專利名稱：β－(3,4－二羥基苯基)－α－羥基丙酸冰片酯、其合成方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治心腦血管疾病的藥物β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯及其合成方法和用途。
背景技術(shù)：
丹參是一種療效明確的治療心腦血管疾病的中藥，目前普遍認(rèn)為丹參素(其化學(xué)名稱為β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸)是丹參水溶性組分的主要活性成分，藥理試驗(yàn)表明，丹參素的療效不顯著。因此，對丹參素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，有可能提高其在防治心腦血管疾病方面的療效。
中國專利申請200410026205中提供一種β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯及其制備方法。該方法從丹參在人血清中的主要代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)并篩選出具有治療效果的β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯，設(shè)計(jì)了它的合成路線，并合成出了此化合物。
冰片可以通過心腦屏障，而丹參不易通過心腦屏障，因此在丹參素的結(jié)構(gòu)中，增加冰片的化學(xué)結(jié)構(gòu)對丹參素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，其改性物β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯用于心腦血管疾病的預(yù)防和治療，效果將可能十分顯著。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯的合成路線，并合成出了β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯，將其用于心腦血管疾病的預(yù)防和治療。
化合物β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯，其結(jié)構(gòu)式為 上述化合物β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯的合成方法如下將β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸與冰片在催化量的催化劑存在下反應(yīng)得到。
所述的催化劑為路易斯酸催化劑，如甲基苯磺酸、S2O82-/ZrO2、三氯化鋁或氯化鋅；β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸與冰片反應(yīng)摩爾比為1∶1～1∶1.5，反應(yīng)在溶劑四氫呋喃、甲苯、1，4-二氧六環(huán)或N，N-二甲基甲酰胺中進(jìn)行，反應(yīng)溫度根據(jù)選擇溶劑的不同而變化，控制在65℃～150℃，反應(yīng)8h～12h。
催化劑S2O82-/ZrO2的制備方法如下在0-10℃下，將氨水加至ZrOCl2溶液中，至pH值9-12，陳化，洗滌沉淀至無Cl-，烘干、研磨后置于(NH4)2S2O8溶液中浸泡，過濾、干燥、研磨，于500-700℃培燒2-5h制得S2O82-/ZrO2。
上述化合物用于制備預(yù)防和治療心腦血管疾病的藥品。


圖1β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯的合成路線2β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯的質(zhì)譜3β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯紅外光譜圖具體實(shí)施方式
以下結(jié)合合成實(shí)例及藥效學(xué)試驗(yàn)報(bào)告對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
實(shí)施例1β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯合成路線如附圖1所示。
(1)乙酰甘氨酸的合成在250mL三口瓶中加入0.33mol甘氨酸和100mL蒸餾水，劇烈攪拌至溶解，攪拌下緩慢滴加0.67mol醋酸酐，繼續(xù)劇烈攪拌50min。抽濾、洗滌、干燥，得白色晶體，收率86.0％。
(2)2-甲基-4-(3，4-二乙酰氧基芐叉基)噁唑酮的合成取3，4-二羥基苯甲醛0.20mol、乙酰甘氨酸0.24mol和無水醋酸鈉0.26mol于250mL三口瓶中，加入醋酸酐189mL，攪拌混勻，在80℃水浴中攪拌反應(yīng)4h，然后升溫至100℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)1h，冷至室溫后將其放入冰箱中冷卻。向其中加入100ml水并攪拌，底部有黃色晶體析出，抽濾、洗滌、干燥，得黃色晶體，收率75.0％。
(3)β-(3，4-二乙酰氧基苯基)-α-乙酰氨基丙烯酸的合成在燒瓶中加入0.15mol 2-甲基4-(3，4-二乙酰氧基芐叉基)噁唑酮、166mL丙酮和166mL蒸餾水，緩慢加熱至沸，加熱回流3h。活性炭脫色，濾液放置結(jié)晶。抽濾、洗滌、干燥，得米黃色結(jié)晶性粉末，收率72.9％。
