專利名稱：中藥復(fù)方通脈口服液有效部位的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中醫(yī)藥防治慢性腎小球疾病領(lǐng)域，特別涉及一種治療慢性腎炎的中藥復(fù)方通脈口服液有效部位的藥物組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
慢性腎小球腎炎是臨床常見病、多發(fā)病，是由多種原因引起的原發(fā)于腎小球的一組臨床表現(xiàn)相似，而病理改變不一，預(yù)后不盡相同的免疫性疾病。其臨床特征為蛋白尿、血尿、水腫、高血壓以及腎功能損害。病情容易反復(fù)，疾病后期腎功能不斷惡化，最終可發(fā)展為尿毒癥而必須行昂貴的腎替代治療。目前統(tǒng)計，慢性腎小球腎炎是國內(nèi)導(dǎo)致尿毒癥發(fā)生的最主要的病因。西醫(yī)對本病的治療較為困難。中醫(yī)藥對本病的防治有一定優(yōu)勢。
中醫(yī)認(rèn)為慢性腎炎的發(fā)病多以氣虛為本，以血瘀為標(biāo)，即因氣虛而發(fā)病，因血瘀而致疾病遷延難愈，虛與瘀均貫穿于疾病過程的始終。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)是引起腎小球疾病的關(guān)鍵，由免疫反應(yīng)介導(dǎo)的凝血啟動則是病變持續(xù)發(fā)展和腎功能進行性減退的重要因素。所以通過補益氣血來調(diào)節(jié)免疫功能，通過活血化瘀來改善腎小球內(nèi)凝血狀態(tài)從而達到防治慢性腎炎的目的。
目前市場上治療慢性腎炎的有關(guān)中成藥主要有兩大類其一具有補益類的蟲草類制劑，如蟲草膠囊、百令膠囊、金水寶等；其二為具有清熱利濕作用的制劑，如雷公藤多甙片、火把花根片、黃蜀葵花膠囊等。蟲草類制劑多偏補，以扶正固本為主；而具有清熱利濕作用的中成藥則以祛邪為主，有一定的免疫抑制作用，且其毒副反應(yīng)較多見。故以上兩種制劑在臨床使用有一定的局限性。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種治療慢性腎炎的中藥復(fù)方通脈口服液有效部位的藥物組合物。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述藥物組合物的制備方法。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種中藥復(fù)方通脈口服液有效部位的藥物組合物，由下列按重量份計中藥原料黃芪10～30份和三七3～9份，或黃芪10～30份、三七3～9份和丹參12～15份，或黃芪10～30份、三七3～9份、丹參12～15份和當(dāng)歸12～15份中提取有效部位復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙配制而成，所述復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙的配伍比為12～1∶1。特別優(yōu)選復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙的配伍比為4∶1。
為了更好地實現(xiàn)本發(fā)明，本發(fā)明中藥原料中還可再加入按重量份計川芎5～15份。
本發(fā)明中藥復(fù)方通脈口服液有效部位的藥物組合物可以制備成任何一種常用口服劑型，如膠囊劑、顆粒劑、口服液、片劑等。
一種中藥復(fù)方通脈口服液有效部位的藥物組合物的制備方法，包括如下工藝步驟和工藝方法從上述中藥原料中提取有效部位復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙配伍而成，所述復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙的配伍比為12～1∶1。
所述復(fù)方多糖按下述方法提取而成取按所述重量配比的中藥原料黃芪和三七，或黃芪、三七和丹參，或黃芪、三七、丹參和當(dāng)歸，或黃芪、三七和川芎，或黃芪、三七、丹參和川芎，或黃芪、三七、丹參、當(dāng)歸和川芎，加8～18倍量水浸泡1～24小時，提取1～3次，每次提取1～3小時，過濾，將每次濾液相合并，然后濃縮至0.1～1.0g生藥/ml，然后加無水乙醇至含醇量60～80％，靜置，過夜，傾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干凈，50～60℃恒溫干燥至恒重。
所述復(fù)方皂苷按下述方法提取而成取按所述重量配比的中藥原料黃芪和三七，或黃芪、三七和丹參，或黃芪、三七、丹參和當(dāng)歸，或黃芪、三七和川芎，或黃芪、三七、丹參和川芎，或黃芪、三七、丹參、當(dāng)歸和川芎，加8～18倍量水浸泡1～24小時，提取1～3次，每次提取1～3小時，將每次提取液相合并，提取液以紗布夾棉花過濾，冷存(0～4℃)，離心10～15min，3000～6000r/min，取上清液，濃縮至0.1～1.0g生藥/ml，加入75～95％乙醇至含醇量達60～80％，邊加邊攪拌，靜置冷藏(0～4℃)過夜，離心，傾出上清液，濃縮至0.1～1.0g生藥/ml，濃縮液上大孔樹脂柱，流出液水浴蒸干，于50～60℃烘干至恒重。
