專利名稱：一種治療男性禿發(fā)藥物的制備方法及其在臨床中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物的制備方法，特別是涉及一種治療男性禿發(fā)藥物的制備方法及其在臨床中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
男性禿發(fā)是中老年男性臨床常見的一種疾病，目前還沒有一種有效治療方法。由于生活節(jié)奏的加快，男性禿發(fā)還有進(jìn)一步升高的趨勢。
一般認(rèn)為，人毛乳頭細(xì)胞(dermal papilla cells，DPC)在毛囊的發(fā)育及周期性生長調(diào)控中起重要作用。要闡明人毛乳頭細(xì)胞對調(diào)節(jié)毛囊生長和發(fā)育的機制，必須從人毛乳頭細(xì)胞自身分泌的生物活性成份著手，這也是今后毛囊研究的重要內(nèi)容之一。我們在建立人毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)模型基礎(chǔ)上，應(yīng)用低傳代人毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)上清制成條件培養(yǎng)基，觀察其對不同傳代的人毛乳頭細(xì)胞生長狀態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液(dermal papilla cellconditional medium DPCCM)能將非凝集生長的人毛乳頭細(xì)胞有效誘導(dǎo)為凝集性生長狀態(tài)，并促進(jìn)細(xì)胞增殖。為進(jìn)一步分析人毛乳頭細(xì)胞生長活性蛋白的體內(nèi)生物學(xué)活性，我們將人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液制成凍干粉，初步應(yīng)用于男性禿發(fā)患者，發(fā)現(xiàn)其有改善男性禿發(fā)的治療效果。
鑒于上述，本發(fā)明的目的在于提供一種治療男性禿發(fā)藥物的制備方法。本發(fā)明的另一目的在于男性禿發(fā)藥物在臨床中的應(yīng)用。
本發(fā)明藥物的制備方法及其臨床應(yīng)用是通過以下步驟來實現(xiàn)的(1).試劑和材料低糖培養(yǎng)基(DMEM)購自Sigma公司。Hepes購自BoehringerMannheim公司。健康人AB型血清第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院輸血科提供。
(2).藥物制備的方法2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備2.1.1人AB型血清的制備a)采集健康獻(xiàn)血員(經(jīng)查排除HIV、HBV、HCV、梅毒螺旋體感染)全血200ml入無抗凝劑的血袋；
b)將全血血袋37℃水箱中放置1小時；c)2000rpm離心30分鐘；d)用血清分離器分離人AB型血清，所分離的人AB型血清可放入-20℃冷凍箱備用，也可直接行下例步驟h)；e)將人AB型血清袋從-20℃冷凍箱中取出，放入4℃冷藏箱中12小時；f)將人AB型血清室溫放置2小時；g)將人AB型血清在37℃水箱中放置1小時；h)將人AB型血清在56℃水箱中放置1小時去除補體，其上下溫差應(yīng)小于0.5℃；i)在超凈臺上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空干；j)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中；k)用吸管分裝為15ml/瓶，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 上述人AB型血清制備的步驟也可為l)采集健康獻(xiàn)血員全血200ml入無抗凝劑的血袋；m)將全血血袋37℃水箱中放置1小時；n)2000rpm離心30分鐘；o)用血清分離器分離人AB型血清，所分離的AB型血清可放入-20℃冷凍箱備用；p)將人AB型血清袋從-20℃冷凍箱中取出，放入4℃冷藏箱中12小時；q)將人AB型血清室溫放置2小時；r)將人AB型血清在37℃水箱中放置1小時；s)將人AB型血清在56℃水箱中放置1小時去除補體，其上下溫差應(yīng)小于0.5℃；t)在超凈臺上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空干；u)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中；v)用吸管分裝為15ml/瓶，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 2.1.2基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備將15ml人AB型血清與85ml低糖培養(yǎng)基(DMEM)，0.24gHepes，0.2g碳酸氫鈉，0.03g L-谷氨酰胺混勻后，用0.22微米孔徑的微孔濾膜過濾除菌，直接使用或-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 2.2人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液的收集(1)取意外死亡的正常健康青年(經(jīng)查排除HI、HBV、HCV、梅毒螺旋體感染)枕后一手掌大小頭皮，用二步酶法分離人毛乳頭細(xì)胞(參見鐘白玉，楊希川，楊衛(wèi)兵，等。二步酶消化法分離人頭皮毛乳頭細(xì)胞[J]。中華皮膚科雜志，2003；36(7)406。)