專利名稱：替普瑞酮在制備預(yù)防和/或治療青光眼藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物的新用途，特別是涉及替普瑞酮(Geranylgeranylacetone，GGA)在制備青光眼預(yù)防和/(“/”表示或)或治療性藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
青光眼是一組由于絕對(duì)性或相對(duì)性眼壓升高所致的視神經(jīng)損傷性疾病。隨著感染性致盲眼病的有效控制，角膜移植、白內(nèi)障復(fù)明手術(shù)的廣泛開(kāi)展，青光眼已成為全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的不可逆致盲眼病(Foster PJ，Johnson GJ.Glaucoma in Chinahowbig is the problem？Br.J.Ophthalmol 2001；851277-82.)。
目前，針對(duì)青光眼眼壓升高的治療手段主要包括藥物、激光、手術(shù)等，且在臨床實(shí)踐中獲得了良好的療效。但是，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)即便青光眼患者的眼壓得到了良好的控制，仍有約40％的患者發(fā)生進(jìn)行性視功能損害(Caprioli J.Neuroprotection of theoptic nerve in glaucoma.Acta Ophthalmol Scand.1997；75364-67.)。
研究表明，青光眼視神經(jīng)損害是指由壓力或低血流灌注壓所致的缺血、缺氧等使視神經(jīng)纖維軸漿流中斷，導(dǎo)致靶源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的供給中斷直接受到損傷的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)死亡。同時(shí)由于產(chǎn)生較多的興奮性毒素，通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活了某些誘導(dǎo)凋亡基因，激發(fā)一系列級(jí)聯(lián)式反應(yīng)，最終導(dǎo)致DNA斷裂，引起損傷周圍原來(lái)完整的RGCs發(fā)生凋亡。因此，治療青光眼的關(guān)鍵是預(yù)防視神經(jīng)的損害和RGCs的凋亡。在控制眼壓的基礎(chǔ)上給予視神經(jīng)保護(hù)被認(rèn)為是青光眼理想的治療方式。
目前的策略主要集中在阻斷啟動(dòng)凋亡通路和補(bǔ)充抗凋亡因子方面。由于凋亡的啟動(dòng)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，存在眾多的已知通路和未知通路，所以單純阻斷任何一個(gè)通路或幾個(gè)通路并不能完全阻止青光眼患者由于多種因素引起的視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡。所以這一策略雖然在各種單一因素的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和體外實(shí)驗(yàn)取得了成功，但是在臨床應(yīng)用方面未能取得明顯的能有說(shuō)服力的效果。抗凋亡因子的補(bǔ)給治療措施包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子補(bǔ)給療法，應(yīng)用基因工程方法減弱凋亡基因，增強(qiáng)抗凋亡基因的策略在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得了一定的成功。但如何能長(zhǎng)期持續(xù)、安全的將這些因子供給視網(wǎng)膜和視神經(jīng)仍是一個(gè)未解決的問(wèn)題。然而，在青光眼視神經(jīng)病變的治療研究領(lǐng)域中目前存在著另外非常重要且被忽視了的問(wèn)題。青光眼所造成的視神經(jīng)損害不但包括視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞，也包括視網(wǎng)膜其它細(xì)胞，更為重要的問(wèn)題是視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的死亡最終會(huì)導(dǎo)致上位神經(jīng)元細(xì)胞代謝活性降低、萎縮，甚至凋亡等繼發(fā)損害，包括LGN(Lateral geniculate nucleus，外側(cè)膝狀體)，枕葉皮層神經(jīng)元(Gupta，Neeru MD，Yucel YH.Glaucoma and the Brain.Journal of Glaucoma 2001；Supplement 1S28-S29.)。有證據(jù)表明，減少營(yíng)養(yǎng)支持，誘導(dǎo)RGCs胞變性，可導(dǎo)致初級(jí)視皮質(zhì)和LGN的損傷(Dandona L，Hendrickson A，Quigley HA.Selective effects of experimental glaucoma on axonal transportby retinal ganglion cells to the dorsal lateral geniculate nucleus.InvestOphthalmol.Vis.Sci.1991；321593-99；Anderson DR，Hendrickson A.Effect ofintraocular pressure on rapid axoplasmic transport in monkey optic nerve.Invest Ophthalmol 1974；13771-83.)。可見(jiàn)，視神經(jīng)纖維損失后，LGN和視皮質(zhì)繼發(fā)性的神經(jīng)元損傷可直接導(dǎo)致青光眼的病情進(jìn)展，并加重存活的RGCs對(duì)進(jìn)行性傷害的易感性。
RGCs的死亡對(duì)靶神經(jīng)元的影響，損傷的靶神經(jīng)元對(duì)存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)的影響，這一相互的病理作用可加重業(yè)已存在的損傷，在青光眼的病情惡化中起重要作用，這提示我們應(yīng)該從整個(gè)視路的總體水平重新審視青光眼視功能傷的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，為臨床青光眼的防治提供新思路。因此，尋找一種能夠作用于整個(gè)視覺(jué)通路，啟動(dòng)其內(nèi)源性神經(jīng)元抗損傷，抗凋亡作用的新治療策略，成為青光眼視神經(jīng)病變治療研究的方向。
HSP又稱應(yīng)激蛋白，普遍存在于原核細(xì)胞及真核細(xì)胞中，在應(yīng)激狀態(tài)下，生物體細(xì)胞啟動(dòng)HSP基因，編碼合成的一類生物進(jìn)化上最保守的蛋白。根據(jù)其分子量、等電點(diǎn)不同，將HSP分為低分子量HSP家族、HSP60家族、HSP70家族、HSP90家族和HSP110家族等，每個(gè)家族又有多個(gè)成員組成(Gupta M，Vavasis C，F(xiàn)rishman WH.Heatshock proteins in cardiovascular disease a new therapeutic target.Cardiol.Rev.2004；1226-30.)。
大量實(shí)驗(yàn)研究表明，機(jī)體在熱應(yīng)激、缺氧、病原體、細(xì)胞因子及理化有害因素等刺激狀態(tài)下，機(jī)體細(xì)胞將大量合成HSPs。HSPs表達(dá)增高，可使細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下存活，并能促進(jìn)受損細(xì)胞自身的修復(fù)。目前認(rèn)為熱應(yīng)激狀態(tài)下HSPs細(xì)胞保護(hù)機(jī)制可與HSPs多種生物學(xué)功能有關(guān)，如幫助蛋白折疊、裝配、向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)易位及分解錯(cuò)裝的蛋白等“分子伴侶”功能、提高細(xì)胞耐熱能力及參與受體功能等。HSPs通過(guò)參與細(xì)胞骨架構(gòu)建而起到穩(wěn)定細(xì)胞的作用，應(yīng)激狀態(tài)下能夠維持細(xì)胞中間絲蛋白完整性，防止細(xì)胞蛋白的展開(kāi)，因此可以預(yù)防細(xì)胞凋亡的發(fā)生。另外，HSPs還可以通過(guò)參與凋亡途徑的多個(gè)層面，抑制凋亡的發(fā)生，例如(1)通過(guò)抑制凋亡前Bcl-2蛋白活化，阻止線粒體外膜的滲漏和致凋亡因子的釋放，從而阻斷線粒體依賴的內(nèi)源性凋亡的發(fā)生。
(2)阻斷由死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑。(3)通過(guò)抑制caspase的活性和對(duì)凋亡的誘導(dǎo)作用，阻斷凋亡小體的形成。(4)調(diào)控參與調(diào)節(jié)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵成分的一些信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，包括JNK，NF-κB和AKT等(Rokutan K.Role of heatshock proteins in gastric mucosal protection.J.Gastroenterol.Hepatol.2000；15 SupplD12-D19.)。在眾多HSP家族成員中研究最多的是HSP70家族(ParkKH，Cozier F，Ong OC，Caprioli J.Induction of heat shock protein 72protectsretinal ganglion cells in a rat glaucoma model.Invest Ophthalmol.Vis.Sci.2001；421522-30.)。
