)通過基因槍給入的流感HADNA疫苗的免疫反應(yīng)(Sasaki等.同前，2001)。最化細(xì)胞(而非免疫細(xì)胞)(綜述于Leitner和Restifo，同前，2003)。不可能使用組成型細(xì)胞死亡促進(jìn)劑。程序性細(xì)胞死亡的抑制還可以提高免疫反應(yīng)，其中共施用Bcl-XL強(qiáng)力提高了基因槍給入之后的T細(xì)胞反應(yīng)。這可以反映延長(zhǎng)樹突細(xì)胞的益處。殺傷轉(zhuǎn)染細(xì)胞由于減少了插入誘變的改變而具有額外的安全性。樹突細(xì)胞(特別是比成熟細(xì)胞更不耐受細(xì)胞死亡誘導(dǎo)物的不成熟樹突細(xì)胞)可以對(duì)不同的抗程序性細(xì)胞死亡基因的耙向減少是不同地敏感的?？梢员粨舻沟目钩绦蛐约?xì)胞死亡基因的非限制性名單為BCL-2、BCL-XL、FLIP、XIAP以及Mcl-l、Bcl-W、Bfl隱l、c畫IAPl、C-IAP2、存活素、Livin和ARC。可以通過非免疫細(xì)胞在注射部位的靶向程序性細(xì)胞死亡來提高免疫反應(yīng)。對(duì)于肌肉注射，其將是骨骼肌細(xì)胞，對(duì)于皮下免疫，其將是角質(zhì)化細(xì)胞。有趣的是，骨骼肌細(xì)胞對(duì)內(nèi)在途徑的程序性細(xì)胞死亡表現(xiàn)耐受；這與降低的ApaFl水平(BurgessDH,SvenssonM,DandreaT,GronlimgK,HammarquistF,OrreniusS,CotgreaveIA.1999CW/Dea/6:256-261)和提高的XIAP水平(ReviewedinPrimeauAJ,AdhihettyPJ,HoodDA.2002Ca"./J///i5/;^"/.27:349-395)相關(guān)聯(lián)。骨骼肌表達(dá)高水平的FLIP和ARC(具有CARD的程序性細(xì)胞死亡抑制劑)。ARC同時(shí)抑制外在和內(nèi)在的程序性細(xì)胞死亡途徑；通過siRNA處理的ARC缺失導(dǎo)致肌細(xì)胞的自發(fā)程序性細(xì)胞死亡(NamYJ,ManiK,AshtonAW,PengCF，KrishnamurthyB,HayakawaY，LeeP,KorsmeyerSJ,Kitsis脂.2004Mo/ec.Ce〃.15:901-912)。這表明載有shRNA以擊倒ARC的DNA疫苗可以耙向骨骼細(xì)胞而非有關(guān)細(xì)胞死亡的樹突細(xì)胞。類似地，F(xiàn)LIP水平在角質(zhì)化細(xì)胞(并且中等水平的XIAP和Livin)中是高的；XIAP和Livin水平在細(xì)胞凋亡刺激后降低(BowenAR,HanksAN,AllenSM,AlexanderA，DiedrichMJ,GrossmanD.2003J7m^fDwmato/120:48-55)。輩巴向一個(gè)或多個(gè)這些基因可以實(shí)現(xiàn)選^t奪性的角質(zhì)化細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡，且不殺傷內(nèi)在的朗格漢司細(xì)胞。關(guān)鍵是，程序性細(xì)胞死亡可以被延緩，并需要在免疫后生成誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的炎性信號(hào)(例如TNFa)。這將在細(xì)胞死亡之前提供高水平的抗原表達(dá),超越例如使用曱病毒屬載體所觀察到的直接程序性細(xì)胞死亡的限制?？梢栽隗w外(使用原代骨骼肌細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、朗格漢司細(xì)胞或樹突細(xì)胞并監(jiān)測(cè)細(xì)胞死亡、干擾素或細(xì)胞因子或趨化因子的分泌、通過RTPCR的基因表達(dá)，和/或通過標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)使用抗體的蛋白質(zhì)表達(dá))或體內(nèi)(在遺傳免疫后，通過監(jiān)測(cè)THl或TH2反應(yīng)、抗體生成、細(xì)胞免疫反應(yīng)和/或保護(hù)性免疫)確定有關(guān)選擇性程序性細(xì)胞死亡和免疫刺激活性的shRNA最佳組合碼?；蛱禺愋詓hRNA被整合入疫苗載體中。由導(dǎo)入細(xì)胞的一個(gè)或數(shù)個(gè)拷貝的載體在接種過程中生成的shRNA的量應(yīng)該足夠用于靶向基因擊倒，因?yàn)楸绢I(lǐng)域教導(dǎo)了單拷貝的shRNA生成基因(與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體生成的生成shRNA的整合細(xì)胞系一樣)能夠足夠用于靶向基因沉默。對(duì)于基因靶向shRNA,如果利用靶向基因中的保守序列，則載體可以不需要被改造，因?yàn)樗鲚d體從小鼠至雪貂至人類是逐級(jí)放大的。例如，已經(jīng)為許多靶向基因(例如Bcl-2)開發(fā)了交叉反應(yīng)性沉默RNA構(gòu)建體(參見RNAiCodex網(wǎng)站http:〃codex.cshl.edu)?；蛘?，shRNA可以是物種特異性的。對(duì)于農(nóng)業(yè)應(yīng)用，優(yōu)選的RNA元件為靶向生物而合理設(shè)計(jì)，并在動(dòng)物研究之前使用耙向組織原代細(xì)胞進(jìn)行體外-瞼證。顯著地，對(duì)于疫苗應(yīng)用，dsRNA是與CpGDNA協(xié)同的，以提高免疫反應(yīng)(WhitmoreMM,DeVeerMJ,EdlingA,OatesRK,SimonsB,LinderD,WilliamsBRG.2004Ca"cwWe^arc/z64:5850-5860)。這可能是通過TLR3(dsRNA反應(yīng)'性；綜述于MatsumotoM,FunamiK,OshiumiH，SeyaT.2004M/cra6/o/48:147-154)與TLR9(CpG反應(yīng)性)(MukhopadhyayS,HerreJ,BrownGD,GordonS.2004/柳卿"o/112:521-530)的相互作用與合作途徑。TLR3和TLR4與TLR7、TLR8和TLR9激動(dòng)劑協(xié)同作用，以在DC中誘導(dǎo)TH1反應(yīng)；這可以是用于DC刺激的組合碼(NapolitaniG，RinaldiA，BertoniF,SallustoF,LanzavecchiaA.2005/w/m^o/.6:749-750)。整合了生成dsRNA(且不需要復(fù)制子基因)與CpG優(yōu)化能力的質(zhì)粒DNA疫苗的建立預(yù)期比曱病毒屬載體(其不是優(yōu)化的基因表達(dá))更有效。更多模式的加入(例如靶向shRNA)使dsRNA反應(yīng)得以定制；例如，可以合理設(shè)計(jì)壞死和程序性細(xì)胞死亡之間的平衡(綜述于KalaiM，LooGV，BergheTV,MeeusA,BurmW,SaelensX,VandenabedeP.2002Ce〃De^/z￡>i^r9:981-994)來最大化免疫反應(yīng)。誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的dsRNA細(xì)胞質(zhì)dsRNA活化PKR、RIGl和MDA-5，其誘導(dǎo)干擾素生成，抑制蛋白質(zhì)合成，從而減少抗原生成，最終導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡(綜述于Wang和Carmichael,同前，2004)。細(xì)胞死亡釋放dsRNA,其然后可以被細(xì)胞攝取，并通過結(jié)合和刺激內(nèi)體定位的TLR-3來進(jìn)一步誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)(綜述于Schroder和Bowie,同前，2005)。該類型的dsRNA刺激發(fā)生于曱病毒屬復(fù)制子疫苗。與標(biāo)準(zhǔn)DNA疫苗相比較，曱病毒屬復(fù)制子(自殺)疫苗使用少100-1000倍的抗原誘導(dǎo)了增強(qiáng)的免疫反應(yīng)(通過肌肉注射)。這些載體誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡，推測(cè)是通過dsRNA的生成，其激活抗病毒途徑并最終導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡(Leitner等.同前，2000)。細(xì)胞死亡是提高的疫苗效力所需要的，并由細(xì)胞質(zhì)復(fù)制子dsRNA介導(dǎo)，其通過TLR-3dsRNA識(shí)別途徑誘導(dǎo)先天免疫?？辜?xì)胞凋亡基因(Bcl-XL)的共遞送盡管增加了抗原生成，但降低了保護(hù)(Leitner等.同前，2003,2004;Matsumoto等.同前2005)。然而，細(xì)胞死亡信號(hào)和最佳抗原生成之間的遞送依賴平衡是需要的，因?yàn)樽詺NA疫苗采用基因槍(其靶向樹突細(xì)胞)遞送是無效的，除非包括了抗程序性細(xì)胞死亡基因(Kim等.同前2004)。7b〃未曱基化的CpG存在于微生物生成的質(zhì)粒的載體骨架中，并且增強(qiáng)(CpG富集質(zhì)粒)可用以通過TLR-9刺激TH1反應(yīng)性先天免疫信號(hào)。不幸的是，這些作用僅使用高劑量才觀察的到，并且如TH2偏移反應(yīng)所反映的，通過使用經(jīng)濟(jì)低量的抗原的高級(jí)遞送方法(例如基因槍)的CpG作用是最小的。而且，在人類中對(duì)DNA疫苗的總體上差的免疫反應(yīng)已經(jīng)部分歸因于人類中顯著降低的(與小鼠相比)TLR-9表達(dá)。蛋白質(zhì)(例如鞭毛蛋白)和RNATLR激動(dòng)劑可能將以低劑量更有效誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)，因?yàn)閬碜赃@些元件的信號(hào)從載體(不同于固定的載體組分，例如CpG)被"》文大"。理想地，對(duì)于在DNA疫苗載體骨架中加入先天免疫誘導(dǎo)物，應(yīng)該沒有相關(guān)的獲得性免疫反應(yīng)，獲得性免疫反應(yīng)將由于在先暴露(預(yù)存免疫)的個(gè)體中的衰減反應(yīng)而限制重復(fù)^f吏用并在群體中產(chǎn)生可變結(jié)果。例如曱病毒屬復(fù)制子載體(其生成dsRNA佐劑)或鞭毛蛋白生成載體含有一種或多種能夠誘導(dǎo)針對(duì)載體組分的獲得性免疫的蛋白質(zhì)。