專利名稱：金黃色葡萄球菌腸毒素e及制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程，涉及一種金黃色葡萄球菌腸毒素E(StaphylococcalEnterotoxin E，SEE)的制備以及用于刺激淋巴細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞生長。具體的說，就是利用來源于金黃色葡萄球菌的編碼SEE的基因與一種質(zhì)粒載體重組，并將其轉(zhuǎn)化至合適宿主進(jìn)行表達(dá)，通過親和純化獲得高純度的重組SEE蛋白，并利用其超抗原活性應(yīng)用于淋巴細(xì)胞增殖和腫瘤細(xì)胞抑制，并與作為目前臨床上使用的金葡菌濾液制劑主要有效成分的金黃色葡萄球菌腸毒素C(SEC)進(jìn)行活性比較。
背景技術(shù)：
1989年，超抗原的概念由瑞典科學(xué)家White提出，它是一類由細(xì)菌、病毒、寄生蟲產(chǎn)生的對(duì)淋巴細(xì)胞有強(qiáng)大刺激功能的蛋白質(zhì)，由于其對(duì)T淋巴細(xì)胞的激活能力是普通抗原的2000-50000倍，故稱為超抗原。金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal Enterotoxin，SE)是目前全世界范圍內(nèi)廣泛研究的一種超抗原。其中研究最為深入的主要包括A型金黃色葡萄球菌腸毒素(StaphylococcalEnterotoxin A，SEA)、B型金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal EnterotoxinB，SEB)、C2型金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal Enterotoxin C2，SEC2)等。
與普通抗原不同，腸毒素超抗原首先以完整分子結(jié)合于抗原提呈細(xì)胞(APC)表面的II類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的抗原結(jié)合溝槽外側(cè)，而后與T細(xì)胞表面的抗原受體分子(TCR)的Vβ區(qū)結(jié)合，形成SE-MHC-TCR三分子復(fù)合物后大量激活T細(xì)胞。由此激活的T細(xì)胞可直接殺傷表達(dá)MHC-II類分子的腫瘤細(xì)胞，而對(duì)不表達(dá)MHC-II類分子的腫瘤細(xì)胞也可產(chǎn)生間接的殺傷效應(yīng)。同時(shí)，被SE激活的CD4+T細(xì)胞可分泌大量細(xì)胞因子，如IL-2、IFN-γ、TNF-α等，對(duì)腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈的殺傷作用。IL-2等因子亦可激活NK細(xì)胞，使其發(fā)揮自然殺傷作用，IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的MHC-II類分子的表達(dá)，增強(qiáng)T細(xì)胞的識(shí)別。因此，經(jīng)SE激活的T細(xì)胞能對(duì)腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織產(chǎn)生高效的直接或者間接的殺傷作用。如Perabo等人證實(shí)經(jīng)SEB刺激的外周血單核細(xì)胞(PBMC)能高效誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞株RT112細(xì)胞和RT4細(xì)胞調(diào)亡。Hedlund等人進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，SEA激活T細(xì)胞使之增殖作用在每只小鼠0.1-100μg范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系，注射后1天出現(xiàn)最大效應(yīng)，增殖效應(yīng)維持4天。為提高在腫瘤治療中的靶向性和特異性，人們針對(duì)不同腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原，制備了多種相關(guān)抗原的單抗-超抗原融合蛋白或?qū)慰古c超抗原偶聯(lián)，大大增強(qiáng)了所激活的T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織的靶向性，使其能特異地殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長。此外，人們還利用腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)的受體的配體制備了配體-超抗原融合蛋白，有效地提高了由此激活的T細(xì)胞對(duì)腫瘤組織的靶向性。另外，將超抗原基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，將超抗原修飾的腫瘤細(xì)胞作為瘤苗繼而免疫動(dòng)物，亦獲得了令人滿意的抵抗腫瘤細(xì)胞再次攻擊的效果。
在我國，以金黃色葡萄球菌腸毒素C(SEC)為主要有效成分的金黃色葡萄球菌濾液制劑作為腫瘤防化療治療的輔助藥物應(yīng)用于臨床已有近十個(gè)年頭，大量的臨床數(shù)據(jù)證明使用后腫瘤患者的免疫能力獲得了顯著的提高，患者的食欲、睡眠以及全身狀況均得到了明顯好轉(zhuǎn)。如羅鋒等對(duì)35例淺表轉(zhuǎn)移性腫瘤應(yīng)用金葡菌濾液制劑進(jìn)行局部治療，治療一個(gè)月后總有效率達(dá)82.9％。湯煒等通過對(duì)早期口腔癌采用局部金葡菌濾液制劑治療及對(duì)晚期口腔癌應(yīng)用金葡菌濾液制劑聯(lián)合化療，發(fā)現(xiàn)其可使大量淋巴細(xì)胞及纖維組織聚集在癌巢附近，并能觀察到腫瘤細(xì)胞顯著減少甚至部分病例腫瘤細(xì)胞消失。吳潔等將金葡菌濾液制劑作為化療的輔助藥物應(yīng)用于食管癌治療，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，可明顯升高白細(xì)胞，減輕胃腸道反應(yīng)。