1988年，Barber等報(bào)道熱刺激時(shí)視網(wǎng)膜內(nèi)可觀察到HSP的表達(dá)，使感受器免受光線的損傷，并首次提出了HSPs的神經(jīng)保護(hù)作用(Barbe MF，Tytell M，Gower DJ，Welch WJ.Hyperthermia protects against light damage in the rat retina.Science1988；2411817-20.)。隨后人們進(jìn)行了大量的相關(guān)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)HSP70表達(dá)增加或整合了含有HSP70基因的大鼠神經(jīng)元對(duì)缺血和損傷顯示出更高的耐受性(Kelly S，Yenari MA.Neuroprotectionheat shock proteins.Curr.Med.Res Opin.2002；18Suppl 2s55-s60.)。對(duì)培養(yǎng)大鼠RGC進(jìn)行熱(42℃)處理及亞致死劑量低氧處理后，發(fā)現(xiàn)二者均可誘導(dǎo)HSP72的合成，且GRC的存活率遠(yuǎn)高于正常對(duì)照組，提示高溫及亞致死劑量低氧可能是通過(guò)誘導(dǎo)的內(nèi)源性HSP產(chǎn)生提高了RGC對(duì)缺氧及興奮毒素的耐受性，從而對(duì)RGC起到保護(hù)作用，使之免于死亡(Caprioli J，Kitano S，Morgan JE.Hyperthermia and hypoxia increase tolerance of retinal ganglioncells to anoxia and excitotoxicity.Invest Ophthalmol.Vis.Sci.1996；372376-81.)。2001年，Park等應(yīng)用大鼠青光眼模型，發(fā)現(xiàn)通過(guò)熱應(yīng)激和Zn劑可誘導(dǎo)內(nèi)源性HSP70的生成，通過(guò)熱應(yīng)激和Zn劑預(yù)誘導(dǎo)HSP72在視網(wǎng)膜的表達(dá)可顯著提高高眼壓狀態(tài)下RGCs的存活率(Park KH，Coz ier F，Ong OC，Caprioli J.Induction of heat shock protein 72 protects retinal ganglion cells in a ratglaucoma model.Invest Ophthalmol.Vis.Sci.2001；421522-30.)。由此可以看出，通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)源性HSP可能會(huì)達(dá)到防治青光眼性視神經(jīng)病變的目的。
但是無(wú)論是采用提高機(jī)體體溫還是造成亞致死劑量缺氧狀態(tài)以誘發(fā)這一保護(hù)性蛋白產(chǎn)生的手段均不適用于人類，也有人提出經(jīng)瞳孔采用激光溫?zé)岽碳ふT導(dǎo)視網(wǎng)膜生產(chǎn)上述保護(hù)性蛋白的策略(Mainster MA，Reichel E.Transpupi llary thermotherapyfor age-related macular degenerationlong-pulse photocoagulation，apoptosis，and heat shock proteins.Ophthalmic Surg.Lasers 2000；31359-73.)，但是，這一方法只能誘導(dǎo)視網(wǎng)膜局部這類保護(hù)性蛋白的產(chǎn)生，對(duì)整個(gè)視覺(jué)通路神經(jīng)元的保護(hù)未起到作用。
LGN中包含中繼神經(jīng)元和中間神經(jīng)元兩大類神經(jīng)元。中繼神經(jīng)元的軸突投射至初級(jí)視皮質(zhì)，中間神經(jīng)元的軸突局限在LGN之中。一個(gè)中繼LGN神經(jīng)元可以接受多個(gè)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的輸入，也通過(guò)中間神經(jīng)元接受鄰近神經(jīng)元的影響。微清白蛋白是標(biāo)記中繼神經(jīng)元的特異性標(biāo)記蛋白，可選擇性地標(biāo)記傳遞視覺(jué)信息至視皮質(zhì)的中繼神經(jīng)元。微清白蛋白是一種具有水溶性的鈣結(jié)合蛋白，酸性，分子量大約為12kD。
替普瑞酮(Geranylgeranylacetone，GGA)是一種非環(huán)狀類異戊二烯復(fù)合物，現(xiàn)已被廣泛用于消化道潰瘍的治療中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供替普瑞酮(Geranylgeranylacetone，GGA)的新用途，即在制備預(yù)防和/或治療青光眼藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的應(yīng)用是以GGA為活性成分在制備預(yù)防和/或治療青光眼藥物中的應(yīng)用。
需要的時(shí)候，在本發(fā)明所述應(yīng)用中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料，所述輔料包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑、穩(wěn)定劑等，必要時(shí)還可加入香味劑、甜味劑及色素等。
本發(fā)明所述應(yīng)用除制成膠囊外，還可以制成片劑、粉劑、粒劑、口服液、注射液、等多種藥物形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
該藥物的成人口服用量一般為50mg/次，3次/天。
本發(fā)明提供了一種GGA的新用途，即在制備預(yù)防和/或治療青光眼藥物中的應(yīng)用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)口服GGA后6小時(shí)即可見(jiàn)大鼠LGN部位HSP 70表達(dá)升高，24小時(shí)時(shí)達(dá)高峰，48小時(shí)時(shí)明顯降低。HSP70的表達(dá)量隨著給予GGA劑量的增加而增加，以400mg/kg和800mg/kg兩組最顯著。GGA誘導(dǎo)大鼠LGN部位HSP 70表達(dá)升高的最佳給藥劑量為400mg/kg/d。(2)視神經(jīng)切斷加GGA治療組和視神經(jīng)切斷加熱休克處理組雙側(cè)dLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和面積較視神經(jīng)切斷組、視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組顯著增高。(3)視神經(jīng)切斷加GGA治療組和視神經(jīng)切斷加熱休克處理組雙側(cè)vLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和面積較視神經(jīng)切斷組、視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組顯著增高，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。(4)視神經(jīng)切斷加GGA治療組和視神經(jīng)切斷加熱休克處理組雙側(cè)LGN中的CCX活性較視神經(jīng)切斷組、視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組顯著增高，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。(5)口服GGA或視熱休克處理后24小時(shí)可見(jiàn)視網(wǎng)膜HSP70表達(dá)顯著升高。(6)視神經(jīng)切斷加GGA治療組和視神經(jīng)切斷加熱休克處理組RGCs胞數(shù)量較視神經(jīng)切斷組、視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組顯著增高，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。(7)視神經(jīng)切斷加GGA治療組和視神經(jīng)切斷加熱休克處理組RGCs胞凋亡數(shù)量較視神經(jīng)切斷組、視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組顯著減少，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明口服GGA可有效誘導(dǎo)外側(cè)膝狀體和視網(wǎng)膜中HSP70表達(dá)，并對(duì)大鼠視神經(jīng)切斷后LGN神經(jīng)元和RGCs胞具有保護(hù)作用，因此可以GGA為活性成分制備成預(yù)防和/或治療青光眼的藥物。