所述大孔樹脂柱為D101型大孔樹脂柱。所述濃縮液上大孔樹脂柱吸附2～3次，每次1～2小時，流出速度為0.5～0.6mL/min。
本發(fā)明中藥復(fù)方通脈口服液有效部位的藥物組合物主要由黃芪、三七等中藥組成。黃芪具有補氣生陽、益衛(wèi)固表等功效，為重要的補氣藥。其對機體免疫系統(tǒng)影響廣泛，具有調(diào)節(jié)免疫的作用。三七、丹參、當(dāng)歸、川芎等具有散瘀止血，消腫定痛、補虛的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明黃芪和三七都具有調(diào)節(jié)免疫的作用。多糖類成分是本發(fā)明中藥復(fù)方通脈口服液有效部位的藥物組合物的主要有效部位之一。試驗結(jié)果表明，復(fù)方多糖提取工藝穩(wěn)定、可行，所得多糖平均得率為7.43％，提取物中多糖的平均含量為46.12％，本發(fā)明對研究和生產(chǎn)過程中中藥復(fù)方有效部位的提取提供一定的實驗基礎(chǔ)。
本發(fā)明中藥復(fù)方通脈口服液有效部位的藥物組合物所含化學(xué)成分復(fù)雜，含有多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)及黃酮等，而主要有效成分皂苷含量約為10％，該中藥復(fù)方中復(fù)方皂苷的分離、富集、純化均有一定的難度，采用大孔樹脂吸附法，純化醇沉以后溶液中的復(fù)方皂苷，并對部分影響得率和含量的工藝參數(shù)進行考察，從結(jié)果看來，復(fù)方皂苷平均得率為2.35％，該粗提物中皂苷含量均在70％以上。使用D101型大孔樹脂，具有吸附快、吸附容量大、洗脫工藝簡單等特點，適合本發(fā)明通脈口服液有效部位的藥物組合物有效部位制劑開發(fā)的使用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果(1)本發(fā)明中藥復(fù)方通脈口服液有效部位的藥物組合物具有益氣活血作用，扶正祛邪兼顧，用之治療慢性腎炎，其機制表現(xiàn)為通過益氣活血法達到調(diào)節(jié)機體的免疫能力，增強免疫穩(wěn)定性，抑制已發(fā)生的免疫反應(yīng)，減輕免疫復(fù)合物對腎小球的直接損傷，降低腎小球濾過膜的通透性；改善體內(nèi)微循環(huán)，降低血液高凝狀態(tài)，并抑制系膜細(xì)胞增生和系膜基質(zhì)的分泌，緩解腎小球纖維、硬化的發(fā)生，并最終改善或穩(wěn)定腎功能的目的。
(2)由本發(fā)明提取的藥效部位配伍組成藥物組合物，更好提高臨床療效，療效顯著，無明顯毒副作用。
(3)本發(fā)明為開發(fā)中藥5類新藥打下良好基礎(chǔ)；本發(fā)明對有效中藥制劑的深入研究開發(fā)、對中醫(yī)藥現(xiàn)代化、中醫(yī)藥走上國際均有很大的現(xiàn)實意義。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例1復(fù)方多糖按下述方法提取而成取按重量份計藥材黃芪10份、三七3份，加8倍量水浸泡24小時，提取2次，每次提取3小時，過濾，將每次濾液相合并，然后濃縮至0.5g生藥/ml，然后加無水乙醇至含醇量60％，靜置，過夜，傾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干凈，50℃恒溫干燥至恒重。
復(fù)方皂苷按下述方法提取而成取按重量份計藥材黃芪10份、三七3份，加8倍量水浸泡24小時，提取2次，每次提取3小時，將每次提取液相合并，提取液以紗布夾棉花過濾，置冰箱冷存(0～4℃)，離心10min，6000r/min，分取上清液，濃縮至1.0g生藥/ml，加入95％乙醇至含醇量達80％，邊加邊攪拌，靜置冷藏(0～4℃)過夜，離心，傾出上清液，濃縮至0.5g生藥/ml，上D101型大孔樹脂柱，吸附2次，每次2小時，流出速度為0.6mL/min，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸于，置于恒溫干燥箱中，50℃烘干至恒重。
該通脈口服液有效部位的藥物組合物有效部位為復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙，復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙的配伍比為3∶1。
實施例2復(fù)方多糖按下述方法提取而成取按重量份計藥材黃芪30份、三七9份、丹參12份，加18倍量水浸泡1小時，提取3次，每次提取1小時，過濾，將每次濾液相合并，然后濃縮至0.1g生藥/ml，然后加無水乙醇至含醇量80％，靜置，過夜，傾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干凈，60℃恒溫干燥至恒重。
復(fù)方皂苷按下述方法提取而成取按重量份計藥材黃芪30份、三七9份、丹參12份，加18倍量水浸泡1小時，提取3次，每次提取1小時，將每次提取液相合并，提取液以紗布夾棉花過濾，置冰箱冷存(0～4℃)，離心15min，5000r/min，取上清液，濃縮至0.1g生藥/ml，加入75％乙醇至含醇量達60％，邊加邊攪拌，靜置冷藏(0～4℃)過夜，離心，傾出上清液，濃縮至0.1g生藥/ml，上D101型大孔樹脂柱，吸附3次，每次1小時，流出速度為0.5mL/min，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于恒溫干燥箱中，60℃烘干至恒重。