已經(jīng)鑒定了誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)的富含U或富含U/G的ssRNATLR7/8激動(dòng)劑(Heil等，同前，2004;Diebold等，同前，2004;Barchet等，同前,2005),和通過TLR-7誘導(dǎo)人和小鼠漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞生成干擾素的序列特異性siRNA(Homung等.同前，2005)。已經(jīng)鑒定了新類免疫刺激核酸，即不需要TLR-3、7、8或9的單鏈CpGRNA(Sugiyama等，同前)。已經(jīng)鑒定了活化RNA激活蛋白激酶PKR的RNA適體(apatamer)(ZhengX,BevilacquaPC.2004iA^10:1934-1945)。這些研究4吏用了外源應(yīng)用的ss腦A和siRNA?？梢越Y(jié)合程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)元件(其將釋放用于活化TLR3、7或8所必需的內(nèi)體才聶耳又的RNA;綜述于CrozatK,BeutlerB.2004Ato/.Jc^/.Sc丄lOl:18:6835-6836)來評(píng)價(jià)誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)的RNA。然而，在TLR3、7/8或9刺激DNA疫苗的設(shè)計(jì)和測(cè)試中需要考慮小鼠和人之間的TLR表達(dá)和免疫學(xué)差異(MestasJ,HughesCCW.2004//附ww"o/.172:2731-2738)。與小鼠相比較，TLR在人類中被差異表達(dá)；在人類中，TLR-3強(qiáng)表達(dá)于脾CDllc(+)未成熟樹突細(xì)胞，在成熟后下調(diào)，并不由LPS誘導(dǎo)。dsRNA誘導(dǎo)這些細(xì)胞生成干擾素a和IL-12。在小鼠中，TLR-3還表達(dá)于巨噬細(xì)胞，且表達(dá)由LPS刺激所誘導(dǎo)。還不知道小鼠和人之間受體表達(dá)模式、反應(yīng)性和免疫學(xué)的差異(綜述于Mestas和Hughes,同前，2004)將對(duì)疫苗在人類中的性能有什么影響。這可以由本發(fā)明的RNA元件通過組成表達(dá)的細(xì)胞質(zhì)RNA反應(yīng)元件(例如RIG1或Mda5)的刺激或者TLR途徑中下游信號(hào)的活化來克服，以避免TLR物種特異性。雖然dsRNA不是內(nèi)在靶特異性的(像存在于哺乳動(dòng)物基因組DNA中的CpG)，但聚I:C在體內(nèi)誘導(dǎo)了與A:U不同的Th2型作用(WangL,SmithD，BotS,DellamaryL,BloomA,BotA.2002JC7/wW110:1175-1184)。這表明可以通過篩選各種dsRNA表達(dá)元件來選擇TH1與TH2偏移，以按需要定制免疫反應(yīng)。dsRNA(聚I:C)已經(jīng)在許多臨床實(shí)驗(yàn)中用作佐劑，并被認(rèn)為對(duì)于人類使用是安全的(例如，參見GiantonioBJ，HochsterH，BlumR5WiernikPH,HudesGR，KirkwoodJ,TrumpD,OkenMM.2001/騰".臉wDrags19:89-92)。dsRNA負(fù)責(zé)對(duì)病毒感染的炎性反應(yīng)(例如，見ZareF，BokarweaM,NenonenM，BergstromT,AlexopoulouL,FlavellRA，TarkowskiA.2004JImmunol172:5656-5663)，并且dsRNA和dsDNA結(jié)合蛋白是突出的自身抗原(SatohM,ShaheenVM，KaoPN,OkanoT,ShawM5YoshidaH5RichardsHB,ReevesWH.1999C7z^w21A:34598-34604)，其可以SaitoJ5SingerDS，KlinmanDM5KrausePR5KohnLD.1999/VocAto/Jcad96:2285)。在許多研究中，質(zhì)粒DNA和dsRNA生成病毒載體還沒有誘導(dǎo)臨床相關(guān)水平的自身抗體。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的量是小的，并且預(yù)期的dsRNA生成顯著小于病毒感染過程中天然出現(xiàn)或使用病毒載體的生成量。因此，我們預(yù)期dsRNA生成質(zhì)粒將顯著比其他載體更安全。遂#已經(jīng)鑒定了許多通過Toll樣受體(TLR)結(jié)合活化先天免疫的微生物特異性基序，例如三酰基脂肽(TLR-l/TLR2)肽聚糖(TLR-2)、dsRNA(TLR3)、細(xì)菌HSP60或脂多糖(LPS;TLR-4)、鞭毛蛋白(TLR5)、二酰基脂肽(TLR-6)、ssRNA(TLR-7,TLR-80)、未曱基化的CpGDNA(TLR-9)。其他病原體模式識(shí)別受體包括NBS-LRR(Nod)家族的細(xì)胞內(nèi)識(shí)別單元(例如Nodi、Nod2,其通過特異性肽聚糖基序^f企測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌)和C型凝集素(例如dectin-l、DC-SIGN)。另外，一些先天免疫系統(tǒng)識(shí)別過程和分子也識(shí)別受損細(xì)胞和組織，如膠原凝集素(例如甘露糖結(jié)合蛋白、表面活性蛋白A和D、Clq)。而且，可以使用其他信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化劑；例如，TLR和IL-1受體(IL-1R)活化相似的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。這些非RNA活化劑中，可以使用本領(lǐng)域已知的方法來選擇結(jié)合并活化受體的RNA適體。然后，這些適體可作為有效的免疫刺激分子佐劑整合入DNA疫苗骨架，以進(jìn)一步加強(qiáng)DNA接種。C型凝集素dectin-l與Toll樣受體2協(xié)同作用，以誘導(dǎo)腫瘤壞死因子(TNF)和白介素12(IL-12)的生成。活化劑的組合碼可用以活化多種受體，以累加或協(xié)同地增強(qiáng)免疫反應(yīng)。而且，雙功能適體(兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn))可用于抗原靶向。例如，抗原結(jié)合位點(diǎn)與樹突細(xì)胞耙向位點(diǎn)的整合可用以耙向通過細(xì)胞壞死釋放的抗原至APC。DNA把向優(yōu)選實(shí)施方案在確定最佳抗原呈遞的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用了靶向pDNAVACCUltra載體進(jìn)行免疫。本領(lǐng)域中已經(jīng)確定改變抗原細(xì)胞內(nèi)定位(例如從細(xì)胞質(zhì)至分泌)或以其他方式耙向抗原呈遞途徑的融合蛋白改變了所生成的免疫反應(yīng)(綜述于Gurunathan等，同前，2000)。可用以改變?nèi)诤系鞍椎募?xì)胞內(nèi)運(yùn)輸或抗原呈遞的優(yōu)選分子是本領(lǐng)域已知的。幾種細(xì)胞內(nèi)靶向序列描述于Williams等，同前2001，并通過引用結(jié)合入本文。幾種抗原呈遞途徑靶向分子描述于Leifert等，同前，2004和Lemieux,同前2002,并通過引用結(jié)合入本文。表3總結(jié)了這些分子中的一些。圖5顯示了整合有一些靶向分子的本發(fā)明的示例性載體。表3:抗原呈遞途徑耙向分子<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>本領(lǐng)域還知道細(xì)胞內(nèi)靶向的效果是抗原特異性，并且需要為每個(gè)抗原經(jīng)驗(yàn)確定為生成期望免疫反應(yīng)的最佳細(xì)胞內(nèi)目的地?，F(xiàn)有技術(shù)中沒與預(yù)期或教導(dǎo)使用靶向載體家族來確定耙向目的地的最佳組合。而且，現(xiàn)有載體(例如Williams等，同前，2001的那些載體)使用II型限制酶用于克隆，并沒有實(shí)現(xiàn)靶抗原的精確表達(dá)，且沒有增加外源序列。這些外源序列可以對(duì)表達(dá)和定位具有重要作用。本文公開的pDNAVACCUltra載體實(shí)現(xiàn)了為抗原快速確定最佳的細(xì)胞內(nèi)目的地。所述載體被設(shè)計(jì)以促進(jìn)基因快速同時(shí)克隆入具有相同骨架的多個(gè)載體(圖3)，特征為針對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)品的各種細(xì)胞內(nèi)靶向目的地。本文公開的示例性靶向目的地，即i)分泌、ii)分泌膜錨定、iii)內(nèi)體、iv)細(xì)胞質(zhì)、v)蛋白體或vi)樹突，不是窮盡性名單，用于靶向的信號(hào)也不是窮盡性的。例如，熱休克蛋白(HSP)結(jié)構(gòu)域可以替換pDNAVACCUltra4中的泛素信號(hào)，以生成HSP標(biāo)簽的克隆載體?；蛘?，可以使用不同于圖5中所列的信號(hào)，例如，酪氨酸酶信號(hào)序列可替代TPA序列。使用所公開的基因自組裝技術(shù)或標(biāo)準(zhǔn)克隆方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到在所述載體家族中加入和使用其他靶向序列(參見表3，示例靶向序列)。因?yàn)槭褂脴?biāo)準(zhǔn)的II型限制酶克隆位點(diǎn)，現(xiàn)有載體(例如Williams等，同前，2001和Bucht等，同前，2001的那些載體)沒有被最佳i殳計(jì)以確定對(duì)耙向各種細(xì)胞內(nèi)目的地的抗原的免疫反應(yīng)。本領(lǐng)域教導(dǎo)載體骨架之間的小序列變化可以改變表達(dá)水平(Hartikka等，同前，1996);已經(jīng)顯示了不同的表達(dá)水平影響生成的免疫反應(yīng)(Zinckgmf和Silbart,同前，2003)。而且，，即使是當(dāng)這些序列不含導(dǎo)向標(biāo)記時(shí)，從克隆位點(diǎn)或肽標(biāo)記添加小肽至重組蛋白可以改變蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位(Ramanathan等，同前，2001)。