與目前臨床上常用的青光眼治療性藥物相比，本發(fā)明的藥物具有以下優(yōu)點(diǎn)1)療效明顯，總有效率可達(dá)92.5％以上；2)安全性高；3)主要用藥途徑為口服，用藥方便；4)GGA價(jià)格低廉，制備該藥物的成本較低，從而可減輕病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本發(fā)明不僅為青光眼的防治提供一條新的途徑，也對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病及進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病的治療及研究具有借鑒作用，在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為BCA法測(cè)蛋白定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2為口服賦形劑、GGA和熱休克處理后大鼠LGN部位HSP70表達(dá)時(shí)間效應(yīng)的蛋白印跡及半定量分析結(jié)果圖3為口服GGA后大鼠LGN部位HSP70表達(dá)劑量效應(yīng)的蛋白印跡及半定量分析結(jié)果圖4為口服賦形劑、GGA或熱休克處理后大鼠LGN部位HSP70分布情況的免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果圖5為正常及視神經(jīng)切斷后大鼠眼底圖6為大鼠雙側(cè)dLGN部位PV陽(yáng)性細(xì)胞分布情況的免疫組化染色結(jié)果圖7為大鼠雙側(cè)vLGN部位PV陽(yáng)性細(xì)胞分布情況的免疫組化染色結(jié)果圖8為大鼠外側(cè)膝狀體位置示意9A為手術(shù)同側(cè)dLGN中PV陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量的定量分析結(jié)果圖9B為手術(shù)同側(cè)dLGN中PV陽(yáng)性細(xì)胞面積的定量分析結(jié)果圖10A為手術(shù)對(duì)側(cè)dLGN中PV陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量的定量分析結(jié)果圖10B為手術(shù)對(duì)側(cè)dLGN中PV陽(yáng)性細(xì)胞面積的定量分析結(jié)果圖11A為手術(shù)同側(cè)vLGN中PV陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量的定量分析結(jié)果圖11B為手術(shù)同側(cè)vLGN中PV陽(yáng)性細(xì)胞面積的定量分析結(jié)果圖12A為手術(shù)對(duì)側(cè)vLGN中PV陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量的定量分析結(jié)果圖12B為手術(shù)對(duì)側(cè)vLGN中PV陽(yáng)性細(xì)胞面積的定量分析結(jié)果圖13為線粒體蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖14A為大鼠手術(shù)同側(cè)LGN線粒體CCX表達(dá)水平圖14B為大鼠手術(shù)對(duì)側(cè)LGN線粒體CCX表達(dá)水平圖15為口服GGA后大鼠視網(wǎng)膜HSP70表達(dá)水平的蛋白印跡及半定量分析結(jié)果圖16A為大鼠視神經(jīng)切斷后RGCs的FG逆行標(biāo)記結(jié)果圖16B為大鼠視神經(jīng)切斷后RGCs計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果圖17A為大鼠視神經(jīng)切斷后用dUTP缺口末段標(biāo)記法檢測(cè)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡情況圖17B為大鼠視神經(jīng)切斷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，體重200-250g，購(gòu)自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證編號(hào)為SCXK(京)2002-0003。12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗條件下飼養(yǎng)。
GGA購(gòu)自日本衛(wèi)材株式會(huì)社。
實(shí)施例1、檢測(cè)口服GGA對(duì)大鼠外側(cè)膝狀體部位HSP70表達(dá)的影響一、蛋白印跡檢測(cè)口服GGA對(duì)大鼠外側(cè)膝狀體(Lateral geniculate nucleus，LGN)部位HSP70表達(dá)的影響1、蛋白印跡檢測(cè)口服賦形劑、GGA和熱休克處理后大鼠LGN部位HSP70表達(dá)的時(shí)間曲線將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為2組N組(正常對(duì)照組，n＝6)和T組(處理組)；T組又分為VT組(賦形劑給藥組)、GT組(GGA給藥組)和HT組(熱休克處理組)。給藥方法為將GGA(400mg/kg)或賦形劑(含5％乳糖和0.008％維生素E)溶于5mL/kg生理鹽水后灌胃，正常對(duì)照組用生理鹽水灌胃(5mL/kg)。熱休克處理方法為水合氯醛(40mg/100g體重)腹腔麻醉，5分鐘后將大鼠置于20×15×8(cm)的無(wú)蓋鋁制飯盒中，然后將裝有大鼠的飯盒放在42℃水浴箱中，測(cè)量大鼠直腸溫度達(dá)到40-42℃時(shí)計(jì)時(shí)15min取出，常溫下待大鼠清醒。
分別對(duì)大鼠進(jìn)行上述處理，于處理后6h、12h、24h、48h(各時(shí)間點(diǎn)n＝6)迅速斷頭處死，取腦，分離雙側(cè)LGN核，液氮內(nèi)凍存，用蛋白印跡檢測(cè)口服賦形劑、GGA和熱休克處理后大鼠LGN部位HSP70表達(dá)的時(shí)間曲線。蛋白印跡檢測(cè)方法包括以下步驟(1)全細(xì)胞蛋白的提取將上述凍存的大鼠LGN組織轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中，按每mg組織10μl的比例加入全細(xì)胞裂解液(50mM Tris·Cl(pH 7.5)，150mM NaCl，5mM EDTA，5mM EGTA，1％SDS)，用手持式勻漿器勻漿，超聲破碎，使組織細(xì)胞完全溶解，制備成蛋白含量為5g/L的電泳樣品，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)BCA法蛋白定量采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，反應(yīng)基本原理為在37℃、堿性環(huán)境條件下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的肽鍵與Cu2+形成一價(jià)銅離子的四聚體，一價(jià)銅離子又與雙金雞寧酸(BCA)形成一紫色復(fù)合物，此復(fù)合物在波長(zhǎng)562nm處有最大吸收波峰。具體方法為取eppendorf管17個(gè)，按表1進(jìn)行編號(hào)和配液。配好后，置于37℃水浴箱中溫浴30分鐘，利用BCA蛋白分析試劑盒(Pierce公司)和紫外分光光度計(jì)內(nèi)蛋白定量程序，用于測(cè)定總蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。
表1全細(xì)胞總蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線液體配制


(3)SDS-PAGE取10μl(50μg蛋白)蛋白電泳樣品與蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品共同進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳分析，電泳條件4℃，電流20-30mA。電泳結(jié)束后將蛋白從SDS-PAGE凝膠上轉(zhuǎn)移至NC膜，轉(zhuǎn)膜條件孔徑為0.22μm的NC(Nitrocellulose filter，硝酸纖維素膜，Bio-Rad公司)、4℃，電流400mA，時(shí)間3小時(shí)。
(4)Western-blot對(duì)轉(zhuǎn)移至NC膜的蛋白進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，具體方法包括以下步驟①將NC膜取出，于TBS緩沖液(20mM Tris，0.5M NaCl，pH7.5)中漂洗5分鐘。
②用10％脫脂牛奶封閉液(稱取10g脫脂奶粉，溶于80mLTTBS(pH7.5)中，攪拌完全溶解，后加入TTBS定容至100mL，再加入10μl乙基汞硫代水楊酸鈉(Thimerosal，美國(guó)Sigma公司)，混勻)封閉膜1小時(shí)，回收封閉液，以重復(fù)使用。
③用蒸餾水沖洗膜3遍后，再用TTBS液(20mM Tris，0.5M NaCl，0.05％Tween-20，pH7.5)漂洗膜三次，每次10分鐘。將HSP 70單克隆小鼠抗體(加拿大Stressgen公司)按1∶1000比例稀釋于20mL TTBS中，并加入0.01％Thimerosal。
④將漂洗后的NC膜放入上述抗體稀釋液中，室溫下孵育3小時(shí)后，回收抗體，4℃環(huán)境中保存，以備重復(fù)應(yīng)用。
⑤用蒸餾水沖洗膜數(shù)遍后，用TTBS液洗膜三次，每次10分鐘。將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(吉泰生物科技公司)按1∶5000比例稀釋于20mL TTBS液中，在雜交盒內(nèi)孵育膜1小時(shí)。
⑥棄二抗溶液，用蒸餾水沖洗膜5遍，再次用TTBS液洗膜，共3次，每次10分鐘。(注以上所有過(guò)程皆在搖床上進(jìn)行)⑦用Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate試劑盒并按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行下述操作取發(fā)光劑和增強(qiáng)劑各1mL，按1∶1比例混和，倒入盛有NC膜的雜交盒內(nèi)，用手輕輕搖動(dòng)雜交盒，使發(fā)光劑及氧化劑混和均勻并與膜表面充分接觸。
⑧5分鐘后，取出膜，用保鮮膜包裹，排凈氣泡，將NC膜貼在暗盒上，進(jìn)入暗室曝光。
⑨取一張X-光片，將感光面對(duì)準(zhǔn)NC膜，放在膜的正上方，合上暗盒，開(kāi)始計(jì)時(shí)，1分鐘后取出X-光片，立即投入顯影液中，顯影5分鐘，用水漂洗X-光片數(shù)次，然后把X-光片轉(zhuǎn)移入定影液中定影10-20分鐘。曝光完畢即可得到有清晰HSP70條帶的X-光片，流水沖洗5分鐘，懸掛晾干。
蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2中的圖A(N正常對(duì)照組，VT賦形劑處理組，GTGGA處理組，HT熱休克處理組)，口服GGA后6小時(shí)即可見(jiàn)大鼠LGN部位HSP70的表達(dá)量升高，24h時(shí)達(dá)高峰，48h時(shí)明顯降低；熱休克處理后12h時(shí)可見(jiàn)大鼠LGN部位HSP70明顯表達(dá)，24和48h時(shí)表達(dá)量下降，但仍顯著高于正常水平；對(duì)照組和賦形劑給藥組的LGN部位未見(jiàn)HSP70表達(dá)量改變。