(4)β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酮酸的合成取0.25molβ-(3，4-二乙酰氧基苯基)-α-乙酰氨基丙烯酸，加入1mol·L-1鹽酸1500mL，攪拌下加熱回流8h。活性炭脫色，抽濾，濾液濃縮至有晶體析出。抽濾、洗滌、干燥，得白色疏松狀晶體，收率48.1％。
(5)β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸的合成取0.17molβ-(3，4-二羥基苯基)丙酮酸，加入112g鋅汞齊和1808mL 1.4mol·L-1鹽酸溶液，加熱回流反應(yīng)8h。過濾后，濾液用乙酸乙酯反復(fù)萃取，并用無水Na2SO4干燥，除去乙酸乙酯，得β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸。
(6)β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯的合成在三口瓶中加入0.12molβ-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸和0.18mol冰片，然后加入催化劑對甲基苯磺酸0.86g，四氫呋喃500mL，65℃下反應(yīng)8h。反應(yīng)結(jié)束后除去催化劑、溶劑和未反應(yīng)的冰片，得棕色粘稠物，柱色譜分離得淡黃色油狀物。
(7)β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯的質(zhì)譜和紅外光譜圖2為化合物質(zhì)譜圖，可以看出351.7是(M+H2O)的分子離子峰，它的分子量為333.69，與β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯相符合。圖3紅外光譜(υ/cm-1)表明3363.61(OH)，2953.12(CH3)，2913.90(CH2)，1725.51(C＝O)，1608.20、1521.53、1450.32(苯環(huán)骨架)，1281.36(酯的C＝O)，1114.39(仲羥基C-O)，885.71和805.68(1，2，4-苯環(huán)三取代)。上述表征證明合成得到了β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯。
實(shí)施例2在三口瓶中加入0.12molβ-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸和0.15mol冰片，然后加入催化劑對甲基苯磺酸0.86g，四氫呋喃500mL，65℃下反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后減壓蒸餾除去反應(yīng)溶劑，所得粘稠狀物質(zhì)在沸水浴下由油泵(1.3×10-3Pa)抽除冰片，然后加入200mL乙酸乙酯，所得溶液用飽和NaHCO3洗滌以除去未反應(yīng)的β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸和對甲基苯磺酸，減壓濃縮所得乙酸乙酯層，得棕色粘稠物，柱色譜分離得淡黃色油狀物。產(chǎn)品的質(zhì)譜與紅外光譜如附圖2和3所示。
實(shí)施例3催化劑S2O82-/ZrO2的制備方法如下取0.025mol ZrOCl2·8H2O配制成1mol·L-1的ZrOCl2溶液，在冰水浴中攪拌，慢慢滴入6mol·L-1的氨水，直至pH值至10，陳化12h，抽濾，用蒸餾水洗滌沉淀至無Cl-為止(用0.1mol·L-1AgNO3檢驗(yàn))。將沉淀在110℃下烘10h，研細(xì)，然后用0.5mol·L-1(NH4)2S2O8溶液浸泡12h，抽濾，干燥，研細(xì)，在馬弗爐中600℃下培燒3h即制得S2O82-/ZrO2。
在三口瓶中加入0.1molβ-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸和0.12mol冰片，然后加入1.33g催化劑S2O82-/ZrO2，1，4-二氧六環(huán)400ml，于100℃下反應(yīng)8h。反應(yīng)結(jié)束后抽濾除去催化劑S2O82-/ZrO2，然后減壓蒸餾除去溶劑，所得粘稠狀物質(zhì)在沸水浴下由油泵(1.3×10-3Pa)抽除冰片，得黑棕色粘稠物，柱色譜分離得淡黃色油狀物。產(chǎn)品的質(zhì)譜與紅外光譜與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例4在三口瓶中加入0.06molβ-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸和0.09mol冰片，然后加入催化劑三氯化鋁0.60g，溶劑N，N-二甲基甲酰胺200ml，于150℃下反應(yīng)10h。反應(yīng)結(jié)束后減壓蒸餾除去溶劑，所得粘稠狀物質(zhì)在沸水浴下由油泵(1.3×10-3Pa)抽除冰片，得黑棕色物質(zhì)，再經(jīng)柱色譜分離得淡黃色油狀物。產(chǎn)品的質(zhì)譜與紅外光譜與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例5藥效學(xué)試驗(yàn)(1)對大腦中動(dòng)脈阻斷大鼠腦微循環(huán)血流量的影響SD大鼠60只，體重220±20g。隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、丹參素注射液組(ip1mL/kg)和β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯小、中、大劑量組(ip5、15、35mg/kg)。正常對照組和模型對照組ip等體積生理鹽水。動(dòng)物腹腔注射1％戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉，仰臥位，頭部固定，延頸中線切口皮膚，行氣管插管，自主呼吸。