該通脈口服液有效部位的藥物組合物有效部位為復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙，復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙的配伍比為12∶1。
實施例3復(fù)方多糖按下述方法提取而成取按重量份計藥材黃芪20份、三七5份、丹參15份、當(dāng)歸12份、川芎5份，加10倍量水浸泡24小時，提取1次，每次提取2小時，過濾，將每次濾液相合并，然后濃縮至0.6g生藥/ml，然后加無水乙醇至含醇量70％，靜置，過夜，傾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干凈，60℃恒溫干燥至恒重。
復(fù)方皂苷按下述方法提取而成取按重量份計藥材黃芪20份、三七5份、丹參15份、當(dāng)歸12份、川芎5份，加10倍量水浸泡24小時，提取1次，每次提取2小時，將每次提取液相合并，提取液以紗布夾棉花過濾，置冰箱冷存(0～4℃)，離心12min，3000r/min，分取上清液，濃縮至0.5g生藥/ml，加入95％乙醇至含醇量達80％，邊加邊攪拌，靜置冷藏(0～4℃)過夜，離心，傾出上清液，濃縮至0.5g生藥/ml，上大孔樹脂柱，吸附3次，每次2小時，流出速度為0.5mL/min，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于恒溫干燥箱中，60℃烘干至恒重。
該通脈口服液有效部位的藥物組合物有效部位為復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙，復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙的配伍比為1∶1。
實施例4復(fù)方多糖按下述方法提取而成取按重量份計藥材黃芪30份、三七3份、丹參12份、川芎15份，加8倍量水浸泡24小時，提取2次，每次提取3小時，過濾，將每次濾液相合并，然后濃縮至0.5g生藥/ml，然后加無水乙醇至含醇量60％，靜置，過夜，傾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干凈，55℃恒溫干燥至恒重。
復(fù)方皂苷按下述方法提取而成取按重量份計藥材黃芪30份、三七3份、丹參12份、川芎15份，加8倍量水浸泡24小時，提取2次，每次提取3小時，將每次提取液相合并，提取液以紗布夾棉花過濾，置冰箱冷存(0～4℃)，離心10min，6000r/min，分取上清液，濃縮至1.0g生藥/ml，加入85％乙醇至含醇量達70％，邊加邊攪拌，靜置冷藏(0～4℃)過夜，離心，傾出上清液，濃縮至0.5g生藥/ml，上D101型大孔樹脂柱，吸附2次，每次2小時，流出速度為0.6mL/min，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于恒溫干燥箱中，55℃烘干至恒重。
該通脈口服液有效部位的藥物組合物有效部位為復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙，復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙的配伍比為4∶1。
實施例5復(fù)方多糖按下述方法提取而成取按重量份計藥材黃芪10份、三七9份、川芎10份，加16倍量水浸泡12小時，提取2次，每次提取3小時，過濾，將每次濾液相合并，然后濃縮至1.0g生藥/ml，然后加無水乙醇至含醇量60％，靜置，過夜，傾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干凈，60℃恒溫干燥至恒重。
復(fù)方皂苷按下述方法提取而成取按重量份計藥材黃芪10份、三七9份、川芎10份，加16倍量水浸泡12小時，提取2次，每次提取3小時，將每次提取液相合并，提取液以紗布夾棉花過濾，置冰箱冷存(0～4℃)，離心12min，4000r/min，分取上清液，濃縮至1.0g生藥/ml，加入95％乙醇至含醇量達80％，邊加邊攪拌，靜置冷藏(0～4℃)過夜，離心，傾出上清液，濃縮至0.5g生藥/ml，上D101型大孔樹脂柱，吸附2次，每次2小時，流出速度為0.6mL/min，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于恒溫干燥箱中，60℃烘干至恒重。
該通脈口服液有效部位的藥物組合物有效部位為復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙，復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙的配伍比為6∶1。
實施例6
復(fù)方多糖按下述方法提取而成取按重量份計藥材黃芪20份、三七5份、丹參15份、當(dāng)歸12份，加10倍量水浸泡24小時，提取1次，每次提取2小時，過濾，將每次濾液相合并，然后濃縮至0.6g生藥/ml，然后加無水乙醇至含醇量70％，靜置，過夜，傾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干凈，60℃恒溫干燥至恒重。
