專利名稱：艾里莫芬烷內(nèi)酯抑制乙肝病毒的用途及其藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技領(lǐng)域，具體來(lái)講，本發(fā)明涉及千里光屬植物中的艾里莫芬烷內(nèi)酯抑制乙肝病毒的用途及其藥物組合物。
背景技術(shù)：
乙型肝炎現(xiàn)為全球性流行性傳染病。據(jù)估計(jì)全球至少有20億人曾經(jīng)感染過(guò)乙型肝炎病毒(HBV)，約3億人成為慢性HBV感染者，其中80％居住在亞非拉國(guó)家。對(duì)病毒性肝炎現(xiàn)在世界上尚無(wú)特效治療。人們將治療重點(diǎn)放在抗病毒治療上，目前多采用干擾素、阿昔絡(luò)韋或拉米呋啶進(jìn)行治療。巖生千里光(Seneciosaluenensis)和雞足千里光(Senecio tsoongianns Ling)均是菊科千里光屬植物，民間用于清熱解毒及治療感冒、咳嗽用。我們?cè)趯?duì)二者的提取及化學(xué)成分研究中，曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)其中含有艾里莫芬烷內(nèi)酯，進(jìn)一步的藥理活性試驗(yàn)表明，艾里莫芬烷內(nèi)酯化合物對(duì)乙肝病毒表面抗原(HbsAg)顯示出明顯的抑制，且在較低濃度下對(duì)HBsAg的抑制率高過(guò)陽(yáng)性對(duì)照阿昔絡(luò)韋(ACV)，同時(shí)從該兩種藥用植物中發(fā)現(xiàn)的艾里莫芬烷內(nèi)酯A、B、C、D對(duì)乙肝病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)有一定的抑制作用。顯示出其有抑制乙肝病毒的作用，由此完成發(fā)明。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供了千里光屬植物中的艾里莫芬烷內(nèi)酯用于抑制乙肝病毒的用途；本發(fā)明的另一目的是提供了一種用于抑制乙肝病毒的藥物組合物。
技術(shù)方案千里光屬植物中一般富含艾里莫芬烷內(nèi)酯，其提取方法多為有機(jī)溶劑浸泡抽提或者回流提取，回收溶劑后，所得浸膏進(jìn)行液液分配和/或各種層析方法，結(jié)合重結(jié)晶技術(shù)純化而得。
根據(jù)上述方法，本發(fā)明提取分離得到多種艾里莫芬烷內(nèi)酯化合物，如化合物A、化合物B、化合物C和化合物D，它們結(jié)構(gòu)如下
它們的化學(xué)名稱分別是化合物A10α-羥基-愛里莫芬-8，7(11)-二烯-8，12-內(nèi)酯；化合物B8β，10β-二羥基-3β-乙酰氧基-6β-當(dāng)歸酰氧基-愛里莫芬-7(11)-烯-8，12-內(nèi)酯；化合物C8′α-[愛里莫芬-7′(11′)，9′-二烯-8β，12-內(nèi)酯基]-愛里莫芬-7(11)，9-二烯-8β，12-內(nèi)酯；化合物D8′β-[愛里莫芬-7′(11′)，9′-二烯-8α，12-內(nèi)酯基]-愛里莫芬-7(11)，9-二烯-8β，12-內(nèi)酯。
具體而言，本發(fā)明中化合物A、B、C和D的制備方法如下由巖生千里光和雞足千里光的全草經(jīng)醇水或酮水系統(tǒng)提取、有機(jī)溶劑柱層析和重結(jié)晶方法純化。具體包括下列步驟a.用醇水或者酮水混合溶劑提取經(jīng)粉碎的藥材，濃縮提取液回收醇溶劑或酮溶劑；
b.將步驟a 得到的浸膏經(jīng)柱層析，用有機(jī)溶劑洗脫，薄層層析檢測(cè)，分別收集含有A、B、C、D的流份，再經(jīng)ODS C18反相柱層析，用甲醇水系統(tǒng)梯度洗脫，薄層層析檢測(cè)，含有A、B、C、D的流份分別減壓揮干溶劑，選用適當(dāng)有面溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，分別得到純品A、B、C、D。
