專利名稱：肌肉生長抑制素在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞因子的新用途，特別是涉及肌肉生長抑制素(Myostatin)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤問題是當(dāng)今科學(xué)界懸而未解的難題之一。腫瘤組織生長快速不受控制，能夠侵襲或轉(zhuǎn)移到任何其它器官并形成新的病灶，嚴(yán)重影響器官的正常生理功能，過快生長的腫瘤還能消耗營養(yǎng)與能量造成惡病質(zhì)，并且容易復(fù)發(fā)，難以治愈。這些特性使得腫瘤成為當(dāng)今威脅人們健康和生命的幾大殺手之一。因此迫切需要能夠殺死腫瘤細(xì)胞，并可治愈由腫瘤導(dǎo)致的涉及多器官和系統(tǒng)的疾病的藥物。
細(xì)胞凋亡是指由基因嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞自殺的過程。許多細(xì)胞就因丟失了正常的凋亡機(jī)制而不停生長，導(dǎo)致腫瘤形成。因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的關(guān)鍵。
人體內(nèi)的細(xì)胞因子是指由機(jī)體各種細(xì)胞合成及分泌的具有多種生理活性并參與病理反應(yīng)的小分子可溶性蛋白質(zhì)，它們對于不同的細(xì)胞具有不同的生理功能。許多腫瘤細(xì)胞由于其內(nèi)部的分析信號紊亂，都會特異性地高表達(dá)某些細(xì)胞因子，其中某種特定的細(xì)胞因子還會產(chǎn)生不同于正常細(xì)胞的反應(yīng)。比如TGF-beta是一種在人體各種類型的組織細(xì)胞中都廣泛表達(dá)的細(xì)胞因子，正常的上皮細(xì)胞的生長會受到TGF-beta的抑制，但上皮來源的腫瘤細(xì)胞非但不會受抑，外源加入TGF-beta還可能促進(jìn)其生長，然而同樣的處理卻能導(dǎo)致肝細(xì)胞癌Hep3B凋亡。正因?yàn)榧?xì)胞因子具有這種特性，理論上講，我們就能應(yīng)用某種特定的細(xì)胞因子來特異性地誘導(dǎo)某種腫瘤細(xì)胞凋亡，并使正常細(xì)胞不受影響，減輕病人的痛苦與身體其它系統(tǒng)的消耗。
1997年，McPherron等從小鼠骨骼肌cDNA文庫中克隆到一個(gè)新基因，該基因編碼由376個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)(Mcpherron A C，L.A.M.，Lee S J(1997)Regulation of skeletal musc le mass in mice by a new TGF-beta superfamily member.Nature 38783-90.)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明該細(xì)胞因子具有TGF-β超家族成員結(jié)構(gòu)上共同的特點(diǎn)，因而將其列為TGF-β超家族中的一類新因子，即Growth andDifferentiation Factor-8(GDF-8)。GDF-8基因主要在骨骼肌中表達(dá)，該基因敲除鼠的骨骼肌是正常野生型小鼠的3倍以上，因GDF-8對骨骼肌生長具有抑制作用，后將其正式命名為肌肉生長抑制素(Myostatin)。1998年，Gonzalez-Cadavid等克隆了人的Myostatin基因組基因，人Myostatin基因全長7.7kb，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，內(nèi)含子1和內(nèi)含子2的長度分別為1.8kb和2.4kb，3個(gè)外顯子編碼的氨基酸序列長度分別為125aa，124aa和126aa(Gonzalez-Cadavid，N.F.，et al.(1998)Organization of the human myostatin gene and expression in healthy men andHIV-infected men with muscle wasting.Proc Natl AcadSci USA95(25)14938-14943.)。
利用基因敲除技術(shù)研究Myostatin基因的功能發(fā)現(xiàn)，純合突變型小鼠的體重要比雜合體或野生型小鼠重約30％(與性別、年齡無關(guān))。突變純合體小鼠肩和臀部的肌肉明顯肥大，移去皮膚發(fā)現(xiàn)整個(gè)身體的骨骼肌都比野生型的小鼠大很多，單塊肌肉的重量約為野生型小鼠的2-3倍。研究這種突變型小鼠肌肉肥大的原因，發(fā)現(xiàn)既有肌細(xì)胞的增生(Hyperplasia)，也有肌纖維的肥大(Hypertrophy)，即“雙肌現(xiàn)象”。同時(shí)，Myostatin功能喪失與雙肌牛的關(guān)系也已被實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(Grobet et al.(1997)Adeletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype incattle.Journal 17(Issue)71-74)。