復(fù)方皂苷按下述方法提取而成取按重量份計藥材黃芪20份、三七5份、丹參15份、當(dāng)歸12份，加10倍量水浸泡24小時，提取1次，每次提取2小時，將每次提取液相合并，提取液以紗布夾棉花過濾，置冰箱冷存(0～4℃)，離心15min，3000r/min，分取上清液，濃縮至0.5g生藥/ml，加入95％乙醇至含醇量達80％，邊加邊攪拌，靜置冷藏(0～4℃)過夜，離心，傾出上清液，濃縮至0.5g生藥/ml，上大孔樹脂柱，吸附3次，每次2小時，流出速度為0.5mL/min，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于恒溫干燥箱中，60℃烘干至恒重。
該通脈口服液有效部位的藥物組合物有效部位為復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙，復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙的配伍比為8∶1。
實施例7復(fù)方多糖按下述方法提取而成取按重量份計藥材黃芪10份、三七3份、丹參12份、當(dāng)歸15份、川芎15份，加16倍量水浸泡12小時，提取2次，每次提取3小時，過濾，將每次濾液相合并，然后濃縮至0.8g生藥/ml，然后加無水乙醇至含醇量60％，靜置，過夜，傾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干凈，50℃恒溫干燥至恒重。
復(fù)方皂苷按下述方法提取而成取按重量份計藥材黃芪10份、三七3份、丹參12份、當(dāng)歸15份、川芎15份，加16倍量水浸泡12小時，提取2次，每次提取3小時，將每次提取液相合并，提取液以紗布夾棉花過濾，置冰箱冷存(0～4℃)，離心10min，6000r/min，分取上清液，濃縮至0.8g生藥/ml，加入95％乙醇至含醇量達80％，邊加邊攪拌，靜置冷藏(0～4℃)過夜，離心，傾出上清液，濃縮至0.5g生藥/ml，上D101型大孔樹脂柱，吸附2次，每次2小時，流出速度為0.6mL/min，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于恒溫干燥箱中，50℃烘干至恒重。
該通脈口服液有效部位的藥物組合物有效部位為復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙，復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙的配伍比為3∶1。
實施例8復(fù)方多糖按下述方法提取而成取按重量份計藥材黃芪30份、三七9份、丹參13份、當(dāng)歸13份、川芎10份，加12倍量水浸泡12小時，提取2次，每次提取3小時，過濾，將每次濾液相合并，然后濃縮至0.5g生藥/ml，然后加無水乙醇至含醇量60％，靜置，過夜，傾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干凈，50℃恒溫干燥至恒重。
復(fù)方皂苷按下述方法提取而成取按重量份計藥材黃芪30份、三七9份、丹參13份、當(dāng)歸13份、川芎10份，加12倍量水浸泡12小時，提取2次，每次提取3小時，將每次提取液相合并，提取液以紗布夾棉花過濾，置冰箱冷存(0～4℃)，離心10min，5000r/min，分取上清液，濃縮至1.0g生藥/ml，加入95％乙醇至含醇量達80％，邊加邊攪拌，靜置冷藏(0～4℃)過夜，離心，傾出上清液，濃縮至0.5g生藥/ml，上D101型大孔樹脂柱，吸附2次，每次2小時，流出速度為0.6mL/min，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于恒溫干燥箱中，50℃烘干至恒重。
該通脈口服液有效部位的藥物組合物有效部位為復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙，復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙的配伍比為4∶1。
實施例9本發(fā)明通脈口服液有效部位的藥物組合物有效部位復(fù)方皂苷部位的指紋圖譜研究以薄層層析法和HPLC法對藥效組分復(fù)方皂苷部位的指紋圖譜進行初步研究；以柱層析法、結(jié)晶法等對復(fù)方化學(xué)成分進行分離純化，結(jié)合IR、MS、1HNMR、13CNMR、HPLC等方法對中藥復(fù)方主要化學(xué)成分進行結(jié)構(gòu)鑒定。本發(fā)明通脈口服液有效部位的藥物組合物有效部位化學(xué)指紋圖譜研究結(jié)果薄層色譜研究結(jié)果顯示，本發(fā)明通脈口服液有效部位的藥物組合物復(fù)方皂苷共有斑點有10個，其Rf值分別為0.11，0.17，0.19，0.23，0.30，0.33，0.47，0.50，0.58，0.63，其中Rf0.17為人參皂苷Rb1、Rf0.33為人參皂苷Rg1，在與黃芪甲苷Rf0.40的位置上，未發(fā)現(xiàn)復(fù)方皂苷中與其相應(yīng)的斑點。高效液相色譜研究結(jié)果表明，本發(fā)明通脈口服液有效部位的藥物組合物復(fù)方皂苷共有峰有12個，其保留時間平均值分別為10.075，21.269，24.163，29.399，31.283，38.291，40.149，41.148，42.927，52.400，53.538，62.632其中RT為24.163為人參皂苷Rg1、38.291為人參皂苷Rb1，兩者積分面積之和占總面積的百分含量大于30％。