盡管目前以SEC為主要有效成分的金葡菌濾液制劑已取得廣泛的應(yīng)用，但由于制劑中存在著大量的蛋白質(zhì)以及多肽類雜質(zhì)，而主要有效成分腸毒素相對(duì)含量極低，使得一部分腫瘤患者在該制劑臨床使用過程中出現(xiàn)了一定程度的相似副反應(yīng)。如，李洪等報(bào)道了分別有28％和24％的腫瘤患者在使用金葡菌濾液制劑并聯(lián)合卡鉑治療惡性胸腔積液過程中出現(xiàn)了發(fā)熱和局部疼痛等副反應(yīng)。劉秀英等在對(duì)鼻咽癌患者使用金葡菌濾液制劑聯(lián)合放療治療的過程中觀察到的主要副作用為中、低度發(fā)熱，約占治療組患者總數(shù)的5％。黎佳全等也報(bào)導(dǎo)了患者在應(yīng)用金葡菌濾液制劑聯(lián)合順鉑治療惡性胸水過程中出現(xiàn)的主要副作用為發(fā)熱，約占治療組患者總數(shù)的65.5％。雖然這些副反應(yīng)基本是暫時(shí)性的，癥狀可以自行緩解或者通過對(duì)癥治療進(jìn)行消除，但仍然對(duì)腫瘤患者的治療和康復(fù)造成了不良的影響。因此，對(duì)于目前金葡菌濾液制劑在臨床應(yīng)用中遇到的問題，需要制備高純度的腸毒素并建立嚴(yán)格可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)逐步克服解決，以求減少在使用過程中產(chǎn)生的毒副作用并增強(qiáng)其腫瘤抑制療效。目前，已經(jīng)有人利用基因工程手段制備金黃色葡萄球菌腸毒素超抗原，如姜永強(qiáng)等將SEA、SEB、SEC1基因片段克隆至pBV220，在大腸桿菌中經(jīng)熱激誘導(dǎo)獲得表達(dá)，但這些方法中純化步驟均采用了離子交換的方法，存在吸附選擇特異性差等弱點(diǎn)。徐明愷等將SEC2基因克隆至pET-28a中表達(dá)，但表達(dá)的重組產(chǎn)物比天然蛋白增加36個(gè)氨基酸，因此抗原決定簇及產(chǎn)物活性改變的可能性均較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種利用基因工程手段制備獲得的重組金黃色葡萄球菌腸毒素E(Staphylococcal Enterotoxin E，SEE)，該蛋白屬于一種超抗原，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。本發(fā)明利用其超抗原活性應(yīng)用于體外促脾淋巴細(xì)胞增殖和以及體外抑制腫瘤細(xì)胞生長，并與金黃色葡萄球菌腸毒素C(Staphylococcal Enterotoxin C，SEC)進(jìn)行超抗原活性比較。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供重組金黃色葡萄球菌腸毒素E(SEE)的制備方法，本發(fā)明構(gòu)建一種可用于表達(dá)金黃色葡萄球菌腸毒素E的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列經(jīng)過重組構(gòu)建而成，質(zhì)粒見說明書附圖6。
本發(fā)明方法具體通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)首先設(shè)計(jì)一對(duì)帶有BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)的上下游引物SEQ IDNO.35’-atg agg atc cag cga aga aat aaa t-3’(上游引物，劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn))，SEQ ID NO.45’-atc tct cga gtc aag ttg tgt ata aat-3’(下游引物，劃線部分為Xho I酶切位點(diǎn))，以金黃色葡萄球菌(FRI326)基因組為模板，采用PCR擴(kuò)增獲得兩端帶有酶切位點(diǎn)的編碼SEE蛋白的基因片段，利用T-A克隆將其連入至pUCm-T質(zhì)粒載體上的多克隆位點(diǎn)，成功構(gòu)建pUCm-T-SEE重組質(zhì)粒。通過測(cè)序證實(shí)獲得的編碼SEE蛋白的基因片段序列(見SEQ ID NO.2)與GenBank數(shù)據(jù)庫中的編碼相同蛋白質(zhì)的基因序列(M21319)完全一致。將該基因片段用相應(yīng)內(nèi)切酶切割后與用相同內(nèi)切酶處理后的pGEX-4T-1質(zhì)粒相連接，成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEE。
(2)將pGEX-4T-1-SEE表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)帶GST標(biāo)簽的GST-SEE融合蛋白。收獲菌體并破碎后離心并收集上清。將菌體上清液與能特異結(jié)合GST的親和填料充分混合，用洗脫液洗脫GST-SEE融合蛋白并收集，將收集到的融合蛋白與凝血酶在合適條件下充分反應(yīng)，反應(yīng)后的混合物再次與能特異結(jié)合GST的親和填料充分混合，分離并收集經(jīng)過純化的SEE蛋白，取樣電泳檢測(cè)。能特征性地結(jié)合GST的親和填料，優(yōu)選偶聯(lián)有谷胱甘肽的Glutathione Sepharose 4 Fast Flow。經(jīng)檢測(cè)獲得電泳純的純化產(chǎn)物后，將該純化產(chǎn)物經(jīng)過脫鹽、冷凍干燥即得重組SEE凍干粉。
初始獲得的蛋白為帶有GST(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)簽的融合蛋白GST-SEE，先利用親和填料純化該融合蛋白，進(jìn)一步去除該標(biāo)簽后再次利用親和填料純化重組SEE蛋白。
初始獲得的GST-SEE融合蛋白占細(xì)菌總蛋白含量的15-25％。