2004年，英國科學(xué)家報(bào)道一名出生不久的男嬰大腿和上臂的肌肉都非常突出。在他四歲半時(shí)，已經(jīng)可以平舉3kg的啞鈴了。經(jīng)遺傳學(xué)調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，編碼Myostatin的基因在第一個(gè)內(nèi)含子上由于剪接位點(diǎn)的突變(由GT//gtaagt突變?yōu)镚T//gtaaat)導(dǎo)致mRNA不能正確剪接，產(chǎn)生無功能的Myostatin(Schuelke et al.(2004)Myostatinmutation associated with gross muscle hypertrophy in a child.Journal350(Issue)2682-2688)?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明Myostatin在人體中的作用與在鼠和牛中一樣，抑制骨骼肌的生長發(fā)育。不僅如此，Myostatin在成體的骨骼肌中也持續(xù)表達(dá)，也同樣能抑制成體肌肉的增生與肥大，甚至促進(jìn)肌肉萎縮與消耗。有一項(xiàng)研究表明Myostatin基因的表達(dá)水平在由HIV感染引起的骨骼肌萎縮而消瘦的病人中高于正常人。
此外，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)Myostatin還與脂肪代謝有關(guān)。Myostatin具有抑制前脂肪細(xì)胞分化的功能，這一調(diào)控過程可能與C/EBP-alpha和PPAR-gamma的信號傳導(dǎo)有關(guān)；還發(fā)現(xiàn)Myostatin基因敲除小鼠表現(xiàn)出脂肪形成能力降低，最終導(dǎo)致瘦蛋白(Leptin)的分泌水平下降。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供肌肉生長抑制素(Myostatin)的新用途，即在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的應(yīng)用是以肌肉生長抑制素為活性成分在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
所述肌肉生長抑制素尤其適用于制備抗惡性腫瘤藥物，如前列腺癌，宮頸癌，肺腺癌和肝癌等。
需要的時(shí)候，在本發(fā)明所述應(yīng)用中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料，所述輔料包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、潤滑劑、穩(wěn)定劑等，必要時(shí)還可加入香味劑、甜味劑及色素等。
本發(fā)明所述應(yīng)用除制成膠囊外，還可以制成片劑、粉劑、粒劑、口服液、注射液、等多種藥物形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
該藥物的成人口服用量一般為400mg/kg/d，可以一次或多次使用，療程為10至20天。
本發(fā)明提供了一種肌肉生長抑制素的新用途，即在制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)Myostatin處理的人前列腺癌、宮頸癌、肺腺癌和肝癌等腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的凋亡細(xì)胞特性1)具有Caspase活性的細(xì)胞的比例顯著升高；2)Caspase 3和Caspase9被激活；3)細(xì)胞色素C由線粒體釋放到胞漿中。因而可以Myostatin為活性成分制備抗腫瘤藥物，該藥物具有以下優(yōu)點(diǎn)1)療效顯著；2)安全性高；3)主要用藥途徑為口服，用藥方便；4)Myostatin價(jià)格低廉，制備該藥物的成本較低，從而可減輕病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本發(fā)明為腫瘤的防治提供了一條新途徑，在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為添加Myostatin后Du-145、Hela和AGZY-83a貼壁細(xì)胞的生長情況圖2為不同濃度Myostatin下A549、AGZY-83a和HepG2細(xì)胞的凋亡比例圖3為利用DAPI染色法觀察到的經(jīng)Myostatin處理后凋亡腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)圖4A為經(jīng)Myostatin處理不同時(shí)間后具有Caspase活性的細(xì)胞所占百分比的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果圖4B為經(jīng)Myostatin處理不同時(shí)間后具有Caspase活性的細(xì)胞所占百分比統(tǒng)計(jì)結(jié)果的柱狀5A為經(jīng)Myostatin處理不同時(shí)間的Hela細(xì)胞的Caspase3激活情況的Westernblot檢測結(jié)果圖5B為經(jīng)Myostatin處理不同時(shí)間的Hela細(xì)胞的Caspase9激活情況的Westernblot檢測結(jié)果圖6A為經(jīng)Myostatin處理后的A549細(xì)胞線粒體及胞漿中細(xì)胞色素C的免疫熒光技術(shù)檢測結(jié)果圖6B為經(jīng)Myostatin處理后的Hela細(xì)胞線粒體及胞漿中細(xì)胞色素C的免疫熒光技術(shù)檢測結(jié)果圖7為經(jīng)Myostatin處理后的Hela細(xì)胞線粒體及胞漿中細(xì)胞色素C的Westernblot檢測結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、觀察Myostatin對腫瘤細(xì)胞生長情況的影響以人前列腺癌細(xì)胞系Du-145、人宮頸癌細(xì)胞系Hela和人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)GZY-83a為例觀察Myostatin對腫瘤細(xì)胞生長情況的影響，實(shí)驗(yàn)方法為將在相同條件下貼壁培養(yǎng)的Du-145、Hela和AGZY-83a細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加Myostatin lug/mL，以PBS為對照，然后在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)12h，觀察細(xì)胞的生長情況。
培養(yǎng)結(jié)束后上述細(xì)胞的生長情況如圖1所示(A.Du-145PBS組，B.Du-145Myostatin組，C.Hela PBS組，D.Hela Myostatin組，E.AGZY-83a PBS組，F(xiàn).AGZY-83aMyostatin組)，添加Myostatin后，貼壁的Du-145、Hela和AGZY-83a細(xì)胞逐漸皺縮、脫壁，而對照細(xì)胞正常生長，表明Myostatin對腫瘤細(xì)胞具有殺滅作用。
實(shí)施例2、檢測不同濃度Myostatin下腫瘤細(xì)胞的凋亡情況以人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、AGZY-83a和人肝癌細(xì)胞系HepG2為例檢測不同濃度Myostatin下腫瘤細(xì)胞的凋亡情況，實(shí)驗(yàn)方法為對在相同條件下貼壁培養(yǎng)的A549、AGZY-83a和HepG2細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合Annexin V-FITC/PI熒光染色的方法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后向培養(yǎng)液中添加不同濃度的Myostatin(對照、50、100、200、500、1000ng/mL)，再在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)12h，培養(yǎng)結(jié)束后用相同方法對凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞的比例，其中流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合Annexin V-FITC/PI熒光染色的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法包括以下步驟1)消化及收集細(xì)胞吸出培養(yǎng)液，由于死亡細(xì)胞已經(jīng)懸起，因此將培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)入離心管中(如吸出培養(yǎng)液體積較大，可用另一離心管保存。離心后同經(jīng)胰酶消化的細(xì)胞合并)；分別加0.2％(W/V)胰酶消化2-3min，吸出胰酶(如懸浮細(xì)胞可省)；添加新鮮含15％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco產(chǎn)品)，洗下細(xì)胞，轉(zhuǎn)入離心管(如懸浮細(xì)胞可省)；4℃、1000rpm用大離心機(jī)離心10分鐘；吸出培養(yǎng)液，再用冷無血清的培養(yǎng)液洗一次，轉(zhuǎn)入EP管；4℃、1000rpm用小離心機(jī)離心10分鐘。
2)Annexin V-FITC/PI熒光染色將經(jīng)步驟1)處理的細(xì)胞用結(jié)合緩沖液(10mmol/LHEPES/NaOH，pH7.4，140mmol/L NaCl，5mmol/L CaCl2)洗滌后再重懸于200μl結(jié)合緩沖液中；轉(zhuǎn)移入流式管(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)為雙樣品)，加入5μl Annexin V-FITC(購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司)，室溫下暗處放置10-15分鐘；補(bǔ)加300μl結(jié)合緩沖液(可根據(jù)細(xì)胞密度，酌量加減結(jié)合緩沖液的添加量)；上流式細(xì)胞儀測定前1分鐘加入5或10μl PI(購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司)，然后用流式細(xì)胞儀對凋亡細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(200-300細(xì)胞/秒)。