對比配伍前后單體有效物質(zhì)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)配伍后人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1結(jié)構(gòu)基本保持不變，但配伍后人參皂苷Rb1旋光度發(fā)生了顯著變化，原值為[α]D26+11.5，現(xiàn)中藥復(fù)方藥物組合物分離成分測得值[α]D200，但其UV、IR、NMR、MS譜數(shù)據(jù)基本一致，配伍后原三七藥材中的人參皂苷Rb1形成了人參皂苷Rb1消旋體。
本發(fā)明通脈口服液有效部位的藥物組合物化學(xué)成分研究結(jié)果從復(fù)方提取液中共分離得到3個單體化合物TM-1、TM-77、TM-92(TM-1為蔗糖類成分、TM-77即為人參皂苷Rg1、TM-92即為人參皂苷Rb1)，經(jīng)初步鑒定為糖類及皂苷類成分。并通過UV、IR、NMR、LC-MS及旋光譜等方法對單體化合物進行了結(jié)構(gòu)鑒定，確定了其中的2個皂苷類成分，即人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1。本發(fā)明通脈口服液有效部位的藥物組合物治療慢性腎炎的主要藥效部位主要為復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙，而皂苷跟多糖合用，實驗效果優(yōu)于單用；經(jīng)多批次樣品比較試驗，本發(fā)明通脈口服液有效部位的藥物組合物復(fù)方皂苷中所有共有峰峰高和峰面積基本一致，其TLC及HPLC指紋圖譜均具有專屬、穩(wěn)定、重復(fù)性強的特點，但其主要成分含量均大于單味藥材中的含量，合煎有助溶或增溶的作用，且合煎后原單味藥材中的主要有效成分結(jié)構(gòu)基本穩(wěn)定。
實施例10本發(fā)明有效部位復(fù)方多糖、復(fù)方皂苷按最佳配伍比(4∶1)組成的藥物組合物與原通脈口服液在抑制系膜細(xì)胞增殖作用的比較采用MTT法(四唑鹽比色法)，比較兩者在抑制系膜細(xì)胞增殖方面的作用，結(jié)果表明本發(fā)明有效部位復(fù)方多糖、復(fù)方皂苷按最佳配伍比(4∶1)組成的藥物組合物在抑制系膜細(xì)胞增殖方面的作用優(yōu)于原通脈口服液組(按重量份計黃芪10份、三七3份、丹參12份、當(dāng)歸12份)。復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙為本發(fā)明的有效組分。

注*P＜0.05，**P＜0.01實施例11通脈口服液有效部位復(fù)方多糖、復(fù)方皂苷按最佳配伍比(4∶1)組成的藥物組合物防治系膜增生性腎炎(MsPGN)的藥效學(xué)評價高劑量組(復(fù)方多糖、復(fù)方皂苷各為960mg/kg、240mg/kg)；中劑量組(復(fù)方多糖、復(fù)方皂苷各為480mg/kg、120mg/kg)；低劑量組(復(fù)方多糖、復(fù)方皂苷各為240mg/kg、60mg/kg)；金水寶組(1320mg/kg)；模型對照組(系膜增生性腎炎大鼠以2ml生理鹽水灌胃)；空白對照組(正常大鼠以2ml生理鹽水灌胃)。
1對24h尿蛋白定量的影響采用大鼠抗胸腺抗血清(AST)制備大鼠MsPGN腎炎模型。模型對照組第2、4周大鼠24h尿蛋白量明顯增加，與空白對照組相比，有非常顯著性差異(P＜0.01)；高、中、低劑量組及金水寶組大鼠尿蛋白均有顯著減低，與模型對照組相比，有非常顯著性差異(P＜0.05～0.01)，低劑量組與金水寶組相比，無顯著性差異(P＞0.05)；高、中劑量組與金水寶組相比，有非常顯著性差異(P＜0.01)2血尿及尿紅細(xì)胞計數(shù)尿紅細(xì)胞檢查空白對照組鏡下無血尿，模型對照組及各給藥組鏡下均可見數(shù)量不等的紅細(xì)胞(+～++++)。
模型對照組第2周、第4周尿中紅細(xì)胞數(shù)明顯增加，與空白對照組比較，有非常顯著性差異(P＜0.01)；金水寶組紅細(xì)胞計數(shù)與模型對照組相比，差異無顯著性意義(P＞0.05)；高、中、低劑量組均能使尿中紅細(xì)胞數(shù)明顯減少，與模型對照組相比，有顯著或非顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)，與金水寶組相比，亦有顯著或非常顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。
3對血肌酐(CSCr)和血尿素氮(CBUN)的影響模型對照組2、4周血尿素氮明顯升高，與空白對照組相比，有非常顯著性差異(P＜0.01)；高、中、低劑量組及金水寶組血尿素氮均有所下降，與模型對照組相比，有顯著或非常顯著性差異(P＜0.05或0.01)；高、中、低劑量組與金水寶組相比，均無顯著性差異(P＞0.05)。模型對照組2、4周血肌酐明顯增加，與空白對照組相對，有顯著性差異(P＜0.05)；高、中、低劑量組及金水寶組降血肌酐作用不明顯，與模型對照組相比，均無顯著性差異(P＞0.05)。
