專利名稱:抑制人Ezrin基因表達(dá)的siRNA及其表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種siRNA,具體地說,涉及一種抑制人Ezrin基因表達(dá)的siRNA及其表達(dá)載體。
背景技術(shù):
RNAi是由雙鏈RNA介導(dǎo)的同源靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默的過程,RNAi可以通過人為的引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA,誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因mRNA降解,從而達(dá)到減少基因表達(dá)的目的。RNAi技術(shù)作為新興的基因阻斷技術(shù),具有明顯的優(yōu)勢,它具有高度的特異性,干擾效率高而且操作簡單。因此以及廣泛的應(yīng)用于基因功能研究以及抗病毒感染、腫瘤治療等熱點領(lǐng)域。
食管癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,嚴(yán)重影響人類健康。全世界食管癌患者術(shù)后5年生存率僅為20%-30%。造成食管癌預(yù)后差的一個重要原因是其轉(zhuǎn)移性強(qiáng),有些病人甚至在確診時已經(jīng)發(fā)生了局部組織浸潤和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。
侵襲和轉(zhuǎn)移是多因素參與的、多步驟完成的分子生物學(xué)變化過程。腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的遷移能力,使得它能克服細(xì)胞與細(xì)胞間以及細(xì)胞和基質(zhì)間的粘附作用侵入周圍組織。侵襲性強(qiáng)的細(xì)胞通常都有細(xì)胞突觸多、細(xì)胞間粘附減弱以及通訊連接喪失等特點。現(xiàn)在普遍認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的這些惡性征是由于肌動蛋白結(jié)合蛋白以及一些相關(guān)的連接蛋白引起的細(xì)胞骨架重組所致。
在這些骨架相關(guān)蛋白中,我們研究的是Ezrin。Ezrin基因又稱VIL2,定位于染色體6q25.2~q26,其表達(dá)產(chǎn)物Ezrin蛋白是ERM(ezrin-radixin-moesin)家族成員之一,主要參與細(xì)胞中細(xì)胞骨架與胞膜之間的連接,具有維持細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動、連接粘附分子及調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能。
越來越多的證據(jù)表明Ezrin調(diào)控腫瘤發(fā)展。轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞系及組織樣品中基因表達(dá)的對比結(jié)果顯示,來自嚙齒動物乳腺、人胰腺和結(jié)腸的癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞中Ezrin的表達(dá)顯著提高;同時,Ezrin在多種人類腫瘤中強(qiáng)烈表達(dá),這些腫瘤包括骨肉瘤、黑色素瘤、星形細(xì)胞瘤、胰腺癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌等;進(jìn)一步的研究顯示抑制Ezrin蛋白能消除鼠科動物橫紋肌肉瘤和骨肉瘤細(xì)胞,Ezrin很可能是惡性腫瘤的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子?,F(xiàn)有的研究還提示Ezrin參與腫瘤細(xì)胞的粘附、凋亡尤其是移動侵襲等生物學(xué)過程,并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
食管癌中Ezrin的表達(dá)情況最近才得到了初步的闡明,在我們以往的研究中發(fā)現(xiàn)在永生化食管上皮細(xì)胞SHEE向食管癌細(xì)胞SHEEmt的惡性轉(zhuǎn)化過程中Ezrin發(fā)揮著重要的作用。我們最近對食管癌臨床組織樣本的研究也揭示食管癌中Ezrin的表達(dá)模式發(fā)生了改變。然而,Ezrin在食管癌及其它腫瘤中的功能及其表達(dá)改變的機(jī)制至今仍未得到很好的闡明。如能應(yīng)用RNAi技術(shù)來抑制食管癌細(xì)胞中Ezrin基因的表達(dá),從而探討Ezrin在食管癌細(xì)胞中的功能,這將有助于從分子水平闡明Ezrin在這些上皮來源的腫瘤組織細(xì)胞表達(dá)改變的機(jī)制,從而為揭開食管癌的發(fā)病機(jī)制及治療提供有用的線索。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抑制人Ezrin基因表達(dá)的siRNA。
本發(fā)明的另一目的是提供上述抑制人Ezrin基因表達(dá)的表達(dá)載體。
本發(fā)明的上述目的可以通過以下措施實現(xiàn)。