對(duì)上述蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用Gel-Doc凝膠成像系統(tǒng)中的Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，得出X-光片上HSP70條帶的密度值，以正常對(duì)照組的蛋白表達(dá)量為1，以與對(duì)照組HSP70條帶的密度值的比值表示各實(shí)驗(yàn)組HSP70蛋白表達(dá)量；以β-actin為內(nèi)參的蛋白印跡結(jié)果先測(cè)出X-光片上HSP70和相應(yīng)的β-actin條帶的密度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算出各組HSP70表達(dá)量(HSP 70條帶的密度值/相應(yīng)的β-actin條帶的密度值)，然后再以正常對(duì)照組的蛋白表達(dá)量為1，以與對(duì)照組HSP70條帶的密度值的比值表示各實(shí)驗(yàn)組HSP70蛋白表達(dá)量。將試驗(yàn)數(shù)據(jù)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(SPSS11.5軟件)，組間比較應(yīng)用q檢驗(yàn)，結(jié)果以x±s表示，p＜0.05為差異有顯著性意義。HSP70蛋白表達(dá)量見(jiàn)圖2中的圖B，與N(正常對(duì)照組1)相比VT(賦形劑處理組)、GT(GGA處理組)和HT(熱休克處理組)在處理后6h、12h、24h、48h時(shí)大鼠LGN部位HSP70的蛋白表達(dá)量分別為賦形劑組(1.13±0.10)、(1.01±0.24)、(0.98±0.14)、(1.05±0.23)；GGA組(4.19±0.39)*、(7.24±0.40)*、(17.28±0.32)*、(2.53±0.37)*；熱處理組(0.99±0.05)、(15.01±0.52)*、(11.18±0.47)*、(9.12±0.48)*(*p＜0.01)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GGA可誘導(dǎo)HSP70在LGN部位表達(dá)，使得通過(guò)安全、簡(jiǎn)便的方式誘導(dǎo)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制進(jìn)行中樞保護(hù)成為可能。HSP70在GGA用藥后24小時(shí)達(dá)高峰，48小時(shí)時(shí)明顯降低。
2、GGA誘導(dǎo)大鼠LGN部位HSP70表達(dá)的劑量曲線檢測(cè)用GGA誘導(dǎo)大鼠LGN部位HSP70表達(dá)的劑量曲線，具體方法為將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為0(對(duì)照)、100、200、400、800(單位mg/kg)GGA劑量組(各劑量組n＝6)，全部大鼠于給藥(給藥方法見(jiàn)步驟1)后24小時(shí)迅速斷頭處死，取腦，分離雙側(cè)LGN核，液氮內(nèi)凍存，用于蛋白印跡檢測(cè)，檢測(cè)方法及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法與步驟1相同，其中，蛋白印跡檢測(cè)時(shí)以一抗以β-actin單克隆小鼠抗體為量參，即將用于檢測(cè)GGA誘導(dǎo)HSP70表達(dá)的劑量曲線的膜置于剝脫液(62.5mM Tris·Cl(pH 6.7)，100mM2-巰基乙醇，2％SDS)中55℃孵育30-60min后，重新與β-actin單克隆小鼠抗體(1∶1000)進(jìn)行雜交反應(yīng)，其余步驟相同。
蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3中的圖A，HSP70的表達(dá)量隨著給予GGA劑量的增加而增加，以400mg/kg和800mg/kg兩組最顯著。
半定量及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)圖3中的圖B，與對(duì)照組相比，不同劑量GGA誘導(dǎo)大鼠LGN部位HSP70蛋白的表達(dá)量為(4.19±0.39)*、(11.33±0.52)*、(17.20±0.45)*、(17.00±0.14)*(*p＜0.01)。100或200mg/kg和400或800mg/kg之間分別比較差異有顯著性意義(#p＜0.01)，400mg/kg和800mg/kg劑量組之間HSP70的表達(dá)差異無(wú)顯著性意義。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GGA可誘導(dǎo)HSP70在LGN部位表達(dá)，400mg/kg和800mg/kg GGA劑量組誘導(dǎo)HSP70的量顯著高于其它組，但兩組之間無(wú)顯著性差異。另外，根據(jù)人治療胃潰瘍的標(biāo)準(zhǔn)劑量按體面積換算出大鼠的用量為396.25mg/kg，極其接近400mg/kg，因此將400mg/kg/d作為優(yōu)選的GGA給藥劑量。
二、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)口服賦形劑、GGA或熱休克處理后大鼠LGN部位HSP70的分部情況免疫組織化學(xué)法檢測(cè)口服賦形劑、GGA或熱休克處理后大鼠LGN部位HSP70的分部情況。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為2組N組(正常對(duì)照組，n＝6)和T組(處理組)；T組又分為VT組(賦形劑給藥組)、GT組(GGA給藥組，400mg/kg)和HT組(熱休克處理組)。給藥及熱休克處理方法與步驟一相同。與上述處理后24小時(shí)時(shí)深度麻醉大鼠，左心室升主動(dòng)脈插管，快速灌注生理鹽水，右心耳剪開(kāi)放血，待流出液體清亮后，再灌注4％多聚甲醛固定液(稱取40g多聚甲醛，置于三角燒瓶中，加入500-800mL 0.1mol/L PBS(NaCl 0.8g，KCl 0.2g，KH2PO40.24g，Na2HPO41.44g，依次溶于900mL蒸餾水中，溶解后，將pH值調(diào)至7.5，后加水至1000mL)，加熱至60℃左右，持續(xù)攪拌(或磁力攪拌)使粉末完全溶解，通常需滴加少許1mol/L NaOH才能使溶液清亮，最后補(bǔ)足0.1mol/L的PBS于1000mL，充分混勻)300mL，取整腦，制備上丘和LGN位置的石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，包括以下步驟(1)60℃烤箱中烤片2小時(shí)后將切片放入二甲苯中脫臘2次，每次15分鐘。
(2)用100％、95％、85％、75％梯度酒精脫苯。各級(jí)為2-5分鐘。蒸餾水沖洗2次，每次5分鐘。
(3)用3％H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，15分鐘，避光。蒸餾水沖洗，0.1M PBS(pH7.5)洗5分鐘(4)將玻片置于盛有PBS的玻片盒中，微波修復(fù)(95℃，5分鐘)，自然冷卻至室溫。10％正常山羊血清室溫封閉15min，傾去血清，勿洗。
(5)HSP 70單克隆小鼠抗體(1∶100)濕盒中4℃過(guò)夜，用PBS代替一抗孵育的切片作陰性對(duì)照。
(6)次日，PBS洗切片，3×5分鐘。滴加生物素化的抗小鼠的IgG(購(gòu)自吉泰生物科技公司)工作液，室溫孵育1小時(shí)。PBS洗切片3次，每次5分鐘。
(7)滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液(購(gòu)自自吉泰生物科技公司)，室溫孵育30分鐘。PBS洗切片3次，每次5分鐘。
(8)用新配制的DAB(DAB 6g，PBS 10mL，30％H2O210mL，充分混勻)，光鏡下顯色。用自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。
(9)100％、95％、85％、75％梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠(北京市北郊化工廠)封片，顯微鏡下觀察并照相。
免疫組織化學(xué)染色結(jié)果如圖4所示(正常對(duì)照組(A)，賦形劑處理組(B)，GGA處理組(C)，熱休克處理組(D)，標(biāo)尺＝20μm)，正常對(duì)照組和賦形劑處理組未見(jiàn)明顯HSP70陽(yáng)性細(xì)胞，給予GAA 400mg/kg或熱休克處理24小時(shí)后，在大鼠LGN組織切片可見(jiàn)散在分布的棕黃色HSP70陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞(箭頭所示)，進(jìn)一步證明GGA可誘導(dǎo)HSP70在LGN部位表達(dá)。