4對血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)的影響模型對照組2、4周血清總蛋白有所降低，與空白對照組相比，有顯著性差異(P＜0.05)；高、中劑量組及金水寶組均使血清總蛋白升高，與模型對照組相比，有非常顯著性差異(P＜0.01)；而低劑量組對血清總蛋白的影響不明顯，與模型對照組相比，無顯著性差異(P＞0.05)；高、中、低劑量組與金水寶組相比，均無顯著性差異(P＞0.05)。模型對照組2、4周血清白蛋白有所降低，與空白對照組比較，有顯著性或非常顯著性差異(P＜0.05或0.01)；高、中劑量組及金水寶組均使血清總蛋白升高，與模型對照組相比，有非常顯著性差異(P＜0.01)；而低劑量組對血清總蛋白的影響不明顯，與模型對照組相比，無顯著性差異(P＞0.05)；高、中、低劑量組與金水寶組相比，均無顯著性差異(P＞0.05)。
5對血液流學(xué)的影響模型對照組全血比粘度(高切、低切)、全血還原粘度(高切、低切)、血漿比粘度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均增加，與空白對照組比較，有顯著性差異(P＜0.05)；高、中、低劑量均能使全血比粘度(高切、低切)、全血還原粘度(高切、低切)、血漿比粘度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)降低，與模型對照組比較，有顯著或非常顯著性差異(P＜0.05或0.01)；金水寶組對全血比粘度(高切、低切)、全血還原粘度(高切、低切)、血漿比粘度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)基本上無明顯影響，與模型對照組相比，無顯著性差異(P＞0.05)。
6對T細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8的影響模型對照組CD3、CD4降低，CD8升高，CD4/CD8降低，與空白對照組比較，有非常顯著性差異(P＜0.01)；高、中、低劑量組與金水寶組均能使CD3、CD4升高，CD8降低，CD4/CD8升高，與模型對照組比較，有顯著或非常顯著性差異(P＜0.05或0.01)；高、中劑量組作用與金水寶相比，無顯著性差異(P＞0.05)，而低劑量組與金水寶組相比，有顯著性差異(P＜0.05)。
7腎臟病理改變及圖像分析(1)HE染色空白對照組腎小球形態(tài)基本正常，腎小球基底膜正常，毛細(xì)血管形態(tài)無異常改變，細(xì)胞及系膜基質(zhì)無增多。模型對照組呈重度系膜增生，可見腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞彌漫性增多，腎小球基底膜基本正常，毛細(xì)血管明顯壓迫，血管腔內(nèi)大量血栓形成，表明此時血液呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，系膜區(qū)基質(zhì)明顯增加，未見腎小球纖維化及硬化。高、中低劑組系膜呈低度增生，血管腔內(nèi)血栓明顯減少，低劑量組及金水寶組腎小球系膜呈中度增生，血管腔內(nèi)仍見有血栓形成(2)PAS染色及圖像分析結(jié)果模型對照組系膜區(qū)基質(zhì)占整個毛細(xì)血管叢面積的百分比明顯高于空白對照組，統(tǒng)計學(xué)處理有非常顯著性差異(P＜0.01)；高劑量組能顯著降低系膜區(qū)基質(zhì)占毛細(xì)血管叢面積的百分比，與模型對照組相比，有非常顯著性差異(P＜0.01)；中劑量組與金水寶亦能均降低系膜區(qū)基質(zhì)占毛細(xì)血管叢面積的百分比，與模型組對照組相比，有顯著性差異(P＜0.05)；而低劑量組作用不明顯，與模型對照組相比，無顯著性差異(P＞0.05)。高劑量組與金水寶組相比，有非常顯著性差異(P＜0.01)。
8免疫熒光空白對照組可見IgG+，沿腎小球系膜區(qū)呈點狀分布，模型對照組IgG++++，沿腎小球系膜區(qū)呈團塊狀沉積，低劑量組、金水寶組IgG++～+++，沿腎小球系膜區(qū)呈團狀分布，中劑量、高劑量組IgG+～++，沿腎小球系膜區(qū)呈點狀分布。
9腎小球內(nèi)細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)表達影響模型對照組腎小球細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于空白對照組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理有非常顯著性差異(P＜0.01)；高、中、低劑量均能顯著降低腎小球細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)陽性細(xì)胞數(shù)，與模型對照組相比，有非常顯著性差異(P＜0.01)；金水寶組能顯著降低降低腎小球細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)陽性細(xì)胞數(shù)，與模型對照組相比，有顯著或非常顯著性差異(P＜0.01或0.05)；高劑量組與金水寶組相比，有顯著性差異(P＜0.05)。
