專利名稱：：具抑制腫瘤細胞生長活性的艾里莫芬雙內酯及用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于天然藥物化學和藥理學
技術領域：
。具體而言，本發(fā)明涉及一類艾里莫芬雙內酯天然產物的制備以及該類天然產物對六種人體腫瘤細胞株如人原髓細胞白血病細胞(HL-60)、鼻咽癌細胞(CNE)、口腔上皮癌細胞(KB)、人肺癌細胞(A549)、人肝癌細胞(BEL-7404)和人子宮頸癌細胞(Hela)腫瘤細胞生長抑制活性篩選。這些天然產物被發(fā)現(xiàn)具有一定的抑制腫瘤細胞生長活性，可預期作為抗腫瘤藥物用途。
背景技術：
：目前，由于工業(yè)發(fā)展帶來的環(huán)境污染等問題，人類的生存環(huán)境質量不斷下降，腫瘤疾病的發(fā)病率和致死率也不斷上升。然而目前臨床所用的細胞毒性抗腫瘤藥物的選擇性不高，導致對正常細胞的惡性殺傷，限制了該類藥物的普遍使用性。因此，尋找和發(fā)現(xiàn)新的選擇性高的細胞毒性抗腫瘤藥物是世界范圍內的研究熱點。我們也致力于這類藥物的研究。黑紫橐吾Ligulariaatroviblacea(Franch.)Hand.-Mazz.是菊科橐吾屬植物，云南民間用于清熱解毒及治療感冒、咳嗽用。本發(fā)明人在對菊科橐吾屬植物和菊科千里光屬的提取及化學成分研究中，曾經發(fā)現(xiàn)其中含有大量的艾里莫芬烷內酯，如近年來發(fā)明人發(fā)現(xiàn)巖生千里光中的艾里莫芬烷內酯具有對腫瘤細胞HL-60，A549和KB株均有一定的細胞毒性(趙昱等，ChineseChemicalLetters，2002年，13卷第4期，333-334頁)。此外，本發(fā)明人還報道了雞足千里光的幾個艾里莫芬烷內酯也對KB腫瘤細胞株和A549細胞株有一定的細胞毒性(趙昱等，ChineseChemicalLetters，2002年，13卷第8期，754-757頁；趙昱等，ChineseChemicalLetters，2005年，16卷第3期，362-364頁)。但是，對于黑紫橐吾的化學成分研究和生物活性研究尚未見報道。據(jù)此，發(fā)明人對其進行了生物追蹤的化學分離及結構鑒定，得到了本發(fā)明中所述的具有新穎結構的艾里莫芬雙內酯類化合物；并根據(jù)全世界尤其是中國的常發(fā)腫瘤疾病譜及腫瘤細胞的敏感性，選擇了人原髓細胞白血病細胞(HL-60)、鼻咽癌細胞(CNE)、口腔上皮癌細胞(KB)、人肺癌細胞(A549)、人肝癌細胞(BEL-7404)和人子宮頸癌細胞(Hela)六株人體腫瘤細胞株作為體外細胞毒活性藥理評價的指標。結果顯示，艾里莫芬雙內酯類化合物有抑制上述人體腫瘤細胞生長的作用，由此完成本發(fā)明。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種具有抑制人體腫瘤細胞生長活性的艾里莫芬雙內酯類化合物，具體而言，本發(fā)明提供了式(1)所示的艾里莫芬雙內酯類衍生物其中R不為氫，可為羥基、甲氧基，或含1-8個碳的飽和/不飽和的直鏈/支鏈的烷氧基團；8位碳是R構型或者S構型。本發(fā)明的另一目的是提供了式(1)化合物用于抑制人體腫瘤細胞生長活性的用途；以及據(jù)此活性將式(1)化合物制備成防治腫瘤疾病藥物的用途。本發(fā)明的再一目的是提供了一種用于抑制人體腫瘤細胞生長活性的藥物組合物。橐吾屬植物中一般富含艾里莫芬烷內酯，其提取方法多為有機溶劑浸泡抽提或者回流提取，回收溶劑后，所得浸膏進行溶劑分配和/或各種層析方法，結合重結晶技術純化而得。根據(jù)上述方法，本發(fā)明提取分離得到多種艾里莫芬烷內酯化合物，如化合物1-A1、化合物1-A2、化合物1-B1；它們是化合物1-A18β-羥基-艾里莫芬-3，7(11)-雙烯-12，8α(14，6α)-雙內酯；化合物1-A28β-甲氧基-艾里莫芬-3，7(11)-雙烯-12，8α(14，6α)-雙內酯；化合物1-B18α-羥基-艾里莫芬-3，7(11)-雙烯-12，8β(14，6α)-雙內酯；具體而言，本發(fā)明中的化合物的制備方法如下由黑紫橐吾的地下部分經醇水或酮水系統(tǒng)提取、有機溶劑柱層析、制備性薄層層析和重結晶方法純化。具體包括下列步驟a.用醇水或者酮水混合溶劑提取經粉碎的藥材，濃縮提取液回收醇溶劑或酮溶劑；b.