相反，本文公開的載體解決了該問題，因?yàn)槠涫潜豢刂频慕M，并因II型限制位點(diǎn)不用于克隆而不含有其他外源序列。本文公開的載體實(shí)現(xiàn)了整合有本領(lǐng)域鑒定的任何和全部靶向分子的受控質(zhì)粒的生成，且不需要經(jīng)由II型酶克隆位點(diǎn)添加在所述抗原側(cè)翼的其他序列。該載體家族通過確定最佳抗原呈遞而具有提高DNA免疫的應(yīng)用。在用于提高DNA接種的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，通過使用pDNAVACCUltra載體增加基因表達(dá)。本文公開的pDNAVACCUltra載體與現(xiàn)有技術(shù)描述的載體相比實(shí)現(xiàn)了提高的基因表達(dá)(圖4)。該載體能夠用以提高靶基因表達(dá)，用于提高免疫反應(yīng)或提高蛋白質(zhì)表達(dá)的目的(例如用于治療用途)。DNA免疫優(yōu)選實(shí)施方案在用于提高DNA接種的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，使用靶向和/或含有RNA元件的載體的組合來提高免疫反應(yīng)。我們?cè)谶@里公開了pDNAVACCUltra靶向載體在疫苗開發(fā)中的各種用途(RapidVACC圖8)。以下討論的是RapidVACC有關(guān)評(píng)價(jià)靶向質(zhì)粒組合的用途。各種RNA元件(即，結(jié)合提高程序性細(xì)胞死亡、免疫刺激等)的評(píng)價(jià)將使用相同的算法和方法。本發(fā)明的一個(gè)目的是優(yōu)化初次-加強(qiáng)方案中的DNA組分。如通過免疫所確定的，與使用其他載體可獲得的免疫反應(yīng)相比較，利用pDNAVACCUltra載體及其優(yōu)良表達(dá)，結(jié)合把抗原和/或RNA元件的最佳細(xì)胞內(nèi)輩巴向，可以顯著提高免疫反應(yīng)。本發(fā)明的另一目的是通過優(yōu)化的DNA初次/DNA加強(qiáng)或l又DNA初次(單次激發(fā))免疫來增強(qiáng)對(duì)遺傳疫苗的免疫反應(yīng)。這是長(zhǎng)久渴望、長(zhǎng)期存在并未解決的需要，因?yàn)槭褂卯愒摧d體或蛋白的結(jié)合DNA接種雖然有效，但消除了DNA接種的優(yōu)點(diǎn)(即，成本、安全性、減少的開發(fā)時(shí)間、減少的工藝過程開發(fā))。RapidVACC是使用本發(fā)明的細(xì)胞內(nèi)靶向載體(具有或沒有RNA元件)來確定保護(hù)性抗原的最佳呈遞的疫苗開發(fā)過程，其使用本文公開的靶向質(zhì)粒免疫方法，結(jié)合本領(lǐng)域已知的抗原鑒定方法、免疫方法(例如電穿孔、超聲、微粒等)和免疫反應(yīng)評(píng)價(jià)方法(例如通過干擾素-Y酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)評(píng)價(jià)T細(xì)胞反應(yīng)，通過酶關(guān)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)和Western印跡法來評(píng)價(jià)抗體反應(yīng)，和通過在相關(guān)動(dòng)物激發(fā)模型中的生物免疫激發(fā)來評(píng)價(jià)保護(hù)性反應(yīng))。本文討論的RapidVACC的用途不是要限制于基于傳統(tǒng)質(zhì)粒的DNA疫苗載體；本文公開的策略和耙向標(biāo)簽可用于任何非病毒或病毒載體系統(tǒng)，包括但不限于微環(huán)、蠓、噬菌體或單鏈DNA載體，或者曱病毒屬、痘病毒、腺病毒或腺病毒相關(guān)的病毒載體。而且，所述策略可用于替代DNA疫苗載體或修飾的pDNAVACCUltra載體，所述替代DNA疫苗載體按需要被修飾以加入RNA元件和/或?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞內(nèi)靶向(例如VR1012、pCMVKm2、pCpG、pCOR、pVC0396、pcDNA3、pVAX、pCWH24-6、pMAX、曱病毒屬復(fù)制子載體等)。例如，pDNAVACCUltra載體中的一種或多種模塊可以被改變，并且所述載體還可用于RapidVACC優(yōu)化。不同的啟動(dòng)子(例如SV40、RSV、RSV-CMV、CMV-雞B肌動(dòng)蛋白CAG啟動(dòng)子等)前導(dǎo)物(例如CMV內(nèi)含子1、RNA運(yùn)出前導(dǎo)物、QB1SP163翻譯增強(qiáng)子、土撥鼠PRE)終止子(例如牛生長(zhǎng)激素終止)、原核復(fù)制起始點(diǎn)(例如其他pMBl或ColEI衍生的起始點(diǎn)、CpG減少的起始點(diǎn)、R6K起始點(diǎn)、R質(zhì)粒起始點(diǎn)、pKLl起始點(diǎn);參見表4示例的復(fù)制起始點(diǎn)，和使用這些復(fù)制起始點(diǎn)的載體)，可選的標(biāo)記(例如可選的抗生素抗性標(biāo)記(例如zeomycin或可選的卡那霉素抗性、tRNA、平衡致死系統(tǒng)、抑制劑滴定質(zhì)粒)。而且，可以在RapidVACC優(yōu)化中使用具有其他元件的質(zhì)粒，例如Rev基因(以增加一些病毒RNA的核輸出)、雙順反表達(dá)所需要的元件[第二轉(zhuǎn)錄單元、內(nèi)在核糖體起始序列(IRES)]、免疫增強(qiáng)CpG序列、位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)(例如多聚體分辨系統(tǒng)或微環(huán)重組酶位點(diǎn))或活性分配系統(tǒng)(例如質(zhì)粒RK2的parA和parB)。圖5的示例載體使用相應(yīng)于靶抗原的起始和終止的ATG和TAA終止密碼子，或者用于C末端延伸的GGC連接子密碼子。這不是要限制本發(fā)明的用途為精確地從起始和種子密碼子表達(dá)抗原?？梢允褂镁幋a內(nèi)在或新密碼子的可選地址標(biāo)記，以便耙抗原通過新的直接鍵合或通過連接肽而連接至靶向標(biāo)簽?？捎靡赃B接抗原至靶向標(biāo)簽的連接肽是本領(lǐng)域公知的。而且，可選的IIS型酶可用于克隆。例如，Aarl可替代Sapl使用。這將需要改變3b至4bp的地址標(biāo)簽。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>4pVC0396是優(yōu)化載體骨架，用于插入真核表達(dá)盒而且，靶向載體的應(yīng)用不限于人類接種，其還可以用于動(dòng)物、鳥類或魚類疫苗開發(fā)。本領(lǐng)域教導(dǎo)了用于最佳免疫保護(hù)的最佳質(zhì)粒組合將是抗原和遞送方法特異性的，并將需要根據(jù)每個(gè)抗原來確定。本領(lǐng)域沒有教導(dǎo)確定最佳呈遞的合理方法。本領(lǐng)域進(jìn)一步教導(dǎo)了現(xiàn)有混合質(zhì)粒免疫結(jié)果的解釋是不確定的，因?yàn)檫@些實(shí)例中使用的載體骨架之間的變異可以改變表達(dá)水平(Hartikka等,同前，1996)、免疫反應(yīng)(Zinckgraf和Silbart,同前2003)和亞細(xì)胞定位(Rarnanathan等，同前，2001)。Williams等，同前，2001教導(dǎo)了被設(shè)計(jì)以促進(jìn)抗原細(xì)胞內(nèi)耙向的載體的建立。這些載體是沒有如本文提出的被用于或考慮用于初次-加強(qiáng)優(yōu)化或混合的呈遞免疫。而且，所述載體在載體骨架間含有變體，并因此不能用于抗原呈遞的嚴(yán)格確定?？傊?，本領(lǐng)域沒有預(yù)期或教導(dǎo)使用靶向載體來確定靶向目的地的最佳組合。該新穎的免疫優(yōu)化策略的應(yīng)用描述如下。新穎的DNA初次/DNA加強(qiáng)疫苗組合的確定可以通過使用具有一個(gè)靶向目的地的DNA疫苗初次免疫和另一疫苗的加強(qiáng)免疫來模仿使用異源載體加強(qiáng)免疫而提高的免疫反應(yīng)。最佳的DNA疫苗初次-加強(qiáng)組合可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)驗(yàn)確定。例一個(gè)DNA初次免疫和一個(gè)DNA加強(qiáng)免疫的所有組合可以使用25組來測(cè)試(即，分泌抗原可以使用分泌、分泌膜錨定、細(xì)胞質(zhì)、蛋白質(zhì)組或內(nèi)體定向的抗原來加強(qiáng)，等等)。在可獲得小動(dòng)物感染模型的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以快速確定最佳免疫組合，因?yàn)樵诔醮魏Y選中僅需要評(píng)價(jià)25個(gè)測(cè)試組。圖8中描繪了一個(gè)可能的方法，其利用本發(fā)明的載體來確定最佳RNA元件(DNA骨架)和初次-加強(qiáng)才莫式中的抗原呈遞。最佳組合可以在初次和加強(qiáng)中使用相同或不同的耙向目的地，以優(yōu)化免疫反應(yīng)。不是要將本申請(qǐng)的范圍限制于圖5中所示的靶向目的地；本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用其他靶向分子增加或更換靶向目的地。靶向分子的實(shí)例列于表3。通過使用影響反應(yīng)的性質(zhì)和強(qiáng)度的RNA元件，例如通過控制細(xì)胞因子或趨化因子的誘導(dǎo)來改變TH1與Th2偏移(例如促迸Th1的IL12、IL18，j足進(jìn)TH2的IL4),可以針對(duì)系統(tǒng)免疫或黏膜免疫、細(xì)胞與體液反應(yīng)、癌癥、變態(tài)反應(yīng)或耐受應(yīng)用來進(jìn)一步提高或定制疫苗的效力。將才艮據(jù)物種和遞送方法(例如電穿孔與基因槍)所靶向的特定細(xì)胞類型來優(yōu)化元件的必要組合。通過來自靶組織的原代細(xì)胞的質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染的初期體內(nèi)評(píng)價(jià)可用作具有期望功能性的RNA元件的預(yù)篩選，以限制用于初期RapidVACC載體骨架篩選的質(zhì)粒數(shù)目(圖8)。