專利名稱：負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物及其制法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及喜樹堿類藥物，更具體而言，是涉及負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物及其制備方法。
背景技術：
喜樹堿(CPT)是一種從中國喜樹中提取出來的一種具有細胞毒性的生物堿，它的作用對象為細胞的拓撲異構酶I(Top I)，通過阻止切開的DNA鏈的再結合，喜樹堿可以有效的殺滅腫瘤細胞。盡管喜樹堿和其很多衍生物在體外腫瘤模型實驗中展現出明顯的抗腫瘤效果，然而這類藥物在水或者各種生物相容的有機溶劑中溶解度都極低，因此不盡人意的溶解性大大制約了它們的實際應用。為解決喜樹堿類藥物的溶解性問題，人們不得不使用藥效低、毒副作用大的羥基喜樹堿(HCPT)或CPT羧酸鹽水溶液，或者通過化學改性得到溶解性改善的喜樹堿類前藥(prodrug)，如已經上市的伊立替康(Irinotecan，CPT-11，1994美國上市，用于治療結直腸癌)和拓撲替康(Topotecan，1996美國上市，用于卵巢癌的治療)等。但是前藥能否在體內完全分解為有效成分在很大程度上影響了該藥的效果，而且病人在藥物代謝方面的個體差異也導致這些前藥在用于各類病人時藥效差別極大。在現有的一些解決非水溶性藥物輸送問題的技術中，使用高分子納米藥物載體在載藥量，制劑的穩(wěn)定性，生物相容性以及“被動靶向”效果等方面均體現出明顯的優(yōu)勢(參見I.Brigger，C.Dubernet，P.Couvreur，Adv.Drug Del.Rev.，54，2002，631-651)。因此，開發(fā)一個負載喜樹堿類藥物的高性能納米藥物載體對于進一步充分發(fā)揮喜樹堿類抗腫瘤藥物藥效具有重大意義。
過去的幾年中，人們一直在努力尋找用于輸送喜樹堿藥物的高性能藥物載體。Ertl B和Shenderova A分別報道了通過傳統的乳化揮發(fā)法制備以聚乙交丙交酯(PLGA)微球為載體的CPT和HCPT的藥物輸送體系(參見Ertl B，Platzer P，Wirth M，and et al.，J.Controlled Release 61，1999，305-317；A.Shenderova，T.Burke，S.Schwendeman，Pharm.Res.14，1997，1406-1414.)，由于CPT和HCPT在PLGA中的溶解度過低，因此在他們得到的微球載藥量并不高，且負載的藥物大部分以微晶的形式存在。這種載藥體系主要目的是用于喜樹堿或羥基喜樹堿的緩釋，同時利用高分子水解產生的微酸環(huán)境來穩(wěn)定CPT的內酯環(huán)。由于微球的尺寸過大，這類體系無法做為靜注劑型，因此其實際應用受到了限制。之后，Yang等人采用固體脂質體納米粒子(Solid Lipid Nanoparticles，SLN，參見S.Yang，J.Zhu，Y.L，and et al.，Pharm.Res.16，1999，751-757；Yang S.，Lu L，Cai Y，and et al.，J.Controlled Release 59，1999，299-307)負載了CPT，并且分別考察了經靜注和口服后，CPT在小鼠體內的分布情況。結果表明，CPT經過SLN負載后，血液中的半衰期得到了明顯延長，組織中的藥物濃度也有所提高，而且相比于原藥，CPT-SLN對腦部有顯著的靶向性。不過由于喜樹堿類物質與脂質的親和性較差，該體系的載藥量也不高(＜5％)，此外制備過程中還需要加入表面活性劑poloxamer 188，為其生物安全性帶來了隱患。為了提高喜樹堿類藥物的負載效率，Zhang等利用了7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38)在堿性水溶液中溶解度大幅增加，而酸化后打開的內酯環(huán)又能夠可逆地重新閉合這一特性，制備了高載藥效率的SN-38脂質體制劑，并且取得了良好的體外和體內抗腫瘤效果(參見J.Zhang，T.Xuan，M.Parmar，and et al.，Intl.J.Pharm.270，2004，93-107)。但是，脂質體成本高，自身性質不夠穩(wěn)定，在體內容易降解和崩解，大量脂質物質在體內可能產生毒副作用，這些都成為制約喜樹堿脂質體實際應用的因素。2004年，Okano等人以部分水解的聚天冬氨酸(PAsp)與聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物為材料，用高溫乳化分散法制備了負載CPT的高分子膠束(參見P.Opanasopit，M.Yokoyama，M.Watanabe，and et al.，Pharm.Res.21，2004，2001-2008)。他們的結果顯示，部分水解后的PAsp與CPT間相互作用得到了加強，能夠獲得令人滿意的負載效果，載藥量達到20％，載藥效率最高可達70％。但是他們的研究中載體材料制備過程復雜，成本較高，負載過程在80℃高溫的水中超聲進行，有可能對藥物和載體材料帶來不利的影響。此外，聚氨基酸在體內應用時的抗原性也是值得重視的問題。
