專利名稱：Tα的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是胸腺肽alpha-1(Thymosin alpha-1，Tα1)的緩釋微球制劑及其用途。
背景技術(shù)：
胸腺肽alpha-1(Thymosin alpha-1，Tα1)是一個N端乙?；乃嵝远嚯?，由28個氨基酸殘基組成，其相對分子質(zhì)3108.3，等電點為4.2，其氨基酸序列是Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-G1u-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。
(Sjogren M.H.Thymalfasinan immune system enhancer for the treatmentof liver disease[J].Journal of gastroenterology and hepatology，2004，19，S69-72)。胸腺肽αl促使致有絲分裂原激活后的外周血淋巴細(xì)胞的T細(xì)胞成熟作用，增加T細(xì)胞在各種抗原或致有絲分裂原激活后產(chǎn)生各種淋巴因子例如α、γ干擾素、白介素2(IL-2)和白介素3(IL-3)的分泌和增加T細(xì)胞上的淋巴因子受體的水平。(Sztein MB，Serrate SA.Characterization of theimmunoregulatory properties of thymosin alphal on interleukin-2production and interleukin-2 receptor expression in normal humanlymphocytes.[J].In tJ Im munopharmacol.1989，11(7)789-800)它同時通過對T4輔助細(xì)胞的激活作用來增強(qiáng)異體和自體的人類混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
為使Tα1在體內(nèi)血藥濃度平穩(wěn)，減少病人的用藥次數(shù)，提高Tα1的用藥質(zhì)量，本發(fā)明使用生物可降解聚合物作為基質(zhì)制備成長效劑型以控制藥物釋放。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種Tα1緩釋微球制劑及其制備方法，制成的Tα1緩釋微球制劑緩釋效果達(dá)4周以上，可用于各種肝炎和免疫力低下病人的治療。
近年來生物可降解的高分子材料廣泛應(yīng)用于蛋白多肽類藥物緩釋微球的制備，其中聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactide-co-glycolide)，PLGA]，由于其良好的生物相容性及生物降解性已被美國FDA批準(zhǔn)為藥用高分子材料使用。以PLGA作為微球基質(zhì)，體內(nèi)外降解實驗證明，在藥物釋放過程中，整個聚合物骨架呈均勻性降解，隨著分子量的下降，骨架材料的親水性增強(qiáng)，由于水分的不斷滲入使蛋白多肽類藥物持續(xù)釋放出來(Wang YM，Sato H，Horikoshi.Invitro and in vivo evalution of taxol release from ploy(lactic-co-glycotic acid)microspheres containing isopropyl myristate anddegradation of the microspheres.J Control Rel，1997，49157)。本發(fā)明就是使用PLGA作為基質(zhì)制備Tα1緩釋微球制劑的。制備供皮下注射的Tα1緩釋微球制劑，可持續(xù)釋藥達(dá)4周以上。
本發(fā)明的胸腺肽alpha-1(Tα1)緩釋注射微球制劑，其組成包括基質(zhì)、胸腺肽alpha-1(Tα1)、保護(hù)劑和，其特征在于所述基質(zhì)PLGA，分子量為3000～40000，為聚乳酸∶羥基乙酸＝25∶75-75∶25的聚乳酸-羥基乙酸共聚物；所述保護(hù)劑包括碳酸鋅、海藻糖和甘露醇；胸腺肽alpha-1(Tα1)與聚乳酸-羥基乙酸共聚物的重量比例為0.5∶100至5∶100，微球粒徑在室溫時＜100μm。
本發(fā)明緩釋微球制劑制備方法有二種1.w/o/w溶劑揮發(fā)法(1)制備油相將基質(zhì)材料PLGA溶于有機(jī)溶劑二氯甲烷制成油相，濃度為100mg～500mg/ml；(2)制備內(nèi)水相取適量Tα1溶于磷酸鹽緩沖液(離子濃度為5～80Mm)中形成內(nèi)水相，Tα1濃度為1mg～10mg/ml。制備微球時將內(nèi)水相加入上述油相超聲乳化形成初乳，將初乳迅速滴加在1～6％聚乙烯醇(PVA)水溶液中(還含有0～25％NaCl，或0～25％葡萄糖)，機(jī)械攪拌充分勻化(攪拌速度為800～2000rpm)，室溫下繼續(xù)低速攪拌4～6小時(攪拌速度為200～600rpm)，洗滌，收集，冷凍干燥即可。