本發(fā)明中的制備方法中，醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇或它們的混合物。優(yōu)選乙醇。醇水混合溶劑可以是醇和水以任意比例混合的溶劑，優(yōu)選乙醇和水的混合溶劑，尤其優(yōu)選60-95％的乙醇水溶液。酮可以是丙酮、甲乙酮、丁酮或它們的混合物，酮水混合溶劑可以是酮和水以任意比例混合的溶劑，優(yōu)選丙酮和水的混合溶劑，尤其優(yōu)選丙酮含量大于60％的酮溶液。步驟b中重結(jié)晶溶劑可以是1至6個(gè)碳的直鏈或支鏈酯類、醚類、醇類、酮類或者它們的混合物。優(yōu)選丙酮和乙酸乙酯。步驟b中柱層析所用介質(zhì)可以是硅膠、硅藻土、反相硅膠、大孔樹脂、氧化鋁、葡聚糖凝膠(Sephadex)類。優(yōu)選硅膠。洗脫溶劑可以是醚、酯、酮、氯仿、二氯甲烷、醇或者是它們中任二者或三者的混合物。優(yōu)選石油醚與丙酮的混合溶劑或者二氯甲烷與乙酸乙酯的混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫。
本發(fā)明中的藥材可以是千里光屬植物任一部位，即可以是千里光屬(Seneciospp)任一植物的根、莖、葉、種子、皮、果實(shí)，也可以是它們的混合物。優(yōu)選全草和地上部分。更優(yōu)選巖生千里光(Senecio saluenensis)和雞足千里光(Seneciotsoongianus Ling)的全草和地上部分。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明得到的千里光屬植物中的艾里莫芬烷內(nèi)酯具有抑制乙型肝炎病毒的活性，可以用于抑制乙肝表面抗原、治療乙型病毒性肝炎等。經(jīng)本發(fā)明人采用轉(zhuǎn)染乙肝病毒的2.2.15細(xì)胞株(HepG 2.2.15)為靶細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)化合物A、B、C和D除了對(duì)乙肝表面抗原有強(qiáng)烈的抑制活性外，還對(duì)乙肝病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)有一定的抑制作用，顯示該化合物具有使乙肝表面抗原轉(zhuǎn)陰、抑制乙肝病毒復(fù)制的功能，從而可能開發(fā)出抗乙肝病毒類藥物。
因此，本發(fā)明可以提供將千里光屬植物中的艾里莫芬烷內(nèi)酯用于制備抑制乙肝表面抗原、抑制乙型肝炎病毒的活性、治療乙型病毒性肝炎的藥物的用途。
本發(fā)明還包括一種用于抑制乙肝表面抗原、治療乙型病毒性肝炎的藥物組合物，該藥物組合物含有治療有效量的作為活性成分的千里光屬植物中的艾里莫芬烷內(nèi)酯，尤其是化合物A、B、C、D和可藥用輔料。這種藥物組合物可以用制藥領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)制成，可以制成各種劑型的藥物組合物，如片劑、顆粒劑、膠囊、口服液、注射劑、透皮貼劑等。這些藥物組合物可以用于降低乙肝表面抗原治、療乙型病毒性肝炎等用途。
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。必須說(shuō)明下述實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1化合物A的制備取2.8公斤干燥的雞足千里光(Senecio tsoongianus Ling)粉碎成粉末，加5倍量95％乙醇浸泡。在室溫下浸泡3次，每次三天。乙醇提取液合并，減壓回收溶劑至干，用1公升水分散，再用60-90°石油醚萃取。減壓回收石油醚得到52克浸膏。取40克該浸膏用600克200-300目硅膠柱層析，石油醚-丙酮(1∶0-0∶1)梯度洗脫。薄層層析檢測(cè)合并相同流份，含有化合物A的部分浸膏再經(jīng)Sephadex LH-20和反相硅膠RP-18純化，最終得到化合物A(32mg)。
化合物A的物理和光譜數(shù)據(jù)無(wú)色針晶，mp.168℃(分解)(CKCl3)；[α]25D＝+12.6°(c0.13，CHCl3)；IR(KBr)3534，2936，2857，1767，1664，1464，1440，1378，1322，1002，922，876，758 cm-1；HREIMS(高分辨電子轟擊質(zhì)譜)C15H20O3計(jì)算值248.3212；實(shí)測(cè)值248.3203；EIMS(電子轟擊質(zhì)譜)248(M+，74)，231(52)，230(50)，220(36)，215(60)，202(21)，192(16)，187(26)，177(52)，175(46)，163(44)，149(51)，139(46)，121(46)，109(61)，91(52)，82(68)，69(100)。