綜上所述，盡管在非水溶性喜樹堿藥物負載與輸送體系的研究中已經取得了一些振奮人心的成果，但由于喜樹堿藥物獨特的溶解性，和各種載體材料的親和性過低以及強烈的自聚集傾向，至今仍然無法采用常規(guī)的載體材料和工藝制備在載體尺寸，載藥量，制備成本，穩(wěn)定性及生物相容性等方面均令人非常滿意的喜樹堿載藥體系。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對喜樹堿類藥物的特點，提供可以用于注射，靜脈滴注或者口服的負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物及其制備方法。
為實現上述目的，本發(fā)明充分利用了喜樹堿類藥物在堿性條件下開環(huán)形成水溶性很好的開環(huán)形式而在酸性條件下又能夠可逆閉環(huán)這一殊性，以可生物降解高分子為主要載體材料，通過本發(fā)明公布的方法，制備具有較高載藥量和高載藥效率的負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物。
本發(fā)明的技術方案如下一種負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物，它是以可生物降解的高分子納米微球為藥物載體，負載至少一種喜樹堿類的藥物，所述的可生物降解的高分子可以是聚酯或聚酯與聚乙二醇形成的兩親嵌段共聚物。
上述的負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物，所述的喜樹堿類藥物包括喜樹堿、10-羥基喜樹堿(HCPT)、9-氨基喜樹堿(9-AC)、9-硝基喜樹堿(9-NC)、7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38)等。
上述的負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物，所述的可生物降解的高分子，選自下列聚合物中的一種或多種混和聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(乙交一丙交酯)(PLGA)、聚己內酯(PCL)或聚(丙交酯一己內酯)，或者上述可生物降解聚酯與聚乙二醇(PEG)形成的兩親嵌段共聚物。優(yōu)選的可生物降解的高分子是上述可生物降解的聚酯與聚乙二醇(PEG)形成的兩親嵌段共聚物。
上述的負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物，藥物載體為顆粒狀，其直徑為60nm-800nm，負載于其中的喜樹堿類藥物的量占負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物總質量的1％-30％。
一種制備上述的負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物的方法，它基本上由下列步驟組成步驟1.將喜樹堿類藥物溶解于適量堿性水溶液中，得到水溶液W1，步驟2.將步驟1得到的W1分散于溶有適量穩(wěn)定劑的有機溶液O1中，通過攪拌、超聲或乳勻等手段得到乳液E1，所述的有機溶液O1可以是乙酸乙酯溶液或二氯甲烷溶液，所述的穩(wěn)定劑為生物相容的兩親物質或可生物降解的兩親高分子。
步驟3.將步驟2得到的E1分散于含有鹽酸或醋酸和適量上述的可生物降解高分子的有機溶液O2中，得到分散液E2，所述的有機溶液O2可以是丙酮或二氯甲烷溶液，步驟4.將步驟3得到的分散液E2與水或含有適量穩(wěn)定劑的水溶液W2混和，通過攪拌、超聲或乳勻等手段分散均勻，所述的水溶液W2中的穩(wěn)定劑可以是Poloxamer 188或聚乙烯醇(PVA)，步驟5.將步驟4得到的分散液加熱減壓，除去有機溶劑，過濾、透析或離心除去未包裹的藥物沉淀和高分子聚集物后，得到本發(fā)明的負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物的水分散液。
上述制備負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物的方法，其中所述的溶有喜樹堿類藥物堿性水溶液W1中喜樹堿類藥物的濃度范圍為5mg/mL-200mg/mL。