優(yōu)選地，最佳DNA疫苗初次-加強(qiáng)組合可實(shí)現(xiàn)異源載體加強(qiáng)免疫的缺失。這將顯著提高DNA疫苗的快速部署效能，因?yàn)镈NA疫苗的開發(fā)時(shí)間顯著短于蛋白質(zhì)或病毒載體系統(tǒng)的開發(fā)時(shí)間。這可以包括在初次和加強(qiáng)中使用不同遞送系統(tǒng)(如Buchan等，同前，2005所教導(dǎo)的)或者不同的注射部位(如Pavlakis等，同前，2004所教導(dǎo)的)。已經(jīng)報(bào)道了當(dāng)質(zhì)粒DNA與純化蛋白(對(duì)應(yīng)于所述質(zhì)粒中編碼的蛋白質(zhì))(Dalemans等，同前，2003、Carrera等，同前，2004以及Imoto和Konishi,同前，2005)或滅活病毒(Rangarajan等，同前2004)被混合注射時(shí)增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。我們推測(cè)使用純化蛋白、滅活病毒或細(xì)胞或者細(xì)胞提取物結(jié)合本發(fā)明的一種或多種靶向質(zhì)粒中編碼的抗原的免疫可以進(jìn)一步增強(qiáng)反應(yīng)。本發(fā)明的一個(gè)目的是使用"混合的呈遞免疫"進(jìn)一步增強(qiáng)免疫反應(yīng)，至不同的細(xì)胞內(nèi)目的地)的免疫來增強(qiáng)對(duì)靶抗原的免疫反應(yīng)。該兩種或多種含有相同抗原(具有不同細(xì)胞目的地)的DNA疫苗質(zhì)粒的新組合可以顯著改善免疫反應(yīng)的性質(zhì)。使用本發(fā)明的載體測(cè)試質(zhì)粒雞尾酒(結(jié)合了2種或多種細(xì)胞內(nèi)耙向目的地的組合)是可行的。提供最佳免疫反應(yīng)的呈遞模式的組合可以是抗原特異性的。本發(fā)明的載體促進(jìn)合理設(shè)計(jì)的快速部署疫苗算法，其中通過使用特定載體組合免疫的連續(xù)循環(huán)來確定最佳的新穎的呈遞組合，其為各被選靶抗原提供了比單獨(dú)耙向目的地更好的免疫反應(yīng)。圖8中描繪了一個(gè)可能的方法。疫苗開發(fā)過程包括使用靶向質(zhì)粒免疫(使用本領(lǐng)域已知的抗原)來鑒定把向保護(hù)抗原。然后通過確定耙向目的地的最佳組合來提高疫苗中抗原的效力，所述確定是通過接種后使用從2種至200種的多種靶向質(zhì)粒組合的單獨(dú)或混合呈遞免疫，最優(yōu)選從5種至36種靶向質(zhì)粒組合。例如，所公開的具有5個(gè)不同靶向目的地的pDNAVACCUltra載體系統(tǒng)，存在5種單個(gè)目的地質(zhì)粒組合、10種2個(gè)目的地質(zhì)粒組合、10種3個(gè)目的地質(zhì)粒組合、5種4個(gè)目的地質(zhì)粒組合和1種5個(gè)目的地質(zhì)粒組合(總共36種組合)。載體家族中加入其他靶向目的地將增加組合數(shù)目，而目的地的消除將減少組合數(shù)目。一旦確定了最佳組合，則使用類似算法為初次和加強(qiáng)步驟確定單次或多次加強(qiáng)接種方案的最佳組合。其不是要限制用于評(píng)價(jià)不同質(zhì)粒組合的選項(xiàng)，因?yàn)橛卸喾N方法可以被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用。例如，在疫苗優(yōu)化過程中，重要的是在初期評(píng)價(jià)之后，可以基于抗原對(duì)抗原特異性排除一些輩巴向目的地或目的地組合，以降低多種加強(qiáng)算法的復(fù)雜性。如果在初期篩選結(jié)果之后初次免疫抗體的數(shù)目減少至3,則僅有1-3個(gè)質(zhì)粒的7種可能組合用于測(cè)試?；蛘?，可以選擇初期篩選中最高反應(yīng)的組合用于隨后的多次加強(qiáng)優(yōu)化。相同的合理方法用于確定最佳載體骨架(RNA元件評(píng)價(jià))。在可獲得小動(dòng)物感染模型的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以快速確定最佳疫苗組合，因?yàn)閮H構(gòu)建了5種質(zhì)粒構(gòu)建體(使用高通量克隆)，且在初期篩選中僅評(píng)價(jià)36個(gè)測(cè)試組。在初次和加強(qiáng)中不同的耙向質(zhì)粒組合可以鑒定為最佳。本領(lǐng)域教導(dǎo)了在DNA初次免疫后通過異源載體加強(qiáng)來獲得比單獨(dú)使用異源載體或DNA疫苗更好的免疫保護(hù)。這可能歸因于不同的抗原呈遞，其益處也可以通過混合的呈遞免疫來獲得。不是要將本申請(qǐng)的范圍限制于本文公開的5種靶向載體；本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用其他靶向分子增加或更換靶向目的地。靶向分子的實(shí)例列于表3。本發(fā)明的一個(gè)目的是優(yōu)化初次-加強(qiáng)方案中的DNA初次免疫。使用具有優(yōu)良表達(dá)的pDNAVACCUltra載體，結(jié)合靶抗原的最佳細(xì)胞內(nèi)靶向組合，可以顯著提高免疫反應(yīng)。本發(fā)明的另一目的是消除對(duì)蛋白質(zhì)或其他異源載體加強(qiáng)免疫以獲得足夠的免疫反應(yīng)的需求。這可以包括在初次和加強(qiáng)中使用相同或不同的靶向目的地組合來取代異源載體加強(qiáng)免疫。這將顯著4是高效用，因?yàn)镈NA疫苗的發(fā)展時(shí)間顯著短于那些用于蛋白質(zhì)或病毒載體系統(tǒng)的疫苗。這可以包括在初次和加強(qiáng)中4吏用不同的遞送系統(tǒng)(如Buchan等，同前，2005所教導(dǎo)的)或不同的注射部位(如Pavlakis等，同前，2004所教導(dǎo)的)。鍵遽絲瘦鄉(xiāng)一MCC」本發(fā)明的一個(gè)目的是使用pDNAVACCUltra靶向基因家族來開發(fā)用于新病原體的基于DNA的快速部署疫苗(RapidVACC)。一旦基因組序列可以獲得，則本發(fā)明的載體促進(jìn)合理設(shè)計(jì)的快速部署疫苗算法。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用特定載體組合免疫的連續(xù)循環(huán)確定了為各選擇靶抗原和抗原組合提供更高免疫反應(yīng)的初次-加強(qiáng)免疫的最佳抗原呈遞。在該模式中，相同或不同的單個(gè)靶向質(zhì)粒被考慮用于初次和加強(qiáng)免疫。在另一實(shí)施方案中，通過使用特定載體組合免疫的連續(xù)循環(huán)確定為各選擇靶抗原和抗原組合提供了比單個(gè)靶向目的地更高免疫反應(yīng)的最佳的新穎的呈遞組合。在該模式中，考慮使用混合模式的免疫評(píng)價(jià)。RapidVACC過程包括使用本文公開的靶向質(zhì)粒免疫方法結(jié)合本領(lǐng)域已知的抗原鑒定方法來鑒定保護(hù)性抗原?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的方法鑒定RapidVACC中使用的抗原。例如，存在基因組學(xué)、生物信息學(xué)、轉(zhuǎn)錄特征或蛋白組學(xué)技術(shù)，其實(shí)現(xiàn)了高通量篩選保護(hù)性表位?？墒褂蒙镄畔W(xué)來鑒定測(cè)序基因組中推定的疫苗候選免疫促進(jìn)T細(xì)胞表位。轉(zhuǎn)錄特征篩選(例如微陣列分析)被用以通過測(cè)定注射后在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的所有蛋白來鑒定疫苗靶。轉(zhuǎn)錄活性PCR(TAP)產(chǎn)物(線性表達(dá)元件)的生成和篩選是產(chǎn)生DNA片段(其在轉(zhuǎn)染入細(xì)胞或DNA免疫之后生成靶蛋白)生成的非常高通量的技術(shù)。該技術(shù)在體外測(cè)定(T細(xì)胞測(cè)定)和體內(nèi)(即遺傳免疫)高通量蛋白組篩選中具有應(yīng)用(SykesKF，JohnstonSA.1999Ato肌ofec/z"o/;17:355-359)。該技術(shù)非常適于在全基因組中鑒定候選抗原(抗原效價(jià))，用以進(jìn)一步分析(即，如本文公開的使用DNA疫苗質(zhì)粒的保護(hù)研究)。來自細(xì)胞內(nèi)病原體的分泌蛋白和膜結(jié)合蛋白可用作足夠保護(hù)性T細(xì)胞表位的來源，以產(chǎn)生有效的多肽DNA疫苗。該假設(shè)在幾種生物中(例如結(jié)才亥分支才干菌(綺co6""en-wmft^e/rw/as/s)、軍團(tuán)才干菌屬(丄eg/owe〃a)和李斯特菌屬(Z^fen'a))的研究之后建成模型，其中已經(jīng)證明多種單個(gè)膜蛋白和分泌蛋白含有部分保護(hù)性表位，以及根據(jù)針對(duì)純化的鏈球菌(5^印tococc船)蛋白的保護(hù)性反應(yīng)的基因組篩選(WizemannTM，HeinrichsJH,AdamouJE,ErwinAL,KunschC,ChoiGH,BarashSC,RosenCA,MasureHR,TuomanenE，GayleA,BrewahYA,WalshW，BarrenP,LaTHlgraR，HansonM,LangermannS,JohnsonS,KoenigS.2001/畫w";69(3):1593-1598)。測(cè)序基因組中鑒定的基因中，被分泌或膜分離的亞型可以使用生物信息學(xué)來確定。生物信息學(xué)程序(例如信號(hào)-P)已經(jīng)用于細(xì)菌基因組篩選，以鑒定分泌蛋白。該亞型將是全部基因的15-20%(如果20%，則為50-300個(gè)基因)。這是檢測(cè)保護(hù)性表位的可控制的量。例如，已經(jīng)在基因組水平上證明了有關(guān)腦膜炎萘瑟氏菌(A^ssen'amem'wg/^fe)的推定分泌蛋白的高通量克隆和表達(dá)及純化，以及用于候選物鑒定的體外和體內(nèi)測(cè)定。該所謂"逆向疫苗學(xué)，，方法是時(shí)間和成本有效的方法，用于將基因組數(shù)據(jù)應(yīng)用于疫苗開發(fā)(綜述于CapecchiB,SerrutoD,Adu-BobieJ，RappuoliR,andPizzaM.2004O^rZwmmAfo/Ao/.6:17-27)?？梢允褂每蛇x的基于蛋白組學(xué)的保護(hù)性表位鑒定，其利用DNA疫苗質(zhì)粒而非純化蛋白，使用高通量克隆外顯子進(jìn)入DNA疫苗載體，并通過表達(dá)文庫免疫來篩選保護(hù)性抗原。