實(shí)施例2、檢測(cè)口服GGA對(duì)視神經(jīng)切斷后大鼠外側(cè)膝狀體的影響實(shí)施1中的實(shí)驗(yàn)證明口服GGA可誘導(dǎo)HSP70在LGN部位表達(dá)，但GGA誘導(dǎo)HSP70上調(diào)是否對(duì)視神經(jīng)切斷模型的LGN具有神經(jīng)保護(hù)作用仍不明確，用微清白蛋白(Parvalbumin，PV)選擇性地標(biāo)記中繼神經(jīng)元(Yucel YH，Zhang Q，Gupta N，Kaufman PL，Weinreb RN.Loss of neurons in magnocellular and parvocellular layers of the lateralgeniculate nucleus in glaucoma.Arch.Ophthalmol 2000；118378-84.)，通過(guò)檢測(cè)PV陽(yáng)性細(xì)胞的分布情況及其數(shù)量和面積，并測(cè)定標(biāo)志神經(jīng)元內(nèi)源代謝水平的線粒體細(xì)胞色素氧化酶(CCX)(Wong-Riley MT.Cytochrome oxidasean endogenousmetabolic marker for neuronal activity.Trends Neurosci.1989；1294-101.)的活性，檢測(cè)GGA對(duì)視神經(jīng)橫斷后LGN神經(jīng)元的影響，具體實(shí)驗(yàn)如下一、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠外側(cè)膝狀體PV的分部情況隨機(jī)將大鼠分為N(正常對(duì)照組)、T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)、T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組，400mg/kg/d)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)，各組n＝12。于術(shù)前24小時(shí)給藥，手術(shù)后每天一次，持續(xù)28天；熱休克處理組于術(shù)前24小時(shí)一次，手術(shù)后每隔一周一次，持續(xù)28天，給藥及熱休克處理方法與實(shí)施例1相同，視神經(jīng)切斷方法如下(Clarke DB，Bray GM，Aguayo AJ.Prolonged administration of NT-4/5fails to rescue most axotomized retinalganglion cells in adult rats.Vision Res.1998；381517-24.)①用水合氯醛(40mg/100g體重)腹腔麻醉大鼠，消毒鋪巾；②沿左眼上眶緣剪開(kāi)皮膚，鈍性分離軟組織至淚腺，將淚腺大部分剪除，繼續(xù)分離至上直肌，斷上直肌后，鈍性向后分離，暴露視神經(jīng)起始部及視神經(jīng)；③縱行挑開(kāi)視神經(jīng)外膜，在距離視神經(jīng)起始部約1mm的位置完全剪斷視神經(jīng)，整個(gè)過(guò)程要避免損傷位于視神經(jīng)下方的視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈；④眼球復(fù)位，縫合創(chuàng)口，用蓋玻片壓平角膜觀察眼底血供。涂抗生素眼膏，手術(shù)完畢。檢查術(shù)后大鼠眼底，見(jiàn)圖5(A正常眼底，B視神經(jīng)切斷后眼底)，將存在持續(xù)性視網(wǎng)膜缺血的大鼠剔除。
大鼠于上述處理后28天時(shí)，深度麻醉，各組分別取6只大鼠，左心室升主動(dòng)脈插管，快速灌注生理鹽水，右心耳剪開(kāi)放血，待流出液體清亮后，再灌注4％多聚甲醛固定液300mL，取整腦放入4％多聚甲醛固定液中4℃固定12-24小時(shí)，石蠟包埋，在LGN處每間隔約200um，作厚度為7um的連續(xù)切片，共6張，用于免疫組化分析。大鼠的LGN主要分為dLGN(Dorsal lateral geniculate nucleus，外側(cè)膝狀體背側(cè)核)、vLGN(Ventral lateral geniculate nucleus，外側(cè)膝狀體背側(cè)核)和IGL(Intergeniculate leaf，中間層)三部分，位置示意圖見(jiàn)圖8(Paxinos G，WatsonC.The rat brain in stereotaxic coordinates，Academic，San Diego，Ca，1986)?，F(xiàn)用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)上述不同處理組大鼠外側(cè)膝狀體PV在dLGN、vLGN和IGL分部情況，一抗為PV單克隆小鼠抗體(按1∶200比例稀釋，美國(guó)AffinityBioReagents公司)，二抗為生物素化的抗小鼠的IgG(購(gòu)自吉泰生物科技公司)工作液，三抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液(購(gòu)自自吉泰生物科技公司)，具體步驟參見(jiàn)實(shí)施例1，以0.1mol/L PBS代替一抗孵育液，用相同方法制備的切片作為陰性對(duì)照。
免疫組化染色結(jié)果表明PV細(xì)胞主要分布于LGN的dLGN和vLGN中，PV陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)染色呈深棕色，胞體形態(tài)不一，胞核淡染，部分細(xì)胞突起明顯，大鼠雙側(cè)dLGN和vLGN部位的PV陽(yáng)性細(xì)胞的分布情況如圖6、圖7所示(手術(shù)同側(cè)A、C、E、G、I；手術(shù)對(duì)側(cè)B、D、F、H、J。A-B正常對(duì)照組；C-D視神經(jīng)切斷組；E-F視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組；G-H視神經(jīng)切斷加GGA治療組；I-J視神經(jīng)切斷加熱休克處理組。標(biāo)尺＝10μm)，兩者相比較，vLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較多。
二、dLGN、vLGN手術(shù)同側(cè)及對(duì)側(cè)的PV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及其面積分析步驟一的免疫組化染色結(jié)果表明dLGN和vLGN兩部位中PV陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)數(shù)量差異很大，故分別進(jìn)行數(shù)據(jù)處理在高倍鏡下對(duì)定位在dLGN、vLGN手術(shù)同側(cè)及對(duì)側(cè)的PV陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算出每mm2細(xì)胞數(shù)，并應(yīng)用Leica Qwin圖像分析軟件進(jìn)行LGN細(xì)胞面積測(cè)量，求得平均神經(jīng)元大小。同時(shí)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(SPSS11.5軟件)，組間比較應(yīng)用q檢驗(yàn)，結(jié)果以x±s表示，p＜0.05為差異有顯著性意義。
其中，手術(shù)同側(cè)dLGN中PV陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量的定量分析結(jié)果見(jiàn)圖9A所示(#p＜0.01)，N(正常對(duì)照組)、T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)手術(shù)同側(cè)dLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)依次為(55.24±3.32/mm2)、(44.33±3.83/mm2)*、(43.33±.27/mm2)*、(51.33±3.26/mm2)**、(50.83±2.86/mm2)**(與對(duì)照組相比*p＜0.01，**p＜0.05)，T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)和T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)同側(cè)dLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較T(視神經(jīng)切斷組)和T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)顯著增高，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。手術(shù)同側(cè)dLGN中PV陽(yáng)性細(xì)胞面積的定量分析結(jié)果見(jiàn)圖9B所示(#p＜0.01)，N、T、T+V、T+G和T+H組手術(shù)同側(cè)dLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞面積依次為(180.437±38.93/μm2)、(140.582±17.924/μm2)*、(141.439±13.381/μm2)*、(161.282±21.257/μm2)**、(160.830±25.269/μm2)**(與對(duì)照組相比*p＜0.01，**p＜0.05)，T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)同側(cè)dLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞面積較T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)顯著增高，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。
手術(shù)對(duì)側(cè)dLGN中PV陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量的定量分析結(jié)果見(jiàn)圖10A所示(#p＜0.01)，N、T、T+V、T+G和T+H組手術(shù)對(duì)側(cè)dLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)依次為(55.24±3.32/mm2)、(40.666±2.50/mm2)*、(41±2.607/mm2)*、(49.16±4.91/mm2)*、(48.5±3.209/mm2)*(與對(duì)照組相比*p＜0.01)，T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)對(duì)側(cè)dLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)顯著增高，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。手術(shù)對(duì)側(cè)dLGN中PV陽(yáng)性細(xì)胞面積的定量分析結(jié)果見(jiàn)圖10B所示(#p＜0.01)，N、T、T+V、T+G和T+H組手術(shù)對(duì)側(cè)dLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞面積依次為(180.437±38.93/μm2)、(134.54±17.150/μm2)*、(134.112±11.203/μm2)*、(160.837±24.711/μm2)*、(158.112±21.198/μm2)*(與對(duì)照組相比*p＜0.01)，T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)對(duì)側(cè)dLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞面積較T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)顯著增高，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。
