專利名稱：藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微粒和藥物組合物，所述微粒和藥物組合物含有穩(wěn)定的、具有免疫原性的、微膠囊化的單鏈核糖核酸(RNA)，所述單鏈核糖核酸刺 激在哺乳動物細(xì)胞中的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還描述并要求保護(hù)所述藥物組 合物的制備方法及其在免疫療法中的應(yīng)用。技術(shù)背景哺乳動物免疫系統(tǒng)具有檢測器組形式的特化"早期預(yù)警系統(tǒng)"，以快 速感知微生物侵入體的出現(xiàn)并觸發(fā)對該侵入體出現(xiàn)的應(yīng)答。各種"Toll 樣受體"(toll-like receptor, TLR)識別在病原體中保守但未出現(xiàn)在多細(xì)胞 生物體中的不同結(jié)構(gòu)體和化學(xué)物質(zhì)。TLR受其適當(dāng)?shù)募觿┑拇碳r(shí)會 導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化，從而引起特異性促炎和/或抗病毒細(xì)胞因子的 生成。目前人們對使用某種TLR激動劑，如CpG寡脫氧核苷酸作為免疫 療法和疫苗佐劑抱有相當(dāng)大的興趣(參見例如Nature Reviews Immunology 2004,第4巻，第248-257頁和第512-520頁)。在感染誘導(dǎo)的細(xì)胞因子中，I型干擾素(INF-a和INF-(3)因其在抗病毒 應(yīng)答中的重要性而聞名。I型干擾素很早就開始介入先天性免疫應(yīng)答，并 且對感染后抗病毒狀態(tài)的快速形成而言是非常重要的。I型干擾素還調(diào)節(jié) 任何針對病毒繼發(fā)的適應(yīng)性應(yīng)答；刺激樹突細(xì)胞交叉激活并誘導(dǎo)具有細(xì) 胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞能生成極高水平的I型干擾素(高達(dá)普通細(xì)胞的 1000倍)。據(jù)認(rèn)為，漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞負(fù)責(zé)對許多病毒感染作出系統(tǒng)性干 擾素應(yīng)答。漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞受某些CpG寡聚核苷酸的刺激時(shí)，會導(dǎo)致 高水平的干擾素-(x的生成。據(jù)認(rèn)為，CpGDNA與TLR9在內(nèi)體區(qū)室中相 互作用。最近已證明，鼠漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞在受到富含鳥嘌呤(guanidine) 和尿嘧啶的單鏈(ss)RNA序列的刺激后，能生成高水平的IFN-a(Diebold 等，Science 2004, 303， 1529)。有很好的證據(jù)表明，該作用受到TLR7(在 小鼠中)的介導(dǎo)。據(jù)認(rèn)為，TLR7類似于TLR9，其在內(nèi)體區(qū)室中以病原相 關(guān)分子模式相互作用。TLR7的細(xì)胞定位(即在內(nèi)體區(qū)室中)可防止其被細(xì) 胞溶質(zhì)中的自身ssRNA所活化。然而，普遍接受的是，僅有ssRNA并不 能有效地刺激槳細(xì)胞樣樹突細(xì)胞生成IFN-ou這是因?yàn)閟sRNA非常容易 受到核酸酶攻擊，并且還因?yàn)閟s-RNA極少有跨質(zhì)膜攝取。發(fā)明內(nèi)容因此，需要提供一種使所述ss-RNA分子穩(wěn)定的方法，以使它們適合 用在免疫療法中。這樣的使ss-RNA穩(wěn)定的方法應(yīng)當(dāng)使RNA免受核酸酶 攻擊，同時(shí)維持其免疫刺激性能。此外，所述使ss-RNA穩(wěn)定的方法應(yīng)當(dāng) 與已有的用于輸送免疫原性化合物的方法互補(bǔ)，由此使得由ss-RNA引起 的普通免疫應(yīng)答不會影響所實(shí)施或共實(shí)施的特效療法，這樣的形式是理 想的。本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些含有ss-RNA的制劑能夠成功地穩(wěn)定和 保護(hù)ss-RNA，并且與其他普通治療試劑相比還能刺激更強(qiáng)的細(xì)胞因子應(yīng) 答，其中所述ss-RNA在穩(wěn)定劑存在下進(jìn)行微膠囊化。具體而言，本發(fā)明 的組合物刺激IFN-(x和IL-12的水平，該水平即使不優(yōu)于也至少相當(dāng)于與 常用體外轉(zhuǎn)染試劑(例如聚乙烯亞胺，下文中稱為"PEI")縮合(condense) 的ss-RNA所刺激的水平。該類型的組合物對體內(nèi)施用而言具有特別的優(yōu) 點(diǎn)因?yàn)楹邢鄬^低水平的穩(wěn)定劑，所以往往具有比上述傳統(tǒng)的穩(wěn)定 化ssRNA更小的毒性。同時(shí)，可根據(jù)施用途徑對所述微粒制劑的粒度進(jìn) 行優(yōu)化。例如，可將本發(fā)明的微粒形成為能提供對輸送至下呼吸道而言 可以感覺到處于優(yōu)化范圍的平均粒度，即lpm 10^im。本發(fā)明的微粒和藥物組合物刺激細(xì)胞因子在宿主細(xì)胞中生成，由此 可用作適用于寬范圍的疾病和感染的普通免疫療法。這在未知或不能提 供特效療法時(shí)是非常有利的。本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，所述組合物可 選地含有特效治療試劑，使得在施用了所述組合物的受累個(gè)體中引發(fā)普
通免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答。本發(fā)明的微粒組合物的還有的其他優(yōu)點(diǎn) 是，它能以干粉形式長期保存(至少數(shù)月)而不喪失其生物效力。在保存后， 所述組合物可以直接作為干粉形式施用(例如通過吸入)，或者在本領(lǐng)域中 已知的藥用溶劑或緩沖劑中再次水化，并根據(jù)需要而通過腸胃外施用。本發(fā)明的組合物也可用于引發(fā)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答，這對于清除胞內(nèi)病原體和癌細(xì)胞是非常重要的。所述組合物的這一特征突出了本發(fā)明的特別的優(yōu)點(diǎn)，其原因在于，根據(jù)IFN-a在誘導(dǎo)CTL應(yīng)答中的 重要性，該特征可以提供一種能誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的疫苗輸送系統(tǒng)。這樣的 疫苗輸送系統(tǒng)特別適用于腫瘤免疫療法。