(3)獲得電泳純的SEE蛋白后，采用MTT法，以有絲分裂原ConA為陽性對(duì)照，建立合適的體外模型以觀察重組SEE蛋白對(duì)ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用以及受SEE刺激增殖的小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。應(yīng)用此模型同時(shí)觀察金黃色葡萄球菌腸毒素C(SEC)的超抗原活性并與重組SEE蛋白的活性進(jìn)行比較，結(jié)果顯示重組SEE蛋白具有典型的超抗原活性，其作用與SEC的作用相當(dāng)。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供重組金黃色葡萄球菌腸毒素E在制備刺激淋巴細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞生長藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明方法的特點(diǎn)是(1)提供了一種高純度的重組SEE蛋白，利用體外小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和腫瘤細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)該重組蛋白具有典型的超抗原活性，其作用與SEC的作用相當(dāng)。該重組蛋白在未被凝血酶切割前帶有GST標(biāo)簽，適合親和純化，經(jīng)凝血酶處理后的該蛋白質(zhì)氨基酸序列及相應(yīng)的核苷酸序列見SEQ ID NO.1，與相應(yīng)的天然蛋白相比，該重組蛋白在N端增加了2個(gè)氨基酸殘基；(2)提供了一種含有SEE基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEE，該質(zhì)粒由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2所示核苷酸融合構(gòu)建而成，可轉(zhuǎn)化入合適的表達(dá)宿主，它含有強(qiáng)啟動(dòng)子，在誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下可高效表達(dá)帶有GST標(biāo)簽的GST-SEE融合蛋白；(3)使用含有由pGEX-4T-1和SEQ IDNO.2的核苷酸構(gòu)建而成的表達(dá)質(zhì)粒的工程菌，表達(dá)產(chǎn)物帶有GST標(biāo)簽，并使用含有能特異結(jié)合GST的親和填料來純化該產(chǎn)物；(4)提供了一種工程菌，該菌株含有表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEE，在合適的誘導(dǎo)劑作用下可高效表達(dá)帶有GST標(biāo)簽的GST-SEE融合蛋白。(5)適用于高效制備具有超抗原活性的高純度腸毒素以及超抗原制劑的開發(fā)。
本發(fā)明方法對(duì)重組SEE進(jìn)行了高效表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度占全菌蛋白的15-25％左右，且為可溶性表達(dá)，便于后續(xù)分離純化。融合蛋白經(jīng)凝血酶高效切割后，所得到的重組蛋白與相應(yīng)的天然蛋白相比，只在N端多出2個(gè)氨基酸。本發(fā)明方法采用親和層析對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，具有步驟簡單，純化速度快的特點(diǎn)，相比從金葡菌培養(yǎng)濾液中分離提取以及利用離子交換層析或分子篩層析等方法能獲得高純度的重組SEE蛋白。體外應(yīng)用該蛋白刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和抑制腫瘤細(xì)胞生長，結(jié)果證明該目的蛋白具有典型的超抗原活性。鑒于在臨床獲得應(yīng)用的金葡菌濾液制劑的主要有效成分為SEC，本發(fā)明通過比較證實(shí)重組SEE蛋白的超抗原活性與SEC相當(dāng)，因此該重組SEE蛋白有望開發(fā)成為一種新的超抗原制劑用于腫瘤患者的臨床康復(fù)和治療。
在本說明書上下文中，除非特別指明，否則所引用的任何技術(shù)術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在本領(lǐng)域中通常理解的含義，而未注明的實(shí)驗(yàn)方法是按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行或按照供應(yīng)商所建議的操作說明進(jìn)行。


圖1為PCR擴(kuò)增所得編碼SEE基因瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1核酸Marker；泳道2編碼SEE蛋白基因PCR產(chǎn)物。
圖2為PCR擴(kuò)增后所測(cè)編碼SEE基因序列測(cè)序結(jié)果圖。
圖3為重組pUCm-T-SEE質(zhì)粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1核酸Marker；泳道2重組pUCm-T-SEE質(zhì)粒；泳道三重組pUCm-T-SEE質(zhì)粒BamH I和Xho I雙酶切產(chǎn)物。
圖4為測(cè)序正確的pUCm-T-SEE質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切后回收的含酶切位點(diǎn)的編碼SEE蛋白成熟肽基因瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1核酸Marker；泳道2含酶切位點(diǎn)的編碼SEE蛋白成熟肽基因的酶切產(chǎn)物。
圖5為重組pGEX-4T-1-SEE質(zhì)粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1核酸Marker；泳道2重組pGEX-4T-1-SEE質(zhì)粒；泳道三重組pGEX-4T-1-SEE質(zhì)粒BamH I與Xho I雙酶切產(chǎn)物。
圖6為重組SEE表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEE示意圖，標(biāo)示的“see”即為編碼SEE蛋白基因序列插入位置。
圖7為重組SEE在BL21(DE3)大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)電泳圖，其中泳道1蛋白質(zhì)Marker；泳道2未經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白；泳道3經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)的菌體破菌后的上清總蛋白。
圖8為重組SEE純化電泳圖，其中泳道1蛋白質(zhì)Marker；泳道2純化后的重組GST-SEE蛋白；泳道3Thrombin切割后的GST、SEE混合溶液；泳道4純化后的SEE蛋白。
圖9為重組SEE對(duì)ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用(48h)，與空白對(duì)照組相比。