上述制備負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物的方法，所述的有機溶液O1與溶有喜樹堿類藥物堿性水溶液W1的體積比為2∶1-10∶1。
上述制備負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物的方法，所述的有機溶液O1中含有濃度為10mg/mL-200mg/mL的穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑為生物相容的兩親物質或可生物降解的兩親高分子，包括但不局限于含有羧基的聚己內酯(如DTPA-PCL-DTPA和Citric-PCL)，聚己內酯(PCL)或聚(丙交酯-己內酯)等聚酯與聚乙二醇(PEG)形成的兩親嵌段共聚物(如PCL-PEG-PCL，PCLLA-PEG-PCLLA等)。
上述制備負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物的方法，所述的有機溶液O2與有機溶液O1的體積比為1∶1-100∶1，優(yōu)選的是2∶1-10∶1。
上述制備負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物的方法，有機溶液O2中，可生物降解高分子的濃度為0.1mg/mL-500mg/mL，優(yōu)選的是2mg/mL-200mg/mL，有機溶液O2中含有酸的濃度為0.0001mol/L-0.1mol/L，所說的酸包括鹽酸、醋酸等。
上述制備負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物的方法，水溶液W2與有機溶液O2的體積比為1∶1-100∶1，優(yōu)選2∶1-20∶1，水溶液W2為pH＜8、含有0-50％生物相容或可生物降解穩(wěn)定劑的水溶液，所述穩(wěn)定劑包括poloxamer系列乳化劑或PVA。
上述制備負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物的方法，制得的負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物以水分散液的方式儲藏或使用，或者進一步經過冷凍干燥成為能夠再次分散的凍干粉儲藏或使用。
本發(fā)明的負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物載藥量可以達到30％以上，負載效率高于85％，穩(wěn)定性好。在合適的制備條件下，得到的載藥納米微球尺寸小于300nm，且無須添加其它穩(wěn)定劑，適合于靜脈注射。通過本發(fā)明公布的方法制備的負載喜樹堿類藥物的高分子納米微球具有明顯的緩釋特點(參見圖3)，制備的負載于高分子納米微球的羥基喜樹堿類藥物具有比羥基喜樹堿自由藥更強的體外抗腫瘤活性(參見表1)，而且體內抗腫瘤效果也得到了增強(參見表2)。
本發(fā)明的制備負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物的方法簡單易行，制備成本較低，通過改變制備中所用的高分子材料及其濃度、溶劑及用量、藥物濃度等參數，可以實現對負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物載藥納米微球的載藥量、尺寸等性質的調節(jié)，具有良好的可控性。


圖1為羥基喜樹堿載藥納米微球在水分散液中粒徑隨儲存時間變化圖。
圖2為SN-38，空白微球和SN-38載藥微球的紅外圖譜。
圖3為羥基喜樹堿載藥納米微球的體外釋放曲線。
具體實施例方式
下面結合實施例進一步闡明本發(fā)明的內容，但是這些實施例并不限制本發(fā)明的保護范圍。
制備例1聚(丙交酯-己內酯)-聚乙二醇-聚(丙交酯-己內酯)兩親嵌段共聚物(PCLLA-PEG-PCLLA)的制備在裝有適量聚乙二醇(PEG)的聚合管中加入計算量的己內酯(CL，美國Aldrich公司)和丙交酯(LA，美國Aldrich公司)以及0.1％(w/w)的辛酸亞錫，其中PEG的數均分子量根據對產物的要求不同，分別為6000或10000不等，但是并不僅限于以上幾種分子量。在真空下封管并將其放入130℃反應48小時。反應得到的粗產物用氯仿溶解后沉淀于大量冷甲醇中以除去未反應的單體和其他低分子量的物質，然后將沉淀物收集用水洗滌數次后減壓干燥，得到PCLLA-PEG-PCLLA三嵌段聚合物。對應PEG分子量為6000和10000，得到的聚合物分別命名為PCLLA-PEG6K-PCLLA和PCLLA-PEG10K-PCLLA。以上得到的共聚物數均分子量均為50000(通過核磁共振圖譜計算)。