本發(fā)明提供了一種微粒組合物，該微粒組合物包含生物降解性聚合 物、免疫原性單鏈核糖核酸(下文中稱為"ss-RNA")物質(zhì)、生物活性大 分子和穩(wěn)定劑，其中，所述生物活性大分子、單鏈核糖核酸(ss-RNA)和 穩(wěn)定劑被膠囊化在所述生物降解性聚合物的內(nèi)側(cè)和/或內(nèi)部，以使所述微 粒具有"空閑(free)"的外表面。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，盡管所 述微粒的外表面上基本不存在被包封的組分，但是不可避免的是，小部 分的所述ss-RNA、生物活性大分子和穩(wěn)定劑各自仍可能存在于所述微粒 的表面上。然而，如此處所述，所述微粒的外表面基本不存在被包封的 組分。因此，本文所使用的"空閑的外表面"是指在形成后不直接包含 被吸附的組分的所述微粒的外表面。然而，具有這樣的空閑外表面的微 ?？赡軙?jīng)過處理，導(dǎo)致其他材料，例如藥物化合物、大分子和核酸被 吸附在其上。此處使用的"被吸附的組分"是指，作為微粒形成過程的 結(jié)果而部分存在于所述微粒表面上的被包封組分，并且"被吸附的組分" 涉及在微粒形成后被吸附于微粒外表面上的物質(zhì)。此處所使用的術(shù)語"微粒"是指直徑為約10nm 約100 pm的顆粒， 優(yōu)選直徑為200 nm 30 pm的顆粒，更優(yōu)選為500 nm 10 pm的顆粒。 通過本領(lǐng)域內(nèi)公知的技術(shù)(例如激光衍射或掃描電子顯微鏡)可以容易地 確定微粒尺寸，并且所述微粒尺寸通常以平均直徑表示。術(shù)語顆粒、粒 子、微粒、微小顆粒和微球體可相互交換使用，并且全部落在上述微粒 的定義范圍之內(nèi)。
可使用任何生物相容的生物降解性聚合物來形成本發(fā)明的微粒，但 優(yōu)選使用已知能在哺乳動物組織內(nèi)降解并適用于藥物施用的聚合物。這樣的生物降解性聚合物的例子包括但不局限于脂肪族聚酯、衍生自聚(a-羥基酸)的聚合物，如聚(丙交酯)("PLA")，或者D，L-丙交酯和乙交酯或 乙醇酸的共聚物，如聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)("PLG"或者"PLGA")，或者聚乙交酯、聚己內(nèi)酯及其共聚物。優(yōu)選所述生物降解性聚合物是聚(丙 交酯)。膠囊化在所述微粒內(nèi)部的所述ss-RNA物質(zhì)可以是任何這樣的單鏈 RNA序列，所述單鏈RNA序列能刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答，尤其是通過刺 激促炎細(xì)胞因子(如腫瘤壞死因子(TNF-a))和/或抗病毒細(xì)胞因子(如 IFN-a、 IFN-P或IL-12)的生成來刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。優(yōu)選ss-RNA能夠 刺激INF-a的生成和分泌。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，IFN-a可通過 許多機(jī)制生成，但優(yōu)選選擇所述ss-RNA，使之能通過與哺乳動物宿主內(nèi) 的樹突細(xì)胞的Toll樣受體(TLR)相互作用并對其進(jìn)行刺激，從而刺激細(xì)胞 因子的生成。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)理解的是，不同的TLR可促進(jìn)IFN-a 的分泌，但優(yōu)選所述ss-腦A刺激TLR-7禾卩/或TLR-8， 二者很可能參與 細(xì)胞因子在人體內(nèi)的表達(dá)。合適的ss-RNA序列是那些具有較高單一堿基比例的序列，即其中包 含富含A、 U、 C或G中任一種的區(qū)域的序列。優(yōu)選所述ss-RNA含有富 含G或富含U的序列。ss-RNA的優(yōu)選實(shí)例包括聚尿苷酸和聚鳥苷酸。 所述ss-RNA更優(yōu)選為聚尿苷酸。ss-RNA的微膠囊化優(yōu)選在生物活性大分子的存在下進(jìn)行。所述大分 子包括已知可引發(fā)普通免疫應(yīng)答的治療試劑，如寡脫氧核苷酸；CpG寡 核苷酸；多肽和蛋白，還有能提供特療效果的物質(zhì)，如能對已知病原體 引起特異性免疫效果的試劑，如病原體特異性抗原，或者，作為另一種 選擇，能對腫瘤或癌癥細(xì)胞上表達(dá)的抗原引起特異性免疫效果的物質(zhì)。此處所使用的術(shù)語"抗原"是指這樣的分子，其中含有一個(gè)或多個(gè) 在抗原存在時(shí)能刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答或者能引起 體液抗體應(yīng)答的表位。術(shù)語抗原是指亞單元抗原或者已被殺死、減毒或
失活的細(xì)菌、病毒或其他微生物。能模仿抗原或抗原決定簇的抗體以及 抗體片段也包括在抗原的定義中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述微粒組合物含有對細(xì)菌病原體具有特異性的抗原，例如炭疽桿菌(^^7/w ""Arac/"的重組的保護(hù)性抗原(rPA) 或來自于鼠疫桿菌(Jem'm'a/7Mto)的Fl和/或V抗原，但本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)理解的是，任何已知的抗原都可配制到所述微粒組合物中。該實(shí)施方 式對病菌感染，例如炭疽熱、瘟疫、類鼻疽、鼻疽病(glander)和衣原體疾 病等此類疾病的治療特別有用，而且對病毒、真菌和寄生物感染也可以 提供合適的抗原或抗原模擬物。所述微粒制劑的穩(wěn)定劑可以是選自在本技術(shù)領(lǐng)域中己知的大量穩(wěn)定 劑中的任何一種。穩(wěn)定劑包括但不局限于去污劑、表面活性劑、分散劑、 懸浮劑或乳化穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑的優(yōu)選實(shí)例包括脂質(zhì)和表面活性劑。然而， 優(yōu)選所選擇的穩(wěn)定劑是藥用試劑，由此可以避免體內(nèi)施用時(shí)可能有毒性 的穩(wěn)定劑。進(jìn)一步優(yōu)選的是，所述穩(wěn)定劑能與ss-RNA形成復(fù)合物。這樣 的復(fù)合物能通過所述穩(wěn)定劑與ss-RNA之間的直接共價(jià)連接形成，例如作 為縮合反應(yīng)的結(jié)果，或者作為另外一種選擇，所述復(fù)合物可以通過靜電、 離子或疏水相互作用而形成。更為優(yōu)選的是，所述穩(wěn)定劑帶有正電荷， 由此實(shí)現(xiàn)與ss-RNA的靜電相互作用。這樣的穩(wěn)定劑的合適例子是陽離子 聚合物和/或陽離子脂質(zhì)。優(yōu)選的例子是陽離子脂質(zhì)，如鯨蠟基三甲基溴 化銨(下文中稱為"CTAB" )， 二甲基二(十八烷基)溴化銨("DDA")和 N-[l-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N，N-三甲基氯化銨("DOTAP")以及諸如 此類的陽離子脂質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可按常規(guī)確定穩(wěn)定劑的合適用量，但優(yōu)選的是， ss-RNA、生物降解性聚合物和穩(wěn)定劑的質(zhì)量比為約1:8:6至約1:15:12， 更優(yōu)選所述組分的質(zhì)量比為大約2:25:18。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定劑的選擇和用量可影響所述穩(wěn)定劑存在時(shí)形 成的微粒的總電荷，由此使所述藥物組合物可帶有凈負(fù)電荷或正電荷。 優(yōu)選所述組合物帶有如通過合適的電荷測量裝置(例如測量；電勢(zeta potential,跨所有固液界面存在的電勢)的ZetasizerTM)來測量的凈正電荷。
