專利名稱：：從刺山柑藥用部位中獲得提取物的方法及該提取物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及天然藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體說(shuō)，涉及從刺山柑中獲得提取物的方法及該提取物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：刺山柑為白花菜科植物刺山柑0^/7^^^^"0a丄，又名槌果藤、老鼠瓜、野西瓜、菠里克果等。刺山柑是一種生長(zhǎng)在炎熱干旱氣候條件下的半灌木，我國(guó)主要分布于新疆天山南北石質(zhì)低山、丘陵坡地、山麓沖溝或戈壁灘。此外，在甘肅、西藏等地也有生長(zhǎng)。刺山柑在國(guó)外主要分布在地中海灣地區(qū)，生長(zhǎng)期為五月到十月。刺山柑的藥用部位為葉、果和根皮，味辛苦、性溫，民間用刺山柑治療關(guān)節(jié)炎、通風(fēng)等癥，效果顯著。從文獻(xiàn)"野西瓜果實(shí)的化學(xué)成分研究"(哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版21巻第6期684-686頁(yè))和IsolationandidentificationofindolederivativesinclubrootsofChinesecabbage(AgriculturalandBiologicalChemistry34,1590-1592)中只能分別得到P-谷甾醇、e-谷甾醇葡萄糖苷或l-氫-3-乙腈基-4-甲氧基-卩引哚。而中國(guó)專禾廿200310113957.9公開(kāi)了一種從植物槌果藤實(shí)中提取抗關(guān)節(jié)炎有效部位的方法，該方法包括將刺山柑果粉碎，加熱回流，冷浸或滲漉提取，減壓濃縮，得到粗提物，將粗提物先用石油醚脫脂，殘余物依次用乙酸乙酯和正丁醇體系洗脫，分別得到乙酸乙酯有效部位和正丁醇有效部位。但是試驗(yàn)表明，乙酸乙酯和正丁醇部位對(duì)II型膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型無(wú)效。
發(fā)明內(nèi)容為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的之一是提供一種從刺山柑藥用部位中獲得提取物的方法，該方法包括將刺山柑藥用部位粉碎，加熱回流，冷浸或滲漉提取，減壓濃縮，得到粗提物，將粗提物用石油醚脫脂，其特征在于，脫脂后的殘余物用氯仿萃取，得到提取物。本發(fā)明的目的之二是提供由所述方法制得的提取物。所述的提取物含有P-谷甾醇、e-谷甾醇葡萄糖苷和1-氫-3-乙腈基-4-甲氧基-吲哚。本發(fā)明的的目的之三是提供所述的提取物在制備治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肩周炎的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的的目的之四是提供一種藥物組合物，該藥物組合物含有所述的提取物和藥學(xué)上可接受的輔料。本發(fā)明所述的從刺山柑中得到提取物的方法的具體步驟如下1)將刺山柑果實(shí)、莖葉和根皮粉碎，用60—900%乙醇進(jìn)行加熱回流，冷浸或滲漉提取，提取1一3次，提取液在40—60'C減壓濃縮，得到刺山柑果、莖葉和根皮的粗提物；2)將粗提物先用石油醚脫脂，殘余物用氯仿萃取，得到含有P-谷甾醇、e-谷甾醇葡萄糖苷和l-氫-3-乙腈基-4-甲氧基-吲哚的提取物。通過(guò)本發(fā)明的方法，可以得到含有P-谷甾醇、e-谷甾醇葡萄糖苷和l-氫-3-乙腈基-4-甲氧基-吲哚的刺山柑氯仿提取物。藥效試驗(yàn)證明，由氯仿萃取的含有P-谷甾醇、P-谷甾醇葡萄糖苷和1-氫-3-乙腈基-4-甲氧基-吲哚的提取物對(duì)治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及肩周炎顯示良好的效果。該提取物對(duì)多種關(guān)節(jié)炎模型(包括II型膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型)均顯示良好的效果，毒性很低，并且是以極性小的化學(xué)成分為主。