制備例2聚己內酯-聚乙二醇-聚己內酯兩親嵌段共聚物(PCL-PEG-PCL)的制備在裝有適量聚乙二醇(PEG)的聚合管中加入計算量的己內酯(CL，美國Aldrich公司)以及0.1％(w/w)的辛酸亞錫，其中PEG的數均分子量根據對產物的要求不同，分別為2000，6000，10000不等，但是并不僅限于以上幾種分子量。在真空下封管并將其放入130℃反應48小時。反應得到的粗產物用氯仿溶解后沉淀于大量冷甲醇中以除去未反應的單體和其他低分子量的物質，然后將沉淀物收集用水洗滌數次后減壓干燥，得到PCL-PEG-PCL三嵌段聚合物。對應PEG分子量為2000，6000和10000，得到的聚合物分別命名為PCL-PEG2K-PCL，PCL-PEG6K-PCL和PCL-PEG10K-PCL。以上得到的共聚物數均分子量均為50000(通過核磁共振圖譜計算)。
制備例3二乙撐三胺五乙酸-聚己內酯-二乙撐三胺五乙酸(DTPA-PCL-DTPA)的制備按照文獻(CH Paik et al.，Journal of Nuclear Medicine，Vol 24，Issue 12 1158-1163)制備二乙撐三胺五乙酸(DTPA)雙酸酐。制得的DTPA雙酸酐經純化干燥后置于干燥器中保存。在玻璃封管中加入計算量的乙二醇(美國Aldrich公司)，在辛酸亞錫催化下，通過開環(huán)聚合制備分子量為2000的α，ω-雙羥基聚己內酯。在裝在100mL三頸瓶上的滴液漏斗中加入一定量α，ω-雙羥基聚己內酯的無水DMF溶液(30％)，向三頸瓶內加入過量的DTPA雙酸酐和催化量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，用適量無水二甲基甲酰胺(DMF)在70℃下攪拌溶解，通氮氣30min以除去體系中的氧氣。待溶解完全后，將溫度升至90℃，緩慢滴加α，ω-雙羥基聚己內酯的DMF溶液，反應48h，得到的產物先沉淀于乙醚中，干燥后用乙酸乙酯溶解，過濾除去未反應的酸酐后，濾液沉淀于大量冷乙醚中，然后將沉淀物收集用熱水洗滌數次后減壓干燥，得到DTPA-PCL-DTPA(平均分子量為2800)。
制備例4端基為檸檬酸的聚己內酯(Citric-PCL)的制備將適量研磨并干燥過的蘋果酸(美國Aldrich公司)，加入三頸瓶中，加入少量DMF攪拌溶解，再加入少量三乙胺助溶和催化劑二月桂酸二丁基錫。將計算量的己內酯加入滴液漏斗中。體系通氮氣除氧，油浴加熱至80℃后，以每秒一滴的速度加入己內酯，加完后反應6-8小時。反應后將生成物沉淀到水中(水中加入適量HCl)，反復2-3次，得到白色粉末，真空干燥48h，得到Citric-PCL聚合物，產物的數均分子量為1500。
實施例1負載于高分子納米微球的喜樹堿藥物的制備先將30mg PCLLA-PEG10K-PCLLA溶解于5mL含有10μL 1.0mol/L HCL的丙酮中得到PCLLA-PEG10K-PCLLA的丙酮溶液O2。另將7mg HCPT溶解于100μLNaOH水溶液中(NaOH濃度為0.3mol/L)，得到亮黃色水溶液W1。與溶有20mgDTPA-PCL-DTPA的500μL乙酸乙酯溶液O1混合，用探頭式超聲儀(microsonix XL-200)分散至均相后得到E1。將E1在攪拌下加入O2，體系逐漸成為散射淡藍色光的分散液E2。將E2與20mL水W2(用HCl調至pH＝5)混和，得到散射淡藍色光的載藥納米粒子分散液，減壓除去有機溶劑，用600nm濾膜過濾除去未包裹的藥物沉淀和高分子聚集物后，得到載藥納米粒子的水分散液。通過動態(tài)光散射技術測得微球平均粒徑為256nm。通過紫外分光光度計測得該藥物載體的載藥量為10.4％，載藥效率高于85％。以下實施例中如無特別說明，則對載藥微球的基本性質表征與此實施例中相同。穩(wěn)定性實驗結果表明微球在水分散液中非常穩(wěn)定，參見圖1。
實施例2負載于高分子納米微球的喜樹堿藥物的制備將30mg PCL-PEG10K-PCL溶解于10mL含有10μL 1.0mol/L HCL的丙酮中得到O2。其余過程同實施例1。通過動態(tài)光散射技術測得微球平均粒徑為162nm。該藥物載體的載藥量為9.8％，載藥效率高于85％。
實施例3負載于高分子納米微球的HCPT藥物的制備先將30mg PCLLA-PEG10K-PCLLA溶解于2mL含有10μL 1.0mol/L HCL的丙酮中得到O2。其余過程同實施例1。用濾紙過濾除去未包裹的藥物沉淀和高分子聚集物后，得到載藥納米粒子的水分散液。通過動態(tài)光散射技術測得微球平均粒徑為495nm。通過紫外分光光度計測得該藥物載體的載藥量為11.6％。
實施例4負載于高分子納米微球的HCPT藥物的制備先將30mg PCLLA-PEG10K-PCLLA溶解于5mL含有10μL 1.0mol/L HCL的丙酮中得到O2。另將10mg HCPT溶解于100μL 0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到W1，其余過程同實施例1。得到的載藥納米微球載藥量為15.0％，負載效率為90％，平均粒徑為261nm。