設(shè)計抑制Ezrin基因表達(dá)的雙鏈siRNA片段依據(jù)Dharmacon公司在網(wǎng)上提供的設(shè)計軟件設(shè)計了兩組siRNA。其堿基序列及作用部位如下E1(SEQ ID NO1)5’GATCCCCTCCACTATGTGGATAATAATTCAAGAGATTATTATCCACATAGTGGATTTTTGGAAA3’5’AGCTTTTCCAAAAATCCACTATGTGGATAATAATCTCTTGAATTATTATCCACATAGTGGAGGG3’作用于人Ezrin mRNA的第274-292;E2(SEQ ID NO2)5’GATCCCCACTTTGGCCTCCACTATGTTTCAAGAGAACATAGTGGAGGCCAAAGTTTTTTGGAAA3’5’AGCTTTTCCAAAAAACTTTGGCCTCCACTATGTTCTCTTGAAACATAGTGGAGGCCAAAGTGGG 3’作用于人Ezrin mRNA的第265-283。
本發(fā)明的可以產(chǎn)生抑制人Ezrin基因表達(dá)的siRNA的載體,其具有以下的基本結(jié)構(gòu)由啟動子、Ezrin編碼區(qū)、終止密碼、DNA序列順序連接而成的環(huán)狀雙鏈DNA分子;啟動子為可啟動產(chǎn)生siRNA的序列,它是啟動它的下游緊鄰之基因的表達(dá)的元件;啟動子優(yōu)選polymerase-III H1-RNA基因啟動子。
Ezrin編碼區(qū)為表達(dá)權(quán)利要求1所述的siRNA的編碼區(qū),由19個核苷酸組成,可采用雙向結(jié)合或以發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)形成雙鏈RNA;
終止密碼為5~6個T;DNA序列為任何真核質(zhì)粒載體和/或病毒的介于RNA編碼區(qū)和啟動子之間的DNA序列,含有質(zhì)粒載體DNA的復(fù)制起始位點,或含有抗生素抗性基因,包括使細(xì)菌獲得對抗某種抗生素的抗性的基因或使真核細(xì)胞獲得某種抗生素的抗性的基因。所述任何真核質(zhì)粒載體和/或病毒優(yōu)選pSUPER.neo載體。所述抗生素抗性基因優(yōu)選抗生素G418抗性基因neo。
上述載體pSUPER.neo(Oligoengine)具有以下優(yōu)點(1)具有polymerase-IIIH1-RNA基因啟動子,可以產(chǎn)生一個不含多聚腺苷酸尾的小RNA轉(zhuǎn)錄子;(2)可以很精確的啟動轉(zhuǎn)錄;(3)終止信號包含有T5;(4)在第二個尿嘧啶的后面終止轉(zhuǎn)錄,可以產(chǎn)生和合成的siRNA相類似的末端,即3’端含兩個不配對的胸腺嘧啶或尿嘧啶。這個載體能在哺乳動物細(xì)胞里面穩(wěn)定的表達(dá)siRNA,而且還含有neo基因,可以用G418篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞,建立細(xì)胞系,適合于做長期的研究。
根據(jù)pSUPER.neo載體圖,我們在線性化載體時采用依次酶切法。同時由于插入siRNA后的載體其Bgl II的酶切位點將被破壞,因此我們在連接后轉(zhuǎn)化之前重新用Bgl II處理半小時,把自身環(huán)化的載體重新酶切成線性,以降低平板克隆生長背景,大大提高陽性質(zhì)粒的篩選的效率。陽性質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Hind III酶切后可獲得一287bp的片斷,而空載體則可切出一227bp的片斷,因此我們采用了更為敏感的非變性聚丙烯電泳加銀染鑒定的辦法進(jìn)行重組子的篩選。
將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)食管癌細(xì)胞系EC109。為獲得穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞,我們首先使用濃度較高的G418進(jìn)行藥物篩選。轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒PSC和轉(zhuǎn)染以上siRNA的細(xì)胞(分別稱為PSE1和PSE2)的EC109細(xì)胞,由于質(zhì)粒載體上有neo基因,具有G418抗性,因此得以存活;而相比之下,未轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒的對照EC109細(xì)胞則因G418的毒性作用而被殺死。為防止連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中,表達(dá)質(zhì)粒的丟失,仍將細(xì)胞置于藥物濃度相對較低的生長環(huán)境中培養(yǎng),如果質(zhì)粒丟失,細(xì)胞仍會因G418的毒性作用而被殺死。在上述條件下,細(xì)胞能夠持續(xù)生長,表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒的EC109細(xì)胞株已被成功建立。