鑒定了保護(hù)性抗原以后，這些方法中沒有一個(gè)教導(dǎo)了在疫苗開發(fā)過程中優(yōu)化抗原呈遞。圖9中使用了示例RapidVACC保護(hù)性抗原優(yōu)化方案，其利用了DNA疫苗質(zhì)粒。在該實(shí)施例中，選擇分泌蛋白用于中和篩選；其不是要限制本申請(qǐng)的技術(shù)于分泌抗原。理論上，可以使用該方案快速鑒定在初次和加強(qiáng)免疫中的有效單個(gè)蛋白質(zhì)(圖9)或多聚蛋白(未顯示)疫苗以及最佳抗原呈遞組合?？梢允褂帽磉_(dá)文庫免疫(BarryMA，LaiWC,JohnstonSA.1995A^^;377:632-635)方案測(cè)試推定抗原的中和作用，其中DNA疫苗免疫原混合物是低復(fù)雜性的，且細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸被合理設(shè)計(jì)以顯著增加敏感性。使用pDNAVACCultra高通量抗原運(yùn)輸DNA疫苗質(zhì)粒的MHCI或MHCII呈遞耙向抗原的表達(dá)可以比純化蛋白免疫在檢測(cè)部分保護(hù)性表位(使用該類病原體所預(yù)期的)上更有效。使用pDNAVACCUltra載體篩選保護(hù)性蛋白將在單個(gè)高通量步驟中產(chǎn)生"金標(biāo)準(zhǔn)"高敏感性保護(hù)免疫結(jié)果。因此，該方法消除了費(fèi)時(shí)的以排除非保護(hù)性T細(xì)胞反應(yīng)性表位的二級(jí)篩選。該雜合基因組/蛋白組方法利用基因組學(xué)和生物信息學(xué)來將用于蛋白組篩選的靶的總數(shù)目減少至可控制的數(shù)目，以用于被設(shè)計(jì)以檢測(cè)部分保護(hù)性表位的高敏感性保護(hù)篩選。最終的疫苗制劑可以消除對(duì)以獲得足夠免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)或其他異源載體加強(qiáng)免疫的需求。這可以包括在初次和加強(qiáng)免疫中使用相同或不同的耙向目的地組合，以取代異源載體加強(qiáng)免疫。這將顯著增強(qiáng)效用，因?yàn)镈NA疫苗的開發(fā)時(shí)間顯著短于那些用于蛋白質(zhì)或病毒載體系統(tǒng)的疫苗。這可以包括在初次和加強(qiáng)免疫中^f吏用不同的遞送系統(tǒng)(如Buchan等，同前，2005所教導(dǎo)的)。實(shí)施例本發(fā)明方法在下述實(shí)施例中被進(jìn)一步描述。這些實(shí)施例通過描述被提供，并不意圖以任何方式限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1:pW2.0的建立pWizBang2.0為促進(jìn)基因和載體的有序、定向組裝，我們?cè)O(shè)計(jì)了為模塊方法設(shè)計(jì)了新載體，其中每個(gè)DNA片段被指定兩個(gè)獨(dú)特的非回文的地址標(biāo)記。該方法依賴于IIS類限制酶在距離酶切位點(diǎn)處消化的能力。鈍化DNA片段(合成dsDNA;PCR擴(kuò)增子；或平端限制片段)被克隆入新載體PWiz-Bang2.0，并使用IIS類酶/4^/(七堿基切割酶，可商業(yè)獲自Fermentas)或爿ar/同裂酶來切割DNA，留下4堿基5'-粘性末端。回收所述片段并在單個(gè)反應(yīng)中連接，生成了期望的構(gòu)建體(圖1)。理論上，獨(dú)特的、非回文的4-堿基末端的使用允許將達(dá)121個(gè)片段確定地結(jié)合在一起。實(shí)施例2:使用基因自組裝建立pDNAVACC載體使用基因自組裝技術(shù)，通過六個(gè)預(yù)克隆模塊的一步組裝建立了DNA疫苗質(zhì)粒。各模塊元件被指定循環(huán)陣列位置，提供了啟動(dòng)子、5-前導(dǎo)物/剪切位點(diǎn)、靶基因或高通量克隆位點(diǎn)、終止子和原核復(fù)制起始點(diǎn)/選擇/位點(diǎn)。單個(gè)模塊通過4bp的獨(dú)特、非回文地址標(biāo)記被指定位置和方向，并克隆入pWiz-Bang2.0。其他特征(例如原核終止子)通過在PCR引物上的5'延伸而被無縫整合入所述模塊。(基因自組裝)模塊由下述產(chǎn)品組成細(xì)菌復(fù)制起始點(diǎn)高拷貝數(shù)pUC衍生的復(fù)制起始點(diǎn)；原核可選擇標(biāo)記基因(卡那霉素；kanR);真核增強(qiáng)子-啟動(dòng)子(CMV或VL30NVL3;AdamsSE,RathjenPD,StanwayCA等1988Mo/Ce〃傷o/8:2989-2998);前導(dǎo)物合成的真核未翻譯的前導(dǎo)物-內(nèi)含子-翻譯起始序列(Kozak序列)盒，衍生自兔p-球蛋白前導(dǎo)物和內(nèi)含子；靶向盒高通量無縫克隆位點(diǎn)靶向基因前導(dǎo)盒(圖5)或者含有天然EGFP或TPA分泌的SEAP的對(duì)照才莫塊；終止子基于兔(3-球蛋白的合成的真核轉(zhuǎn)錄終止子使用尸/wDNA聚合酶(以避免增加額外堿基進(jìn)入平端片段末端)進(jìn)行了生成片段的PCR。片段被克隆入pWiz-Bang2.0的Sma/位點(diǎn)，插入片段被測(cè)序以在使用A^/釋放所述片段、使用T4DNA連接酶結(jié)合和轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞之前確認(rèn)正確的末端。確認(rèn)了代表性克隆的序列?；厥账銎尾⒃谝粋€(gè)反應(yīng)中連接，高頻率(〉90%)生成了期望的構(gòu)建體。來自六個(gè)含有六個(gè)連接片段(使用從70bp至2kb的片段的上述模塊的排列)的獨(dú)立反應(yīng)的15/16分離物生成了期望的構(gòu)建體，表明了高保真連接的4-堿基懸垂末端?？梢酝ㄟ^使用編碼其他靶向肽(參見表3示例)的新盒取代靶向盒來快速生成新的耙向載體。實(shí)施例3:pDNAVACC元件的驗(yàn)證使用來自gWiz國(guó)GFP(GeneTherapySystems,SanDiegoCA,USA)(VicalVR1012載體的衍生物(Hartikka等，同前，1996))的相應(yīng)區(qū)域取代pDNAVACC5-EGFP元件，以證實(shí)各pDNAVACC區(qū)的功能性。使用標(biāo)準(zhǔn)PCR和限制酶克隆方法進(jìn)行模塊和片段交換，并通過限制消化來確認(rèn)。i)側(cè)翼區(qū)上游的增強(qiáng)子使用^%0/-5^/片段取代的^20/(1^1111內(nèi)部位點(diǎn))-5^/(CMV增強(qiáng)子內(nèi)部位點(diǎn))片段ii)啟動(dòng)子-前導(dǎo)物-內(nèi)含子-Kozak:使用5^/-&//(填充的(filled);恢復(fù)Sail位點(diǎn)，見下)取代的Spe/(CMV增強(qiáng)子內(nèi)部位點(diǎn))-NcoI(EGFP起始密碼子)片段。a.通過使用來自gWiz-GFP的片段取代&//-Bg///片段來用來自g-Wiz-GFP的kozak-GFP耳又代該克隆內(nèi)的EGFP。iii)終止子使用3"附///-;^"/片段取代的Bglll-Stul片段。iv)起始點(diǎn)-Kan盒使用X附/iMo/取代的5hJ-A7zo/(內(nèi)部kanR位點(diǎn))片段。各親本和交換質(zhì)粒的EGFP或GFP表達(dá)水平大約相等，-險(xiǎn)證了所述設(shè)計(jì)并表明外源序列的缺失沒有降低表達(dá)。實(shí)施例4:起始點(diǎn)的方向和組成顯著影響拷貝數(shù)通過缺失分析確定了產(chǎn)生高拷貝質(zhì)粒生成的pUC起始點(diǎn)的最小尺寸。通過從Qiagen小質(zhì)粒試劑盒制品獲得的質(zhì)粒的定量確定了質(zhì)?？截悢?shù)。通過基因自組裝生成了含有核心起始點(diǎn)的衍生物(圖2:經(jīng)由RNaseH切割位點(diǎn)的RNAII啟動(dòng)子)，并發(fā)現(xiàn)其具有顯著減少的拷貝數(shù)。^;^4終止子(Notl/StuI消化的，klenow填充并重連的)的去除沒有改變拷貝數(shù)。至核心起始點(diǎn)的任一側(cè)翼區(qū)的添加增加了拷貝數(shù)，但各自相對(duì)完整的lkb起始點(diǎn)具有減少的拷貝數(shù)。質(zhì)粒的產(chǎn)率意想不到和顯著地改變了原始起始點(diǎn)和kanR基因在同一pDNAVACC載體骨架中的相對(duì)彼此的方向(表1)。通過側(cè)翼獨(dú)特限制位點(diǎn)的兩個(gè)消化產(chǎn)物的連接反轉(zhuǎn)了kanR和起始點(diǎn)基因的方向(&w/ZF^/用于起始點(diǎn)反轉(zhuǎn)，i^p/ZPme/用于KanR反轉(zhuǎn))。本文確定的最佳方向具有起始點(diǎn)和kanR基因的分支轉(zhuǎn)錄，以及在kanR基因后包括了雙轉(zhuǎn)錄終止子。實(shí)施例5:pDNAVACCUltra性篩選中)分離了ColEI和pMBl起始點(diǎn)的許多向上拷貝形式。與幾種高拷貝數(shù)突變體有關(guān)的損傷集中于RNAI啟動(dòng)子，但不影響RNAI的轉(zhuǎn)錄。甚至，其似乎影響RNAII復(fù)制引物二級(jí)結(jié)構(gòu)，這可以影響RNAI/RNAII相互作用或者RNAI抑制復(fù)制起始的能力(Lin-ChaoS，ChenW，WongT.1992Mo/M/cra6:3385-3393;FitzwaterT，ZhangX，ElbleR，PoliskyB.1988￡Mfi(9/7:3289-3297)。普遍使用的pMBl起始點(diǎn)(例如pUC19)或CoIEl起始點(diǎn)(pMMl、pMM7)的向上拷貝衍生物缺失了附屬ROP(rom)蛋白，并具有去穩(wěn)定RNAI/RNAII相互作用的其他改變。對(duì)于溫度敏感性起始點(diǎn)(例如pUC、pMMl、pMM7),培養(yǎng)物從30。C至42。C的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致了質(zhì)粒拷貝數(shù)增加30至40倍，至每細(xì)胞300個(gè)拷貝?？赡苡捎诎被狃囸I狀態(tài)下的無負(fù)荷tRNA結(jié)合的額外調(diào)控，許多這些衍生物被溫度和進(jìn)入穩(wěn)定期而凈皮最大地i秀導(dǎo)(pMMl、pMM7、pUC)。