細(xì)胞凋亡比例的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2所示，表明Myostatin可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并呈現(xiàn)濃度依賴趨勢，隨Myostatin濃度升高，凋亡細(xì)胞的比例也逐漸增加。
實(shí)施例3、DAPI染色觀察經(jīng)Myostatin處理后凋亡細(xì)胞細(xì)胞核的形態(tài)將在相同條件下貼壁培養(yǎng)的AGZY-83a、HepG2、A549和Hela的培養(yǎng)液中添加Myostatin lug/mL，然后在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)12h，培養(yǎng)結(jié)束后用利用DAPI染色法觀察經(jīng)Myostatin處理后凋亡細(xì)胞細(xì)胞核的形態(tài)，染色方法如下先用與實(shí)施例2相同的方法用消化及收集細(xì)胞，然后對細(xì)胞進(jìn)行固定及DAPI染色用3.7％甲醛溶液懸浮細(xì)胞，冰上固定5分鐘后，4℃、3000rpm離心10分鐘；棄上清，將細(xì)胞沉淀用冷PBS洗滌，用0.2％(V/V)Triton在37℃下處理15分鐘；再用冷PBS洗滌，加入DAPI染色液(將DAPI溶解于磷酸鹽緩沖液中，工作濃度為lug/mL)，4℃、3000rpm離心10分鐘，棄上清；將細(xì)胞用封片劑懸起滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，用指甲油封片，干燥后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。
DAPI染色結(jié)果如圖3所示(A.AGZY-83a，B.HepG2，C.A549，D.Hela；箭頭指示的是凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核)，表明Myostatin誘導(dǎo)凋亡的腫瘤細(xì)胞具有典型凋亡細(xì)胞的核形態(tài)。
實(shí)施例4、用流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)Myostatin處理不同時(shí)間的Hela細(xì)胞的Caspase總活性變化情況Caspase激活是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志事件之一，現(xiàn)用下述方法檢測經(jīng)Myostatin處理不同時(shí)間的Hela細(xì)胞的Caspase活性的變化情況，具體方法為向貼壁培養(yǎng)的Hela的培養(yǎng)液中添加Myostatin lug/mL，然后分別培養(yǎng)12h、18h、24h、36h、48h，培養(yǎng)結(jié)束后用CaspACETMFITC-VAD-FMK In Situ Marker試劑盒(普洛麥格生物技術(shù)有限公司)及流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)Myostatin處理不同時(shí)間后具有Caspase活性的細(xì)胞所占的百分比。
經(jīng)Myostatin處理不同時(shí)間后具有Caspase激活細(xì)胞所占的百分比如圖4A所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果的柱狀圖如圖4B所示(Control為對照)，表明經(jīng)Myostatin處理后腫瘤細(xì)胞的Caspase總活性升高，具有凋亡細(xì)胞的特性，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴趨勢，隨Myostatin作用時(shí)間延長，具有Caspase活性的細(xì)胞比例也逐漸增加。
實(shí)施例5、Western blot檢測經(jīng)Myostatin處理不同時(shí)間的Hela細(xì)胞的Caspase3和Caspase9的激活情況研究表明，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)Caspase3和Caspase9將被激活，是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物之一，現(xiàn)用下述方法檢測經(jīng)Myostatin處理不同時(shí)間的Hela細(xì)胞的Caspase3和Caspase9的激活情況，具體方法如下一、Caspase3的激活情況向貼壁培養(yǎng)的Hela細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加Myostatin lug/mL，然后分別培養(yǎng)12h、18h、24h、36h、48h，培養(yǎng)結(jié)束后用Western blot檢測經(jīng)Myostatin處理不同時(shí)間的Hela細(xì)胞的Caspase3的激活情況，一抗為Cleaved Caspase-3(Asp175)Antibody(購自Cell Signaling公司)，二抗為山羊抗兔的抗體(購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。以β-actin為內(nèi)參(一抗購自Santa Cruz生物技術(shù)公司；二抗為兔抗山羊抗體，購自中山金橋生物技術(shù)有限公司)。