更優(yōu)選的是，由所得組合物測得的；電勢為約0mV 100mV，更優(yōu)選為 20mV 80mV，進(jìn)一步更優(yōu)選為30 mV 60 mV。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，具 有大約50 mV的；電勢的藥物組合物對刺激INF-a的生成特別有效。理想的是，所述微粒組合物包含具有以下尺寸的微粒，所述尺寸使 之能進(jìn)行有效施用并運(yùn)輸至免疫系統(tǒng)，并且特別適用于吸入施用。所述 微粒優(yōu)選具有0.1 pm 5 pm的平均直徑，更優(yōu)選具有0.2 pm 4 pm的平 均直徑。最優(yōu)選所述微粒具有大約1 pm的平均直徑。這樣的微?？珊线m 通過將所述微粒與藥用佐劑和/或賦形劑(如粘合劑、填充劑、稀釋劑、潤 滑劑、顏料、甜味劑和分散劑等類似賦形劑)混合而配制成藥物組合物?？蓪⑺鏊幬锝M合物配制成能夠提供一種共施用所述微粒與其他治 療試劑或佐劑的方法。所述微粒的空閑外表面提供了方便的位置以供吸 附另外的治療試劑(如另外的抗原、免疫原性蛋白和多肽、核酸如CpG寡 核苷酸和DNA載體)之用。這些另外的治療試劑可用于修飾所述微粒的 空閑外表面以提供增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的第二方面提供了制備所述微粒和藥物組合物的方法，所述 方法包括以下步驟(a) 制備生物降解性聚合物的溶液；(b) 將含有免疫原性ss-RNA和生物活性大分子的溶液加入到步驟 (a)的所述溶液中以形成乳液；(c) 將來自步驟(b)的所述乳液加入到含有穩(wěn)定劑的溶液中以形成 雙乳液；(d) 除去溶劑；以及(e) 收集所得的微粒。用在本方法中的ss-RNA選自本文己經(jīng)描述的名單，并可方便地將其溶于水性溶液，例如蒸餾水或水性緩沖液中，而所述生物降解性聚合物 則溶解在與水不混溶的溶劑如有機(jī)溶劑(例如二氯甲垸)中，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，可以使用任何溶劑的組合，只要其能在混合時(shí)形成 乳液即可。生物降解性聚合物可以方便地選自已經(jīng)在本文提供的替代物 名單。同樣應(yīng)當(dāng)理解的是，所述穩(wěn)定劑可以選自已經(jīng)在上文中描述的穩(wěn) 定劑，并且所述穩(wěn)定劑可以溶解在任何溶劑中，使得當(dāng)將穩(wěn)定劑溶液加入到第一乳液(即在步驟(b)中形成的乳液)時(shí)能形成雙乳液。因此，優(yōu)選的是，在步驟(C)中使用水性溶劑或與水混溶性溶劑來溶解所述穩(wěn)定劑。這 樣的組合可以制得水-油-水(w-o-w)雙乳液，但應(yīng)當(dāng)理解的是，油-水-油(O-W-O)雙乳液也同樣合適。在步驟(C)中，將所述第一乳液(即步驟(b)中制 得的乳液)加入到穩(wěn)定劑溶液中。雖然優(yōu)選按此順序進(jìn)行添加，但也可以通過將穩(wěn)定劑溶液加入到步驟(b)的乳液中來形成合適的雙乳液(因此而 形成微粒)。優(yōu)選在攪拌的同時(shí)，將步驟(b)的乳液加入到穩(wěn)定劑溶液中，這是因?yàn)楸景l(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，這樣能夠提供更好的所得微粒。更優(yōu)選在劇烈攪拌的同時(shí)，將來自步驟(b)的乳液滴加到穩(wěn)定劑溶液中。可通過任何 常規(guī)范方法來實(shí)施溶劑去除步驟(c)，例如持續(xù)攪拌、真空或加熱蒸發(fā)并 通過例如過濾或離心收集所得微粒。更優(yōu)選通過超速離心收集所述微粒。 然后收集所述微粒并直接使用，或者對其進(jìn)行進(jìn)一步的處理、加工或配 制，例如將其與藥用化合物混合來形成藥物組合物。雖然對于一些應(yīng)用 而言，希望進(jìn)行進(jìn)一步的加工，但在大多數(shù)情況下是沒有必要進(jìn)行進(jìn)一 步的加工的，因?yàn)樗梦⒘＞哂性谑褂脮r(shí)有效的尺寸，而不需要進(jìn)一步 的加工。根據(jù)本發(fā)明方法制備的微粒組合物可進(jìn)一步經(jīng)過凍干步驟，使之能 作為干燥粉末長期保存。本發(fā)明人己發(fā)現(xiàn)，這些經(jīng)過凍干的組合物可以 穩(wěn)定數(shù)月，并且對于通過例如普通吸入器裝置而進(jìn)行的粘膜施用，其具 有可直接作為干燥粉末使用的優(yōu)點(diǎn)。作為另外一種選擇，根據(jù)需要以及 在需要時(shí)，將所述干燥粉末重新水化，這對于制備適用于腸胃外施用的 組合物來說是特別有利的。


下文將通過實(shí)施例的方式，并參考下述附圖來對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述圖1顯示使用激光衍射測量法測得的、裝載有RNA的微粒的粒度分 布圖，所述微粒使用聚乙烯醇^￥八)或>1-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]^凡^ 三甲基氯化銨(DOTAP)作為穩(wěn)定劑進(jìn)行制備。數(shù)據(jù)為三次獨(dú)立試驗(yàn)的結(jié)果。圖2顯示裝載有poly-U的聚丙交酯微粒的掃描電子顯微圖，所述微 粒使用聚乙烯醇(PVA)或N-[l-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N，N-三甲基氯化 銨(DOTAP)作為穩(wěn)定劑進(jìn)行制備。圖3顯示來自于Flt3L擴(kuò)增性骨髓來源樹突細(xì)胞的大批培養(yǎng)物(bulk culture)的上清液的干擾素-a的水平，所述樹突細(xì)胞經(jīng)過在一定濃度范圍 的溶液中的poly-U (游離Poly-U)、膠囊化在聚丙交酯微粒中的poly-U (MS(微粒)中的Poly-U)、聚丙交酯空微粒(空的MS)和與PEI縮合的 poly-U (Poly-U PEI)刺激過夜。聚丙交酯微粒使用N-[l-(2,3-二油酰氧基) 丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)或聚乙烯醇(PVA)作為穩(wěn)定劑來制 備。作為對照用的細(xì)胞也與1 nmol的CpG共培養(yǎng)。