分離右側(cè)頸總靜脈及頸總動(dòng)脈，穿線備用。將動(dòng)物固定于大鼠立體定位儀上，于右側(cè)顳頂部用牙科鉆鉆開一直徑為6×8mm大小的顱窗，止血后剪開硬腦膜，暴露軟腦膜，玻璃及牙科水泥覆蓋密閉，將激光多普勒微循環(huán)血流計(jì)的激光探頭固定于顱窗上。之后動(dòng)物取側(cè)臥位固定，將右側(cè)頸總動(dòng)脈提起，結(jié)扎近心端，小心剪開頸總動(dòng)脈，將一直徑約0.3mm的尼龍線，穿入動(dòng)脈，穿線前標(biāo)記從動(dòng)脈切口到眼外眥的距離，將尼龍線穿入至接近標(biāo)記位置時(shí)，應(yīng)減慢穿線速度，并同時(shí)觀察激光多普勒微循環(huán)血流分析儀所顯示的腦微循環(huán)血流量，穿到大腦中動(dòng)脈時(shí)可出現(xiàn)微循環(huán)灌流量的突然下降，出現(xiàn)微循環(huán)血流量下降后，再向內(nèi)穿入約1mm，然后將切口的遠(yuǎn)心端及動(dòng)脈內(nèi)的絲線牢固結(jié)扎，剪去多余的絲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，查看尼龍線是否阻塞大腦中動(dòng)脈的起始部，未阻塞動(dòng)脈者實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作廢；對照組不做處理。顱窗制備完畢后，將JI2200型激光多普勒微循環(huán)血流儀探頭固定于顱窗處，并維持探頭在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中無位移及轉(zhuǎn)動(dòng)，記錄該區(qū)結(jié)扎前及結(jié)扎后5、15、30、45和60min時(shí)的微循環(huán)血流量，用藥組記錄時(shí)間相同。以觀測時(shí)間1min內(nèi)的平均微循環(huán)灌流量為該觀察時(shí)間的微循環(huán)灌流量。
表1對大腦中動(dòng)脈阻斷大鼠腦微循環(huán)血流量的影響(n＝10)

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01本實(shí)驗(yàn)顯示，阻斷大腦中動(dòng)脈后，供血區(qū)(額頂葉)腦微循環(huán)血流量迅速下降，并維護(hù)一較低水平，至阻斷后30min腦微循環(huán)血流量才有所增加，但增加幅度較低，說明腦缺血模型成功；β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯15mg/kg 30min和35mg/kg 15min后腦微循環(huán)血流量均明顯增加。提示擴(kuò)張微動(dòng)脈，增加微循環(huán)的血流量，缺血性腦血管疾病可能具有較好的的作用，但作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。
(2)對心臟缺血再灌注損傷(I/R)的保護(hù)作用SD大鼠52只，體重220±20g。隨機(jī)分為模型對照組、丹參素注射液組(im 1mL/kg)和β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯小、中、大劑量組(ip5、15、35mg/kg)。正常對照組和模型對照組ip等體積生理鹽水。各組連續(xù)給藥5d。末次給藥的同時(shí)，用1.5％戊巴比妥鈉麻醉大鼠(ip45mg/kg)，右頸動(dòng)脈插管，經(jīng)換能器連接八導(dǎo)生理記錄儀，氣管插管，通氣頻率60次/min，開胸，以6/0線，在距冠狀動(dòng)脈前降支根部1mm～2mm系一個(gè)袢，其間穿過一塑料管，拉緊袢，觀察心電圖變化，ST抬高或降低均為結(jié)扎成功，結(jié)扎線以下心肌組織顏色變暗。30min后拔出塑料管，使冠狀動(dòng)脈血流再通，再灌時(shí)局部組織充血。對于缺血30min再灌注30min組，分別記錄實(shí)驗(yàn)前、缺血1min和30min、再灌30min測定心肌梗死面積；對于缺血30min再灌注2h組，取心臟組織，用10％福爾馬林固定后，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，分別行免疫組化檢測；假手術(shù)組只穿線，但不結(jié)扎冠脈。
對心肌I/R心肌梗死范圍的影響大鼠經(jīng)30min缺血和30min再灌注后重先結(jié)扎冠脈前降支，處死動(dòng)物，迅速取下心臟，將1％伊文思藍(lán)0.5mL經(jīng)主動(dòng)脈注入心腔，以區(qū)分缺血區(qū)和非缺血區(qū)。剪去心房和右室，-20℃冷藏30min，將心臟放入特制的切片槽內(nèi)，沿長軸切成2mm的薄片，切片浸入1％的TTC磷酸緩沖液中(pH值7.4)，37℃孵育30min，以區(qū)分危險(xiǎn)區(qū)和壞死區(qū)。然后用10％的甲醛固定24h，以增強(qiáng)染色顏色對比照相。經(jīng)處理后，心肌組織被分為蘭色為正常心肌，淺紅色為缺血心肌，灰白色為壞死心肌。通過計(jì)算機(jī)圖像分析軟件計(jì)算梗死心肌(nec)占危險(xiǎn)區(qū)心肌(即缺血心肌，包括缺血梗死區(qū)和缺血未梗死區(qū)心肌，aar)的面積百分比(nec/aar)及梗死心肌占整個(gè)心肌面積百分比(nec/lv)來表示梗死程度，同時(shí)計(jì)算危險(xiǎn)區(qū)心肌占左室面積百分比(aar/lv)。
表2對心肌I/R心肌梗死面積的影響

與模型對照組比較*P＜0.05結(jié)果表明，與模型組比較，大劑量組aar/lv、nec/lv和nec/aar分別下降22.5％、20.4％和22％(P＜0.01)，提示可減少心肌I/R心肌梗死面積。