經(jīng)Myostatin處理24h、36h后的Western blot檢測結(jié)果如圖5A所示，表明Caspase3在用Myostatin處理24h、36h后的Hela細(xì)胞中被激活，進(jìn)一步證明Myostatin可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
二、Caspase9的激活情況用與步驟一相同的方法檢測經(jīng)Myostatin處理不同時(shí)間的Hela細(xì)胞的Caspase9的激活情況，一抗為特異性識別人的全長和切割形式的Caspase 9的抗體(Caspase 9Abtibody(human specific)購自Cell Signaling公司)，二抗為山羊抗兔的抗體(購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。以β-actin為內(nèi)參(一抗購自Santa Cruz生物技術(shù)公司；二抗為兔抗山羊抗體，購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。
經(jīng)Myostatin處理12h、18h、24h后的Western blot檢測結(jié)果如圖5B所示，表明Caspase9在用Myostatin處理24h后的Hela細(xì)胞中被激活，進(jìn)一步證明Myostatin可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
實(shí)施例6、檢測經(jīng)Myostatin處理后的A549和Hela細(xì)胞線粒體及胞漿中的細(xì)胞色素C研究表明，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)線粒體中的細(xì)胞色素C釋放到胞漿中，能夠啟動內(nèi)源性的凋亡途徑，并激活Caspase9。現(xiàn)用下述方法檢測經(jīng)Myostatin處理不同時(shí)間后的A549和Hela細(xì)胞線粒體中細(xì)胞色素C的釋放情況，具體方法如下一、A549細(xì)胞線粒體及胞漿中細(xì)胞色素C的免疫熒光檢測向貼壁培養(yǎng)的A549細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加Myostatin 1ug/mL，然后分別培養(yǎng)12h、18h、24h、36h、48h，培養(yǎng)結(jié)束后對A549細(xì)胞線粒體及胞漿中的細(xì)胞色素C(CytochromeC)進(jìn)行免疫熒光檢測，一抗為PURIFIED MOUSE ANTI-CYTOCHROME C MONOCLONALANTIBODY(購自BD公司)，二抗為FITC標(biāo)記的山羊抗兔抗體(購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。
經(jīng)Myostatin處理24h、36h后的A549細(xì)胞線粒體及胞漿中的細(xì)胞色素C免疫熒光檢測結(jié)果如圖6A所示(圖中A列為特異性標(biāo)記線粒體的Mitotracker-Red，B列為FITC標(biāo)記的細(xì)胞色素C，C列為細(xì)胞核的DAPI染色結(jié)果，D列為A和B疊加圖，E為A、B和C的疊加圖)，表明經(jīng)Myostatin處理后A549細(xì)胞線粒體中的細(xì)胞色素C被釋放到胞漿中，證明Myostatin可通過激活內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
二、Hela細(xì)胞線粒體及胞漿中細(xì)胞色素C的免疫熒光檢測用與步驟一相同的方法檢測經(jīng)Myostatin處理后Hela細(xì)胞線粒體及胞漿中的細(xì)胞色素C進(jìn)行免疫熒光檢測。
經(jīng)Myostatin處理24h后的A549細(xì)胞線粒體及胞漿中的細(xì)胞色素C免疫熒光檢測結(jié)果如圖6B所示(圖中A列為FITC標(biāo)記的細(xì)胞色素C，B列為特異性標(biāo)記線粒體的MitoTracker-Red，C列為A和B疊加圖，D列為細(xì)胞核的DAPI染色結(jié)果，E為A、B和D的疊加圖)，表明經(jīng)Myostatin處理后Hela細(xì)胞線粒體中的細(xì)胞色素C被釋放到胞漿中，證明Myostatin可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
三、Hela細(xì)胞線粒體及胞漿中細(xì)胞色素C的Western blot檢測用Western blot法對經(jīng)Myostatin處理后Hela細(xì)胞線粒體及胞漿中的細(xì)胞色素C進(jìn)行檢測，一抗為PURIFIED MOUSE ANTI-CYTOCHROME C MONOCLONAL ANTIBODY(購自BD公司)，二抗為山羊抗小鼠的抗體(購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。