2.s/o/o溶劑揮發(fā)法(1)制備油相將基質(zhì)材料PLGA溶于有機(jī)溶劑乙腈制成油相，濃度為50mg～300mg/ml；(2)制備Tα1微粉將適量的聚乙二醇(PEG)和Tα1及保護(hù)劑(其比例為10∶1∶2)分散于水溶液中，冷凍干燥后用乙腈洗滌、離心，除去PEG，得到Tα1微粉，保護(hù)劑選自碳酸鋅、海藻糖和甘露醇等，Tα1濃度為1mg～10mg/ml。
(3)制備微球?qū)α1微粉加入油相，超聲分散，然后逐滴加在大豆油中，機(jī)械攪拌充分勻化(攪拌速度為500～800rpm)，室溫下攪拌1～1.5小時，再加入適量的石油醚繼續(xù)攪拌2～3小時(攪拌速度為200～500rpm)，可得Tα1微球，洗滌，收集，冷凍干燥即可。
本發(fā)明所用的基質(zhì)材料PLGA，分子量為3000～40000，聚乳酸(PLA)∶羥基乙酸(PGA)為25∶75～75∶25，濃度為50mg～300mg/ml。超聲乳化10次，超聲條件為輸出功率450w；工作時間40ms/次。
本發(fā)明緩釋微球經(jīng)體外釋放實驗，緩釋達(dá)4周以上，釋放符合近似零級模式，可用于各種肝炎和免疫力低下病人的治療。


圖1為實施例1制備的Tα1微球體外累積釋放～時間曲線圖，圖2為實施例2制備的Tα1微球體外累積釋放～時間曲線圖，圖3為實施例3制備的Tα1微球體外累積釋放～時間曲線圖，圖4為本發(fā)明Tα1的緩釋微球制劑給藥后30天內(nèi)CD4+/CD8+值～時間曲線圖。
圖中含▲的曲線代表免疫功能低下的大鼠注射w/o/w(葡萄糖)法制備的Tα1緩釋微球后30天內(nèi)CD4+/CD8+變化值、含●的曲線代表注射劑組、含■的曲線代表空白微球組。
具體實施例方式
實施例1w/o/w(NaCl)溶劑揮發(fā)法制備Tα1緩釋微球制劑將PLGA(RG502H，PLA∶PGA＝50∶50，Mw＝14000)100mg溶于1.0ml二氯甲烷制成油相，Tα11mg溶于0.1ml的磷酸鹽緩沖液中形成內(nèi)水相，將其加入上述油相，超聲乳化10次，超聲條件為輸出功率450w；工作時間40ms/次。形成w/o的初乳，將含3％PVA溶液30ml(含NaCl 5％)置于攪拌容器中，將初乳在高速攪拌(1200rpm)下快速加入外水相中充分勻化，二分鐘后，將轉(zhuǎn)速下調(diào)至400rpm同時外水相加入100ml蒸餾水，室溫下攪拌4小時，微球硬化后離心分離并洗滌，冷凍干燥。密封分裝后輻照消毒即可。Tα1微球的包封率為87.8％，粒徑＜100μm。
實施例2w/o/w(葡萄糖)溶劑揮發(fā)法制備Tα1緩釋微球制劑將PLGA(RG502H，PLA∶PGA＝50∶50，Mw＝14000)100mg溶于1.0ml二氯甲烷制成油相，Tα11mg溶于0.1ml的磷酸鹽緩沖液中形成內(nèi)水相，將其加入上述油相，超聲乳化10次，超聲條件為450w；工作時間40ms/次。形成w/o的初乳，將含3％PVA溶液30ml(含Glucose 10％)置于攪拌容器中，將初乳在高速攪拌(1200rpm)下快速加入外水相中充分勻化，2分鐘后，將轉(zhuǎn)速下調(diào)至400rpm同時外水相加入100ml蒸餾水，室溫下攪拌4小時，微球硬化后離心分離并洗滌，冷凍干燥。密封分裝后輻照消毒即可。Tα1微球的包封率為90.2％，粒徑＜100μm。
實施例3s/o/o溶劑揮發(fā)法制備Tα1緩釋微球制劑將PEG(PEG6000)19.3mg和Tα11mg及保護(hù)劑(碳酸鋅0.22mg)分散于1ml重蒸溜水中，旋渦混合3分鐘左右，冷凍干燥后，用二氯甲烷洗滌，離心，除去PEG，得到Tα1微粉。將PLGA(RG502H，PLA∶PGA＝50∶50，Mw＝14000)120mg溶于乙腈1.0ml制成油相，將微粉加入上述油相，超聲分散，將其逐滴加入大豆油中充分勻化，攪拌(500rpm)1小時，再加入適量的石油醚繼續(xù)攪拌(200rpm)2小時，可得Tα1微球，離心，用石油醚洗滌，收集，冷凍干燥，密封分裝后輻照消毒即可。Tα1微球的包封率為91％，粒徑＜100μm。
實施例4.微球的體外釋放試驗精密稱取Tα1微球10mg各8支分別置于10ml玻璃離心管中，加入適量10mMpH 7.4磷酸緩沖液(含0.02％疊氮鈉作為抑菌劑，0.01％Tween-80作為潤濕劑)為釋放介質(zhì)，置于恒溫水浴搖床中，在100rpm振蕩速度、37℃±0.5℃溫度條件下進(jìn)行微球的體外釋放度測定。分別在2h、1d、6d、11d、16d、21d、27d取出離心管，于12000rpm離心10min，吸出上清液后將殘余微球冷凍干燥24h。以后每隔4-5天同以上操作方法取樣一次，并用HPLC法測定Tα1的含量。