手術(shù)同側(cè)vLGN中PV陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量的定量分析結(jié)果見(jiàn)圖11A所示(#p＜0.01)，N、T、T+V、T+G和T+H組手術(shù)同側(cè)vLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)依次為(325.16±6.79/mm2)、(302±9.89/mm2)*、(303.83±11.44/mm2)*、(314.66±8.59/mm2)**、(314.33±5.16/mm2)**(與對(duì)照組相比*p＜0.01；**p＜0.05)，T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)同側(cè)vLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)顯著增高，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。手術(shù)同側(cè)vLGN中PV陽(yáng)性細(xì)胞面積的定量分析結(jié)果見(jiàn)圖11B所示(#p＜0.01)，N、T、T+V、T+G和T+H組手術(shù)同側(cè)vLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞面積依次為(192.997±46.851/μm2)、(151.160±18.627/μm2)*、(151.010±16.682/μm2)*、(173.375±18.035/μm2)、(172.082±24.805/μm2)**(與對(duì)照組相比*p＜0.01；**p＜0.05)，T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)對(duì)側(cè)dLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞面積較T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)顯著增高，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。
手術(shù)對(duì)側(cè)vLGN中PV陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量的定量分析結(jié)果見(jiàn)圖12A所示(#p＜0.01)，N、T、T+V、T+G和T+H組手術(shù)對(duì)側(cè)vLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)依次為(325.16±6.79/mm2)、(302.66±9.309/mm2)*、(303±11.436/mm2)*、(312.33±4.546/mm2)*、(312.33±4.457/mm2)*(與對(duì)照組相比*p＜0.01)。T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)對(duì)側(cè)vLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)顯著增高，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。手術(shù)對(duì)側(cè)vLGN中PV陽(yáng)性細(xì)胞面積的定量分析結(jié)果見(jiàn)圖12B所示(#p＜0.01)，N、T、T+V、T+G和T+H組手術(shù)對(duì)側(cè)vLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞面積依次為(192.997±46.851/μm2)、(130.825±9.083/μm2)*、(135.153±12.880/μm2)*、(168.803±24.027/μm2)、(167.796±27.106/μm2)**(與對(duì)照組相比*p＜0.01)，T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)對(duì)側(cè)dLGN中的PV陽(yáng)性細(xì)胞面積較T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)顯著增高，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。
與對(duì)照組相比，視神經(jīng)切斷后LGN中繼神經(jīng)元數(shù)目減少，而GGA給藥組和熱休克處理組的中繼神經(jīng)元數(shù)目較單純手術(shù)組和口賦形劑組升高，且視神經(jīng)切斷后LGN中不僅中繼神經(jīng)元的數(shù)量減少，細(xì)胞的面積也減小，GGA給藥組和熱休克處理組的中繼神經(jīng)元的面積較單純手術(shù)組和口賦形劑組增大，表明GGA對(duì)視神經(jīng)切斷造成的LGN損傷具有保護(hù)作用。
三、檢測(cè)大鼠外側(cè)膝狀體內(nèi)線粒體細(xì)胞色素氧化酶活性細(xì)胞色素氧化酶存在于線粒體內(nèi)膜，是呼吸鏈的終端酶，在ATP生成過(guò)程中起決定性作用。神經(jīng)元是高度分化的高能耗細(xì)胞，富含線粒體。腦組織的高能磷酸化合物形成主要依賴葡萄糖的有氧分解，而生物體90％分子氧的消耗過(guò)程都在線粒體細(xì)胞色素氧化酶(CCX)處完成，所以，CCX在保證腦神經(jīng)元正常能量代謝、維持其正常功能的過(guò)程中起到重要作用，且CCX活力與神經(jīng)元的活性呈正相關(guān)，是神經(jīng)元內(nèi)源代謝的標(biāo)志。口服GGA誘導(dǎo)LGN部位線粒體細(xì)胞色素氧化酶活性升高，以檢測(cè)GGA是否對(duì)視神經(jīng)切斷造成的LGN的損傷具有保護(hù)作用。
用與步驟一相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組及處理，處理后28天時(shí)，對(duì)大鼠進(jìn)行深度麻醉，各組分別取6只大鼠，斷頭處死大鼠，用線粒體提取試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取腦線粒體，并用BCA法測(cè)定線粒體濃度。
1、建立線粒體蛋白濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度測(cè)定前需要建立線粒體蛋白濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，方法為用與實(shí)施例1相同的方法建立線粒體蛋白濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線取Eppendorf管17個(gè)，按表2進(jìn)行編號(hào)和配液。配好后，置于37℃水浴箱中溫浴30分鐘，然后用BCA分析試劑盒和紫外分光光度計(jì)內(nèi)定量程序，繪制一線粒體蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖13)，備用。
表2線粒體蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線液體配制



2、細(xì)胞色素C氧化酶活性測(cè)定測(cè)定上述各組大鼠腦線粒體濃度后，用細(xì)胞色素C氧化酶分析試劑盒(美國(guó)sigma公司)測(cè)定其中的細(xì)胞色素C氧化酶(CCX)活性，具體方法為先將0.95mL分析緩沖液加入比色杯，進(jìn)行分光光度計(jì)調(diào)零。然后，加適量酶或線粒體混懸液和1×酶稀釋緩沖液使總液量達(dá)到1.05mL，并混勻。加入50μl還原型亞鐵細(xì)胞色素C溶液，混勻，反應(yīng)開(kāi)始。5秒鐘后開(kāi)始測(cè)量。每間隔10秒分光光度計(jì)自動(dòng)測(cè)量一次，共六次，記錄數(shù)據(jù)。最后根據(jù)sigma公司提供的下述公式〔式I，ΔA表示A/min(樣品)-A/min(空白)，dil表示酶或樣品的稀釋因子〕計(jì)算酶活性，以對(duì)照組CCX活性為100％，以百分?jǐn)?shù)表示各實(shí)驗(yàn)組CCX活性量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(SPSS11.5軟件)，組間比較應(yīng)用q檢驗(yàn)，結(jié)果以x±s表示，p＜0.05為差異有顯著性意義。

式I大鼠手術(shù)同側(cè)膝狀體部位CCX活性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖14A(#p＜0.01)，與N(正常對(duì)照組100％)相比，T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)、T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)手術(shù)同側(cè)LGN中的CCX活性水平分別為(57.07±2.85)％*、(57.24±3.84)％*、(88.36±2.41)％*、(87.36±3.72)％*，差異有顯著性意義(*p＜0.01)。組間比較T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)同側(cè)LGN中的CCX活性較T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)顯著增高，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。