圖10為重組SEE與SEC對(duì)耐阿霉素慢性髓原性白血病細(xì)胞(K562-AD)的抑制作用(48h)，與空白對(duì)照組相比。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例提供了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下面的實(shí)施例中所公開的技術(shù)表示能有效實(shí)施本發(fā)明，不過，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在不超出本發(fā)明的構(gòu)思的前提下，可以對(duì)這些具體實(shí)施方案進(jìn)行多種改變，仍然能獲得相似的結(jié)果。
實(shí)施例1SEE的基因克隆和pUCm-T-SEE重組質(zhì)粒的構(gòu)建含內(nèi)切酶位點(diǎn)的編碼SEE成熟肽基因序列的PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)如下一對(duì)引物序列SEQ ID NO.3(上游引物，劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn))5’-atg agg atccag cgaaga aat aaa t-3’，SEQ ID NO.4(下游引物，劃線部分為Xho I酶切位點(diǎn))5’-atc tct cga gtc aag ttgtgt ata aat-3’，以金黃色葡萄球菌(FRI326)基因組模板，按照以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增獲得710bp的DNA片段，PCR結(jié)果凝膠電泳圖參見圖1。
PCR體系H2O60μLBuffer(10×) 10μLMg2+(25mmol/L) 8μLBSA(5mg/mL)10μLPrimer-up(25μmol/L) 4μLPrimer-down(25μmol/L) 4μLdNTP(20mmol/L) 2μLTemplate(Genome ofFRI326，10ng/μL)1μLTaq Polymerase(5U/μL) 1μLPCR程序
1、95℃預(yù)變性3min2、95℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸1min3、依步驟2循環(huán)34次4、72℃延伸10min含編碼SEE蛋白成熟肽基因序列的pUCm-T-SEE重組質(zhì)粒的構(gòu)建將PCR擴(kuò)增所得的SEE成熟肽基因克隆入pUCm-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中擴(kuò)增。提取該重組質(zhì)粒，經(jīng)BamH I與Xho I酶切鑒定后送樣測(cè)序，結(jié)果顯示獲得的編碼SEE蛋白的基因全長序列與GenBank數(shù)據(jù)庫的編碼相同蛋白質(zhì)的序列(M21319)完全一致。測(cè)序結(jié)果參見圖2。pUCm-T-SEE質(zhì)粒酶切鑒定參見圖3。
含內(nèi)切酶位點(diǎn)的編碼SEE成熟肽基因序列的獲取使用BamH I與Xho I酶切測(cè)序正確的pUCm-T-SEE重組質(zhì)粒。
以含SEE全長基因的pUCm-T-SEE重組質(zhì)粒作為酶切對(duì)象，按照以下條件進(jìn)行酶切，獲得含內(nèi)切酶位點(diǎn)的編碼SEE成熟肽基因序列，對(duì)目標(biāo)基因的回收結(jié)果參見圖4。
酶切體系Buffer R+(10×)5μLPlasmid(pUCm-T-SEE)35μLBamH I(4000U) 5μLXho I(2000U) 5μL37℃水浴2h。
含編碼SEE成熟肽基因的pGEX-4T-1-SEE重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建獲得上述步驟得到的含酶切位點(diǎn)的編碼SEE成熟肽的基因片段以及pGEX-4T-1質(zhì)粒酶切產(chǎn)物的大片段，將兩者連接，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEE。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，經(jīng)過BamH I和Xho I酶切鑒定，結(jié)果表明目的基因片段已插入載體質(zhì)粒。pUCm-T-SEE質(zhì)粒酶切鑒定參見圖3。
pGEX-4T-1-SEE質(zhì)粒示意圖參見圖6。目的基因在pGEX-4T-1-SEE質(zhì)粒上的詳細(xì)序列見SEQ ID NO.1。
實(shí)施例2重組SEE的表達(dá)SEE表達(dá)菌株的構(gòu)建從含有pGEX-4T-1-SEE重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α中提取該質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，通過抗生素抗性篩選陽性克隆，獲得可以大量表達(dá)GST-SEE融合蛋白的工程菌菌株。
融合蛋白GST-SEE的表達(dá)將上述工程菌單菌落接種于5mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)6h，作為種子液。將該種子液以1-5％的接種量接種于含氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4h，按0.01％-0.1％的體積比加入0.1mol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5h。
實(shí)施例3重組SEE的純化樣品的預(yù)處理經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液4℃10000rpm離心，棄上清收集沉淀。沉淀用原菌液體積的1/10量的PBS重懸，將混懸液置FRENCH細(xì)胞破碎儀中，于700psi下破碎，懸液呈粘稠狀。后用超聲破碎儀繼續(xù)超聲破碎2min使核酸降解，菌體裂解液粘度降低。超聲后向菌體裂解液中加入20％的Triton-100至終濃度為1％，充分混勻，冰浴靜置30min。靜置完畢后將菌體裂解液4℃12000rpm離心30min，取上清液低溫保存待用。上清液取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，在分子量50kD處有較濃的條帶，此即為誘導(dǎo)表達(dá)的GST-SEE融合蛋白。Quantity One圖像分析軟件顯示該條帶濃度大占總蛋白濃度的15-25％。經(jīng)誘導(dǎo)后菌體裂解液蛋白電泳結(jié)果參見圖7。