篩選出來的細(xì)胞株首先進(jìn)行干擾效果的分析。本發(fā)明用RT-PCR和Western blotting分別從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進(jìn)行分析。結(jié)果顯示無論是在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平,干擾后的細(xì)胞Ezrin表達(dá)均明顯降低,而且轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的細(xì)胞Ezrin基因的表達(dá)未受影響,結(jié)果同時還顯示干擾效果的比較為PSE1>PSE2。此外,連續(xù)幾代的細(xì)胞總蛋白中Ezrin表達(dá)的檢測也顯示干擾的效果非常的穩(wěn)定。
與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明設(shè)計、合成了靶向人Ezrin基因的兩對siRNA,并成功構(gòu)建了它們在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)載體。同時,運(yùn)用這些siRNA可以有效、特異地干擾Ezrin的表達(dá),建立了食管癌Ezrin低表達(dá)細(xì)胞株,為深入研究食管癌及其它Ezrin相關(guān)腫瘤中Ezrin的功能打下了堅實的基礎(chǔ)。
圖1為siRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)示意圖;圖2載體構(gòu)建示意圖;圖3為Ezrin基因siRNA哺乳動物內(nèi)表達(dá)載體PSE的酶切鑒定圖;圖4為陽性質(zhì)粒的測序鑒定圖;圖5為Ezrin干擾效果的檢測;圖6為pSUPER.neo載體圖。
圖3中,1、2泳道為陽性質(zhì)粒,3泳道為陰性對照,第4泳道為100bp DNA marker。圖5中,(A)干擾效果的Western blotting檢測;(B)干擾穩(wěn)定性的檢測;(C)干擾效果的RT-PCR檢測;β-actin和GAPDH分別作為的Western blotting和RT-PCR的上樣對照。
具體實施例方式
實施例1靶向Ezrin基因的siRNA設(shè)計、合成和退火。
依據(jù)Dharmacon公司在網(wǎng)上提供的設(shè)計軟件設(shè)計了兩組siRNA序列,如表1表1
設(shè)計的原則如下(1)從mRNA的AUG起始密碼開始,尋找5’AA(N19)TT,其中N是任意堿基,結(jié)構(gòu)長度為19bp的序列(如表1);
(2)目標(biāo)序列上不能連續(xù)出現(xiàn)3個或者三個以上的G或者C;(3)干擾序列避免在靶基因的首末端;(4)選擇GC含量在30%-52%之間的序列;(5)靶向ORF區(qū);(6)挑選的序列在公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較;克隆入siRNA表達(dá)載體中的DNA片段包括兩個短的反向重復(fù)序列,中間由發(fā)夾序列分隔,隨后接上5-6個T作為RNA聚合酶III的轉(zhuǎn)錄終止子;片段的5’端加Bgl II的酶切位點,而3’端則含有HindIII的酶切位點(見圖1)。整理好的序列送上?;瞪锛夹g(shù)有限公司合成。
合成的寡核苷酸序列(2OD)加入66μl的無核酸酶水中(終濃度為1μg/μl),充分溶解。退火時,在一新的離心管中依次加入下列試劑(總體積50μl)siRNA正反義鏈各3μl,加上44μl的退火緩沖液(10Mm NaCl,50mM Hepes,pH7.4),充分混勻后在PCR儀上完成以下操作94℃4min,80℃4min,75℃4min,然后是70℃10min,37℃ 20min,最后冷卻到25℃。產(chǎn)物可以直接用于連接或者保存于4℃。
實施例2 表達(dá)載體PSE1和PSE2的構(gòu)建1.載體的線性化及回收在離心管中依次加入下列試劑(總體積50μl)無菌水37.5μl、pSUPER.neo載體5μl、10×緩沖液B 5μl、乙?;疊SA(10mg/ml)0.5μl和HindIII(20u/μl)2μl?;靹蚝螅?7℃水浴孵育1h后繼續(xù)往混合物中加入Bgl II(20u/μl)2μl,在37℃水浴再孵育1h。取5μl電泳進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,以未酶切質(zhì)粒為對照,鑒定載體是否已成線性。參照Quick PCR purification kit說明書回收線性pSUPER.neo載體片段。
在酶切混合液中加入5倍體積的PB緩沖液,然后將此混合液轉(zhuǎn)移至QIAquick spin柱,12000×g離心1min;棄流出液,在QIAquickspin柱加入750μl PE緩沖液,12000×g離心1min,棄流出液;將QIAquick spin柱放回原收集管,12000×g再離心1min;接著將QIAquick spin柱轉(zhuǎn)移至一干凈1.5ml離心管中,并加入30μlEB緩沖液于柱中心,室溫下放置1min,室溫下12000×g離心1min。取2μl回收液進(jìn)行電泳,確定回收成功,剩余回收液-20℃凍存?zhèn)溆谩?br>