數(shù)據(jù)是三份小量培養(yǎng) 物的平均值(士SD)，并代表三次獨(dú)立的試驗(yàn)。圖4顯示來自于Flt3L擴(kuò)增性骨髓來源樹突細(xì)胞的大批培養(yǎng)物的上清 液的TNF-a水平，所述樹突細(xì)胞經(jīng)過在一定濃度范圍的溶液中的poly-U (游離PoIy-U)、膠囊化在聚丙交酯微粒中的poly-U(MS中的Poly-U)、聚 丙交酯空微粒(空的MS)和與PEI縮合的poly-U (Poly-U PEI)剌激過夜。 聚丙交酯微粒使用N-[l-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨 (DOTAP)或聚乙烯醇(PVA)作為穩(wěn)定劑來制備。作為對照用的細(xì)胞也與 1 nmol的CpG共培養(yǎng)。數(shù)據(jù)是三份小量培養(yǎng)物的平均值(士SD)，并代表 三次獨(dú)立的試驗(yàn)。圖5顯示來自于Flt3L擴(kuò)增性骨髓來源樹突細(xì)胞的大批培養(yǎng)物的上清 液的IL-12 p40的水平，所述樹突細(xì)胞經(jīng)過在一定濃度范圍的溶液中的 poly-U (游離Poly-U)、膠囊化在聚丙交酯微粒中的poly-U(MS中的 Poly-U)、聚丙交酯空微粒(空的MS)和與PEI縮合的poly-U (Poly-U PEI) 刺激過夜。聚丙交酯微粒使用N-[l-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基 氯化銨(DOTAP)或聚乙烯醇(PVA)作為穩(wěn)定劑來制備。作為對照用的細(xì)胞 也與1 nmol的CpG共培養(yǎng)。數(shù)據(jù)是三份小量培養(yǎng)物的平均值(士SD)，并 代表三次獨(dú)立的試驗(yàn)。
圖6顯示Flt-3L擴(kuò)增性骨髓來源樹突細(xì)胞(BMDC)在微膠囊化的 OVA、微膠囊化的poly-U、共微膠囊化的OVA和poly-U、表面吸附有 CpG的微膠囊化的OVA、在溶液中的CpG和OVA或者單獨(dú)的培養(yǎng)基進(jìn) 行過夜剌激后的細(xì)胞因子分泌。結(jié)果是三次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值(士SD)。 * 表示與微膠囊化的OVA處理相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P〈0.05)。圖7顯示在使用微膠囊化的OVA、共微膠囊化的OVA和poly-U、 表面吸附有CpG的微膠囊化的OVA、在溶液中的CpG和OVA或者在溶 液中的poly-U和OVA來對BALB/c小鼠進(jìn)行皮下免疫之后的血清抗-OVA IgG的滴度。結(jié)果是每處理組6只小鼠的平均值(士SD)c/表示與幼稚(naive) 對照相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P〈0.05)。圖8顯示在使用微膠囊化的OVA、共微膠囊化的OVA和poly-U、 表面吸附有CpG的微膠囊化的OVA、在溶液中的CpG和OVA或者在溶 液中的poly-U和OVA對BALB/c小鼠進(jìn)行皮下免疫之后的OVA特異性 的IFN-y和IL-4ELISPOTS。結(jié)果是每處理組6只小鼠的平均值(士SD)。 * 表示與幼稚對照相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P0.05)。"表示與所有其 他處理相比較具有顯著差異(P0.05)。圖9顯示取自經(jīng)共微膠囊化的OVA和poly-U免疫的6只小鼠(上圖) 或幼稚小鼠(下圖)的四聚體染色淋巴結(jié)細(xì)胞的FACS分析。如由增強(qiáng)的 FL2信號所證實(shí)，經(jīng)共微膠囊化的OVA和poly-U免疫的小鼠具有數(shù)量更 多的帶結(jié)合四聚體(boundtetramer)的CD8細(xì)胞。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1Poly-U在聚乙烯醇穩(wěn)定化的聚丙交酯微粒中的膠囊化 將聚尿苷酸(poly-U， Sigma， Dorset UK)膠囊化在聚丙交酯微粒中。 簡言之，將10 mg的poly-U懸浮在0.5 ml的聚乙烯醇(PVA)(13 kDa 23 kDa; 1.5% w/v(重量/體積比)；Sigma, Dorset UK)的水溶液中，并使 用Silverson勻漿器(Silverson， Bucks. UK)激烈攪拌，使之與溶解在9 ml 的二氯甲垸(DCM; Sigma, Dorset UK)中的125 mg聚丙交酯(PLA)混合。
將所得乳液滴加入經(jīng)激烈攪拌的含有3.0% w/v的PVA(13 kDa 23 kDa) 的第二水相(卯ml)中。在溶劑蒸發(fā)后，通過超速離心收獲硬化的聚合微 粒，然后進(jìn)行冷凍干燥(Edwards， Crawley UK)。 實(shí)施例2Poly-U在N-[l-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP) 穩(wěn)定化的聚丙交酯微粒中的膠囊化將10 mg的poly-U溶解在0.5 ml體積的蒸餾水中。使用Silverson 勻漿器(Silverson， Bucks. UK)激烈攪拌，使之與溶解在9 ml的 DCM(Sigma， Dorset UK)中的125 mg PLA混合。將所得乳液滴加入經(jīng)激 烈攪拌的含有0.1c/。w/vDOTAP的第二水相(90ml)中。在溶劑蒸發(fā)后，通 過超速離心收獲硬化的聚合微粒，然后在l%w/v海藻糖(Sigma， Dorset UK)中進(jìn)行凍干(Edwards， Crawley UK)。實(shí)施例3Poly-U和卵清蛋白(OVA)在DOTAP穩(wěn)定化的聚丙交酯微粒中的膠囊化通過共加入在0.5 ml蒸餾水中的5 mg的OVA和10 mg的poly-U， 按照實(shí)施例2所描述的那樣，將卵清蛋白(OVA; Sigma， Dorset, UK)膠 囊化在聚丙交酯微粒中。在上述實(shí)施例中，如通過納米微滴(NanoDrop)技術(shù)所證實(shí)，從PVA-和DOTAP穩(wěn)定化的微粒中成功地提取出RNA(結(jié)果未示出)。實(shí)施例4卵清蛋白(OVA)微粒的制備在沒有poly-U的情況下，按照實(shí)施例3所述制備微膠囊化的OVA。poly-U在N-[l-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨穩(wěn)定化的 聚丙交酯微粒表面上的吸附采用改進(jìn)的單乳液溶劑蒸發(fā)法制備陽離子微粒。使用Silverson勻漿 器(Silverson， Bucks. UK)激烈攪拌，將溶解在9 ml的DCM(Sigma， Dorset UK)中的125 mg PLA與90 ml體積的0.1% w/v DOTAP混合。在溶劑蒸