GST-SEE融合蛋白的純化取1mL經(jīng)過預(yù)處理的蛋白溶液，經(jīng)0.45μm膜過濾后加入至預(yù)平衡的1mL Glutathione Sepharose 4 Fast Flow柱中，輕輕混勻，結(jié)合30min后流盡液體。用PBS沖洗柱子3次，每次10mL，流盡液體。向柱中加入0.5mL還原型谷胱甘肽洗脫液，輕輕混勻。反應(yīng)20min后收集溶液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)蛋白濃度。重復(fù)上步的洗脫步驟直至蛋白濃度低于0.1mg/mL停止收集，結(jié)果顯示各洗脫液組分中蛋白濃度呈正態(tài)分布。將各收集組分用SDS-PAGE檢驗(yàn)純度與濃度，結(jié)果顯示純化得到的GST-SEE融合蛋白為單一條帶，分子量約50kD，電泳結(jié)果參見圖8。
融合蛋白的切割將上述純化得到的GST-SEE融合蛋白收集組分合并，經(jīng)過脫鹽柱或者用10000截留分子量的透析帶透析，將溶液置換成含1.5mol/LNaCl、2.5mmol/LCaCl2的凝血酶緩沖溶液并同時(shí)去除溶液中的谷胱甘肽。每1mL蛋白溶液加入20mg/mL凝血酶2μL，25℃反應(yīng)24h，取樣電泳，檢測(cè)酶切反應(yīng)程度，酶切結(jié)果見圖8。
重組SEE的純化將反應(yīng)后的蛋白溶液加入至預(yù)平衡的GlutathioneSepharose 4 Fast Flow柱子中，輕輕混勻，靜置20min后使液體流盡并收集。SDS-PAGE檢測(cè)溶液中蛋白純度與濃度。結(jié)果顯示融合蛋白的GST標(biāo)簽已去除，在27KD分子量附近有單一條帶，即為純化的SEE蛋白，將純化后的蛋白溶液脫鹽后凍干保存。SEE純化蛋白電泳結(jié)果參見圖8。
實(shí)施例4MTT法測(cè)定重組SEE對(duì)ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用以ICR小鼠的脾淋巴細(xì)胞為靶細(xì)胞，將其懸浮于含10％小牛血清的RPMIM1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL，每孔100μL鋪于96孔板中，設(shè)調(diào)零孔(僅含培養(yǎng)基)、空白孔(脾淋巴細(xì)胞+培養(yǎng)基)、陽性對(duì)照孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+Con A)和實(shí)驗(yàn)孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+四個(gè)不同濃度梯度的SEE)，每種設(shè)三個(gè)復(fù)孔。其中，Con A終濃度為10μg/mL，SEE終濃度分別為10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL和0.01μg/mL。于鋪板后44h在待測(cè)孔中加入10μL/孔的MTT溶液，小心吹打混勻后，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸除上清，并加入120μL/孔的DMSO，吹打助溶后培養(yǎng)箱中放置10min，酶標(biāo)儀雙波長法(570nm為測(cè)定波長，630nm為參考波長)測(cè)定各孔OD570nm-OD630nm值，作圖分析作用腸毒素對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖作用，并用student t檢驗(yàn)做統(tǒng)計(jì)分析。
各孔的吸光度與對(duì)照組相比，陽性對(duì)照Con A和10μg/mL SEE在作用48h后ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞均有極顯著增加(P＜0.001＝，0.01μg/mL-1μg/mL SEE在作用48h后ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞均有顯著增加(P＜0.01＝。同時(shí)隨著藥物濃度的增加作用效果更加顯著(參見圖9)。
實(shí)施例5MTT法測(cè)定重組腸毒素SEE的體外抑瘤活性設(shè)調(diào)零孔(僅含培養(yǎng)基)、腫瘤細(xì)胞對(duì)照孔(培養(yǎng)基+腫瘤細(xì)胞)、淋巴細(xì)胞本底釋放孔[含空白孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞)、陽性對(duì)照孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+Con A)和實(shí)驗(yàn)孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+四個(gè)不同濃度梯度的SEE)]以及抑瘤作用孔[含空白孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞)、陽性對(duì)照孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞+ConA)和實(shí)驗(yàn)孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞+四個(gè)不同濃度梯度的SEE)]，每種設(shè)三個(gè)復(fù)孔。其中，Con A終濃度為10μg/mL，SEE終濃度分別為10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL和0.0μg/mL，本底釋放孔中5×106個(gè)/mL脾淋巴細(xì)胞以100μL/孔加入，腫瘤作用孔中5×106個(gè)/mL脾淋巴細(xì)胞和2.5×105個(gè)/mL耐阿霉素慢性髓原性白血病細(xì)胞(K562-AD)的混合懸液以100μL/孔加入到實(shí)驗(yàn)孔中，最后按用10％FCS RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋藥物至要求濃度，50μL/孔加入各孔，并小心吹打混勻。