實(shí)施例2化合物B的制備取2.6公斤巖生千里光(Senecio saluenensis)粉碎成粉末，加5倍量95％乙醇浸泡。在室溫下浸泡兩次，每次四天。乙醇提取液合并，減壓回收溶劑至干，用1公升水分散，再用60-90°石油醚萃取。減壓回收石油醚得到46克浸膏。取40克該浸膏用600克200-300目硅膠柱層析，石油醚-丙酮(1∶0-0∶1)梯度洗脫。薄層層析檢測(cè)合并相同流份，含有化合物B的部分浸膏再經(jīng)Sephadex LH-20和反相硅膠RP-18純化，最終得到化合物B(27mg)。
化合物B的物理和光譜數(shù)據(jù)無(wú)色針晶，mp.178℃(分解)(CHCl3)；[α]25D＝+96°(c1.12，CHCl3)；IR(KBr)3477，3213，2965，2924，1759，1730，1716，1645，1446，1257，1223，1161，1140，1075，1034，994，870，740 cm-1；
HREIMS(高分辨電子轟擊質(zhì)譜)C22H30O8計(jì)算值422.4742，實(shí)測(cè)值422.4723；EIMS(電子轟擊質(zhì)譜)340(M-82+，2)，322(4)，304(3)，280(5)，262(28)，244(10)，100(9)，83(100)。
表1.化合物A和化合物B的13C-NMR譜數(shù)據(jù)*C化合物A化合物B134.127.1230.130.0321.370.3434.736.4543.647.2631.972.67149.3 151.68151.3 103.19113.0 43.210 72.974.211 122.9 128.712 172.1 165.513 8.4 8.714 15.512.515 15.712.5*(在氘代丙酮中測(cè)定)20.4 & 170.8(OAc)，170.3(C-1’)，115.0(C-2’)，159.4(C-3’)，20.4(C-4’)，27.4(C-5’)。
表2.化合物A和化合物B的1H-NMR譜數(shù)據(jù)*H 化合物A 化合物B1 1.92m(多重峰)1.75m1’ 1.58m1.57m2 1.36m1.92m2’ 1.42m1.31m3 1.49m5.72brs(寬單峰)3’ 1.82m-
4α 2.23m 1.45dq(雙四重峰)(6.9，3.6)6α 2.64brd(寬雙峰)(13.0) 4.85d(雙峰)(2.4)6β 2.59d(雙峰)(13.0) -9 5.48brs(寬單峰) 2.35m9’ - 2.15m13 1.85d(1.4) 1.92brs14 0.83s(單峰) 1.24s15 0.85d(6.6) 0.95d(6.8)OH 3.76br(寬峰)3.95br+not detected.(未測(cè)得)*OAcδ2.02s，5.67brs(寬單峰)(H-2’)，2.11s(Me-4’)，1.88s(Me-5’)。
實(shí)施例3化合物C和D的制備取2.8公斤干燥的雞足千里光(Senecio tsoongianus Ling)粉碎成粉末，加5倍量95％乙醇浸泡。在室溫下浸泡3次，每次三天。乙醇提取液合并，減壓回收溶劑至干，用1公升水分散，再用60-90°石油醚萃取。減壓回收石油醚得到52克浸膏。取40克該浸膏用600克200-300目硅膠柱層析，石油醚-丙酮(1∶0-0∶1)梯度洗脫。薄層層析檢測(cè)合并相同流份，含有化合物C的部分浸膏再經(jīng)Sephadex LH-20和反相硅膠RP-18純化，最終得到化合物C(42mg)。含有化合物D的部分浸膏再經(jīng)同樣純化方法，最終在丙酮-乙醇(1∶1)溶劑中重結(jié)晶純化得到化合物D(26mg)。
化合物C和D的結(jié)構(gòu)最早由下列研究者分到并報(bào)道。F.Bohlmann and N.L.Van，Phytochemistry，1978，17，1173-1178.發(fā)明人首次報(bào)道從中國(guó)產(chǎn)的千里光屬植物中發(fā)現(xiàn)該兩個(gè)化合物。關(guān)于化合物C和化合物D化學(xué)物理及光譜數(shù)據(jù)列舉如下化合物C無(wú)色針狀晶體，mp.167-168℃(CHCl3).[α]25D＝+141°(c0.81，CHCl3).