發(fā)后，通過超速離心收獲硬化的聚合微粒，然后進(jìn)行凍干(Edwards， Crawley UK)。在即將使用前，poly-U隨后以5重量％的裝載量吸附到微 粒上。實(shí)施例6CpG DNA在裝載有OVA的微粒的表面上的吸附通過使CpG吸附到所述微粒的表面上，用CpG (MWG-BIOTECH Ltd, Bucks, UK)"修飾"按照實(shí)施例3所述而制備的裝載有卵清蛋白的 微粒。將裝載有7 mg OVA的微粒懸浮在0.7 ml的CpG DNA (ggTGCATCGATGCAgggggG)溶液中，所述CpG DNA溶液為800嗎/ml 的所述CpGDNA在無菌鹽水中的溶液。在室溫下，將微粒在此溶液中孵 育20分鐘。實(shí)施例7采用激光衍射分析來測定微粒粒度分布使用Mastersizer 2000(Malvern Instruments, Malvern， UK)測定按如 上所述在實(shí)施例1、 2、 3和4中制備的微粒的尺寸。激光衍射測量法揭 示，所述經(jīng)裝載的聚丙交酯微粒具有大約1 jam的粒度分布(如圖1所示)。 PVA穩(wěn)定化的制劑(圖IA)和DOTAP穩(wěn)定化的制劑(圖IB)都有相似的粒 度分布。實(shí)施例8掃描電子顯微鏡使用掃描電子顯微鏡(Hitachi S800)研究微球體的尺寸和形狀。使用 Pro Plus圖像分析軟件來分析圖像。圖2顯示，PVA穩(wěn)定化的制劑(圖2A) 和DOTAP穩(wěn)定的制劑(圖2B)均有相似的粒度分布和形狀。微粒表面電荷的分析使用Zetamaster(Malvem Instruments, Malvem， UK)領(lǐng)!j定根據(jù)實(shí)施例 1、 2、 3和4制備的微粒的；電勢。結(jié)果總結(jié)在以下的表l中，該結(jié)果表 明，與使用PVA作為穩(wěn)定劑制備的微球體(-0.90)相比，用DOTAP穩(wěn)定的 微粒具有明顯要多的正C電勢(+41.81)。
表1使用聚乙烯醇(PVA)或N-[l-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲 基氯化銨(DOTAP)作為穩(wěn)定劑制備的空微?；蜓b載有RNA的微粒的；電 勢的測量結(jié)果(重復(fù)數(shù)=3)_制劑C電勢(平均數(shù)土SE)含有RNA的PVA穩(wěn)定化的微粒-0.90±1.03PVA穩(wěn)定化的空微粒-5.57±1.48含有RNA的DOTAP穩(wěn)定化的微粒+41.81±3.77DOTAP穩(wěn)定化的空微粒+46.54±4,78實(shí)施例10Poly-U與聚乙烯亞胺(PEI)的復(fù)合在即將用以與如上述實(shí)施例1、 2和5制備的微膠囊化的poly-U進(jìn) 行比較研究之前，將20嗎的poly-U與30 (il在150 mM NaCl中的20 mM 聚乙烯亞胺(2 kD PEI; Aldrich)混合。實(shí)施例11Flt3-L擴(kuò)增性骨髓來源樹突細(xì)胞的分離和培養(yǎng)使用由Gillet等改進(jìn)的方法(Journal of Experimental Medicine ， 195， (2002) 953)制備含有骨髓來源漿細(xì)胞樣和骨髓樣樹突細(xì)胞(BMDC)的大批 培養(yǎng)物。簡言之，通過脫頸法(根據(jù)1986年動物科學(xué)程序法案(Animal (Scientific Procedures) Act 1986)殺死6 8周齡的雌性C57/BL6(Charles River， UK)。從后腿中移除脛骨和腓骨，然后放置在無菌培養(yǎng)基 (RPMI-1640)(Sigma， UK)中，所述無菌培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%熱滅活胎牛血 清(FBS) (Sigma, UK)、 1。/。青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺(Sigma， UK)和50 的2-巰基乙醇(2-ME) (Sigma， UK)以送至二級微生物安全柜中。隨后使 用25號針頭通過骨干注射所述補(bǔ)充型培養(yǎng)基而將骨髓排出。清洗細(xì)胞， 然后再懸浮于lmL的培養(yǎng)基中，并測定存活細(xì)胞數(shù)。將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至 2X 1(^個(gè)細(xì)胞/mL，然后往培養(yǎng)基中進(jìn)一步補(bǔ)充100 ng/mL的鼠Fms樣酪 氨酸激酶受體-3配體因子(Flt3L; R&D Systems, Oxford, UK)。將細(xì)胞 鋪在6孔組織培養(yǎng)板(Sterilin， Stone， UK)上，并在存在5%<:02的充分 潮濕環(huán)境中，在37"C孵育。5天之后，移去一半培養(yǎng)基并更換以新鮮Flt3L 補(bǔ)充型培養(yǎng)基。10天之后，清洗細(xì)胞，并以2Xl()S個(gè)細(xì)胞/ml重新接種 在無菌平底96孔組織培養(yǎng)板(Sterilin， Stone， UK)中。實(shí)施例12樹突細(xì)胞激活測試裝載有poly-U的微球體按照實(shí)施例11所述進(jìn)行制備的C57BL/6 Flt3L BMDC的大批培養(yǎng)物 與逐步提高劑量的poly-U在無菌96孔平底板中進(jìn)行共培養(yǎng)。DC也與逐 步提高劑量的如實(shí)施例1和2所述的聚丙交酯微粒膠囊化的ssRNA進(jìn)行 共培養(yǎng)。添加到培養(yǎng)物中的微膠囊化的poly-U的質(zhì)量與使用的游離 ssRNA的劑量相當(dāng)(基于100%的理論裝載效率；即假設(shè)在配制過程中使 用的100n/。的ssRNA均已加入)。也測試了將所述細(xì)胞與逐步增加量的聚 丙交酯空微粒進(jìn)行孵育的效果。DC也與逐步提高劑量的PEI縮合 ssRNA(如實(shí)施例10所述進(jìn)行制備)進(jìn)行共培養(yǎng)。1 nmol的K-型(常規(guī)的) CpG (ODN1668 : tccatgacgttcctgatgct)禾P A/D-型 CpG (D 19 : ggTGCATCGATGCAgggggG)用作陽性對照。將細(xì)胞與各種刺激物共培養(yǎng) 18小時(shí)。通過將細(xì)胞和制劑在10000 rpm下離心10分鐘，得到培養(yǎng)物上 清液。使用商購的ELISA試劑盒(R&D systems, Oxford UK)對使用poly-U 和CpG進(jìn)行刺激的DC培養(yǎng)物進(jìn)行量化。結(jié)果Flt3-L擴(kuò)增性骨髓來源樹突細(xì)胞的大批培養(yǎng)物的細(xì)胞因子分泌量因 刺激物的性質(zhì)和劑量而異。正如所料，CpGDNA刺激IFN-a的高水平生 成(如圖3所示)。最近，Diebold等[Science， 303， (2004), 1529]已證明，PEI 復(fù)合的poly-U能用于有效地刺激漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞分泌I型干擾素。