將步驟a得到的浸膏經石油醚、醋酸乙酯、正丁醇進行溶劑分配；將得到的醋酸乙酯提取物進行柱層析，用有機溶劑洗脫，薄層層析檢測，分別收集含有式(1)所示艾里莫芬雙內酯化合物的流份，再經制備薄層或者葡聚糖凝膠(SephadexLH-20)柱層析，梯度洗脫，薄層層析檢測，含有式(1)所示艾里莫芬雙內酯化合物的流份分別減壓揮干溶劑，選用適當有機溶劑進行重結晶，分別得到純品。本發(fā)明中的制備方法中，醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇或它們的混合物。優(yōu)選乙醇。醇水混合溶劑可以是醇和水以任意比例混合的溶劑，優(yōu)選乙醇和水的混合溶劑，尤其優(yōu)選60-95％的乙醇水溶液。酮可以是丙酮、甲乙酮、丁酮或它們的混合物，酮水混合溶劑可以是酮和水以任意比例混合的溶劑，優(yōu)選丙酮和水的混合溶劑，尤其優(yōu)選丙酮含量大于60％的酮溶液。步驟b中重結晶溶劑可以是1至6個碳的直鏈或支鏈酯類、醚類、醇類、酮類或者它們的混合物。優(yōu)選丙酮和醋酸乙酯。步驟b中柱層析所用介質可以是硅膠、硅藻土、反相硅膠、大孔樹脂、氧化鋁、葡聚糖凝膠(Sephadex)類。優(yōu)選硅膠。洗脫溶劑可以是醚、酯、酮、氯仿、二氯甲烷、醇或者是它們二者或三者的混合物。優(yōu)選石油醚與丙酮或石油醚與醋酸乙酯的混合溶劑，或者氯仿與甲醇的混合溶劑進行梯度洗脫。本發(fā)明中的藥材可以是黑紫橐吾Ligulariaatroviblacea(Franch.)Hand.-Mazz.的任一部位，即可以是其根、莖、葉、種子、皮、果實，也可以是它們的混合物。優(yōu)選其地下部分。式(1)化合物具有重要的生物活性，對六株人體腫瘤細胞，包括人原髓細胞白血病細胞(HL-60)、鼻咽癌細胞(CNE)、口腔上皮癌細胞株(KB)、人肺癌細胞(A549)、人肝癌細胞(BEL-7404)、人子宮頸癌細胞(Hela)的細胞毒活性體外試驗表明此類艾里莫芬雙內酯化合物對人體腫瘤細胞生長具有抑制作用(具體見實施例)，有可能發(fā)展成為新的防治腫瘤藥物。本發(fā)明的式(1)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與藥學上常用的輔料或載體結合，制備得到具有腫瘤細胞生長抑制活性從而可以用于防治腫瘤疾病的藥物組合物。上述各類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。本發(fā)明的式(1)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與現(xiàn)已上市的抗腫瘤藥物，如鉑類藥物順鉑(DDP)、喜樹堿類藥物伊立替康(Irinatecan，CPT-11)、長春花堿類藥物失碳長春花堿(Vinorebine，NVB諾維本)、脫氧胞昔類藥物吉西他濱(Gemcitabine，Gemzar健擇)、足葉乙甙(Etoposide)、紫杉醇(Paclitaxel)等聯(lián)合使用，制備得到防治腫瘤疾病類藥物組合物。該類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。具體實施例方式為了更好地理解本發(fā)明的實質，下面首先用實施例的形式說明式(1)化合物制備的過程，實施例給出了代表性化合物的部分物理和化學及波譜學數(shù)據(jù)。必須說明，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。其次分別用該類艾里莫芬雙內酯化合物對六種腫瘤細胞株生長的抑制作用的藥理實驗結果，說明其在抗腫瘤藥物研究領域中的新用途。藥理實施例給出了代表性化合物的部分活性數(shù)據(jù)。必須說明，本發(fā)明的藥理實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。實施例1化合物1-A1的制備取5.0公斤干燥的黑紫橐吾Ligulariaatroviblacea(Franch.)Hand.-Mazz.地下部分粉碎成粉末，加50升95％乙醇浸泡。在室溫下浸泡3次，每次7天。乙醇提取液合并，減壓回收溶劑至干得到462克浸膏，用3公升水分散，再依次用60-90°石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取。減壓回收醋酸乙酯提取液得到89.0克浸膏。該浸膏用800克100-200目硅膠柱層析，氯仿-甲醇(50∶0-0∶1)梯度洗脫。