鋪板后44h在待測(cè)孔中加入15μL/孔的MTT溶液，小心吹打混勻后，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸除上清，并加入120μL/孔的DMSO，吹打助溶后培養(yǎng)箱中放置10min，酶標(biāo)儀雙波長法(570nm為測(cè)定波長，630nm為參考波長)測(cè)定各孔OD570nm-OD630nm值，僅含培養(yǎng)基的調(diào)零孔調(diào)零。按下式計(jì)算抑瘤率抑瘤率(％)＝100-[(抑瘤作用孔-淋巴細(xì)胞本底釋放孔)/腫瘤細(xì)胞對(duì)照孔]×100，作圖分析腸毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，并用student t檢驗(yàn)做統(tǒng)計(jì)分析。
MTT法測(cè)定SEE體外抑瘤活性實(shí)驗(yàn)(各三只小鼠)，SEE以K562-AD作靶細(xì)胞，與不加藥的抑瘤空白對(duì)照孔相比，陽性對(duì)照ConA和0.01-10mg/L的SEE在作用48h后抑瘤率均有極顯著的增高(P＜0.001)，同時(shí)隨著藥物濃度的增加作用效果也更顯著(參見圖10)。按相同實(shí)驗(yàn)方案檢測(cè)SEC對(duì)K562-AD細(xì)胞的抑制作用，經(jīng)比較，重組SEE對(duì)K562-AD細(xì)胞的抑制作用與SEC相當(dāng)。
本發(fā)明涉及的序列<110>浙江大學(xué)<120>金黃色葡萄球菌腸毒素I及制備和應(yīng)用<160>4<210>1<211>696<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(696)<223>含部分凝血酶酶切位點(diǎn)序列的重組金黃色葡萄球菌腸毒素E<440>1gga tcc agc gaa gaa ata aat gaa aaa gat ttg cga aaa aag tct 45Gly Ser Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser1 5 10 15gaa tta caa aga aat gct tta agc aat ctt agg caa att tat tat 90Glu Leu Gln Arg Asn Ala Leu Ser Asn Leu Arg Gln Ile Tyr Tyr16 20 25 30tat aat gaa aaa gct ata act gaa aac aaa gag agt gat gat cag 135Tyr Asn Glu Lys Ala Ile Thr Glu Asn Lys Glu Ser Asp Asp Gln31 35 40 45ttt tta gag aat act ttg tta ttt aaa ggt ttt ttc aca ggt cat 180
Phe Leu Glu Asn Thr Leu Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Gly His46 50 55 60cca tgg tat aac gat tta tta gta gat ctt ggt tca aaa gat gct 225Pro Trp Tyr Asn Asp Leu Leu Val Asp Leu Gly Ser Lys Asp Ala6165 70 75act aat aaa tat aaa ggg aaa aaa gta gac tta tat ggt gct tat 270Thr Asn Lys Tyr Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr76 80 85 90tat gga tat caa tgt gct gga ggc aca cca aat aaa aca gca tgt 315Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys91 95 100 105atg tac ggg ggt gta aca tta cat gat aat aac cga ttg acc gaa 360Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu106 110 115 120gaa aaa aaa gta cca att aac ttg tgg ata gac gga aaa caa act 405Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu Trp Ile Asp Gly Lys Gln Thr121 125 130135aca gta cct ata gat aaa gtt aaa aca agc aaa aaa gaa gta act 450Thr Val Pro Ile Asp Lys Val Lys Thr Ser Lys Lys Glu Val Thr136 140 145 150gtt caa gag cta gat ctt cag gca agg cat tat tta cac gga aaa 495Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg His Tyr Leu His Gly Lys151 155 160 165ttt ggt tta tat aac tca gac agc ttt ggc ggt aag gtg caa aga 540Phe Gly Leu Tyr Asn Ser Asp Ser Phe Gly Gly Lys Val Gln Arg166 170 175 180ggc ttg att gtg ttt cat tct tct gaa ggg tcc acg gta agt tat 585Gly Leu Ile Val Phe His Ser Ser Glu Gly Ser Thr Val Ser Tyr181 185 190 195gat ttg ttt gat gct caa ggg caa tat cca gat aca tta tta aga 630Asp Leu Phe Asp Ala Gln Gly Gln Tyr Pro Asp Thr Leu Leu Arg196 200 205 210att tac aga gat aat aaa act att aat tca gag aac ctc cat att 675Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Leu His Ile211 215 220 225gat ttg tat tta tac aca act 696Asp Leu Tyr Leu Tyr Thr Thr226 230 232<210>2<211>690<212>DNA<213>金黃色葡萄球菌(Staphylococcus auerus)<220>