；(2)培養(yǎng)時在50ml培養(yǎng)瓶中加入5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，100ml培養(yǎng)瓶中加入7ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，3天換一次基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(3)開啟超凈臺并用紫外線消毒30分鐘，操作時著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒雙手后在超凈臺上將低傳代毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清從培養(yǎng)瓶中無菌倒入50ml無菌離心管中，用旋絲口蓋蓋上離心管并擰緊，在IK16型離心機(美國SIGMA公司)中3000rpm離心10分鐘；(4)在超凈臺上打開離心管，用無菌吸管吸出離心管中的上清(小心不能攪起底部的沉淀)，移入無菌玻璃容器中，加無菌橡皮塞后，作好標(biāo)記，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 2.3人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液凍干粉的制備(1)凍干室紫外線消毒4小時；(2)操作時著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒雙手后在超凈臺上用無菌吸管將人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液分為3ml/凍干瓶，蓋上瓶塞且留出凍干孔；(3)將凍干瓶放入凍干機中；(4)凍干過程I -40℃ 4小時II -20℃ 3小時 (開始抽真空至結(jié)束)III-5℃ 10小時IV 5℃ 4小時V 15℃ 3小時VI 25℃ 5小時(5)在真空環(huán)境下，真空封包凍干瓶；(6)打開凍干機凍干室門，取出凍干瓶，加瓶蓋并加壓封包瓶塞；(7)貼上標(biāo)簽，注明標(biāo)識和日期，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 治療男性禿發(fā)藥物的理化特性為顏色白色；
形態(tài)粉末狀；pH值7.35；溶解度每瓶用3ml生理鹽水在3秒鐘內(nèi)可完全溶解，溶解后液體為橙紅色。
本發(fā)明的優(yōu)點和產(chǎn)生的有益效果是人毛乳頭細(xì)胞為分泌性細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時可分泌許多蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可促進(jìn)毛囊的生長和發(fā)育，在體外實驗我們已證明其有確切的生物學(xué)活性，但其應(yīng)用于臨床還未見報道，我們在原有的培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞的基礎(chǔ)上，改進(jìn)其培養(yǎng)基，用人AB型血清替代小牛血清，成功地培養(yǎng)出人毛乳頭細(xì)胞，我們收集培養(yǎng)過低傳代人毛乳頭細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用于臨床治療男性禿發(fā)，觀察其治療效果，發(fā)現(xiàn)有確切的治療作用，取得了良好的經(jīng)濟效益和社會效益。
應(yīng)用本發(fā)明制備的藥物在治療男性禿發(fā)中有明顯的療效，本藥物所用細(xì)胞和培養(yǎng)血清均對人體均無抗原性，用于人體無任何過敏反應(yīng)，本發(fā)明用含人AB型血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞，較以前用小牛血清培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞在技術(shù)上取得了突破，為本藥物應(yīng)用于臨床奠定了基礎(chǔ)，這也是本發(fā)明關(guān)鍵技術(shù)的核心所在。此外，本發(fā)明所用藥物為皮下注射，其有效藥物利用度大大提高，其制備工藝十分考究，實用性強，能為廣大患者服務(wù)。


圖1為本發(fā)明男性禿發(fā)治療前示意2為本發(fā)明男性禿發(fā)治療后示意圖具體實施方式
使用前依照上述藥物制備的方法進(jìn)行藥物的配制每瓶凍干粉用3ml生理鹽水溶解(恢復(fù)凍干前原始濃度)。
(1)、藥物的生物安全性實施例1.1小鼠急性毒性試驗我們選用7～9周齡、體重為18～22g的昆明種小鼠。按預(yù)試驗公比0.8設(shè)立50.0ml/kg、40.0ml/kg、32.0ml/kg、25.6ml/kg、20.5ml/kg等5個劑量組，每組10只小鼠，雌雄各半。單次腹腔注射，藥后立即觀察、記錄動物的中毒反應(yīng)、死亡情況及時間，連續(xù)觀察14天。
1.2家兔熱原試驗選3只體重為1.8～2.4kg的日本大耳白家兔。按10ml/kg耳靜脈注射給藥。測量家兔肛門體溫，深度為6厘米，以后每隔1小時測量體溫1次，共3次。
1.3細(xì)菌培養(yǎng)隨機抽取5支凍干瓶，無菌生理鹽水溶解，4道劃線法接種于普通血平板上，培養(yǎng)48小時后觀察結(jié)果。
1.4真菌培養(yǎng)隨機抽取5支凍干瓶，無菌生理鹽水溶解，接種于沙堡氏培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10日后觀察結(jié)果。
1.5結(jié)果小鼠急性毒性試驗顯示在腹腔注射不同劑量人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液樣品溶液后，各組動物未發(fā)現(xiàn)明顯的中毒癥狀，在整個試驗期限內(nèi)無動物死亡或其它異常征象。家兔熱原試驗顯示在耳靜脈注射人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液樣品溶液后，各動物的體溫變化均符合熱原試驗的要求。細(xì)菌和真菌培養(yǎng)均未見細(xì)菌和真菌生長。
(2)、藥物的臨床應(yīng)用(1)治療男性禿發(fā)藥物的理化特性為顏色白色；形態(tài)粉末狀；pH值7.35；使用前依照上述藥物制備的方法進(jìn)行藥物的配制每瓶凍干粉用3ml生理鹽水溶解(恢復(fù)凍干前原始濃度)。藥物溶解度每瓶用3ml生理鹽水在3秒鐘內(nèi)可完全溶解，溶解后液體為橙紅色。
(2)治療方案選擇50例年齡在40～68歲的男性禿發(fā)患者為試驗對象，常規(guī)消毒患部皮膚后皮下多點注射，每周1次，每個患部(直徑小于5厘米)每次最多3ml，共4次，治療完成后觀察6個月。
人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液在通過生物安全鑒定后，我們在患者知情同意的情況下應(yīng)用于患部。50例人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液治療的男性禿發(fā)患者中，除6例無效外其余均有一定療效。