薄層層析檢測合并相同流份，含有化合物1-A1的部分浸膏再經制備薄層(60-90°石油醚-醋酸乙酯4∶1)繼以SephadexLH-20柱層析純化(甲醇洗脫)，最終得到45毫克化合物1-A1?；衔?-A1的物理和光譜數(shù)據(jù)無色針晶；熔點193-195℃(氯仿)；[α]D20+45.0°(c0.40，丙酮)；紫外λmax(丙酮)nm221；3284，1772，1720，1668，1424；電噴霧質譜ESI-MS(m/z)277[M+H]+；高分辨電噴霧質譜HR-ESI-MS(m/z)277.1043(計算值[C15H16O5+H]+277.1031)；13C和1HNMR譜圖數(shù)據(jù)見表1和表2。實施例2化合物1-A2的制備同實施例1，從5.0公斤干燥的黑紫橐吾得到89.0克醋酸乙酯浸膏。該浸膏用800克100-200目硅膠柱層析，氯仿-甲醇(50∶0-0∶1)梯度洗脫。薄層層析檢測合并相同流份，含有化合物1-A2的部分浸膏(4.8克)再經200-300目硅膠(90克)柱層析，以60-90°石油醚-醋酸乙酯8∶1-2∶1梯度洗脫，繼以制備薄層(60-90°石油醚-醋酸乙酯6∶1)純化，最終得到化合物1-A2(17毫克)?；衔?-A2的物理和光譜數(shù)據(jù)無色針晶；熔點167-169℃；[α]D20+41.0°(氯仿；c0.25)；UVλmax(氯仿)nm219；1777，1741，1679；電噴霧質譜ESI-MS(m/z)291[M+H]+；高分辨電噴霧質譜HR-ESI-MS(m/z)291.1189(計算值[C16H18O5+H]+291.1188)；13C和1HNMR譜圖數(shù)據(jù)見表1和表2。實施例3化合物1-B1的制備同實施例1，從5.0公斤干燥的黑紫橐吾得到89.0克醋酸乙酯浸膏。該浸膏用800克100-200目硅膠柱層析，氯仿-甲醇(50∶0-0∶1)梯度洗脫。薄層層析檢測合并相同流份，含有化合物1-B1的部分浸膏再經制備薄層(60-90°石油醚-醋酸乙酯4∶1)繼以SephadexLH-20柱層析純化(甲醇洗脫)，最終得到化合物1-B1(23mg)。無色針晶；熔點172-174℃；[α]D20-62.0°(丙酮；c0.20)；UVλmax(丙酮)nm222；3325，1774，1745，1671，1428；電噴霧質譜ESI-MS(m/z)277[M+H]+；高分辨電噴霧質譜HR-ESI-MS(m/z)277.1050(計算值[C15H16O5+H]+277.1031)；13C和1HNMR譜圖數(shù)據(jù)見表1和表2。表1.化合物1-A1、1-A2、1-B1的13CNMR譜數(shù)據(jù)*<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="556">碳號1-A11-A2a)1-B112345678910111213141522.1t22.3t137.7d130.5s44.6s82.8d155.3s103.6s37.2t34.4d126.1s169.0s8.9q171.2s26.9q21.5t21.7t137.0d129.7s44.0s82.1d152.2s105.2s35.2t32.9d128.7s168.5s9.1q170.5s26.8q22.5t22.8t139.1d130.9s45.2s83.9d156.3s104.6s37.5t34.9d126.6s170.8s8.9q172.9s27.1q</table></tables>*在氘代氯仿中測定q代表伯碳；t代表叔碳；d代表仲碳；s代表季碳；a)8-甲氧基信號δC50.8(q)。表2.化合物1-A1、1-A2、1-B1的1HNMR譜數(shù)據(jù)*<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="573">氫原子1-A11-A2a)1-B111’22’32.02多重峰1.66多重峰2.27多重峰2.27多重峰6.75(三重峰，J＝3.6Hz)1.99多重峰1.68多重峰2.36多重峰2.17多重峰6.85(三重峰，J＝3.2Hz)2.09多重峰1.73多重峰2.40多重峰2.40多重峰6.89(三重峰，J＝3.2Hz)</table></tables>a)8-甲氧基δH3.22(單峰)。