圖1為口服刺山柑氯仿提取物對(duì)角叉菜膠引起的小鼠急性關(guān)節(jié)炎的影響；圖2為口服刺山柑氯仿提取物對(duì)II型膠原誘導(dǎo)的大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防作用；圖3為口服刺山柑氯仿提取物對(duì)II型膠原誘導(dǎo)的大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用；圖4為口服刺山柑氯仿提取物對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防作用；圖5為口服刺山柑氯仿提取物對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用；圖6為刺山柑氯仿提取物的e-谷甾醇的TLC圖譜，其中l(wèi)為刺山柑氯仿提取物，2，3為P-谷甾醇，展開(kāi)劑為氯仿甲醇=20:1，顯色劑為香草醛-濃硫酸；圖7為刺山柑氯仿提取物的e-谷甾醇葡萄糖苷的TLC圖譜，其中1為剌山柑氯仿提取物，2，3為e-谷甾醇葡萄糖苷，展開(kāi)劑為氯仿甲醇=15:1，顯色劑為香草醛-濃硫酸；圖8a和8b分別為刺山柑氯仿提取物和l-氫-3-乙腈基-4-甲氧基』引哚的HPLC圖譜，其中高效液相色譜條件如下HP1100色譜柱為DiamonsilC18(250x4.6mm,5|i，Dikma)。流動(dòng)相A(超濾水)和B(乙腈，Merck)呈梯度變化0—20min5%B—30%B，21—50min31%B—70%B;檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，流速1.0mL/min，柱溫25。C。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:將2公斤剌山柑果實(shí)、莖葉和根皮粉碎，用20升75%乙醇進(jìn)行加熱回流、冷浸提，取提取2次，提取時(shí)間為2個(gè)小時(shí)，合并提取液，提取液在4(TC減壓濃縮，即可得到刺山柑抗關(guān)節(jié)炎粗提物浸膏；將粗提物浸膏先后用石油醚脫脂，殘余物用氯仿萃取，得到含有e-谷甾醇、e-谷甾醇葡萄糖苷和l-氫-3-乙腈基-4-甲氧基-n引哚等化合物的提取物。實(shí)施例2:將5公斤刺山柑果實(shí)、莖葉和根皮粉碎，用100升70%乙醇進(jìn)行加熱回流，滲漉提取，提取2次，提取時(shí)間為5小時(shí)，合并提取液，提取液在45'C減壓濃縮，即可得到刺山柑抗關(guān)節(jié)炎粗提物浸膏；將粗提物浸膏先后用石油醚脫脂，殘余物用氯仿萃取，得到含有P-谷甾醇、e-谷甾醇葡萄糖苷和1-氫-3-乙腈基-4-甲氧基-H引哚等化合物的提取物。實(shí)施例3將3公斤刺山柑果實(shí)、莖葉和根皮粉碎，用45升80%乙醇進(jìn)行加熱回流，冷浸提取，提取1次，提取時(shí)間為10小時(shí)，合并提取液，提取液在5(TC減壓濃縮，即可得到刺山柑抗關(guān)節(jié)炎粗提物浸膏；將粗提物浸膏先后用石油醚脫脂，殘余物用氯仿萃取，得到含有P-谷甾醇、e-谷甾醇葡萄糖苷和1-氫-3-乙腈基-4-甲氧基-U引哚等化合物的提取物。實(shí)施例4將5公斤刺山柑果實(shí)、莖葉和根皮粉碎，用40升90%乙醇進(jìn)行加熱回流，滲漉提取，提取1次，提取時(shí)間為8小時(shí)，合并提取液，提取液在60'C減壓濃縮，即可得到刺山柑抗關(guān)節(jié)炎粗提物浸膏；將粗提物浸膏先后用石油醚脫脂，殘余物用氯仿萃取，得到含有P-谷甾醇、e-谷甾醇葡萄糖苷和1-氫-3-乙腈基-4-甲氧基-吲哚等化合物的提取物。實(shí)施例5將2公斤刺山柑果實(shí)、莖葉和根皮粉碎，用30升65%乙醇進(jìn)行加熱回流、冷浸提，取提取2次，提取時(shí)間為2個(gè)小時(shí)，合并提取液，提取液在4(TC減壓濃縮，即可得到刺山柑抗關(guān)節(jié)炎粗提物浸膏；將粗提物浸膏先后用石油醚脫脂，殘余物用氯仿萃取，得到含有e-谷甾醇、e-谷甾醇葡萄糖苷和1-氫_3-乙腈基-4-甲氧基-吲哚等化合物的提取物。從剌山柑中得到的氯仿提取物的抗關(guān)節(jié)炎藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)例一、氯仿提取物對(duì)角叉菜膠誘發(fā)小鼠足跖腫脹的影響將20g昆明小鼠先分成給藥組500mg/kg，po;陽(yáng)性對(duì)照消炎痛組10mg/kg，po;空白對(duì)照組；按上述方法給藥三天，致炎前先測(cè)各組大鼠右后足跖的體積一次，末次給藥一小時(shí)后在大鼠右后足跖中部皮下注射P/。