大鼠手術(shù)對(duì)側(cè)膝狀體部位CCX活性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖14B(#p＜0.01)，與N(正常對(duì)照組100％)相比，T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)、T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)手術(shù)對(duì)側(cè)LGN中的CCX活性依次下降(47.17±4.00)％*、(47.46±1.44)％*、(74.10±4.50)％*、(72.77±4.07)％*，差異有顯著性意義(*p＜0.01)。組間比較T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)對(duì)側(cè)LGN中的CCX活性較T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)顯著增高，差異具有顯著性意義(#p＜0.01)。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明視神經(jīng)切斷后LGN細(xì)胞色素氧化酶活性明顯下降，提示LGN神經(jīng)元的活性降低，GGA給藥組和熱休克處理組的LGN細(xì)胞色素氧化酶活性明顯升高，進(jìn)一步說(shuō)明GGA對(duì)視神經(jīng)切斷造成的LGN損傷具有保護(hù)作用。
實(shí)施例3、檢測(cè)口服GGA對(duì)大鼠視神經(jīng)切斷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的影響青光眼導(dǎo)致視功能損傷的病理基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)進(jìn)行性死亡和視神經(jīng)纖維丟失，RGC的死亡常導(dǎo)致視功能發(fā)生不可逆性損害，因此，青光眼治療的關(guān)鍵在于阻止視神經(jīng)損害，保護(hù)視功能。實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)證明GGA對(duì)視神經(jīng)切斷造成的LGN損傷具有保護(hù)作用，但GGA是否也能對(duì)由視神經(jīng)切斷誘導(dǎo)的RGCs損傷起到保護(hù)作用，現(xiàn)用下述實(shí)驗(yàn)檢測(cè)口服GGA對(duì)大鼠視神經(jīng)切斷后RGCs的影響。
一、檢測(cè)口服GGA對(duì)大鼠視網(wǎng)膜HSP70表達(dá)的影響將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組N(正常對(duì)照組)、V(賦形劑處理組)、G(GGA處理組，400mg/kg)和H(熱休克處理組)，各組n＝6。大鼠于給賦形劑、GGA或熱休克處理后24小時(shí)迅速斷頭處死，取眼球，分離雙眼視網(wǎng)膜，液氮內(nèi)凍存，用蛋白印跡法檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜HSP70表達(dá)情況，并對(duì)HSP70表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析，具體實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)實(shí)施例1。
大鼠視網(wǎng)膜HSP70表達(dá)水平的蛋白印跡結(jié)果見(jiàn)圖15中的圖A，大鼠口服GGA或熱休克處理后24小時(shí)可見(jiàn)視網(wǎng)膜HSP70表達(dá)升高。大鼠視網(wǎng)膜HSP70表達(dá)水平的半定量分析結(jié)果見(jiàn)圖15中的圖B，與正常組相比(N∶1)，V(賦形劑處理組)、G(GGA處理組，400mg/kg)和H(熱休克處理組)視網(wǎng)膜中HSP70的表達(dá)量分別為(0.96±0.12)、(12.31±0.68)*、(11.82±0.75)*(*p＜0.01)。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明口服GGA可以安全、有效地誘導(dǎo)HSP70在視網(wǎng)膜的表達(dá)，從而對(duì)RGCs起到保護(hù)作用。
二、檢測(cè)口服GGA對(duì)大鼠視神經(jīng)切斷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的影響1、FG逆行標(biāo)記法計(jì)數(shù)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞隨機(jī)將大鼠分為5組N(正常對(duì)照組)、T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)、T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組，GGA 400mg/kg)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)。于術(shù)前24小時(shí)給藥，以后每天一次。熱休克處理于術(shù)前24小時(shí)一次，以后每隔一周一次。具體給藥及處理方法見(jiàn)實(shí)施例1。視神經(jīng)切斷模型的建立方法為水合氯醛(40mg/100g體重)腹腔麻醉，消毒鋪巾，沿左眼上眶緣剪開(kāi)皮膚和軟組織，暴露視神經(jīng)起始部及視神經(jīng)，縱行挑開(kāi)視神經(jīng)外膜，在距離視神經(jīng)起始部約1mm的位置完全剪斷視神經(jīng)，在手術(shù)剪斷視神經(jīng)的同時(shí)于眶側(cè)斷端留置一小塊浸有50g/L的FG(Flurogold，熒光金，美國(guó)Affinity公司)的明膠海綿(北京化學(xué)試劑公司)，切口復(fù)位，縫合。整個(gè)手術(shù)過(guò)程要避免損傷位于視神經(jīng)下方的視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈。
對(duì)上述各組大鼠的RGCs進(jìn)行FG逆行標(biāo)記法逆行標(biāo)記的方法為動(dòng)物麻醉后，固定大鼠于立體定位儀(日本Narishige公司)上，耳間顱頂正中線垂直切開(kāi)頭皮，分離暴露顱骨矢狀縫和人字縫，找到Bregma點(diǎn)，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜確定雙側(cè)上丘)，每側(cè)上丘注射兩點(diǎn)(前囟后-5.9mm和-6.4mm，旁開(kāi)1.4mm，深0.4mm)，每點(diǎn)注射1.5μl。徹底止血，分層縫合顱骨膜、腱膜和皮膚。處理后14天時(shí)，各組取6只大鼠，麻醉處死動(dòng)物后取眼球，浸入40g/L的多聚甲醛溶液避光后固定1小時(shí)。經(jīng)PBS漂洗3次后沿角膜緣剪除角膜，分離視網(wǎng)膜，平鋪于載玻片上，在視網(wǎng)膜周邊做幾處小切口便于平伏，最后用Vectashield(Vector公司)封片。
上述各組大鼠RGCs的FG逆行標(biāo)記結(jié)果如圖16A所示(A-E圖分別為N(正常對(duì)照組)、T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)、T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)，標(biāo)尺＝30μm)，可見(jiàn)FG逆行標(biāo)記能很好地將大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)記出來(lái)，標(biāo)記均勻清楚。
在熒光顯微鏡下對(duì)上述各組大鼠的RGCs進(jìn)行計(jì)數(shù)，具體方法為以視盤(pán)為中心在通過(guò)視乳頭的坐標(biāo)軸上，分別在視網(wǎng)膜鼻上、鼻下、顳上、顳下距取中心1mm(后部)，2mm(中周)，3mm(周邊)處，同一顯微鏡視場(chǎng)高倍視野(400×)下，手工計(jì)數(shù)每一視野中的RGCs數(shù)(Caprioli J，Ishii Y，Kwong JM.Retinal ganglion cellprotection with geranylgeranylacetone，a heat shock protein inducer，in a ratglaucoma model.Trans.Am.Ophthalmol Soc.2003；10139-50.)。圓形胞體、直徑超過(guò)8Lm為RGCs，而形態(tài)不規(guī)則的、直徑較小的為小膠質(zhì)細(xì)胞，不予計(jì)數(shù)(Cheng L，Sapieha P，Kittlerova P，Hauswirth WW，Di PA.TrkB gene transfer protectsretinal ganglion cells from axotomy-induced death in vivo.J.Neurosci.2002；223977-86.)，以對(duì)照組RGCs數(shù)目為100％，以百分?jǐn)?shù)表示各實(shí)驗(yàn)組RGCs的存活量，同時(shí)對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
RGCs計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果如圖16B所示(#p＜0.01)，與N(正常對(duì)照組100％)相比，T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)、T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)視網(wǎng)膜中的RGCs存活量(11.33±0.99)％*、(11.39±0.39)％*、(46.16±4.10)％*、(47.91±1.67)％*，差異有顯著性意義(*p＜0.01)。組間比較T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)視網(wǎng)膜中的RGCs存活量較T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)顯著增高，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。