實施例5負載于高分子納米微球的HCPT藥物的制備先將30mg聚己內酯(PCL，平均分子量50000，Sigma公司)溶解于15mL含有10μL 0.15mol/L HCL的丙酮中得到O2。另將0.5mg HCPT溶解于100μL 0.03mol/L的NaOH水溶液中，得到的亮黃色水溶液W1。將W1與溶有20mg Citric-PCL的1mL二氯甲烷溶液O1混合，用探頭式超聲儀(microsonix XL-200)將上述混合液分散至均相后得到E1，在攪拌下將E1加入O2，體系逐漸成為散射淡藍色光的分散液即E2。將E2與60mL 5％Poloxamer 188水溶液W2(用HCl調至pH＝5)混和，得到散射淡藍色光的載藥納米粒子分散液，減壓除去有機溶劑，用600nm濾膜過濾除去未包裹的藥物沉淀和高分子聚集物后，得到載藥納米粒子的水分散液。通過動態(tài)光散射技術測得微球平均粒徑為63nm。通過紫外分光光度計測得該藥物載體的載藥量為1％，載藥效率高于85％。
實施例6負載于高分子納米微球的SN-38藥物的制備先將30mg PCLLA-PEG10K-PCLLA溶解于5mL含有10μL 1.0mol/L HCl的丙酮中得到O2。另將7mg SN-38溶解于100μL 0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到的亮黃色水溶液W1。將10mg DTPA-PCL-DTPA溶解于1mL乙酸乙酯溶液混合得到O1，將W1和O1混合并用探頭式超聲儀(microsonix XL-200)分散至均相后得到E1，在攪拌下將E1加入O2，體系逐漸成為散射淡藍色光的分散液E2。將E2與60mL水W2(用HCl調至pH＝5)混和，得到散射淡藍色光的載藥納米粒子分散液，減壓除去有機溶劑，用600nm濾膜過濾除去未包裹的藥物沉淀和高分子聚集物后，得到載藥納米粒子的水分散液。通過動態(tài)光散射技術測得微球平均粒徑為215nm。通過紫外分光光度計測得該藥物載體的載藥量為14.6％，載藥效率92％。從圖2顯示的紅外圖譜可以看出，負載后沒有新的吸收峰出現。
實施例7負載于高分子納米微球的喜樹堿藥物的制備先將30mg PCLLA-PEG6K-PCLLA溶解于5mL含有10μL 1.0mol/L HCl的丙酮中得到O2。另將5mg CPT溶解于100μL0.3mol/L的NaOH水溶液中得到W1，其余操作同實施例1。通過動態(tài)光散射技術測得微球平均粒徑為228nm。通過紫外分光光度計測得該藥物載體的載藥量為8.1％，載藥效率89％。
實施例8負載于高分子納米微球的喜樹堿藥物的制備先將30mg PCL(分子量50000，Sigma公司)溶解于1mL含有10μL 1.0mol/L HCl的乙酸乙酯中得到O2。另將5mg喜樹堿溶解于100μL 0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到的黃色水溶液W1。將W1與溶有20mg PCL-PEG6K-PCL的500μL二氯甲烷溶液O1混合，用探頭式超聲儀(microsonix XL-200)分散至均相后得到E1，在攪拌下將E1加入O2，體系逐漸成為散射淡藍色光的分散液E2。將E2與20mL 5％PVA水溶液W2(用HCl調至pH＝5)混和，并且通過乳勻分散均勻，減壓除去有機溶劑，用600nm濾膜過濾除去未包裹的藥物沉淀和高分子聚集物后，得到載藥納米粒子的水分散液。通過動態(tài)光散射技術測得微球平均粒徑為515nm。通過紫外分光光度計測得該藥物載體的載藥量為8.0％，載藥效率88.7％。
實施例9負載于高分子納米微球的羥基喜樹堿藥物的制備先將30mg PCLLA-PEG10K-PCLLA溶解于5mL含有10μL 1.0mol/L HCL的丙酮中得到PCLLA-PEG10K-PCLLA的丙酮溶液O2。另將7mg HCPT溶解于100μL 0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到亮黃色水溶液W1。將W1與溶有20mg DTPA-PCL-DTPA的200μL三氯甲烷溶液O1混合，分散至均相后得到E1。其余操作同實施例1。該藥物載體的載藥量為11.6％，載藥效率高于90％。平均粒徑為266nm。
實施例10負載于高分子納米微球的羥基喜樹堿藥物的制備先將30mg PLGA(50∶50，數均分子量40000，Sigma公司，下同)溶解于5mL含有10μL 1.0mol/L醋酸的丙酮中得到PLGA的丙酮溶液O2。另將7mg HCPT溶解于100μL0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到亮黃色水溶液W1。將W1與溶有20mgDTPA-PCL-DTPA的500μL乙酸乙酯溶液O1混合，分散至均相后得到E1。除了W2是2％的PVA水溶液20mL外，其余制備條件同實施例1。該藥物載體的載藥量為9.7％，載藥效率高于85％。平均粒徑為324nm。