圖 3中所示的結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)，并且還指出，恰當(dāng)配制的含有ssRNA的 聚合(聚丙交酯)微粒能用于刺激從漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞中分泌IFN-cu為此， 使用DOTAP作為穩(wěn)定劑制備的裝載有poly-U的聚丙交酯微粒是IFN-a 生成的有效刺激物。與暴露于未配制(游離)的poly-U的DC相比，由 DOTAP穩(wěn)定化的裝載有poly-U的微粒所刺激的IFN-a的水平明顯 (PO.001)更高，該水平與用PEI縮合的poly-U刺激形成的IFN-a的水平 相當(dāng)。相反，DC與使用PVA作為穩(wěn)定劑制備的裝載有poly-U的聚丙交 酯微粒進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果導(dǎo)致低水平的IFN-a的生成。DC與聚丙交酯"空" 微粒的共培養(yǎng)物未能刺激IFN-a的生成，而不管在制劑中所使用的穩(wěn)定
劑類型如何。此外，在通過DC剌激IFN-a的生成方面，用帶正電荷的表 面裝載有poly-U的聚丙交酯微粒對DC進(jìn)行的剌激是無效的。如圖4所示，游離的poly-U和聚丙交酯微粒膠囊化的poly-U能剌激 Flt3L擴(kuò)增性骨髓來源樹突細(xì)胞的大批培養(yǎng)物的TNF-a生成。通過使用 PVA作為穩(wěn)定劑制備的裝載有poly-U的聚丙交酯微粒的刺激能引發(fā)最高 水平的TNF-a生成。通過對比，使用DOTAP作為穩(wěn)定劑制備的裝載有 poly-U的聚丙交酯微粒是較低效率的TNF-a生成剌激物。用PEI濃縮的 poly-U未能引起顯著水平的TNF-a生成。Flt3-L擴(kuò)增性骨髓來源樹突細(xì)胞的大批培養(yǎng)物的IL-12p40生成在如 圖5所示的寬范圍的刺激后發(fā)生。游離的poly-U在高刺激劑量(l嗎 100嗎)下能有效地引發(fā)適當(dāng)水平的IL-12p40分泌。然而，在低刺激劑量 (1嗎 100 ng)下，微膠囊化在DOTAP穩(wěn)定化的微粒中的poly-U是 IL-12 p40生成的最有效的刺激物(P0.05，與所有其他poly-U處理組相 比)。:突細(xì)胞活性測試裝載有OVA的微粒按照實(shí)施例11所述制備C57BL/6 Flt3L擴(kuò)增性骨髓來源樹突細(xì)胞的 大批培養(yǎng)物，并將其與含有共膠囊化的OVA或者OVA與1嗎的poly-U 的微粒制劑進(jìn)行共培養(yǎng)。還使用裝載有OVA并用CpG修飾的微粒以及 OVA和CpG的溶液對細(xì)胞進(jìn)行刺激。蛋白質(zhì)和核酸裝載值假定為100% 的最大理論值。因此用相當(dāng)于OVA和CpG的最大量的劑量水平對細(xì)胞 進(jìn)行刺激，其中所述OVA和CpG的最大量理論上存在于與具有100%效 率的膠囊化/吸附過程相當(dāng)?shù)奈⒘Ｌ幚斫M中。還測試了所述細(xì)胞與相當(dāng)量 的聚丙交酯空微粒孵育的效果。將細(xì)胞與各種刺激物共培養(yǎng)18小時(shí)。通 過將細(xì)胞和制劑在10000 rpm下離心10分鐘，得到培養(yǎng)物上清液。使用 商購的ELISA試劑盒(R&D systems, Oxford UK)對上清液中的細(xì)胞因子 水平進(jìn)行量化。使用ANOVA(方差分析)和Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)確 定統(tǒng)計(jì)差異。結(jié)果
如使用流式細(xì)胞計(jì)確定的那樣，F(xiàn)lt3L擴(kuò)增性BMDC的大批培養(yǎng)物 同時(shí)含有CDllbHi B220L°W (骨髓樣)和CDllbL°w B220Hi (漿細(xì)胞樣)型DC (未示出)。Flt3-L擴(kuò)增性BMDC的大批培養(yǎng)物的細(xì)胞因子分泌的數(shù)量和 模式因剌激物的性質(zhì)而異。圖6顯示，混合有CpG DNA的OVA刺激干 擾素-a (IFN-a)的高水平生成。然而，當(dāng)使用裝載有OVA并用CpG修飾 的微粒刺激細(xì)胞時(shí)，IFN-cx分泌依然較高(P0.05)。與空微?；蛘邇H裝載 有OVA的微粒相比較，含有poly-U或者poly-U和OVA的微粒剌激更高 水平的IFN-a (P<0.05)。當(dāng)使用裝載有OVA并用CpG修飾的微粒刺激細(xì)胞時(shí)，上清液中的 TNF-a水平最高(P0.05)。相對于其他處理，用可溶性抗原和CpG對細(xì) 胞進(jìn)行刺激也導(dǎo)致顯著的TNF-a生成(P0.05)。當(dāng)用裝載有OVA并用CpG修飾其表面的微?；蛘呷芤褐械腃pG和 OVA對BMDC進(jìn)行剌激時(shí)，在培養(yǎng)物上清液中的IL-12 p40濃度最高。 與用裝載有OVA的微粒刺激的培養(yǎng)物相比，用含有poly-U (還有OVA或 者不再有OVA)的微粒進(jìn)行刺激引起IL-12 p40分泌水平的提高(P0.05)。用在溶液中的"裸露"poly-U刺激Flt3L擴(kuò)增性BMDC的大批培養(yǎng) 物引發(fā)其量可忽略的IFN-a、 TNP-a和IL-12 p40 (結(jié)果未示出)。在所有 測試濃度(10嗎 0.001嗎)下，Poly-U "修飾"的微粒也根本未能刺激 IFN-a或IL-12p40的生成。實(shí)施例14體內(nèi)免疫化研究所有試驗(yàn)均嚴(yán)格遵守1986年科學(xué)程序法案(1986 Scientific Procedures Act)。在試驗(yàn)的第0、 14和28天，通過皮下注射至側(cè)腹部而 對6 8周齡的雌性C57/BL6 (Charles River， UK)小鼠進(jìn)行免疫。微粒裝 載值假設(shè)為最大理論值，即100%。因此，與用微粒材料進(jìn)行免疫的小鼠 相比，用可溶性抗原/TLR激動劑給藥的小鼠接受或者相同或者更高的劑小鼠接受100 pl無菌鹽水的注射液，所述無菌鹽水包含(1) 1 mg 含有40嗎OVA的微粒，(2)1 mg含有40嗎OVA和80嗎poly-U的微粒， (3) 1 mg含有40嗎OVA和80嗎吸附在表面上的CpG的微粒，(4)含有 40 jig OVA和80昭CpG的溶液，或(》含有40 |ug OVA和80嗎poly-U的溶液。第六組作為幼稚對照。 實(shí)施例15血清抗OVA抗體水平的測定對按照實(shí)施例14進(jìn)行免疫的小鼠在第32天采血而得到血清。使用 標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法分析血清的抗OVA抗體。簡言之，將個(gè)體血清樣品均分 至用OVA (在PBS中，5 ng/ml)預(yù)先涂布的微量滴定板上。用抗小鼠IgGl 和IgG2a的過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體(Harlan-SeraLab， Crawley Down, UK)檢測血清抗體的結(jié)合。