IR(KBr)2925，2856，2360，1751，1685，1462，1379，1094，1003 cm-1.EIMS(電子轟擊質(zhì)譜)462(M+，1)，447(0.2)，418(0.3)，391(0.2)，374(0.4)，328(0.4)，303(0.2)，281(0.3)，261(9)，247(0.4)，231(100)，215(12)，203(9)，202(4)，189(9)，175(36)，161(41)，149(36)，91(15).
化合物D無(wú)色針狀晶體，mp.185-186℃(CHCl3).[α]25D＝+90°(c0.64，CHCl3).
IR(KBr)2926，1764，1749，1685，1647，1442，1338，1183，1099，1008，745cm-1.EIMS(電子轟擊質(zhì)譜)462(M+，3)，420(2)，392(4)，378(1)，364(6)，336(2)，247(1)，231(100)，217(5)，215(5)，203(6)，189(8)，175(37)，161(42)，149(37)，131(13)，119(18)，105(19)，91(26)，69(34).
表3化合物C和D的13C-NMR數(shù)據(jù)(100MHz，氘代丙酮作溶劑)C化合物C化合物D*(8β half) 化合物D*(8α half)132.833.733.6226.929.527.6330.731.731.6443.340.144.1545.846.146.0638.133.438.27160.9 160.9 160.9886.786.586.59117.0 115.1 115.610 152.1 156.6 154.911 122.8 124.3 124.012 172.7 174.1 174.113 8.4 8.4 8.414 18.120.518.715 15.416.815.7表4化合物C和D的1H-NMR數(shù)據(jù)HC D(8α一半)D(8β一半)1 2.17m2.19ddd(13.6，13.6，4.2) 2.10 ddd(13.4，13.4，3.3)1′2.15m1.93m1.89m2 1.82m1.77m1.76m2’ 1.45m1.29m1.10m3 1.34m1.31m1.26m3’ 1.55m1.54m1.22m4α 1.71m1.78m1.20m6α 2.35brd(13.0)2.74brs(11.4)2.65d(12.9)
6β 2.67d(13.0) 2.91d(13.9)2.87brd(13.1)9 5.60brs 5.07brs5.5d(1.4)9’ - - -13 1.79brs 1.83d(1.3) 1.82d(1.4)14 0.86s 0.84s 0.84s15 0.93d(6.8)0.92d(7.4) 0.90d(6.9)OH + + +注m(多重峰)；brs(寬單峰)；s(單峰)；d(二重峰)；brd(寬雙峰)；ddd(三疊二重峰)實(shí)施例4愛里莫芬內(nèi)酯化合物A、B、C和D對(duì)乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的抑制活性材料與方法1、體外細(xì)胞模型HepG 2.2.151.1儀器與試劑PE7700自動(dòng)熒光PCR儀，美國(guó)Perkin Elmer公司生產(chǎn)；HBV-DNA熒光定量檢測(cè)試劑盒由中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因診斷中心提供，胎牛血清、DMEM、G418、胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco公司。
1.2體外細(xì)胞模型轉(zhuǎn)染乙肝病毒的2.2.15細(xì)胞株(HepG 2.2.15)由浙江大學(xué)時(shí)屬第一醫(yī)院衛(wèi)生部傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)提供，將HepG 2.2.15細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)液(含10％胎牛血清，380ug/mL G418)，5％CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.3藥物作用HepG 2.2.15細(xì)胞用0.06％胰蛋白酶消化液消化，稀釋成8×104/mL懸液，每孔200uL，兩天后換含藥培養(yǎng)液，藥物濃度分別為100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行孔，每三天換含藥培養(yǎng)基一次，吸取換出的培養(yǎng)上清于-20℃凍存待檢。以同樣條件下不含藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照，以拉米呋啶和阿昔絡(luò)韋作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)試時(shí)吸上清液用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定乙肝病毒表面抗原(HBsAg)，得到結(jié)果如表所示。余下細(xì)胞用MTT法測(cè)定藥物細(xì)胞毒性。試驗(yàn)另設(shè)培養(yǎng)液空白對(duì)照組四孔。