實施例11負載于高分子納米微球的SN-38藥物的制備先將30mg PLGA溶解于5mL含有10μL 1.0mol/L HCl的丙酮中得到PLGA的丙酮溶液O2。另將15mg SN-38溶解于100μL0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到亮黃色水溶液W1。將W1與溶有20mg PCL-PEG10K-PCL的200μL二氯甲烷溶液O1混合，分散至均相后得到E1。采用的W2為1％的polaxomer 188水溶液400mL，其余操作同實施例1。該藥物載體的載藥量為20.6％，載藥效率高于85％。平均粒徑為379nm。
實施例12負載于高分子納米微球的SN-38藥物的制備先將30mg PCL(分子量50000，Sigma公司，下同)溶解于5mL含有10μL 1.0mol/LHCl的丙酮中得到PLGA的丙酮溶液O2。另將15mg SN-38溶解于100μL 0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到亮黃色水溶液W1。將W1與溶有20mg PCL-PEG10K-PCL的200μL二氯甲烷溶液O1混合，分散至均相后得到E1。采用的W2為1％的PVA水溶液10mL，其余操作同實施例1。該藥物載體的載藥量為21.2％，載藥效率高于87％。平均粒徑為405nm。
實施例13負載于高分子納米微球的SN-38藥物的制備先將30mg PLA(分子量20000，Sigma公司)溶解于5mL含有10μL 1.0mol/L HCl的丙酮中得到PLGA的丙酮溶液O2。另將7mg SN-38溶解于100μL 0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到亮黃色水溶液W1。將W1與溶有20mg PCL-PEG10K-PCL的100μL二氯甲烷溶液O1混合，分散至均相后得到E1。采用的W2為1％的polaxomer 188水溶液500mL，其余操作同實施例1。該藥物載體的載藥量為11.0％，載藥效率高于85％。平均粒徑為395nm。
實施例14負載于高分子納米微球的喜樹堿藥物的制備先將30mg PCL溶解于5mL含有10μL 1.0mol/L HCl的丙酮中得到PLGA的丙酮溶液O2。另將15mg CPT溶解于100μL0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到亮黃色水溶液W1。將W1與溶有20mg DTPA-PCL-DTPA的200μL二氯甲烷溶液O1混合，分散至均相后得到E1。采用的W2為1％的PVA水溶液400mL，其余操作同實施例1。該藥物載體的載藥量為21.0％，載藥效率高于85％，平均粒徑為377nm。
實施例15負載于高分子納米微球的喜樹堿藥物的制備先將50mg PLGA溶解于1mL含有10μL 1.0mol/L HCl的丙酮中得到PLGA的丙酮溶液O2。另將30mg CPT溶解于200μL0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到亮黃色水溶液W1。將W1與溶有20mg DTPA-PCL-DTPA的2mL二氯甲烷溶液O1混合，分散至均相后得到E1。采用的W2為0.01％的PVA水溶液400mL，將E1在高速攪拌下與W2混和均勻，所用濾膜孔徑為3μm，其余操作同實施例1。該藥物載體的載藥量為29.7％，載藥效率高于85％。平均粒徑為839nm。
實施例16負載于高分子納米微球的喜樹堿藥物制備先將30mg PLGA溶解于1mL含有1.0×10-5mol/L醋酸的二氯甲烷中得到O2。另將20mg喜樹堿溶解于100μL 0.5mol/L的NaOH水溶液中，得到的黃色水溶液W1。將W1與溶有20mg PCL-PEG2K-PCL的500μL二氯甲烷溶液O1混合，用探頭式超聲儀(microsonix XL-200)分散至均相后得到E1，在攪拌下將E1加入O2，體系逐漸成為散射淡藍色光的分散液E2。將E2與20mL 5％PVA水溶液W2(用HCl調至pH＝5)混和，并且通過乳勻分散均勻，減壓除去有機溶劑，用600nm濾膜過濾除去未包裹的藥物沉淀和高分子聚集物后，得到載藥納米粒子的水分散液。通過動態(tài)光散射技術測得微球的平均粒徑為575nm。載藥量為9.0％，載藥效率高于90％。
實施例17負載于高分子納米微球的9-氨基喜樹堿藥物的制備除所用藥物為9-AC外，其余步驟同實施例1。得到的微球的平均粒徑為275nm，載藥量為8.7％，載藥效率高于85％。