角叉菜膠0.1ml致炎，以后每隔一小時(shí)測(cè)足跖體積1次，計(jì)算腫脹率及抑制率，組間差異以t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。結(jié)果如下。表1氯仿提取物對(duì)角叉菜膠致小鼠急性炎癥的影響(X，n-10，x士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>()內(nèi)為腫脹率(％)<>內(nèi)為抑制率(％)由表1可見(jiàn)，氯仿提取物可明顯地抑制角叉菜膠致小鼠足跖急性炎癥，并高于消炎痛組的作用。二、氯仿提取物對(duì)n型膠元(cn)誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎的影響致炎劑H型膠元溶解在0.1mol/L醋酸中，使終濃度為2mg/ml膠元溶液，fC過(guò)夜，次日將II型膠元溶液滴加至冷的不完全弗氏佐劑中，充分乳化(II型膠元液弗氏不完全佐劑=1:1)，使II型膠元終濃度為lmg/mlQII型膠元乳劑4'C冰箱保存?zhèn)溆?。免疫方法每只大鼠?點(diǎn)背部皮內(nèi)注射免疫，每點(diǎn)O.lml,共5ml(含有II型膠元量為0.5mg)，7天后以同樣的方法追加免疫一次。對(duì)照組注射0.1mol/L醋酸及不完全弗氏佐劑乳化液，注射前及免疫后20天起用排水法測(cè)定右后足踝部關(guān)節(jié)的腫脹度。l.氯仿提取物對(duì)II型膠元(CII)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的預(yù)防作用150180gWistar大鼠分成給藥組氯仿提取物50mg/kg，po;消炎痛組lmg/kg，po;空白對(duì)照組。給藥組動(dòng)物首次免疫后開(kāi)始給藥8天。用排水法測(cè)量免疫前和首次免疫后20、22、24、27天的足踝關(guān)節(jié)腫脹值，計(jì)算腫脹率及抑制率，組間差異以t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。表2氯仿提取物對(duì)II型膠元(CII)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的預(yù)防作用(％，n=8，x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>()內(nèi)為腫脹率(％)<>內(nèi)為抑制率(％)由表2可見(jiàn)，氯仿提取物可明顯地預(yù)防ii型膠元誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎，其作用均明顯高于消炎痛組。2.氯仿提取物對(duì)n型膠元(cii)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的治療作用150180gWistar大鼠分成給藥組氯仿提取物50mg/kg，po;消炎痛組lmg/kg，po;空白對(duì)照組。給藥組動(dòng)物首次免疫后第19天開(kāi)始連續(xù)給藥8天。用排水法測(cè)量免疫前和首次免疫后19、21、23、26、28天的足踝關(guān)節(jié)腫脹值，計(jì)算腫脹率及抑制率同上，組間差異以t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。表3氯仿提取物對(duì)ii型膠元(cii)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的治療作用(％，n=8，x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>()內(nèi)為腫脹率(％)<>內(nèi)為抑制率(％)由表3可知，氯仿提取物可治療n型膠元誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎，其作用均高于消炎痛組。三、氯仿提取物對(duì)佐劑性大鼠關(guān)節(jié)炎的影響l.Zhp-I對(duì)佐劑誘導(dǎo)的大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎預(yù)防作用將130150gSD大鼠分成大劑量組氯仿提取物250mg/kg,iv;中劑量組氯仿提取物125mg/kg，iv;小劑量組氯仿提取物62.5mg/kg,iv;消炎痛組lmg/kg，p0;空白對(duì)照組。