<221>CDS
<222>(1)...(654)<223>克隆所得金黃色葡萄球菌腸毒素E<440>2agc gaa gaa ata aat gaa aaa gat ttg cga aaa aag tct gaa tta45Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu15 10 15caa aga aat gct tta agc aat ctt agg caa att tat tat tat aat90Gln Arg Asn Ala Leu Ser Asn Leu Arg Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn16 20 25 30gaa aaa gct ata act gaa aac aaa gag agt gat gat cag ttt tta135Glu Lys Ala Ile Thr Glu Asn Lys Glu Ser Asp Asp Gln Phe Leu31 35 40 45gag aat act ttg tta ttt aaa ggt ttt ttc aca ggt cat cca tgg180Glu Asn Thr Leu Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Gly His Pro Trp46 50 55 60tat aac gat tta tta gta gat ctt ggt tca aaa gat gct act aat225Tyr Asn Asp Leu Leu Val Asp Leu Gly Ser Lys Asp Ala Thr Asn61 65 70 75aaa tat aaa ggg aaa aaa gta gac tta tat ggt gct tat tat gga270Lys Tyr Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly76 80 85 90tat caa tgt gct gga ggc aca cca aat aaa aca gca tgt atg tac315Tyr Gln Cys Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr91 95 100 105ggg ggt gta aca tta cat gat aat aac cga ttg acc gaa gaa aaa360Gly Gly Val Thr Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys106 110 115 120aaa gta cca att aac ttg tgg ata gac gga aaa caa act aca gta405Lys Val Pro Ile Asn Leu Trp Ile Asp Gly Lys Gln Thr Thr Val121 125 130 135cct ata gat aaa gtt aaa aca agc aaa aaa gaa gta act gtt caa450Pro Ile Asp Lys Val Lys Thr Ser Lys Lys Glu Val Thr Val Gln136 140 145 150gag cta gat ctt cag gca agg cat tat tta cac gga aaa ttt ggt495Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg His Tyr Leu His Gly Lys Phe Gly151 155 160 165tta tat aac tca gac agc ttt ggc ggt aag gtg caa aga ggc ttg540Leu Tyr Asn Ser Asp Ser Phe Gly Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu166 170 175 180att gtg ttt cat tct tct gaa ggg tcc acg gta agt tat gat ttg585Ile Val Phe His Ser Ser Glu Gly Ser Thr Val Ser Tyr Asp Leu181 185 190 195ttt gat gct caa ggg caa tat cca gat aca tta tta aga att tac630Phe Asp Ala Gln Gly Gln Tyr Pro Asp Thr Leu Leu Arg Ile Tyr196 200 205 210
aga gat aat aaa act att aat tca gag aac ctc cat att gat ttg675Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Leu His Ile Asp Leu211 215 220 225tat tta tac aca act690Tyr Leu Tyr Thr Thr226 230<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>向金黃色葡萄球菌腸毒素E基因兩端添加酶切位點(diǎn)并從金黃色葡萄球菌基因組中擴(kuò)增金黃色葡萄球菌腸毒素E基因所用的上游引物<440>3atg agg atc cag cga aga aat aaa t<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>向金黃色葡萄球菌腸毒素E基因兩端添加酶切位點(diǎn)并從金黃色葡萄球菌基因組中擴(kuò)增金黃色葡萄球菌腸毒素E基因所用的下游引物<440>4atc tct cga gtc aag ttg tgt ata aat
權(quán)利要求