實施例18負載于高分子納米微球的9-AC藥物的制備除所用藥物為9-AC外，其余步驟同實施例3。得到的微球的平均粒徑為512nm，載藥量為10.9％，載藥效率高于85％。
實施例19負載于高分子納米微球的9-硝基喜樹堿(9-NC)藥物的制備除所用藥物為9-NC外，其余步驟同實施例1。得到的納米粒子直徑為233nm，載藥量為10.2％，載藥效率高于90％。
實施例20負載于高分子納米微球的9-NC藥物的制備除所用藥物為9-NC外，其余步驟同實施例3。得到的微球的平均粒徑為488nm，載藥量為11.0％，載藥效率高于90％。
實施例21負載于高分子納米微球的羥基喜樹堿藥物的凍干粉劑制備按照實施例1中所述操作制備納米微球的水分散液，在該分散液中加入200mg葡萄糖，在Freezone 6凍干機上冷凍干燥48小時，得到淺黃色的疏松凍干粉。用蒸餾水再分散后，得到的納米微球尺寸為276nm，適合于靜脈注射。
實施例22負載于高分子納米微球的羥基喜樹堿藥物的體外釋放將實施例1中制備的納米微球分散液稀釋至相當于HCPT濃度100μg/mL，取稀釋液2mL放置于透析袋中于400mL水中透析，在預定時間取4mL釋放介質，通過HPLC測定其中的羥基喜樹堿濃度，得到HCPT載藥納米微球的體外釋放曲線。從圖3可以看到負載于其中的藥物表現出持續(xù)穩(wěn)定的釋放特性。
實施例23負載于高分子納米微球的羥基喜樹堿藥物的抗腫瘤效果測試1.細胞株為人胃癌細胞BGC-823。通過MTT法測定了實施例1中制備的納米微球對BGC-823細胞的體外殺傷效果(如表1所示)。從表1可以看到制備的HCPT載藥納米微球對BGC-823細胞具有較強的體外殺傷力。
2.選用18-22克雌性ICR小鼠及生長良好的7-11天的Sarcoma 180瘤種，將瘤種接種于小鼠右側腋部皮下，約4.5-5×106細胞/只，接種24小時后隨機分籠，每組5只。分別按照2mg/kg，4mg/kg和8mg/kg的HCPT劑量給小鼠尾靜脈注射負載HCPT的納米粒子，另外藥物對照組按照8mg/kg給藥，空白載體對照組按照納米粒子質量濃度80mg/kg的劑量靜注，陰性對照組注射生理鹽水。給藥時間為接種后的第二天和第五天。第8天處死動物，稱體重、瘤重，計算各組平均瘤重以及腫瘤抑制率并進行T檢驗，結果如表2所示。
可以看出，采用本專利公布的方法，可以將溶解性很差的喜樹堿類藥物已其有效的閉環(huán)形式負載于生物相容的高分子納米微球中，由此得到的藥物能夠利用藥物載體的被動靶向特性以及緩釋特性，在較低的藥物用量下便可以獲得比自由藥物更好的抗腫瘤效果。本發(fā)明所述的負載于高分子納米微球的其它喜樹堿類藥物，如SN-38或CPT等也具有類似的良好的抗腫瘤效果。
表1.HCPT載藥納米微球對人胃癌BGC-823體外細胞毒性實驗結果。

a空白載體的濃度與負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物組的濃度相對應，考慮到載藥量為10％，故載體組的濃度分別為10，20，40μg/mL。
具體實施例方式
下面通過實施例，對本發(fā)明的技術方案作進一步具體的說明。
實施例1取健康活蛇(蝮蛇、烏梢蛇)，拋去內臟，用清水清洗后。剝離脂肪，在120℃的高溫條件壓軋蛇油，提純凈化(利用凈化器，反復濾去沉淀物)在50％的蛇油中加入含有維生素A1為4.28g/100g的維生素片劑3.5％、含有維生素E為10g/100g的維生素片劑6％、含有維生素C為24g/100g的維生素2.5％營養(yǎng)成分，含有微量元素Na為52.6mg/100g、微量元素Zn為105.2mg/100g、微量元素Fe為24.3mg/100g的片劑38％，攪拌混勻后，生化滅菌(常規(guī)方法甲醛消毒或者核輻射)，通過生化檢驗(測各成份的配置數量)制成軟膠囊，灌裝以后，在紫外線的照射下輻射滅菌外包裝打印日期、出廠。
權利要求
1.一種負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物，其特征是它是以可生物降解的高分子納米微球為藥物載體，負載至少一種喜樹堿類的藥物，所述的可生物降解的高分子可以是聚酯或聚酯與聚乙二醇形成的兩親嵌段共聚物。
2.根據權利要求1所述的負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物，其特征是所述的喜樹堿類藥物是喜樹堿、10-羥基喜樹堿、9-氨基喜樹堿、9-硝基喜樹堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿、拓撲替康或伊立替康。