動(dòng)物致炎前先用測(cè)右后足跖的體積一次，然后在大鼠右后足跖中部皮下注射弗氏完全佐劑0.1ml致炎，致炎7天后開(kāi)始按上述分組，并開(kāi)始給藥8天，每隔一定時(shí)間測(cè)足跖體積，計(jì)算腫脹率及抑制率，組間差異以t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。表4氯仿提取物對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防作用(％，n=8，x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>()內(nèi)為腫脹率(％)<>內(nèi)為抑制率(％)由表4可知，高劑量氯仿提取物對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎，相當(dāng)于消炎痛組，略高于雷公藤組。2.Zhp-I對(duì)佐劑誘導(dǎo)的大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎治療作用將130150gSD大鼠分成大劑量組氯仿提取物250mg/kg,iv;中劑量組氯仿提取物125mg/kg，iv;小劑量組氯仿提取物62.5mg/kg，iv;消炎痛組lmg/kg，po;雷公藤組1.5mg/kg，pO。動(dòng)物致炎前先用測(cè)右后足跖的體積一次，然后在大鼠右后足跖中部皮下注射弗氏完全佐劑O.lml致炎，致炎19天后開(kāi)始按上述分組，并開(kāi)始給藥8天，每隔一定時(shí)間測(cè)足跖體積，計(jì)算腫脹率及抑制率，組間差異以t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。表5氯仿提取物對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用(％，n=8，x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>()內(nèi)為腫脹率(％)<>內(nèi)為抑制率(％)由表5可知，高劑量氯仿提取物對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎，相當(dāng)于消炎痛組，略高于雷公藤組。權(quán)利要求1.從刺山柑藥用部位中獲得提取物的方法，該方法包括將刺山柑藥用部位粉碎，加熱回流，冷浸或滲漉提取，減壓濃縮，得到粗提物，將粗提物用石油醚脫脂，其特征在于，脫脂后的殘余物用氯仿萃取，得到提取物。2.由權(quán)利要求1所述的方法制得的提取物。3.如權(quán)利要求2所述的提取物，其特征在于，該提取物含有P-谷甾醇、6-谷甾醇葡萄糖苷和1-氫-3-乙腈基-4-甲氧基』引哚。4.權(quán)利要求2或3所述的提取物在制備治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肩周炎的藥物中的應(yīng)用。5.藥物組合物，含有權(quán)利要求2或3所述的提取物和藥學(xué)上可接受的輔料。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種從刺山柑藥用部位中獲得提取物的方法，該方法包括將刺山柑藥用部位粉碎，加熱回流，冷浸或滲漉提取，減壓濃縮，得到粗提物，將粗提物先用石油醚脫脂，其特征在于，脫脂后的殘余物用氯仿萃取，得到提取物。該提取物可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肩周炎。藥效學(xué)研究表明，由本發(fā)明方法得到的提取物對(duì)多種關(guān)節(jié)炎模型(包括Ⅱ型膠原所誘發(fā)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的模型)具有明確效果。文檔編號(hào)A61K36/185GK101185663SQ200610118369公開(kāi)日2008年5月28日申請(qǐng)日期2006年11月15日優(yōu)先權(quán)日2006年11月15日發(fā)明者英劉,劉全海,劉珉宇,彤吳,吳學(xué)軍,姜仁吉,孫海燕,燕李,李晶晶,璘肖,立蔡,賀興冬申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院