2.將退火后的siRNA連接進(jìn)線性化的載體中退火后的siRNA與線性pSUPER.neo載體的連接。在一新的離心管內(nèi)依次加入以下試劑(冰上操作)2×T4DNA連接酶緩沖液5μl、線狀pSUPER.neo載體1μl、siRNA 3μl和T4DNA連接酶1μl,混勻,25℃循環(huán)水浴1h。轉(zhuǎn)化前加入1μl Bgl II處理半小時。
3.將連接產(chǎn)物常規(guī)轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞——JM109。生長出的克隆擴(kuò)增后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定取2μl質(zhì)粒DNA,加入2μl10×buffer,2μl乙酰化BSA,8μl無菌水和3μlEcoR I和3μlHindIII限制性內(nèi)切酶。37℃水浴4~5h。8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,并進(jìn)行銀染鑒定,步驟如下10%乙醇固定30min;1%硝酸處理8min;超純水洗兩次后用0.2%的硝酸銀染色30min,然后在3%無水碳酸鈉與0.1%的甲醛組成的顯色液中顯色數(shù)分鐘,最后在10%的冰乙酸中定影。按照載體圖,含有siRNA的重組子經(jīng)酶切后可見287bp的片斷,而空載體對照則可切出227bp的片斷。篩選出的陽性克隆再進(jìn)行測序獲得表達(dá)質(zhì)粒(圖2、3、4)。
實施例3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及干擾效果的分析鑒定后的重組子轉(zhuǎn)染進(jìn)人食管癌細(xì)胞系EC109細(xì)胞,同時還轉(zhuǎn)染空載體做對照。為獲得穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞,我們首先使用濃度較高的G418(400μg/ml)進(jìn)行藥物篩選。轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒PSC和轉(zhuǎn)染以上siRNA的細(xì)胞(分別稱為PSE1和PSE2)的EC109細(xì)胞,由于質(zhì)粒載體上有neo基因,具有G418抗性,因此得以存活;而相比之下,未轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒的對照EC109細(xì)胞則因G418的毒性作用而被殺死。為防止連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中,表達(dá)質(zhì)粒的丟失,仍將細(xì)胞置于藥物濃度相對較低的生長環(huán)境中培養(yǎng)(200μg/ml),如果質(zhì)粒丟失,細(xì)胞仍會因G418的毒性作用而被殺死。在上述條件下,細(xì)胞能夠持續(xù)生長,表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒的EC109細(xì)胞株已被成功建立。
轉(zhuǎn)染的方法為首先,在玻璃試管中加入97μl無血清培養(yǎng)基,然后直接往里加入3μl FuGENE6(Roche公司)轉(zhuǎn)染試劑,輕輕混勻后室溫下靜置5min。取1μg質(zhì)粒(PSE質(zhì)粒和pSUPER.neo空載體)加入以上的混合物中,輕輕混勻。室溫下靜置15min后,取以上混合物加入培養(yǎng)皿中,置于5%CO2、濕度95%和37℃條件下培養(yǎng)。24h后,把培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液換為含有G418(400mg/L)的常規(guī)199培養(yǎng)液進(jìn)行篩選。14天后,抗藥克隆長出,換為培養(yǎng)液中含200mg/L G418的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),傳代擴(kuò)增。
篩選建立的細(xì)胞株用于干擾效果的分析。本發(fā)明分別用RT-PCR和Western blotting的方法從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進(jìn)行干擾效果的分析。提取細(xì)胞總蛋白Western blotting分析,結(jié)果提示(圖5A)PSE1和PSE2在蛋白水平上對Ezrin均有不同程度的干擾效果,而轉(zhuǎn)染空載體的PSC和未作處理的EC109細(xì)胞之間Ezrin表達(dá)無差異,其中PSE1較對照減弱了87%,而PSE2則為75%。提取細(xì)胞總RNA,用人Ezrin特異性的引物進(jìn)行RT-PCR,結(jié)果顯示在RNA水平PSE1和PSE2中Ezrin的表達(dá)均較兩個對照減弱,且PSE1>PSE2(圖5C),這與Westernblotting的結(jié)果一致。經(jīng)過連續(xù)的傳代,分別收獲第7、8、9代細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blotting檢測,以確定干擾的穩(wěn)定性(圖5B)。結(jié)果顯示各代均有明顯干擾效果而且程度比較穩(wěn)定。