經(jīng)Myostatin處理12h、18h、24h后的Western blot檢測結(jié)果如圖7所示，經(jīng)Myostatin處理24h后Hela細(xì)胞線粒體中的細(xì)胞色素C被釋放到胞漿中，從而進(jìn)一步證明Myostatin可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
實(shí)施例7、毒性試驗(yàn)1)一般毒性試驗(yàn)采用貓和大鼠試驗(yàn)?zāi)Ｐ?購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，用貓(24只，雌、雄各半，體重2.4-3.7Kg，分為4組，每組6只，用藥劑量分別為0.05、50、120mg/Kg)試驗(yàn)，觀察Myostatin對血壓、呼吸頻率、心率等影響；用鼠(40只，雌、雄各半，體重18-20g，分為4組，每組10只，用藥劑量分別為0.05、30、50mg/Kg)試驗(yàn)，觀察Myostatin對大鼠自主活動情況的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，三個(gè)劑量的Myostatin對貓的血壓、呼吸頻率與幅度、心率、心律均無明顯影響，對大鼠的自主活動次數(shù)也無明顯影響。
2)急性毒性試驗(yàn)采用小鼠試驗(yàn)?zāi)Ｐ?購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，昆明種小鼠(40只，分為空白對照組和Myostatin組，每組各20只)，一次最大灌胃口服給藥量10.63g/Kg，相當(dāng)于臨床擬用量(3.75mg/Kg)的2834倍，觀察28天，包括小鼠體重增減率、活動情況及死亡情況，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示表1Myostatin對小鼠的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，一次灌胃口服最大給藥量10.63g/Kg，相當(dāng)于臨床給藥量的2834倍，但試驗(yàn)動物均未發(fā)生急性毒性反應(yīng)，僅見雄性小鼠體重的增長率高于雌性小鼠，說明Myostatin的毒性很小。
3)長期毒性試驗(yàn)采用大鼠試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，SPF級Wistar大鼠(購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，176只，體重90-100g，分為空白對照組及Myostatin三個(gè)劑量組(93.75、187.5及375mg/Kg)，共四組，每組44只大鼠，空白對照組給予同劑量的生理鹽水，每日灌胃給藥一次，連服6個(gè)月，觀察指標(biāo)包括試驗(yàn)動物的一般生理指標(biāo)及外周血相、血液生化、肝功、腎功等主要臟器器官指數(shù)及組織病理學(xué)檢查檢查等的變化，試驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠口服不同劑量(93.75、187.5及375mg/Kg)的Myostatin，分別為臨床用藥量的25、50及100倍，連續(xù)給藥6個(gè)月，未見各項(xiàng)指標(biāo)異常，不同劑量組間也無明顯差異(p＞0.05)，說明長期服用Myostatin是安全的，無毒性的累積效應(yīng)。
權(quán)利要求
1.肌肉生長抑制素在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤為惡性腫瘤。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述惡性腫瘤包括前列腺癌，宮頸癌，肺腺癌和肝癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了肌肉生長抑制素在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)Myostatin處理的人前列腺癌、宮頸癌、肺腺癌和肝癌等腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的凋亡細(xì)胞特性1)具有Caspase活性的細(xì)胞的比例顯著升高；2)Caspase 3和Caspase 9被激活；3)細(xì)胞色素C由線粒體釋放到胞漿中。因而可以Myostatin為活性成分制備抗腫瘤藥物，該藥物具有以下優(yōu)點(diǎn)1)療效顯著；2)安全性高；3)主要用藥途徑為口服，用藥方便；4)Myostatin價(jià)格低廉，制備該藥物的成本較低，從而可減輕病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本發(fā)明為腫瘤的防治提供了一條新途徑，在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號A61P35/00GK1903359SQ20061008910
公開日2007年1月31日 申請日期2006年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月3日
發(fā)明者邊睿, 趙相軒, 劉泳, 朱大海, 陳佺 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所