藥理實施例1化合物1-A1對KB細胞的細胞毒活性KB(口腔上皮癌)細胞用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％的胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL的鏈霉素。細胞以每孔5×103的濃度加入到96孔板中，在37℃含5％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。細胞存活率的測定用改良MTT法。細胞經過24小時的孵育后，分別將新配的化合物1-A1的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中，使孔中1-A1化合物最終濃度分別為100μg/mL，33.3μg/mL，11.1μg/mL和3.7μg/mL。72小時后，加入10μLMTT(5mg/mL)的磷酸鹽緩沖液，再繼續(xù)在37℃培養(yǎng)4小時后，離心5分鐘除去未轉化的MTT，每孔中加入200μL二甲亞砜，以溶解還原的MTT晶體甲臜(formazan)，所形成的formazan用酶標儀在570nm波長下比色，細胞存活率由樣品相對于對照品的比值計算。其中化合物1-A1對KB細胞半抑制濃度(IC50)由劑量效應曲線得到。化合物1-A1的IC50為7.32×10-5M；陽性對照順鉑對KB細胞的IC50為5.67×10-6M。實驗結論KB細胞是測試化合物對腫瘤細胞的細胞毒性的有效工具和評價指標。本實驗表明此類艾里莫芬雙內酯化合物對KB細胞具有較強的細胞毒性，有可能發(fā)展成為新的具有抗腫瘤作用的藥物。藥理實施例2化合物1-A1對HL-60細胞的細胞毒活性HL-60(人原髓細胞白血病細胞)細胞用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％小牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素。細胞以每孔1×104個密度接種到96孔板中，在37℃含5％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。細胞存活率的測定用改良MTT法，具體方法如藥理實施例1。其中化合物1-A1對HL-60細胞半抑制濃度(IC50)由劑量效應曲線得到?；衔?-A1的IC50為1.97×10-4M；而陽性對照順鉑對HL-60細胞的IC50為2.07×10-5M。實驗結論本實驗表明此類艾里莫芬雙內酯化合物對HL-60細胞具有較強的細胞毒性，有可能發(fā)展成為新的具有治療白血病及相關腫瘤作用的藥物。藥理實施例3化合物1-A1對CNE細胞的細胞毒活性CNE(鼻咽癌)細胞用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％的胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL的鏈霉素。以每孔5×103細胞的濃度加入到96孔板中，在37℃含5％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。細胞存活率的測定用改良MTT法，具體方法如藥理實施例1。其中化合物1-A1對CNE細胞半抑制濃度(IC50)由劑量效應曲線得到?；衔?-A1的IC50為1.91×10-4M；而陽性對照順鉑對CNE細胞的IC50為4.62×10-6M。實驗結論本實驗表明此類艾里莫芬雙內酯化合物對CNE細胞具有較弱的細胞毒性。藥理實施例4化合物1-A1對A549細胞的細胞毒活性A549(人肺癌)細胞用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％的胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL的鏈霉素。細胞以每孔5×103的濃度加入到96孔板中，在37℃含5％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。細胞存活率的測定用改良MTT法，具體方法如藥理實施例1。其中化合物1-A1對A549細胞半抑制濃度(IC50)由劑量效應曲線得到?；衔?-A1的IC50為1.06×10-4M；而陽性對照順鉑對A549細胞的IC50為1.38×10-5M。實驗結論本實驗表明此類艾里莫芬雙內酯化合物對A549細胞具有較強的細胞毒性，有可能發(fā)展成為新的具有抗肺癌及相關腫瘤作用的藥物。