3.根據權利要求1所述的負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物，其特征是所述的可生物降解的高分子，選自下列聚合物中的一種或多種混和聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(乙交-丙交酯)(PLGA)、聚己內酯(PCL)或聚(丙交酯-己內酯)，或者上述可生物降解聚酯與聚乙二醇(PEG)形成的兩親嵌段共聚物。
4.根據權利要求1所述的負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物，其特征是藥物載體為顆粒狀，其直徑為60nm-800nm，負載于其中的喜樹堿類藥物占負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物總質量的1％-30％。
5.一種制備權利要求1所述的負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物的方法，其特征是它基本上由下列步驟組成步驟1.將喜樹堿類藥物溶解于堿性水溶液中，得到水溶液W1，步驟2.將步驟1得到的水溶液W1分散于溶有穩(wěn)定劑的有機溶液O1中，通過攪拌、超聲或乳勻手段得到乳液E1，所述的有機溶液O1是乙酸乙酯溶液或二氯甲烷溶液，所述的穩(wěn)定劑是生物相容的兩親物質或可生物降解的兩親高分子，步驟3.將步驟2得到的乳液E1分散于含有鹽酸或醋酸和上述的可生物降解高分子的有機溶液O2中，得到分散液E2，所述的有機溶液O2是丙酮或二氯甲烷溶液，步驟4.將步驟3得到的分散液E2與水或含有穩(wěn)定劑的水溶液W2混和，通過攪拌、超聲或乳勻等手段分散均勻，所述的水溶液W2中的穩(wěn)定劑是Poloxamer 188或聚乙烯醇，步驟5.將步驟4得到的分散液加熱減壓，除去有機溶劑，然后過濾、透析或離心除去未包裹的藥物沉淀和高分子聚集物，得到負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物的水分散液。
6.根據權利要求5所述的制備負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物的方法，其特征是步驟1所述的溶有喜樹堿類藥物堿性水溶液W1中喜樹堿類藥物的濃度范圍為5mg/mL-200mg/mL。
7.根據權利要求5所述的制備負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物的方法，其特征是所述的有機溶液O1與溶有喜樹堿類藥物堿性水溶液W1的體積比為2∶1-10∶1，所述的有機溶液O1中含有濃度為10mg/mL-200mg/mL的穩(wěn)定劑。
8.根據權利要求5所述制備負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物的方法，其特征是所述的有機溶液O2與有機溶液O1的體積比為1∶1-100∶1，有機溶液O2中，可生物降解高分子的濃度為0.1mg/mL-500mg/mL，有機溶液O2中含有酸的濃度為0.0001mol/L-0.1mol/L。
9.根據權利要求5所述制備負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物的方法，其特征是所述的水溶液W2與有機溶液O2的體積比為1∶1-100∶1，水溶液W2為pH＜8、含有0-50％生物相容或可生物降解穩(wěn)定劑的水溶液，所述穩(wěn)定劑包括poloxamer系列乳化劑或聚乙烯醇。
10.根據權利要求5所述制備負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物的方法，其特征是制得的負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物以水分散液的方式儲藏或使用，或者進一步經過冷凍干燥成為能夠再次分散的凍干粉儲藏或使用。
全文摘要
一種負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物，它是以可生物降解的高分子納米微球為藥物載體，負載至少一種喜樹堿類的藥物，所述的可生物降解的高分子可以是聚酯或聚酯與聚乙二醇形成的兩親嵌段共聚物。本發(fā)明的負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物，藥物載體為顆粒狀，其直徑為60nm－800nm，負載于其中的喜樹堿類藥物占負載于高分子納米微球的喜樹堿類藥物總質量的質量百分比可高達30％。可用于靜注。本發(fā)明公開了其制法。
文檔編號A61P35/00GK1861192SQ200610038798
公開日2006年11月15日 申請日期2006年3月13日 優(yōu)先權日2006年3月13日
發(fā)明者蔣錫群, 張樂洋, 楊昌正 申請人:南京大學