pMM7^皮才艮道在早期對(duì)數(shù)期的每細(xì)胞具有119個(gè)拷貝，并在晚期穩(wěn)定期經(jīng)歷拷貝數(shù)的進(jìn)一步增加(21倍)。在穩(wěn)定期，pMM7質(zhì)粒DNA占細(xì)胞總DNA的>50%。通過位點(diǎn)定向誘變?cè)趐DNAVACC-EGFP(以上述實(shí)施例4中確定的優(yōu)化的kanR基因起始點(diǎn)方向)載體骨架中構(gòu)建了一系列嵌合起始點(diǎn)。這些起始點(diǎn)位于pMBl起始點(diǎn)骨架中，其整合了l)pUC起始點(diǎn)突變，2)pMMl起始點(diǎn)突變，3)pMMl+pUC起始點(diǎn)突變，和4)pMMl、pMM7和pUC起始點(diǎn)突變。誘變處理的質(zhì)粒經(jīng)序列驗(yàn)證，并在處于中期對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的搖瓶培養(yǎng)物中確定了拷貝數(shù)。結(jié)果表明1)單獨(dú)的pMMl比其他三種組合具有顯著低的表達(dá)2)pMMl+pUC具有類似于處于對(duì)數(shù)期的pUC和三重組合的表達(dá)，但意想不到地在穩(wěn)定期具有提高的產(chǎn)率。pDNAVACCultra質(zhì)粒具有優(yōu)化的kanR基因-起始點(diǎn)方向(圖2),且具有pUC或pMMl+pUCRNAII突變。這比pDNAVACC(pUC起始點(diǎn)和非最佳kanR基因-起始點(diǎn)方向)增加了2倍的質(zhì)粒拷貝數(shù)(表1)。實(shí)施例6:嵌合啟動(dòng)子生成和評(píng)價(jià)增強(qiáng)子-啟動(dòng)子上游的獨(dú)特限制位點(diǎn)被整合入pDNAVACC載體，以實(shí)現(xiàn)嵌合增強(qiáng)子的構(gòu)建。使用基因自組裝構(gòu)建了含有細(xì)胞內(nèi)靶向EGFP的衍生pDNAVACC和pDNAVACCultra載體(由CMV或VL30啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))。通過PCR生成了嵌合增強(qiáng)子。PCR引物被設(shè)計(jì)為含有側(cè)翼限制位點(diǎn)和I"7)。產(chǎn)物經(jīng)消化，被克隆入^wiZY^/消化的pDNAVACC-EGFP，并經(jīng)序列驗(yàn)證。在使用lipofectamine(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)、Superfect(Qiagen，Valencia,CA,USA)或TROjene(AvantiPolarLipids,Alabaster,AL，USA)轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞系(或者人類HTam或鼠PA317)之后24-72小時(shí)，使用熒光顯微鏡檢查確定了EGFP的體外表達(dá)。通過異源SV40增強(qiáng)子重復(fù)序列(含有NFkB和其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn))或5NFkB結(jié)合位點(diǎn)的串聯(lián)體區(qū)別增強(qiáng)了CMV和VL30啟動(dòng)子在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)(表2)。使用具有任一啟動(dòng)子的pDNAVACCultra構(gòu)型的總體表達(dá)是較高的。通常，盡管在ultra構(gòu)型中使用CMV啟動(dòng)子沒有觀察到體外表達(dá)的提高，但SV40增強(qiáng)子的加入提高了表達(dá)。使用pDNAVACCUltraCMV-EGFP或pDNAVACCUltraSV40-CMV-EGFP構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致了使用近100%轉(zhuǎn)染的最高表達(dá)水平。相對(duì)于對(duì)照gWIZ-EGFP質(zhì)粒提高了表達(dá)效率。實(shí)施例7:體內(nèi)表達(dá)在小鼠中測(cè)定了SEAP的體內(nèi)表達(dá)。該研究使用了每組4只小鼠，且一個(gè)肌肉內(nèi)劑量的質(zhì)粒(5ug/20ul)通過電穿孔遞送至一個(gè)CT(脛骨肌)肌肉。在第4天放血。構(gòu)建體，并測(cè)定了體內(nèi)表達(dá)。結(jié)果(圖4)表明pDNAVACCUltraCMV-SEAP的表達(dá)比gWIZ-SEAP提高了。SV40增強(qiáng)子的加入顯著增強(qiáng)了使用5ug劑量的體內(nèi)表達(dá)。實(shí)施例8:質(zhì)粒穩(wěn)定性相對(duì)于含有SV40-CMV、CMV、SV40-NVL3和NVL3啟動(dòng)子的pDNAVACC質(zhì)粒，測(cè)定了pDNAVACCUltraCMV-GFP和pDNAVACCUltraSV40-CMV-GFP質(zhì)粒的穩(wěn)定性。通過從甘油保藏品質(zhì)粒的連續(xù)培養(yǎng)測(cè)定了質(zhì)粒的穩(wěn)定性。簡(jiǎn)單說，從甘油保藏品的LB+卡那霉素中過夜飽和的質(zhì)粒被認(rèn)為是第O代(GO)，兩個(gè)連續(xù)10-5稀釋液被再次培養(yǎng)至飽和(分別為G20和G40)。在超過40代的研究中沒有檢測(cè)到不穩(wěn)定性(超螺旋、復(fù)制中間體、二聚體形成％)。所有的質(zhì)粒主要是超螺旋的，且在所有時(shí)間點(diǎn)具有非常低水平的缺口質(zhì)?；蚨垠w形成。使用所有制中間體。pDNAVACC質(zhì)粒中SV40增強(qiáng)子的加入意想不到地導(dǎo)致了在甘油保藏中較低的生存力；相反，使用含有SV40的pDNAVACCUltra質(zhì)粒沒有觀察到生存力損失。這證明甘油保藏生存力受質(zhì)粒中元件方向的影響。實(shí)施例9:細(xì)月包內(nèi)輩巴向生成了整合有靶向信號(hào)(靶向盒；TPA、泛素或LAMP肽前導(dǎo)物和C末端膜錨定標(biāo)簽，如果需要；參見圖5)的高通量無縫克隆位點(diǎn)靶向基因前導(dǎo)盒，并使用基因自組裝技術(shù)整合入pDNAVACCultra載體家族。pDNAVACCultral(分泌-內(nèi)體)pDNAVACCultra2(分泌)pDNAVACCultra3(分泌-細(xì)胞膜-錨定)pDNAVACCultra4(蛋白酶體)pDNAVACCultra5(天然的)pDNAVACCultra6(細(xì)胞膜錨定)pDNAVACCultra7(內(nèi)體)pDNAVACCultra8(分泌-交叉呈遞)所有克隆位點(diǎn)^皮i殳計(jì)用于高通量克隆應(yīng)用(圖3)，并可在多種載體間相容，實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)步驟中建成幾種不同細(xì)胞內(nèi)靶向基因構(gòu)建體。所述載體家族含有CMV或嵌合SV40-CMV啟動(dòng)子(見下)。這些靶向序列是示例序列，并可以使用具有相似或不同靶向功能的其他靶向序列替代。例如，鼠G76A泛素衍生物被描述用于蛋白體靶向。該殘基減少了切割，使融合物作為聚泛素化的靶。去穩(wěn)定氨基酸(丙氨酸)緊隨G76殘基后被編碼(以確保;故切割的產(chǎn)物具有不穩(wěn)定的N端(如通過N端法則所確定的)，并還被靶向至蛋白質(zhì)組(Delogu等，同前，2000))。然而，其他物種或泛素衍生物可以被置換入所述載體。實(shí)施例10:高通量克隆圖3描述了pDNAVACC載體的高通量應(yīng)用實(shí)例。在使用5bpl(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA)消化之后，通過使用在末端整合有位點(diǎn)以產(chǎn)生5'ATG和3TAA或5'ATG和3'GGC的3bp粘性末端的引物從克隆或基因組DNA的擴(kuò)增拷貝了基因。對(duì)于不具有C端延伸的成員(例如泛素，天然的和分泌的)，地址標(biāo)記準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)于基因的起始(ATG)和終止(TAA)密碼子。對(duì)于膜或內(nèi)體錨定的載體，GCC丙氨酸連接子替代TAA終止子使用，以促進(jìn)運(yùn)輸(即，GPI或內(nèi)體靶向)所需要的C端延伸。使用Sapl的載體切割產(chǎn)生與被切割的PCR產(chǎn)物相容的粘性末端。因此，插入片段被定向并準(zhǔn)確地克隆入所述載體。多數(shù)回收的克隆是重組的，因?yàn)镾apl在親本載體中產(chǎn)生的粘性末端不是相容的。所述載體和PCR產(chǎn)物的SapI位點(diǎn)被去除，并沒有被整合入最終載體。Sapl添加至連接反應(yīng)，以清除未切割或單個(gè)切割的親本載體，選^f奪性地富集重組的轉(zhuǎn)化菌落(該策略可僅用于沒有內(nèi)部Sapl位點(diǎn)的插入片段)。靶基因內(nèi)的Sapl位點(diǎn)通常不是有害的，因?yàn)閮?nèi)部Sapl位點(diǎn)與一個(gè)地址標(biāo)記相匹配的機(jī)會(huì)僅有1/16。8-96孔(PCR[96-孔梯度封閉])格式可用于高通量應(yīng)用(PCR、純化、消化、連接至Sapl消化的載體)。該實(shí)施例不是要將克隆限制于Sapl的IIS型克隆。還可以使用替代的IIS型酶，例如AarI,其為克隆產(chǎn)生4bp的粘性末端。替代的克隆策略可用以克隆進(jìn)入系列載體。例如，PCR引物可以加入修飾的堿基，其實(shí)現(xiàn)了所述引物末端堿基的缺失，以產(chǎn)生克隆需要的粘性末端。通過尿嘧啶N轉(zhuǎn)葡萄糖基酶的dU切除(SmithC，DayPJ,WalkerMR.1993戶C7M"/2oA2:328-32)、通過稀土金屬離子的核苷酸切除(ChenGJ,QiuN，PageMR2002說otec/zm々/^.32:516,518-20)已經(jīng)用以生成粘性末端?；蛘撸褂镁哂蠷NA序列(不能由某一熱穩(wěn)定DNA聚合酶拷貝)的嵌合PCR引物的RNA粘性末端克隆方法，以生成與所述引物的RNA組分序列相同的5'粘性末端(ColjeeVW,MurrayHL，DonahueWF,JarrellKA.20007Vaf傷otec/wo/.18:789-91)。這不是要成為完全的名單。