研究表明RGCs通常于視神經(jīng)切斷后4-5d開(kāi)始死亡，隨手術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)，RGCs數(shù)目不斷減少，RGCs數(shù)目在手術(shù)后7d約為正常數(shù)的50％，手術(shù)后14d時(shí)約90％的RGCs死亡(Cheng L，Sapieha P，Kittlerova P，Hauswirth WW，Di PA.TrkB gene transferprotects retinal ganglion cells from axotomy-induced death in vivo.J.Neurosci.2002；223977-86.)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明視神經(jīng)切斷后RGCs的數(shù)量約是正常對(duì)照組的11.3％，與現(xiàn)有研究結(jié)果一致，而GGA給藥組和熱休克處理組視神經(jīng)切斷后的RGCs的數(shù)量較單純視神經(jīng)切斷和神經(jīng)切斷加賦形劑組顯著增多，證明GGA對(duì)RGCs具有保護(hù)作用。
2、dUTP缺口末段標(biāo)記法檢測(cè)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡情況研究表明切斷視神經(jīng)可誘發(fā)大量RGCs凋亡，實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)也對(duì)此得到了進(jìn)一步的驗(yàn)證，但導(dǎo)致凋亡的原因仍不清楚，研究表明可能與以下原因相關(guān)靶源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的中斷、興奮性氨基酸過(guò)度釋放、氧自由基及NO(nitric oxide，一氧化氮)等對(duì)神經(jīng)元的毒性作用，此外，神經(jīng)元自身的狀態(tài)也可影響神經(jīng)元的存活；受損的RGCs對(duì)靶源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的反應(yīng)性降低可能也是RGCs凋亡的原因之一(Marcic TS，Belyea DA，Katz B.Neuroprotection in glaucomaa model for neuroprotectionin optic neuropathies.Curr.Opin.Ophthalmol 2003；14353-56.)，現(xiàn)用TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTPnick-end labeling)檢測(cè)視神經(jīng)切斷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞地凋亡情況。
用與步驟1相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組及處理，各組大鼠于處理后7天時(shí)深度麻醉，左心室升主動(dòng)脈插管，快速灌注生理鹽水，右心耳剪開(kāi)放血，待流出液體清亮后，再灌注4％多聚甲醛300mL，取眼球放入4％多聚甲醛4℃過(guò)夜，石蠟包埋，制備經(jīng)過(guò)視神經(jīng)的4μm石蠟切片，對(duì)其進(jìn)行TUNEL染色(TUNEL試劑盒，德國(guó)Roche公司)并統(tǒng)計(jì)RGCs細(xì)胞凋亡數(shù)，具體方法包括以下步驟(1)切片常規(guī)脫蠟，入水；(2)擦干樣品周圍的水分，加蛋白酶K(20μg/mL溶于Tris·HCL中，pH7.4-8.0)50μl/片，室溫放置濕盒中10分鐘；(3)PBS液終止反應(yīng)，洗3次，每次5min；(4)加TUNEL反應(yīng)混合物(試劑1和試劑2的混合物，試劑盒自帶)50μl/片，混勻后加樣品片上，置于濕盒中，室溫標(biāo)記60分鐘；(5)PBS液終止反應(yīng)，洗3次，每次5min；(6)擦干樣品周圍的水分，加轉(zhuǎn)化劑-POD液50μl/片，室溫反應(yīng)30分鐘；(7)PBS液終止反應(yīng)，洗3次，每次5min；(8)用新鮮配制的0.03％H2O2-0.5mg/mL DAB顯色10分鐘左右，顯微鏡下觀察顯色情況；
(9)蘇木素復(fù)染；(10)脫水，透明，常規(guī)封片，鏡檢。
細(xì)胞凋亡結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)凋亡陽(yáng)性為胞漿和(或)胞膜棕褐色染色，計(jì)數(shù)每張切片中凋亡RGCs數(shù)，每個(gè)視網(wǎng)膜計(jì)數(shù)3張切片(n＝6)，計(jì)算RGCs凋亡細(xì)胞總數(shù)，求得平均每張切片的RGCs細(xì)胞凋亡數(shù)，并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(SPSS11.5軟件)，組間比較應(yīng)用q檢驗(yàn)，結(jié)果以x±s表示，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
RGCs的TUNEL染色結(jié)果如圖17A所示(A-E圖分別為N(正常對(duì)照組)、T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)、T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)，標(biāo)尺＝10μm)，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞為胞漿和(或)胞膜棕褐色染色。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如圖17B所示(#p＜0.01)，T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)、T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)視網(wǎng)膜中凋亡細(xì)胞數(shù)分別是(42.28±5.15)*、(39.83±5.63)*、(21.56±4.12)*、(20.72±3.27)*，差異有顯著性意義(*p＜0.01)。與N(正常對(duì)照組)相比(1±0.69)相比差異有顯著性意義(*P＜0.01)。組間比較T+G(視神經(jīng)切斷加GGA治療組)、T+H(視神經(jīng)切斷加熱休克處理組)視網(wǎng)膜中凋亡細(xì)胞數(shù)較T(視神經(jīng)切斷組)、T+V(視神經(jīng)切斷加賦形劑治療組)顯著降低，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GGA給藥組和熱休克處理組的RGCs胞凋亡的數(shù)量較單純手術(shù)組和口賦形劑組減少，進(jìn)一步證明GGA或熱休克處理對(duì)RGCs具有保護(hù)作用，原因可能與HSP70對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用相關(guān)。
實(shí)施例4、GGA治療青光眼的臨床試驗(yàn)對(duì)已確診為早、晚期青光眼的患者服用GGA后進(jìn)行初步臨床觀察，包括療效及不良反應(yīng)等，先后對(duì)青光眼早期和晚期患者進(jìn)行觀察，并進(jìn)行了初步分析，結(jié)果表明，本發(fā)明多肽化合物對(duì)早、晚期青光眼的均有較好的療效，其中對(duì)早期的療效尤為突出，且未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.替普瑞酮在制備預(yù)防和/或治療青光眼藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了替普瑞酮在制備預(yù)防和/或治療青光眼藥物中的新用途。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明口服GGA可有效誘導(dǎo)外側(cè)膝狀體和視網(wǎng)膜中HSP70表達(dá)，并對(duì)大鼠視神經(jīng)切斷后LGN神經(jīng)元和RGCs胞具有保護(hù)作用，效果顯著。與目前臨床上常用的青光眼治療性藥物相比，本發(fā)明的藥物具有以下優(yōu)點(diǎn)1)療效明顯，總有效率可達(dá)92.5％以上；2)安全性高；3)主要用藥途徑為口服，用藥方便；4)GGA價(jià)格低廉，制備該藥物的成本較低，從而可減輕病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本發(fā)明不僅為青光眼的防治提供一條新的途徑，也對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病及進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病的治療及研究具有借鑒作用，在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A61P27/06GK1903188SQ200610089109
公開(kāi)日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2006年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月3日
發(fā)明者王寧利, 趙麗, 姜利斌, 李俊發(fā), 盧青君, 李遼青, 范爾鐘, 王玲, 王懷洲, 王春芳, 龍彩霞, 韓松, 李愛(ài)琴, 盧弘, 陳鳳華 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院