本發(fā)明通脈口服液有效部位的藥物組合物有效部位按最佳配伍比組成的可以有效地減少模型大鼠的24h尿蛋白量，減少尿紅細(xì)胞數(shù)、降低血肌酐及血尿素氮水平、改善血液流變學(xué)、提高血清總蛋白及白蛋白水平、增強細(xì)胞免疫功能、減輕腎組織的病理損害。
實施例12本發(fā)明通脈口服液有效部位的藥物組合物作用機制的研究一、本發(fā)明通脈口服液有效部位的藥物組合物對大鼠腎小球系膜細(xì)胞IL-1β、IL-10的影響(1)含藥血清制備按臨床成人用量的20倍即8g(生藥)/kg，灌胃給藥，連續(xù)7天，第7天重復(fù)給藥2次，間隔時間2h，并于末次給藥后1h，無菌操作，眼眶靜脈取血，靜置1h，待血凝固后離心(1500rpm，10min)，分離血清，并將含藥血清置于56℃水浴箱中，水浴30min滅活處理。置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> (2)實驗分組與給藥取第3代MC，用含10％FCS(胎牛血清)的DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度到5×104～105/ml，轉(zhuǎn)種于6孔培養(yǎng)板中，1ml/孔，則每孔細(xì)胞數(shù)為5×104～105/ml。37℃，5％CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)24h，各孔均換液，加入不含F(xiàn)CS的DMEM培養(yǎng)液1ml以同步各組細(xì)胞于G0期。然后分①空白對照組(加10％FBS)；②LPS組(LPS10ug/ml)③LPS+有效部位藥物組合物(10％復(fù)方多糖/復(fù)方皂苷3∶3含藥血清+10uG/ml LPS)，共3組，每組設(shè)復(fù)孔4個。5％CO2，飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)。于培養(yǎng)3h，6h，12h，24h時分別取出相應(yīng)的培養(yǎng)板，收集各組上清液，-20℃保存。
(3)IL-1β、IL-10測定檢測IL-1β、IL-10，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。
(4)統(tǒng)計方法應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間均數(shù)比較用單因素方差分析。
各組分在不同時段對大鼠系膜細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β的影響，結(jié)果表明LPS組在不同時間段比空白對照組IL-1β產(chǎn)生量均明顯增加，且有非常顯著差異(P＜0.01)，并在加入LPS12小時時分泌量最多，但與其它時間點比較差異無顯著性(P＞0.05)。LPS+有效部位藥物組合物與LPS組在6h、12h、24h比較IL-1β分泌量均下降，在6h、12h二個時間點有非常顯著性差異(P＜0.01)，而24h時間點有顯著性差異(P＜0.05)。在3h時間點LPS+有效部位藥物組合物與LPS組比較IL-1β無明顯差異。
各組分在不同時段對大鼠系膜細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10的影響，結(jié)果表明大鼠腎小球系膜細(xì)胞經(jīng)加入LPS刺激后IL-10表達量在不同時間點均無明顯增加，與空白對照組相比均無顯著性差異(P＞0.05)。而LPS+有效部位藥物組合物與空白對照組比較，LPS+有效部位藥物組合物在6h時間點IL-10分泌量有明顯增加，有非常顯著性差異(P＜0.01)。LPS+有效部位藥物組合物與LPS組比較，LPS+有效部位藥物組合物僅在6h時間點IL-10分泌量較LPS組有明顯增加，差異有顯著性(P＜0.05)，而在其它時間點無明顯變化。
二、本發(fā)明通脈口服液有效部位的藥物組合物對大鼠腎小球系膜細(xì)胞IL-1β、IL-10mRNA表達的影響(1)含藥血清制備方法同前。
(2)IL-1β、IL-10mRNA的檢測1.實驗分組與給藥取第3代MC，用含10％FCS的DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度到1×106/ml，轉(zhuǎn)種于75cm2培養(yǎng)瓶中，加入10％FCS的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5％CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)24h，各瓶均換液，加入不含F(xiàn)CS的DMEM培養(yǎng)液以同步各組細(xì)胞于G0期。然后分①空白對照組(加10％FBS(胎牛血清))；②LPS組(LPS10uG/ml)③LPS+有效部位藥物組合物(10％復(fù)方多糖/復(fù)方皂苷3∶3含藥血清+10uG/ml LPS)，共3組。5％CO2，飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)。于培養(yǎng)6h、24h時分別取出相應(yīng)的培養(yǎng)瓶，提取系膜細(xì)胞總RNA，總RNA產(chǎn)物進行逆轉(zhuǎn)錄-聚核酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)(ImagemasterSoftware)進行條帶光密度分析，得到mRNA的光密度值。