2、MTT法檢測(cè)樣品對(duì)細(xì)胞的毒性；愛里莫芬內(nèi)酯化合物A、B、C、D對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞毒活性細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％的胎牛血清，800,000U/mL青霉素和1mg/mL的鏈霉素。細(xì)胞在37℃，含5％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
細(xì)胞存活率的測(cè)定用改良MTT法，在孵育結(jié)束時(shí)每孔加入20μL MTT[溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑](5mg/mL，用磷酸緩沖液PBS配制)，在37℃條件下繼續(xù)孵育4小時(shí)，然后每孔加入100μL終止液(10％十二烷基硫酸鈉SDS，用1∶1的異丁醇和2M鹽酸配制)以裂解細(xì)胞和溶解甲□(formazan)結(jié)晶。微孔反應(yīng)板在黑暗潮濕的條件下放置過(guò)夜。所形成的甲□用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下比色，細(xì)胞存活率由樣品相對(duì)于對(duì)照的比值計(jì)算。
3、ELISA法(標(biāo)準(zhǔn)HBsAg診斷試劑盒)檢測(cè)樣品對(duì)HBsAg的抑制作用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒檢測(cè)方法加入藥物孵育5，7，14天后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，吸出少許，用ELISA法測(cè)定，在450nm檢測(cè)OD值。測(cè)定HBsAg，結(jié)果以P/N值表示。以同樣條件用不含樣品的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照。將6個(gè)平行孔的P/N比取平均值后，計(jì)算抑制率。
抑制率＝(對(duì)照孔P/N值-實(shí)驗(yàn)孔P/N值)÷(對(duì)照孔P/N值-2.1)4、陽(yáng)性藥物對(duì)照阿昔洛韋(ACV)。
檢測(cè)結(jié)果表5實(shí)施例4中測(cè)試對(duì)HBsAg抑制率的試驗(yàn)結(jié)果樣品編號(hào)最大無(wú)毒濃度TCD0 對(duì)HBsAg抑制率(％)(μg/mL) 100μg/mL 50μg/mL25μg/mL化合物A10058.054.045.0化合物B10076.252.740.4化合物C10036.374.617.3化合物D10038.467.617.2ACV50063.762.327.0備注本試驗(yàn)以抗病毒藥物阿昔洛韋(ACV)作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行比較試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明(1)目前最具價(jià)值的判斷乙型肝炎病毒感染的標(biāo)志有乙型表面抗原與抗體(HBsAg與HBsAb)、乙型肝炎e抗原與抗體(HBeAg與HBeAb)、乙型肝炎核心抗原與抗體(HbcAg與HBcAb)等。其中HBsAg是判斷HBV感染的重要標(biāo)志，抑制HBsAg并使HBsAg轉(zhuǎn)陰反應(yīng)是治療乙型肝炎中的直接目的之一。
(2)樣品A、B、C、D在100μg/mL時(shí)未見對(duì)細(xì)胞的毒性，但因樣品濃變大于100μg/mL時(shí)溶解度較差，故只報(bào)告TCD0(最大無(wú)毒濃度)。分別觀察在100μg/mL時(shí)無(wú)毒的樣品在第5，7，14天對(duì)HBsAg的抑制情況，第14天抑制數(shù)據(jù)見表?？梢娀衔顰、B、C、D對(duì)HBsAg均顯示明顯抑制，且抑制率與樣品濃度有關(guān)。結(jié)論千里光屬植物中的艾里莫芬烷內(nèi)酯A、B、C、D在低濃度下對(duì)HBsAg抑制率均超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照藥品阿昔絡(luò)韋(ACV)，屬于強(qiáng)效的HBsAg抑制劑。