以取樣天數(shù)為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的Tα1累積釋放百分比為縱坐標(biāo)制作藥物釋放曲線，上述三個實施例制備的微球制劑釋放曲線分別見圖1～3。由圖可見所制備的Tα1緩釋微球制劑可在體外釋藥4周左右。
實施例5.動物試驗選取成年SD雄鼠30只，體重200g左右，隨機(jī)分為3組，每10只為一組。A組為Tα1注射劑組，B組作為對照組(空白微球組)，C組為Tα1注射微球組。每組大鼠分別腹腔給予免疫抑制劑環(huán)磷酰胺(CTX)50mg/kg·d-1，給藥體積500μl/100g，每組10只。每五天給藥一次，使所有大鼠產(chǎn)生免疫抑制反應(yīng)。從第10個實驗日起，A組大鼠皮下給與Tα1注射劑不同的處理(按體表面積換算表中的折算比計算每只大鼠應(yīng)給予的劑量給藥)，每周給藥2次B組皮下注射空白微球；C組皮下注射Tα1微球。Tα1的給與劑量143μg/kg，皮下給藥體積為500μl/100g。在給藥過后的第1d、2d、7d、12d、22d、27d，眼眶靜脈竇取血100μl。加入熒光素標(biāo)記的CD4、CD8抗體，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測得到CD4+/CD8+值。CD4+/CD8+值和時間的曲線圖見圖4。
由圖4可見，Tα1微球具有與靜脈注射原料藥相同的使免疫抑制大鼠CD4+/CD8+值增高的作用，而且微球組的效果明顯優(yōu)于注射機(jī)組。說明Tα1微球在體內(nèi)有明顯的緩釋作用，持續(xù)刺激大鼠的免疫調(diào)節(jié)功能，所以本發(fā)明可作為Tα1的緩釋劑型用于可用于各種肝炎和免疫力低下病人的治療。
權(quán)利要求
1.一種胸腺肽alpha-1(Tα1)緩釋微球制劑，其組成包括基質(zhì)、胸腺肽alpha-1(Tα1)、保護(hù)劑，其特征在于所述基質(zhì)PLGA，分子量為3000～40000，為聚乳酸∶羥基乙酸＝25∶75-75∶25的聚乳酸-羥基乙酸共聚物；所述保護(hù)劑包括碳酸鋅、海藻糖和甘露醇；胸腺肽alpha-1(Tα1)與聚乳酸-羥基乙酸共聚物的重量比例為0.5∶100至5∶100，微球粒徑在室溫時＜100μm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胸腺肽alpha-1(Tα1)緩釋微球制劑，其特征在于其制備采用下列方法方法1w/o/w溶劑揮發(fā)法，或方法2s/o/o溶劑揮發(fā)法具體步驟如下方法1將基質(zhì)溶于有機(jī)溶劑制成油相，濃度為100mg～500mg/ml；取Tα1溶于磷酸鹽緩沖液(離子濃度為5～80Mm)中形成內(nèi)水相，Tα1濃度為1mg～10mg/ml；外水相采用1～6％聚乙烯醇(PVA)水溶液中(還含有0～25％NaCl，或0～25％葡萄糖)；內(nèi)水相加入上述油相超聲乳化形成初乳，在機(jī)械充分?jǐn)嚢柘?攪拌速度為800～2000rpm)將初乳迅速滴加到外水相中形成復(fù)乳，室溫下繼續(xù)低速攪拌4～6小時(攪拌速度為200～600rpm)，洗滌、收集微球，冷凍干燥即得Tα1微球。方法2將基質(zhì)PLGA溶于有機(jī)溶劑乙腈制成油相，濃度為50mg～300mg/ml；將聚乙二醇(PEG)和Tα1及保護(hù)劑(其比例為10∶1∶2)，分散于水溶液中，Tα1濃度為1mg～10mg/ml，冷凍干燥后用乙腈洗滌、離心，除去PEG，得到Tα1微粉；將Tα1微粉加入油相，超聲分散，然后逐滴加在大豆油中，機(jī)械攪拌(攪拌速度為500～800rpm)充分勻化，室溫下攪拌1～1.5小時，再加入適量的石油醚繼續(xù)攪拌2～3小時(攪拌速度為200～500rpm)，可得Tα1微球，洗滌，收集，冷凍干燥即得Tα1微球。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種胸腺肽alpha-1(Tα1)緩釋微球制劑在各種肝炎，腫瘤病人和免疫力低下病人的治療中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胸腺肽alpha－1(Tα
文檔編號A61P37/04GK1965810SQ20061011841
公開日2007年5月23日 申請日期2006年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月17日
發(fā)明者鐘延強(qiáng), 朱艷, 魯瑩, 張國慶, 尹東鋒, 樊莉, 陳琰, 齊琰 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)