由于每一個(gè)亞類特異性偶聯(lián)物與其亞類分子的 反應(yīng)性可能不同，為便于將一個(gè)亞類的滴度與另一個(gè)的進(jìn)行比較，因此 分析了濃度為0.2 ng/ml 50.0 ng/ml的每一亞類抗體的標(biāo)準(zhǔn)溶液 (Harlan-SeraLab， Crawley Down, UK)。繪得的標(biāo)準(zhǔn)曲線能測出得自各個(gè) 處理組的血清中的每個(gè)IgG亞類的平均濃度。使用統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)(Dunnett)來 確定，與對照(幼稚)動物相比，任一免疫處理是否刺激了更高水平的特異 性抗體。結(jié)果通過與幼稚小鼠進(jìn)行比較，注射裝載有OVA并用CpG修飾的微粒 的小鼠具有顯著的抗OVA抗體滴度，但注射含有OVA和poly-U的微粒 的小鼠表現(xiàn)出增強(qiáng)的抗體應(yīng)答(如圖7所示)。在血清轉(zhuǎn)化小鼠中，IgGl 是檢測到的主導(dǎo)抗OVA抗體。對小鼠注射裝載有OVA的微?；蛘咦⑸?可溶性O(shè)VA與CpG的混合物，可在一些小鼠中引起特異性血清抗OVA IgGl應(yīng)答，但組內(nèi)變異使得該效果在與幼稚動物比較時(shí)缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)上的 顯著性。注射混合有poly-U的OVA溶液引起可忽略的血清抗OVA IgG 水平?？筄VA IgG2a只是在使用和CpG或poly-U共配制的抗原進(jìn)行免 疫的小鼠中才被檢測到。實(shí)施例16細(xì)胞應(yīng)答的分析ELISPOT分析在第35天，殺死按照實(shí)施例14進(jìn)行免疫的小鼠，并按個(gè)體(而不是
集中)將脾取下。在補(bǔ)充型RPMI-1640中制備單細(xì)胞懸浮液。根據(jù)制造商的指導(dǎo)來使用IFN-y和IL-4 ELISPOT試劑盒(BD Biosciences, Oxford, UK)。簡言之，用100 pl的5 (xg/ml在PBS中的捕 獲抗體涂布具有硝化纖維素底部的96孔板，并在4(TC孵育過夜。用200^1 的補(bǔ)充型RPMI處理2小時(shí)而封閉游離結(jié)合位點(diǎn)。將脾細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為 2.5X10S個(gè)細(xì)胞/ml，并將其加至適當(dāng)?shù)目字?。分析?xì)胞時(shí)，總是按來自 于每個(gè)處理組中的單只小鼠來進(jìn)行?；蛘呤褂? pg/ml在補(bǔ)充型 RPMI-1640中的OVA，或者單獨(dú)使用補(bǔ)充型RPMI-1640作為陰性對照， 或者使用2.5 pg/ml刀豆球蛋白A(Concanavalin A)(Sigma， Dorset, UK) 作為陽性對照來對細(xì)胞進(jìn)行過夜刺激，設(shè)三次重復(fù)。通過先使用dH20然 后使用含有0.05%吐溫-20的PBS清洗而移除細(xì)胞。用生物素標(biāo)記的抗小 鼠細(xì)胞因子抗體和與鏈菌親和素結(jié)合的辣根過氧化物酶來檢測細(xì)胞因子 分泌位點(diǎn)。使用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)底物試劑組(Sigma, Dorset, UK) 對酶反應(yīng)進(jìn)行顯色。使用解剖光顯微鏡(dissecting light microscope; Zeiss Stemi 2000)測定斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)目，并以相對于鋪板的1 x 106個(gè)細(xì)胞 表示。采用ANOVA和Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)來確定統(tǒng)計(jì)差異。 結(jié)果如使用ELISPOT所進(jìn)行的檢測，注射裝載有OVA的微粒會引發(fā)比 IFN-Y分泌細(xì)胞更多的OVA特異性IL-4分泌脾細(xì)胞數(shù)量；指示Th2型應(yīng) 答的曲線如圖8所示。如果用同時(shí)含有OVA和ssRNA的微粒對小鼠進(jìn) 行注射，則該趨勢得到逆轉(zhuǎn)。實(shí)際上，與任何其他處理組相比，注射共 膠囊化的OVA和ssRNA會產(chǎn)生最多數(shù)量的OVA特異性IFN-y分泌細(xì)胞 (P<0.05)。與CpG促進(jìn)Thl應(yīng)答的見解相吻合的是，注射裝載有OVA并 用CpG修飾的微粒或者在含有CpG的溶液中的OVA，會誘發(fā)合適數(shù)量 的OVA特異性IFN-y分泌T細(xì)胞(P0.05)。與用裝載有OVA的微粒或者 裝載有OVA和poly-U的微粒進(jìn)行免疫的小鼠相比，用裝載有OVA并用 CpG修飾的微粒或者在溶液中的OVA與CpG進(jìn)行免疫的小鼠的OVA特 異性IL-4分泌細(xì)胞的數(shù)目明顯偏低(P0.05)。注射混合有poly-U的OVA 溶液，會導(dǎo)致其量可忽略的OVA特異性IL-4和IFN-y分泌脾細(xì)胞。細(xì)胞應(yīng)答的分析淋巴結(jié)細(xì)胞的四聚體染色和FACS分析在第35天，殺死按照實(shí)施例14進(jìn)行免疫的小鼠，取下與注射部位 連通(draining)的腹股溝淋巴結(jié)并收集用于四聚體分析。在補(bǔ)充型 RPMI-1640中制備單細(xì)胞懸浮液。在增濕的5% C02環(huán)境下，在37"C， 用OVA(50 ^ig/ml)刺激淋巴結(jié)細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液72小時(shí)。在刺激后， 從培養(yǎng)板上分離細(xì)胞并使用iTAgTM MHC I類鼠四聚體-SA-PE試劑盒 (Beckman Coulter, Immunomics， France)染色。除四聚體染色以夕卜，還使 用FITC偶聯(lián)CD3(Pharmingen, BD Biosciences, UK)禾卩Cy 5.5偶聯(lián)CD 8 (Pharmingen， BD Biosciences, UK)抗體來染色細(xì)胞。所有染色和固定 過程均按照制造商的說明書進(jìn)行。在固定后，在BD FACScan流式細(xì)胞 計(jì)上對細(xì)胞進(jìn)行分析。使用相應(yīng)的同型對照來確立用于分析的象限和/或 區(qū)域。使用Cell Quest Pro流式細(xì)胞計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。結(jié)果來自于經(jīng)免疫的小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞的四聚體染色揭示，OVA和 poly-U的共微膠囊化可生成抗原特異性CD8+ T細(xì)胞(如圖9所示)。如增 強(qiáng)的FL2信號所證實(shí)，用共微膠囊化的OVA和poly-U(圖9A)進(jìn)行免疫 的小鼠具有更多數(shù)量的帶有結(jié)合四聚體的CD8細(xì)胞。圖9B顯示由幼稚 小鼠得到的曲線。