實(shí)施例5.愛里莫芬內(nèi)酯類化合物A、B、C、D對(duì)乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)的抑制試驗(yàn)材料與方法1.1儀器與試劑PE7700自動(dòng)熒光PCR儀，美國(guó)Perkin Elmer公司生產(chǎn)；HBV-DNA熒光定量檢測(cè)試劑盒由中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因診斷中心提供，胎牛血清、DMEM、G418、胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco公司。
1.2體外細(xì)胞模型HepG 2.2.15細(xì)胞株由浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院衛(wèi)生部傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)提供，將HepG 2.2.15細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)液(含10％胎牛血清，380ug/mL G418)，置5％CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.3藥物作用參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行(1.Sells M A，Chen M L，Acs G.Productionof hepatitis B virus particles in HepG2 cells transfected with cloneshepatitis B virus DNA.Proc Natl Acad Sci USA，1987，84(4)1005-1009。2.Caselmann WH，Meyer M，Scholz et al.Type Iinterferons inhibit hepatitisB virus replication and reduce hepatocellular gene expression in culturedliver cells.J Infect Dis，1992.166(5)966-968)。HepG 2.2.15細(xì)胞用胰蛋白酶消化液消化，稀釋成8×104/mL懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200uL，24小時(shí)后，換含藥培養(yǎng)液，藥物濃度分別為0.5mg/mL，0.05mg/mL，0.005mg/mL，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，留取培養(yǎng)上清于-20℃凍存待檢。以同樣條件下不含藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照，以拉米呋啶和阿昔絡(luò)韋作為陽(yáng)性對(duì)照，用同樣的方法測(cè)定其對(duì)HBV的抑制作用。
1.4 HBV-DNA定量采用常規(guī)堿裂解法從培養(yǎng)上清中提取HBV-DNA。按試劑說(shuō)明書操作，50μL反應(yīng)體積中含30uL反應(yīng)緩沖液，5uL MgCl2，5uL引物和探針，7uL樣品處理上清液和3uL Taq酶。各反應(yīng)管放入PCR儀中，按下列條件擴(kuò)增92℃2分鐘預(yù)變性，然后按93℃45秒-55℃120秒，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，由電腦自動(dòng)分析計(jì)算出結(jié)果。
1.5試驗(yàn)結(jié)果 愛里莫芬內(nèi)酯類化合物A、B、C、D對(duì)乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)的抑制試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。
表6與藥物作用24小時(shí)后的HBV-DNA樣品編號(hào)0.5mg/mL 0.05mg/mL 0.005mg/mL拉米呋啶(LAM) 2.2×1031.2×1045.9×105化合物A 3.2×1051.0×1061.8×107化合物B 1.4×1044.2×1056.7×106化合物C 3.5×1044.4×1068.2×102化合物D 3.2×1054.5×1056.6×106阿昔絡(luò)韋(ACV) 6.0×1053.9×1051.6×106對(duì) 照 7.6×1078.8×1073.3×108注HBV-DNA中的數(shù)值代表每毫升中的病毒顆粒數(shù)。