權(quán)利要求
1.一種治療男性禿發(fā)藥物的制備方法，其特征在于用含人AB型血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)低傳代人毛乳頭細(xì)胞，收集低傳代人毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清，將所收集上清液制備成凍干粉；(1)上述人AB型血清制備的步驟為a)采集健康獻(xiàn)血員全血200ml入無抗凝劑的血袋；b)將全血血袋37℃水箱中放置1小時；c)2000rpm離心30分鐘；d)用血清分離器分離人AB型血清；e)將人AB型血清在56℃水箱中放置1小時去除補體，注意其上下溫差應(yīng)小于0.5℃；f)在超凈臺上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空干；g)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中；h)用吸管分裝為15ml/瓶，-20℃凍存?zhèn)溆茫?2)上述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備方法基礎(chǔ)培養(yǎng)基將15ml人AB型血清與85ml低糖培養(yǎng)基(DMEM)，0.24gHepes，0.2g碳酸氫鈉，0.03g L-谷氨酰胺混勻后，用0.22微米孔徑的微孔濾膜過濾除菌，直接使用或-20℃凍存?zhèn)溆茫?3)人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液的收集過程為a)取意外死亡的正常健康青年枕后一手掌大小頭皮，用二步酶法分離人毛乳頭；b)培養(yǎng)時在50ml培養(yǎng)瓶中加入5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，100ml培養(yǎng)瓶中加入7ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，3天換一次基礎(chǔ)培養(yǎng)基；c)開啟超凈臺并用紫外線消毒30分鐘，操作時著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒雙手后在超凈臺上將低傳代人毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清從培養(yǎng)瓶中無菌倒入50ml無菌離心管中，用旋絲口蓋蓋上離心管并擰緊，在離心機中離心；d)在超凈臺上打開離心管，用無菌吸管吸出離心管中的上清，移入無菌玻璃容器中，加無菌橡皮塞后，作好標(biāo)記，-20℃凍存?zhèn)溆谩?4)人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液的凍干過程為a)凍干室紫外線消毒4小時；b)操作時著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒雙手后在超凈臺上用無菌吸管將藥物分為3ml/凍干瓶，蓋上瓶塞且留出凍干孔；c)將凍干瓶放入凍干機中；d)連續(xù)凍干過程I -40℃4小時II-20℃3小時III -5℃ 10小時IV5℃ 4小時V 15℃ 3小時VI25℃ 5小時e)在真空環(huán)境下，真空封包凍干瓶；f)打開凍干機凍干室門，取出凍干瓶，加瓶蓋并加壓封包瓶塞；g)貼上標(biāo)簽，注明標(biāo)識和日期，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療男性禿發(fā)藥物的制備方法，上述人AB型血清制備的步驟也可為a)采集健康獻(xiàn)血員全血200ml入無抗凝劑的血袋；b)將全血血袋37℃水箱中放置1小時；c)2000rpm離心30分鐘；d)用血清分離器分離人AB型血清，所分離的AB型血清可放入-20℃冷凍箱備用；e)將人AB型血清袋從-20℃冷凍箱中取出，放入4℃冷藏箱中12小時；f)將人AB型血清室溫放置2小時；g)將人AB型血清在37℃水箱中放置1小時；h)將人AB型血清在56℃水箱中放置1小時去除補體，其上下溫差應(yīng)小于0.5℃；i)在超凈臺上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空干；j)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中；k)用吸管分裝為15ml/瓶，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 3.一種治療男性禿發(fā)藥物在臨床中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藥物的制備方法，特別是涉及一種治療男性禿發(fā)藥物的制備方法。藥物的前體為含15％人AB型血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，該基礎(chǔ)培養(yǎng)基按15ml人AB型血清、85ml低糖培養(yǎng)基(DMEM)、0.24gHepes、0.2g碳酸氫鈉、0.03gL－谷氨酰胺配比構(gòu)成。用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)低傳代人毛乳頭細(xì)胞，收集低傳代人毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清為人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液，將所收集的人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液制備成凍干粉。本發(fā)明所制備的藥物在治療男性禿發(fā)中有明顯的療效，本藥物所用細(xì)胞和培養(yǎng)血清對人體均無抗原性，用于人體無任何過敏反應(yīng)。此外，本發(fā)明所用藥物為皮下注射，其有效藥物利用度大大提高，其制備工藝十分考究，實用性強，能為廣大患者服務(wù)。
文檔編號A61K9/19GK1879883SQ200610042780
公開日2006年12月20日 申請日期2006年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月30日
發(fā)明者羅洋 申請人:羅洋