權(quán)利要求
1.一種微粒組合物，所述微粒組合物含有(a)生物降解性聚合物；(b)免疫原性單鏈核糖核酸；(c)生物活性大分子；和(d)穩(wěn)定劑；其中，所述生物活性大分子、單鏈核糖核酸和穩(wěn)定劑被膠囊化在所述生物降解性聚合物的內(nèi)側(cè)和/或內(nèi)部，以使所述微粒的外表面空閑。
2. 如權(quán)利要求1所述的微粒組合物，其中，所述生物降解性聚合 物具有生物相容性并且在哺乳動物組織中降解。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的微粒組合物，其中，所述生物降解性 聚合物是脂肪族聚酯。
4. 如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的微粒組合物，其中，所述生 物降解性聚合物是聚丙交酯。
5. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的微粒組合物，其中，所述免疫 原性單鏈核糖核酸能夠刺激促炎細(xì)胞因子和/或抗病毒細(xì)胞因子的生成。
6. 如權(quán)利要求5所述的微粒組合物，其中，所述單鏈核糖核酸刺 激抗病毒細(xì)胞因子的生成。
7. 如權(quán)利要求6所述的微粒組合物，其中，所述抗病毒細(xì)胞因子 是INF-a禾口/或INF-p禾口/或IL-12。
8. 如權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的微粒組合物，其中，所述單 鏈核糖核酸能夠剌激宿主細(xì)胞的Toll樣受體。
9. 如權(quán)利要求8所述的微粒組合物，其中，所述單鏈核糖核酸刺 激TLR-7和/或TLR-8。
10. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的微粒組合物，其中，所述單鏈 核糖核酸具有主要富含單一堿基的序列。
11. 如權(quán)利要求10所述的微粒組合物，其中，所述單鏈核糖核酸 序列主要由鳥嘌呤和/或尿嘧啶組成。
12. 如權(quán)利要求10或11所述的微粒組合物，其中，所述單鏈核糖核酸是聚尿苷酸。
13. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的微粒組合物，其中，所述生物 活性大分子是寡脫氧核苷酸或病原體特異性抗原。
14. 如權(quán)利要求13所述的微粒組合物，其中，所述生物活性大分 子是細(xì)菌病原體特異性抗原或病毒病原體特異性抗原。
15. 如權(quán)利要求13或14所述的微粒組合物，其中，所述生物活性 大分子是炭疽桿菌的重組的保護(hù)性抗原。
16. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的微粒組合物，其中，所述生物 活性大分子是在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原。
17. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的微粒組合物，其中，所述穩(wěn)定 劑是能與所述單鏈核糖核酸形成復(fù)合物的藥用化合物。
18. 如權(quán)利要求17所述的微粒組合物，其中，所述穩(wěn)定劑是陽離 子聚合物或陽離子脂質(zhì)。
19. 如權(quán)利要求17或18所述的微粒組合物，其中，所述穩(wěn)定劑是 N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N，N,N-三甲基氯化銨。
20. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的微粒組合物，其中，所述組合 物具有總凈正電荷。
21. 如權(quán)利要求20所述的微粒組合物，其中，所述組合物具有0 mV 100 mV的；電勢，優(yōu)選具有20 mV 80 mV的；電勢，更優(yōu)選具有30 mV 60mV的C電勢。
22. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的微粒組合物，其中，得到的所 述微粒具有0.1 pm 5 pm的平均直徑，更優(yōu)選具有0.2 jmi 4 (im的平均直徑。
23. 如權(quán)利要求22所述的微粒組合物，其中，所述微粒具有約1 的平均直徑。
24. 制備權(quán)利要求1 23所述的微粒組合物的方法，所述方法包括 以下步驟(a)制備生物降解性聚合物的溶液；(b)將含有免疫原性單鏈核糖核酸和生物活性大分子的溶液加入到步驟(a)的所述溶液中以形成乳液； (C)將來自步驟(b)的所述乳液加入到含有穩(wěn)定劑的溶液中以形成雙乳液；(d) 除去溶劑；以及(e) 收集所得的微粒。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述微粒進(jìn)一步經(jīng)過凍干 步驟。
26. —種藥物組合物，該藥物組合物含有權(quán)利要求1 23中任一項(xiàng) 所述的微粒組合物和藥用佐劑和/或賦形劑。
27. 如權(quán)利要求26所述的藥物組合物，該藥物組合物應(yīng)用于醫(yī)學(xué)中。
28. 權(quán)利要求26所述的藥物組合物在制備用于治療病原體感染的 藥物中的應(yīng)用。
29. 權(quán)利要求26所述的藥物組合物在制備用于刺激宿主細(xì)胞的 Toll樣受體的藥物中的應(yīng)用。
30. 權(quán)利要求26所述的藥物組合物在制備用于治療癌癥的藥物中 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藥物組合物和微粒組合物，所述微粒組合物包含生物降解性聚合物、免疫原性單鏈核糖核酸(ss-RNA)物質(zhì)、生物活性大分子和穩(wěn)定劑，其中，所得微粒的外表面沒有被吸附的分子。所述組合物能在樹突細(xì)胞中有效產(chǎn)生免疫應(yīng)答，尤其是通過刺激IFN-α生成的增加來產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本發(fā)明還描述并要求保護(hù)源自所述微粒的藥物組合物的制備方法和在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
文檔編號A61K39/07GK101132773SQ200680006703
公開日2008年2月27日 申請日期2006年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月2日
發(fā)明者加雷思·大衛(wèi)·希利, 安吉拉·韋斯特伍德, 斯蒂芬·J·埃爾文, 詹姆斯·愛德華·埃利斯 申請人:英國國防部