試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明結(jié)論千里光屬植物中的艾里莫芬烷內(nèi)酯在低濃度下作用24小時(shí)后對(duì)HBV-DNA均有一定的抑制活性，其中化合物B活性超過(guò)作為陽(yáng)性對(duì)照藥物之一的阿昔絡(luò)韋，化合物D則在相同濃度下對(duì)HBV-DNA抑制活性與阿昔絡(luò)韋相同。但是所有化合物對(duì)HBV-DNA抑制活性比較陽(yáng)性對(duì)照藥品拉米呋啶要差，屬于有一定活性的HBV-DNA抑制劑。
實(shí)施例5.藥物組合物(例如片劑或注射劑)的制備方法千里光屬植物中的艾里莫芬烷內(nèi)酯按照一般制藥藥劑學(xué)要求，用藥用輔料進(jìn)行壓片，每片含主藥0.1-10mg，此處主藥指以化合物A、B、C、D單體及它們的組合物或者根據(jù)其內(nèi)酯結(jié)構(gòu)進(jìn)行的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)改造后的衍生物。用含有權(quán)利要求2中化合物的化合物(以化合物A為例)2,000mg，按照藥劑學(xué)一般壓片法混勻后加輔料8,000mg，壓制成100片。每片重100mg。
用含有權(quán)利要求2中化合物的化合物(以化合物B為例)2,000mg，按照常規(guī)藥劑學(xué)要求，進(jìn)行活性炭吸附，經(jīng)0.65μ微孔濾膜過(guò)濾后，填入氮?dú)夤嘌b成水針制劑。每只針劑灌裝2ml，共灌裝1000安瓿。
權(quán)利要求
1.千里光屬植物中的艾里莫芬烷內(nèi)酯用于制備治療乙型病毒性肝炎、抑制乙肝表面抗原的藥物的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述千里光屬植物中的艾里莫芬烷內(nèi)酯是下面的化合物A，B，C，D，或者它們的可藥用鹽，或它們的混合物
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述千里光屬植物中的艾里莫芬烷內(nèi)酯是10α-羥基-愛里莫芬-8，7(11)-二烯-8，12-內(nèi)酯(化合物A)；8β，10β-二羥基-3β-乙酰氧基-6β-當(dāng)歸酰氧基-愛里莫芬-7(11)-烯-8，12-內(nèi)酯(化合 物B)；8′α-[愛里莫芬-7′(11′)，9′-二烯-8β，12-內(nèi)酯基]-愛里莫芬-7(11)，9-二烯-8β，12-內(nèi)酯(化合物C)；8′β-[愛里莫芬-7′(11′)，9′-二烯-8α，12-內(nèi)酯基]-愛里莫芬-7(11)，9-二烯-8β，12-內(nèi)酯(化合物D)。
4.一種用于治療乙型病毒性肝炎、抑制乙肝表面抗原的藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的權(quán)利要求1-3之一的千里光屬植物中的艾里莫芬烷內(nèi)酯和可藥用輔料。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的藥物組合物，其可以是片劑、顆粒劑、膠囊、口服液、注射劑、透皮貼劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及千里光屬植物中的艾里莫芬烷內(nèi)酯抑制乙肝病毒的用途及其藥物組合物。本發(fā)明人從千里光屬植物中提取分離得到艾里莫芬烷型倍半萜內(nèi)酯，并發(fā)現(xiàn)其具有抑制乙肝病毒氧核糖核酸HBV－DNA以及降低乙肝病毒表面抗原HBsAg的活性。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這種艾里莫芬烷型倍半萜內(nèi)酯可以用于抑制乙肝表面抗原、治療乙型病毒性肝炎，通常以含有這種內(nèi)酯的藥物組合物形式使用。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1582921SQ0315369
公開日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2003年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月22日
發(fā)明者趙昱, 李海波, 楊雷香, 周長(zhǎng)新, 白驊 申請(qǐng)人:浙江海正天華新藥研發(fā)有限公司