對Bax、Bcl-2、caspase-3、MMP-2和PPARγ蛋白質(zhì)表達(dá)的影響采用標(biāo)準(zhǔn)免疫組化ABC和SP法染色。Bax抗兔多克隆抗體(Santa CruzBio.Inc.)，稀釋度為1∶200；Bcl22抗兔多克隆抗體(TBD天津生物技術(shù)中心)，稀釋度為1100；caspase-3抗兔多克隆抗體(Normarkers Fromont，CA)，稀釋度為1∶200；MMP-2抗小鼠單克隆抗體(Normarkers Fromont，CA)，稀釋度為1∶200；PPARγ抗羊多克隆抗體(Santa Cruz Bio.Inc.)，稀釋度為1∶500。具體步驟按ABC和SP試劑盒說明書操作，DAB顯色，中性樹脂封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。檢測內(nèi)容陽性表達(dá)的細(xì)胞為棕黃色，MMP-2蛋白在胞漿內(nèi)，Bcl-2為核膜和胞漿表達(dá)，Bax主要存在胞漿，部分在胞核表達(dá)，caspase-3主要在胞核表達(dá)，部分在胞漿表達(dá)。用CMIAS圖像分析系統(tǒng)對切片進(jìn)行隨機(jī)選場、自動(dòng)采點(diǎn)分析，以所得心肌組織切片平均光密度值或積分光密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。
表3 對Bax、Bcl-2、caspase-3、MMP-2、和PPARγ蛋白質(zhì)表達(dá)的影響(n＝10)

與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01本實(shí)驗(yàn)表明心肌細(xì)胞I/R確實(shí)存在Bcl-2和Bax表達(dá)的變化，說明它們參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯能減少Bax、caspase-3蛋白質(zhì)的表達(dá)，增加Bcl-2蛋白質(zhì)表達(dá)，提示β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯能夠通過誘導(dǎo)Bcl-2表達(dá)和減少Bax、caspase-3來調(diào)動(dòng)細(xì)胞對抗損傷的自我保護(hù)機(jī)制，逆轉(zhuǎn)心肌I/R所啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡和壞死過程，而對心肌細(xì)胞起保護(hù)作用。
MMP-2與心肌I/R損傷有關(guān)，且是通過裂解肌鈣蛋白I實(shí)現(xiàn)的，而肌鈣蛋白I的裂解可直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。特異性MMP-2抑制劑可使大鼠心肌I/R心臟功能得以改善，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯作用后減少M(fèi)MP-2蛋白質(zhì)，這可能為β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯抗心肌I/R損傷的另一機(jī)制。
權(quán)利要求
1.結(jié)構(gòu)式(I)表示的化合物β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯
2.權(quán)利要求1所述化合物β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯的合成方法，其特征在于將β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸與冰片在催化量的催化劑存在下反應(yīng)得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯的合成方法，其特征在于所述的催化劑為路易斯酸催化劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯的合成方法，其特征在于所述的路易斯酸催化劑為對甲基苯磺酸、S2O82-/ZrO2、三氯化鋁或氯化鋅。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯的合成方法，其特征在于β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸與冰片摩爾比為1∶1～1∶1.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯的合成方法，其特征在于反應(yīng)在溶劑四氫呋喃、甲苯、1，4-二氧六環(huán)或N，N-二甲基甲酰胺中進(jìn)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸冰片酯的合成方法，其特征在于反應(yīng)在65℃～150℃反應(yīng)8h～12h。
8.權(quán)利要求1所述化合物用于制備預(yù)防和治療心腦血管疾病的藥品。
全文摘要
本發(fā)明公開了結(jié)構(gòu)式(I)表示的化合物β－(3，4－二羥基苯基)－α－羥基丙酸冰片酯及其合成方法和用途。其合成方法如下將β－(3，4－二羥基苯基)－α－羥基丙酸與冰片在催化量的催化劑存在下反應(yīng)得到，催化劑為路易斯酸催化劑，如對甲基苯磺酸、S
文檔編號A61P9/00GK1868998SQ20061004278
公開日2006年11月29日 申請日期2006年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月15日
發(fā)明者鄭曉暉, 張群正, 王世祥, 趙新鋒 申請人:西北大學(xué)