生成粘性末端短區(qū)的各種策略對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。還可以構(gòu)建并使用具有傳統(tǒng)限制酶位點(diǎn)的載體。然而，這樣的栽體將含有限定所述限制位點(diǎn)的其他序列，并因?yàn)槠湓黾恿斯羌荛g的可變性而因此是次優(yōu)選的。對(duì)于該類應(yīng)用，iis型克隆比不需要連接的克隆(Lic)更簡(jiǎn)單。使用ns類克隆，單個(gè)引物對(duì)促進(jìn)了克隆入三個(gè)載體，并且兩個(gè)PCR產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)了克隆入整個(gè)家族。這是因?yàn)閱蝹€(gè)3bp密碼子的重疊區(qū)可以在所述載體家族中無縫復(fù)制。不需要連接的克隆需要載體和插入片段之間更長(zhǎng)的互補(bǔ)區(qū)(最小10bp;AslanidisC,deJongPJ,SchmitzG.1994TkfeAoAjpp/.4:172-177);因此，無縫克隆將需要載體特異性引物的獨(dú)特組合，以將基因克隆入各運(yùn)輸載體。然而，我預(yù)期LIC可用以實(shí)施本發(fā)明，因?yàn)長(zhǎng)IC也可以是無縫的。使用這些載體的高通量應(yīng)用可以包括基因組的功能性基因組篩選保護(hù)性抗原，通過將cDNA或基因組片段高通量克隆入一個(gè)或多個(gè)載體，以及評(píng)價(jià)所述載體或載體池在體內(nèi)的保護(hù)性免疫或免疫反應(yīng)。實(shí)施例11:使用生成免疫刺激RNA的DNA疫苗誘導(dǎo)先天免疫免疫刺激RNA是本領(lǐng)域公知的。雖然免疫刺激反應(yīng)可能是物種和細(xì)胞類型特異性的，但來自靶組織的原代細(xì)胞系的基質(zhì)轉(zhuǎn)染可用以為每個(gè)疫苗/遞送組合選擇最佳的RNA元件組合。用于免疫刺激RNA元件的潛在靶是本領(lǐng)域已知的。細(xì)胞質(zhì)dsRNA活化PKR和RIG-1和MDA-5，其誘導(dǎo)干擾素生成、抑制蛋白質(zhì)合成，從而減少抗原生成，最終導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡。RIG-1和MDA-5刺激可以通過TNFa和IL12生成來誘導(dǎo)TH1偏移。如下證明了RNA元件提高DNA疫苗免疫刺激活性的用途。通過將pDNAVACCultra5隱EGFP-mU6和pDNAVACCultra5-EGFP-SV40-mU6(圖2)(分別為pDNAVACCultra5-EGFP和pDNAVACCultra5-EGFP-SV40的衍生物)。所得到的構(gòu)建體經(jīng)序列驗(yàn)證。該載體生成了60bpRNA,其包括載體編碼的trpA終止子發(fā)夾結(jié)構(gòu)。線性載體(Nhel/Hpal消化的)經(jīng)純化。退火相容性寡核苦酸之后，在U6啟動(dòng)子控制下克隆了RNA元件。(5'平端-3'Nhel相容)。5'端的第一堿基是噤呤，并且是轉(zhuǎn)錄的RNA的第一堿基。以終止PolIII轉(zhuǎn)錄的一段4-6胸腺嘧咬殘基位于Nhel位點(diǎn)之前。本領(lǐng)域中描述的許多免疫刺激ssRNA、shRNA和dsRNA元件被克隆入所述載體。長(zhǎng)口生產(chǎn)商(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)戶斤述，4吏用lipofectamine2000將濃度為0.4ug質(zhì)粒/mL的質(zhì)粒DNA(單獨(dú)或結(jié)合)轉(zhuǎn)染入小鼠巨噬細(xì)胞系RAW267.4、肌肉細(xì)胞系C2C12和成纖維細(xì)胞系PA317。在培養(yǎng)4小時(shí)后除去轉(zhuǎn)染介質(zhì)，并在24、48和72小時(shí)通過熒光顯微鏡檢查確定EGFP的表達(dá)。通過加入U(xiǎn)6驅(qū)動(dòng)的RNA元件，在所有轉(zhuǎn)染中檢測(cè)到了高水平的EGFP表達(dá)，并且與親本載體相比沒有減少。這說明了單個(gè)DNA疫苗質(zhì)粒中抗原表達(dá)盒與RNA元件的相容性。如生產(chǎn)商(R&DSystems,Minneapolis,MN)所描述的，使用試劑盒在轉(zhuǎn)染后36小時(shí)(表5)測(cè)定了來自RAW267.4轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液中的TNFa(預(yù)示TH1先天免疫誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子)的水平。與親本載體相比，RNA元件的加入顯著增加了TNFa的表達(dá)。如預(yù)測(cè)的，某一免疫刺激RNA元件具有比基礎(chǔ)載體(其轉(zhuǎn)錄載體編碼的trpA終止子)更強(qiáng)的TNFa誘導(dǎo)。在這里使用0.8ug質(zhì)粒/mL的RAW267.4的重復(fù)轉(zhuǎn)染中獲得了類似的結(jié)果，在轉(zhuǎn)染后15小時(shí)的測(cè)定表明了TNFa的顯著誘導(dǎo)(表6)。這說明DNA疫苗載體骨架中免疫刺激RNA元件的加入可以提高載體介導(dǎo)的免疫刺激，且無抗原表達(dá)的損失。表5:RAW264.7細(xì)胞系中免疫刺激RNA元件誘導(dǎo)的TNFa生成(轉(zhuǎn)染后36小時(shí))。__<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>實(shí)施例12:使用生成shRNA的DNA疫苗誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡圖10中顯示了誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的shRNA的潛在靶。Arc和Flip高水平表達(dá)于骨骼肌中，同時(shí)Flip高水平表達(dá)于角質(zhì)化細(xì)胞。通過RNA元件的單一基因或這些基因產(chǎn)物的組合的定向減少可用以使攝取了DNA疫苗質(zhì)粒的細(xì)胞對(duì)細(xì)胞死亡信號(hào)變得敏感，以增加細(xì)胞死亡。雖然這可能是物種和細(xì)胞類型特異性的，但來自靶組織的原代細(xì)胞系的基質(zhì)轉(zhuǎn)染可用以為每個(gè)疫苗/遞送組合選擇最佳的RNA元件組合。實(shí)施例13:使用生成shRNA的DNA疫苗誘導(dǎo)質(zhì)粒表達(dá)普遍存在的NFkB抑制蛋白(a、卩或e亞基)是NFicB核定位的短半衰期抑制劑。針對(duì)一個(gè)或多個(gè)這些耙的RNA元件生成抑制劑shRNA將導(dǎo)致NFkB活化和核定位，其將同時(shí)提高含有表達(dá)質(zhì)粒(例如含有SV40的pDNAVACCUltra質(zhì)粒)的NFkB位點(diǎn)的核定位和表達(dá)。雖然最佳的耙亞基可能是物種和細(xì)胞類型特異性的，但來自靶組織的原代細(xì)胞系的基質(zhì)轉(zhuǎn)染可用以為每個(gè)疫苗/遞送組合選擇最佳的RNA元件組合。實(shí)施例14:RapidVACC疫苗開發(fā)算法顯示了用于生成和評(píng)價(jià)抗原特異性DNA疫苗的RapidVACC算法概述(圖8)。從靶生物的相關(guān)組織預(yù)篩選原代細(xì)胞可用以篩選和選擇包括在第一輪中的最佳RNA元件。第一輪是評(píng)價(jià)含有質(zhì)粒的RNA元件的程序性細(xì)胞死亡、先天免疫刺激和最終提高的免疫反應(yīng)。盡管這里顯示了一論優(yōu)化，但初期可進(jìn)行兩或多個(gè)循環(huán)以通過結(jié)合來自初期篩選的有希望的元件進(jìn)一步優(yōu)化RNA表達(dá)盒。一旦載體骨架被鎖定(里程碑1),則各附加循環(huán)的動(dòng)物研究?jī)?yōu)化(例如呈遞優(yōu)化、混合呈遞優(yōu)化)可附加地或協(xié)同地提高疫苗性能，并且最終的疫苗性能不僅僅依賴于單一參數(shù)的成功。因?yàn)楣羌芎统蔬f是確定的，其開發(fā)時(shí)間將顯著較短(2-3周來制備和生產(chǎn)疫苗)。一旦開發(fā)了平臺(tái)，則顯示了針對(duì)新抗原的標(biāo)準(zhǔn)開發(fā)時(shí)間線(使用現(xiàn)有的快速動(dòng)物模型)，且沒有加速(圖8)。最佳呈遞預(yù)期是抗原和遞送特異性的。電穿孔靶向肌細(xì)胞，并可能通過交叉呈遞將用于免疫呈遞的抗原遞送至APC。這可能最好需要供體細(xì)胞中分泌的和/或穩(wěn)定的蛋白，以及細(xì)胞死亡，以引起和刺激APC。對(duì)于靶向樹突細(xì)胞的基因槍，直接初次免疫可能是主要的抗原呈遞模式，并且蛋白體和/或內(nèi)體定向抗原(分別對(duì)提高的MHCI或MHCII呈遞)可能是最佳的。針對(duì)各模式而優(yōu)化的質(zhì)粒組合可以最終提供更好的保護(hù)。例如，表達(dá)天然、樹突和蛋白體耙向的SIV抗原的載體的組合在獼猴中提供了更好的保護(hù)(Rosati等，同前，2005);使用編碼細(xì)胞質(zhì)和泛素結(jié)合的乳頭瘤病毒衣殼基因的混合質(zhì)粒觀察到了類似的提高(Liu等.同前，2001)。歸根結(jié)底，dsRNA、ssRNA和/或誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的shRNA的組合可以提供比這里評(píng)價(jià)的初始單一組分載體更好的先天免疫反應(yīng)。由于poim轉(zhuǎn)錄單元的小尺寸，多種組分可最終被整合入最終的疫苗。而且，由于考慮了超過一種質(zhì)粒的組合疫苗(與流感一樣，其中可以結(jié)合超過一種的抗原表達(dá)質(zhì)粒)，各質(zhì)粒上可以存在不同的組分。本發(fā)明的結(jié)論、分支和范圍因此，讀者將理解，本發(fā)明的遺傳疫苗通過使用載體編碼的靶向分子提供了合理的遺傳免疫優(yōu)化方法。雖然以上描述含有許多特定性，但這些不應(yīng)該解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制，而應(yīng)解釋為其一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的舉例說明。許多其他變化是可負(fù)巨。例如，MDA5、RIG-1和PKR激活免疫刺激RNA元件可以與編碼shRNA以抑制LGP2(RIG-1和MDA5的sdRNA免疫刺激的抑制劑)的抑制RNA元件和/或PKR抑制劑相結(jié)合。