1.一種金黃色葡萄球菌腸毒素E，該蛋白為一種超抗原，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌腸毒素E的制備方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)以金黃色葡萄球菌基因組作為模板，向上下游引物兩端添加BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過基因測(cè)序證實(shí)獲得的目的基因片段序列為SEQ ID NO.2，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的編碼相同蛋白質(zhì)的基因序列完全一致，將編碼金黃色葡萄球菌腸毒素E蛋白的基因序列連入pUCm-T載體；(2)通過亞克隆技術(shù)，將基因兩端添加有BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)的金黃色葡萄球菌腸毒素E成熟肽基因構(gòu)建成pGEX-4T-1-金黃色葡萄球菌腸毒素E重組質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，采用常規(guī)方法IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；(3)利用能特異性地結(jié)合GST的親和純化填料純化重組金黃色葡萄球菌腸毒素E蛋白，電泳鑒定結(jié)果顯示獲得了高純度的重組金黃色葡萄球菌腸毒素E蛋白；其特征是步驟(1)用于擴(kuò)增含帶有BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)的編碼腸毒素金黃色葡萄球菌腸毒素E成熟肽基因的上下游引物是SEQ ID NO.35’-atgagg atccag cga aga aat aaa t-3′，劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn)，SEQ ID NO.45’-atc tctcga gtc aag ttg tgt ata aat-3’，劃線部分為Xho I酶切位點(diǎn)，pGEX-4T-1-金黃色葡萄球菌腸毒素E重組質(zhì)粒是由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列經(jīng)過重組構(gòu)建而成；步驟(2)適合質(zhì)粒pGEX-4T-1-金黃色葡萄球菌腸毒素E原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白的宿主，選用大腸桿菌BL21。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的金黃色葡萄球菌腸毒素E的制備方法，其特征是所述的重組原核表達(dá)系統(tǒng)是由pGEX-4T-1質(zhì)粒和編碼金黃色葡萄球菌腸毒素E蛋白的基因序列重組構(gòu)建而成，可以用于帶谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽的重組金黃色葡萄球菌腸毒素E蛋白的表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的金黃色葡萄球菌腸毒素E的制備方法，其特征是通過設(shè)計(jì)添加有酶切位點(diǎn)的上下游引物PCR擴(kuò)增從FRI 326金黃色葡萄球菌菌株基因組中獲得編碼金黃色葡萄球菌腸毒素E蛋白的基因片段，將其克隆至pGEX-4T-1質(zhì)粒，構(gòu)建了原核表達(dá)系統(tǒng)pGEX-4T-1-金黃色葡萄球菌腸毒素E，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至合適的大腸桿菌宿主用于表達(dá)重組金黃色葡萄球菌腸毒素E蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的金黃色葡萄球菌腸毒素E的制備方法，其特征是初始獲得的蛋白為帶有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽的融合蛋白谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-金黃色葡萄球菌腸毒素E，先利用親和填料純化該融合蛋白，進(jìn)一步去除該標(biāo)簽后再次利用親和填料純化重組金黃色葡萄球菌腸毒素E蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的金黃色葡萄球菌腸毒素E的制備方法，其特征是初始獲得的蛋白谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-金黃色葡萄球菌腸毒素E融合蛋白占細(xì)菌總蛋白含量的15-25％。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的金黃色葡萄球菌腸毒素E的制備方法，其特征是最終經(jīng)過親和層析純化得到的重組金黃色葡萄球菌腸毒素E蛋白純度大于95％。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的金黃色葡萄球菌腸毒素E的制備方法，其特征是親和填料優(yōu)選偶聯(lián)有谷胱甘肽的Glutathione Sepharose 4 Fast Flow。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌腸毒素E在制備刺激淋巴細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌腸毒素E在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種重組金黃色葡萄球菌腸毒素E，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列，該重組質(zhì)粒由pGEX－4T－1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列經(jīng)過重組構(gòu)建而成。本發(fā)明利用其超抗原活性應(yīng)用于體外促脾淋巴細(xì)胞增殖和以及體外抑制腫瘤細(xì)胞生長，并與金黃色葡萄球菌腸毒素C進(jìn)行超抗原活性比較，證實(shí)重組SEE蛋白的超抗原活性與SEC相當(dāng)，適用于制備具有超抗原活性的高純度腸毒素以及超抗原制劑的開發(fā)。該重組SEE蛋白有望開發(fā)成為一種新的超抗原制劑用于腫瘤患者的臨床康復(fù)和治療。
文檔編號(hào)A61K39/085GK1962692SQ20061015481
公開日2007年5月16日 申請(qǐng)日期2006年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月17日
發(fā)明者陳樞青, 張偉, 潘映秋, 丁丁 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)