藥理實施例5化合物1-B1對BEL-7404細胞的細胞毒活性BEL-7404(人肝癌)細胞用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％的胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL的鏈霉素。細胞以每孔5×103的濃度加入到96孔板中，在37℃含5％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。細胞存活率的測定用改良MTT法，具體方法如藥理實施例1。其中化合物1-B1對BEL-7404細胞半抑制濃度(IC50)由劑量效應曲線得到?；衔?-B1的IC50為1.11×10-4M；而陽性對照順鉑對BEL-7404細胞的IC50為1.50×10-5M。實驗結論本實驗表明此類艾里莫芬雙內酯化合物對BEL-7404細胞具有較強的細胞毒性，有可能發(fā)展成為新的具有抗肝癌及相關腫瘤作用的藥物。藥理實施例6化合物1-A1對Hela細胞的細胞毒活性Hela(人子宮頸癌)細胞用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％的胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL的鏈霉素。細胞以每孔5×103的濃度加入到96孔板中，在37℃含5％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。細胞存活率的測定用改良MTT法，具體方法如藥理實施例1。其中化合物1-A1對Hela細胞半抑制濃度(IC50)由劑量效應曲線得到?；衔?-A1的IC50為9.99×10-5M；而陽性對照順鉑對Hela細胞的IC50為4.20×10-6M。實驗結論本實驗表明此類艾里莫芬雙內酯化合物對Hela細胞具有較強的細胞毒性，有可能發(fā)展成為新的具有抗子宮頸癌及相關腫瘤作用的藥物。權利要求1.一種艾里莫芬雙內酯類衍生物，具有式(1)所示的結構式式(1)其中R不為氫，可為羥基、甲氧基，或含1-8個碳的飽和/不飽和的直鏈/支鏈的烷氧基團；8位碳是R構型或者S構型。2.根據(jù)權利要求1所述的艾里莫芬雙內酯類衍生物，其特征是其中8，12內酯環(huán)為8α，12構型，具有式(1-A)所示的結構式其中，R的定義與權利要求1中的相同。3.根據(jù)權利要求2所述的艾里莫芬雙內酯類衍生物，其特征是化合物1-A18β-羥基-艾里莫芬-3，7(11)-雙烯-12，8α(14，6α)-雙內酯；化合物1-A28β-甲氧基-艾里莫芬-3，7(11)-雙烯-12，8α(14，6α)-雙內酯。4.根據(jù)權利要求1的所述的艾里莫芬雙內酯類衍生物，其特征是具有式(1-B)所示的結構式，其中8，12內酯環(huán)為8β，12構型，R的定義與權利要求1中的相同。5.根據(jù)權利要求4的所述的艾里莫芬雙內酯類衍生物，其特征是化合物1-B1是8α-羥基-艾里莫芬-3，7(11)-雙烯-12，8β(14，6α)-雙內酯。6.根據(jù)權利要求1-5任一所述的艾里莫芬雙內酯類衍生物，在制備抑制人原髓細胞白血病細胞、鼻咽癌細胞、口腔上皮癌細胞、人肺癌細胞、人肝癌細胞、人子宮頸癌細胞生長活性的藥物中應用。7.根據(jù)權利要求1-5所述的艾里莫芬雙內酯類衍生物，其特征是所述藥物和/或含有其可藥用鹽，及可藥用輔料。8根據(jù)權利要求7所述的艾里莫芬雙內酯類衍生物，其特征是所述藥物的制劑形式包括注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑、控釋或緩釋劑或納米制劑。全文摘要本發(fā)明涉及一類艾里莫芬雙內酯及其可藥用鹽或溶劑化物。本發(fā)明還涉及其制備方法及其藥物組合物和醫(yī)藥用途。本發(fā)明的化合物具有體外抑制六種人體腫瘤細胞如人原髓細胞白血病細胞(HL－60)、鼻咽癌細胞(CNE)、口腔上皮癌細胞(KB)、人肺癌細胞(A549)、人肝癌細胞(BEL－7404)和人子宮頸癌細胞(Hela)的活性，可預期開發(fā)為抗腫瘤藥物用途。文檔編號A61P35/00GK1850825SQ200610051718公開日2006年10月25日申請日期2006年5月30日優(yōu)先權日2006年5月30日發(fā)明者趙昱,黃可新,王曉雨,施樹云,孫蓮莉,王利霞,楊雷香申請人:溫州醫(yī)學院