這將最大化免疫刺激，同時(shí)預(yù)防PKR介導(dǎo)的抗原表達(dá)的抑制。其他抑制RNA元件可以被加入以在非免疫細(xì)胞中選擇性誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡，以提高抗原交叉呈遞或影響TH1與TH2偏移。因此，本發(fā)明的范圍不應(yīng)該由所述實(shí)施方案來確定，而是由所附權(quán)利要求及其法律等同替代所確定。權(quán)利要求1.一種用于調(diào)節(jié)個(gè)體對(duì)表達(dá)載體的反應(yīng)的方法，該方法包括以下步驟a.將一個(gè)或多個(gè)編碼蛋白質(zhì)或肽的基因克隆入含有一個(gè)或多個(gè)RNA元件的表達(dá)載體，和b.遞送所述表達(dá)載體至真核細(xì)胞，和c.評(píng)價(jià)載體遞送后的基因表達(dá)或免疫反應(yīng)或保護(hù)，從而所述RNA元件的使用實(shí)現(xiàn)了提高的基因表達(dá)和/或提高的免疫反應(yīng)。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述載體是病毒載體。3.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述載體是非病毒載體。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述載體是質(zhì)粒。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述載體是pDNAVACCUltra質(zhì)粒。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述RNA元件選自免疫刺激RNA、促進(jìn)程序性細(xì)胞死亡的RNA、抑制程序性細(xì)胞死亡的RNA、促進(jìn)壞死細(xì)胞死亡的RNA、促進(jìn)質(zhì)粒核定位的RNA、促進(jìn)啟動(dòng)子表達(dá)的RNA、結(jié)合配體的RNA、鈍化基因的短發(fā)夾RNA、促進(jìn)抗原交叉呈遞的RNA、改變細(xì)胞表達(dá)以定制和增強(qiáng)蛋白質(zhì)表達(dá)或免疫反應(yīng)的其他RNA或其組合。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述RNA元件用以避免生成至少一種獲得性免疫反應(yīng)。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述RNA元件用以促進(jìn)一種或多種先天免疫反應(yīng)。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述RNA元件用以預(yù)防插入誘變和/或避免惡性轉(zhuǎn)化。10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述RNA元件與一種或多種轉(zhuǎn)錄物結(jié)合以改變超過一種細(xì)胞功能或途徑。11.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述RNA元件選自生成下述物質(zhì)的那些RNA元件單鏈RNA、雙鏈RNA、發(fā)夾RNA、微RNA、RNA適體或核酶或其組合。12.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述個(gè)體是哺乳動(dòng)物、鳥或魚。13.—種用于確定引發(fā)免疫反應(yīng)的靶抗原組合物的方法，該方法包括以下步驟a.將靶抗原克隆入含有兩種或多種表達(dá)載體的載體家族，所述表達(dá)載體各自為所述抗原指定了不同的細(xì)胞內(nèi)靶向，和b.使用1種或多種載體的混合物初次免疫，且c.使用1種或多種載體的混合物加強(qiáng)免疫，其中各組在所述初次免疫中接受第一載體，并在所述加強(qiáng)免疫中接受相同或不同的載體，和d.評(píng)價(jià)免疫后的免疫反應(yīng)或保護(hù)，從而所述載體家族的使用實(shí)現(xiàn)了引發(fā)免疫反應(yīng)的抗原組合物的快速確定。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中在初次免疫或加強(qiáng)免疫中使用了兩種或多種載體的混合物。15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述載體是病毒載體。16.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述載體是非病毒載體。17.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述載體是質(zhì)粒。18.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述載體家族靶向抗原至i)分泌的，ii)分泌-膜錨定的，iii)細(xì)胞內(nèi)，iv)內(nèi)體，v)增強(qiáng)的蛋白體加工或vi)交叉呈遞的目的地。19.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述分泌通過所述抗原的天然分泌信號(hào)、TPA或其他分泌信號(hào)所指定。20.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述初次免疫和加強(qiáng)免疫使用不同的遞送方法。21.如權(quán)利要求13所述的方法，其中進(jìn)行多次加強(qiáng)免疫。22.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述個(gè)體是哺乳動(dòng)物、鳥或魚。23.—種關(guān)于DNA疫苗質(zhì)粒的組合物，該組合物包括a.pMBl或Co正l衍生的可操作連接至卡那霉素抗性基因的復(fù)制起始其中各單元的轉(zhuǎn)錄是分支的，從而與其他方向相比，提高了細(xì)菌培養(yǎng)物中的質(zhì)粒產(chǎn)率。24.—種關(guān)于DNA疫苗質(zhì)粒的組合物，該組合物包括真核啟動(dòng)子-卡那霉素抗性基因方向，其中各單元的轉(zhuǎn)錄是分支的，從而與其他方向相比，增強(qiáng)了真核細(xì)胞中的靶基因表達(dá)。25.如權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述真核啟動(dòng)子選自NVL3和CMV。26.—種關(guān)于DNA疫苗質(zhì)粒的組合物，該組合物包括a.pMBl或CoIEl衍生的可才喿作連接至卡那霉素抗性基因的復(fù)制起始點(diǎn)，b.真4亥啟動(dòng)子，c.位于所述真核啟動(dòng)子上游的SV40增強(qiáng)子，其中所述真核啟動(dòng)子-SV40增強(qiáng)子-卡那霉素抗性基因的方向是以便所述真核啟動(dòng)子和所述卡那霉素抗性基因的轉(zhuǎn)錄是分支的，從而與其他方向相比，提高了從真核啟動(dòng)子的表達(dá)、甘油保存的存活力和/或復(fù)制中間體的生成。27.如權(quán)利要求26所述的DNA疫苗質(zhì)粒組合物，其中所述真核啟動(dòng)子選自CMV和NVL3。28.如權(quán)利要求26所述的組合物，其中其用以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。29.如權(quán)利要求26所述的組合物，其中其被調(diào)節(jié)以允許抗原細(xì)胞內(nèi)靶向。30.如權(quán)利要求26所述的組合物，其中其被調(diào)節(jié)以允許篩選或選擇特定類型的抗原表達(dá)或呈遞，包括下述組的任一個(gè)或全部分泌、膜錨定的、內(nèi)體的、蛋白體的、分泌的、細(xì)胞質(zhì)的或交叉呈遞的目的地、或上述的組合。31.如權(quán)利要求26所述的組合物，其中其被調(diào)節(jié)以包括RNA元件。32.—種減少不期望的質(zhì)?；蚣?xì)胞系性質(zhì)的方法，該方法包括改變1種或多種質(zhì)粒元件的方向或組成，及比較不同方向或組成的效果。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述不期望的質(zhì)粒或細(xì)胞系性質(zhì)選自低百分比的超螺旋、高百分比的二聚體形成、高復(fù)制中間體生成或低溫保藏過程中的低存活。34.—種將基因克隆入超過一種的真核表達(dá)載體的方法，各載體為抗原指定了不同的細(xì)胞內(nèi)靶目的地，其通過a.使用與超過一種的載體相容的引物PCR擴(kuò)增所述基因，和b.將所述PCR產(chǎn)物克隆入超過一種的載體。35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中通過IIS型限制酶消化所述PCR產(chǎn)物和所述靶向載體來完成所述PCR產(chǎn)物克隆。36.如權(quán)利要求34所述的方法，其中通過傳統(tǒng)的II型限制酶消化所述PCR產(chǎn)物和所述靶向載體來完成所述PCR產(chǎn)物克隆。37.如權(quán)利要求34所述的方法，其中通過不依賴連接的克隆來完成所述PCR產(chǎn)物克隆。38.—種包含DNA復(fù)制起始點(diǎn)的物質(zhì)的組合物，該組合物包括a.pMB1的復(fù)制起始點(diǎn)；含有b.pUC突變；和c.pMMl突變，其中所述pUC和pMMl突變的組合用以誘導(dǎo)搖瓶培養(yǎng)物穩(wěn)定期中較高拷貝數(shù)和較高生產(chǎn)率。全文摘要公開了改良的DNA疫苗質(zhì)粒。所述改良的質(zhì)粒清除了所有的外源序列，并具有優(yōu)良的真核表達(dá)、細(xì)菌生產(chǎn)過程中提高的產(chǎn)率和穩(wěn)定性，促進(jìn)抗原靈活靶向各個(gè)細(xì)胞內(nèi)目的地，和新的基于RNA的功能性。這些載體被用于新的免疫方法，其中使抗原靶向各個(gè)細(xì)胞內(nèi)目的地的免疫刺激DNA疫苗質(zhì)粒的組合用以引發(fā)提高的免疫反應(yīng)。文檔編號(hào)A61K49/00GK101437547SQ200680008503公開日2009年5月20日申請(qǐng)日期2006年1月20日優(yōu)先權(quán)日2005年1月20日發(fā)明者詹姆士·A·威廉姆斯申請(qǐng)人:自然科技公司