所有實驗均表明,本發(fā)明所提供的siRNA表達(dá)載體能有效的在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA并能特異、高效的干擾Ezrin的表達(dá),為研究Ezrin基因在食管癌中的功能提供很好的工具。
抑制人Ezrin基因表達(dá)的siRNA及其表達(dá)載體序列表SEQUENCE LISTING<110>汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院<120>抑制人Ezrin基因表達(dá)的siRNA及其表達(dá)載體<130>
<160>4<170>Patent In version 3.2<210>1<211>
<212>DNA<213>人工序列<400>1E15’GATCCCCTCCACTATGTGGATAATAATTCAAGAGATTATTATCCACATAGTGGATTTTTGGAAA 3’5’AGCTTTTCCAAAAATCCACTATGTGGATAATAATCTCTTGAATTATTATCCACATAGTGGAGGG 3’<210>2<211>
<212>DNA<213>人工序列<400>2E25’GATCCCCACTTTGGCCTCCACTATGTTTCAAGAGAACATAGTGGAGGCCAAAGTTTTTTGGAAA 3’5’AGCTTTTCCAAAAAACTTTGGCCTCCACTATGTTCTCTTGAAACATAGTCGAGGCCAAAGTGGG 3’<210>3<211>
<212>DNA<213>人工序列<400>35′TCCACTATGTGGATAATAA3<210>4<211>
<212>DNA<213>人工序列<400>45′ACTTTGGCCTCCACTATGT3′
權(quán)利要求
1.一種抑制人Ezrin基因表達(dá)的siRNA,其特征在于該siRNA是下列雙鏈RNA中的一種或兩種,其堿基序列及作用部位如下E15’GATCCCCTCCACTATGTGGATAATAATTCAAGAGATTATTATCCACATAGTGGATTTTTGGAAA3’5’AGCTTTTCCAAAAATCCACTATGTGGATAATAATCTCTTGAATTATTATCCACATAGTGGAGGG3’作用于人Ezrin mRNA的第274-292;E25’GATCCCCACTTTGGCCTCCACTATGTTTCAAGAGAACATAGTGGAGGCCAAAGTTTTTTGGAAA 3’5’AGCTTTTCCAAAAAACTTTGGCCTCCACTATGTTCTCTTGAAACATAGTGGAGGCCAAAGTGGG 3’作用于人Ezrin mRNA的第265-283。
2.一種可以產(chǎn)生抑制人Ezrin基因表達(dá)的siRNA的載體,其特征在于其具有以下的基本結(jié)構(gòu)由啟動子、Ezrin編碼區(qū)、終止密碼、DNA序列順序連接而成的環(huán)狀雙鏈DNA分子;啟動子為可啟動產(chǎn)生siRNA的序列,它是啟動它的下游緊鄰之基因的表達(dá)的元件;Ezrin編碼區(qū)為表達(dá)權(quán)利要求1所述的siRNA的編碼區(qū),由19個核苷酸組成,可采用雙向結(jié)合或以發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)形成雙鏈RNA;終止密碼為5~6個T;DNA序列為任何真核質(zhì)粒載體和/或病毒的介于RNA編碼區(qū)和啟動子之間的DNA序列,含有質(zhì)粒載體DNA的復(fù)制起始位點,或含有抗生素抗性基因,包括使細(xì)菌獲得對抗某種抗生素的抗性的基因或使真核細(xì)胞獲得某種抗生素的抗性的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體,其特征在于所述啟動子為polymerase-III H1-RNA基因啟動子。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體,其特征在于所述任何真核質(zhì)粒載體和/或病毒為pSUPER.neo載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體,其特征在于所述抗生素抗性基因為抗生素G418抗性基因neo。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種siRNA,公開了一種抑制人Ezrin基因表達(dá)的siRNA及其表達(dá)載體。本發(fā)明設(shè)計、合成了靶向人Ezrin基因的兩對siRNA,并成功構(gòu)建了它們在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)載體。同時,運(yùn)用這些siRNA可以有效、特異地干擾Ezrin的表達(dá),建立了食管癌Ezrin低表達(dá)細(xì)胞株,為深入研究食管癌及其它Ezrin相關(guān)腫瘤中Ezrin的功能打下了堅實的基礎(chǔ)。
文檔編號A61P35/00GK1927877SQ20061003749
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月5日
發(fā)明者許麗艷, 謝劍君, 李恩民 申請人:汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院