2.統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以X±S表示。通過SPSS11.0統(tǒng)計軟件，采用單因數(shù)方差分析對各組均數(shù)進行顯著性檢驗，P＜0.05具有顯著性差異。
IL-1βmRNA表達在6小時LPS組及24小時LPS組均明顯上調(diào)，而在空白對照組無表達。加入有效部位藥物組合物后，不論在6小時，還是24小時均較LPS組表達下降，差異有顯著性(P＜0.05)。而IL-10mRNA在空白對照組、及24小時間點無表達，在6小時時間點有表達，且加入本發(fā)明通脈口服液有效部位的藥物組合物后，IL-10mRNA表達量較LPS組明顯上調(diào)，有非常顯著性差異(P＜0.01)。
實踐證明，本發(fā)明通脈口服液有效部位的藥物組合物能有效地防治慢性腎炎，其機制表現(xiàn)為通過益氣活血法達到調(diào)節(jié)機體的免疫能力，增強免疫穩(wěn)定性，抑制已發(fā)生的免疫反應(yīng)，減輕免疫復(fù)合物對腎小球的直接損傷，降低腎小球濾過膜的通透性；改善體內(nèi)微循環(huán)，降低血液高凝狀態(tài)，并抑制系膜細(xì)胞增生和系膜基質(zhì)的分泌，緩解腎小球纖維、硬化的發(fā)生，并最終改善或穩(wěn)定腎功能的目的。
權(quán)利要求
1.一種中藥復(fù)方通脈口服液有效部位的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物由下列按重量份計中藥原料黃芪10～30份和三七3～9份，或黃芪10～30份、三七3～9份和丹參12～15份，或黃芪10～30份、三七3～9份、丹參12～15份和當(dāng)歸12～15份中提取有效部位復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙配制而成，所述復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙的配伍比為12～1∶1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥復(fù)方通脈口服液有效部位的藥物組合物，其特征在于，所述復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙的配伍比為4∶1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥復(fù)方通脈口服液有效部位的藥物組合物，其特征在于，所述中藥原料中再加入按重量份計川芎5～15份。
4.一種權(quán)利要求1或2或3所述的中藥復(fù)方通脈口服液有效部位的藥物組合物的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物組合物制備成膠囊劑、顆粒劑、口服液或片劑。
5.一種權(quán)利要求1或2或3所述的中藥復(fù)方通脈口服液有效部位的藥物組合物的制備方法，其特征在于包括如下工藝步驟和工藝方法從中藥原料中提取有效部位復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙配伍而成，所述復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙的配伍比為12～1∶1；所述復(fù)方多糖按下述方法提取而成取按所述重量配比的中藥原料黃芪和三七，或黃芪、三七和丹參，或黃芪、三七、丹參和當(dāng)歸，或黃芪、三七和川芎，或黃芪、三七、丹參和川芎，或黃芪、三七、丹參、當(dāng)歸和川芎，加8～18倍量水浸泡1～24小時，提取1～3次，每次提取1～3小時，過濾，將每次濾液相合并，然后濃縮至0.1～1.0g生藥/ml，然后加無水乙醇至含醇量60～80％，靜置，過夜，傾出上清液，沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次先后清洗至干凈，50～60℃恒溫干燥至恒重；所述復(fù)方皂苷按下述方法提取而成取按所述重量配比的中藥原料黃芪和三七，或黃芪、三七和丹參，或黃芪、三七、丹參和當(dāng)歸，或黃芪、三七和川芎，或黃芪、三七、丹參和川芎，或黃芪、三七、丹參、當(dāng)歸和川芎，加8～18倍量水浸泡1～24小時，提取1～3次，每次提取1～3小時，將每次提取液相合并，提取液以紗布夾棉花過濾，冷存，離心10～15min，3000～6000r/min，取上清液，濃縮至0.1～1.0g生藥/ml，加入75～95％乙醇至含醇量達60～80％，邊加邊攪拌，靜置冷藏過夜，離心，傾出上清液，濃縮至0.1～1.0g生藥/ml，濃縮液上大孔樹脂柱，流出液水浴蒸干，于50～60℃烘干至恒重。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的中藥復(fù)方通脈口服液有效部位的藥物組合物的制備方法，其特征在于，所述大孔樹脂柱為D101型大孔樹脂柱。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的中藥復(fù)方通脈口服液有效部位的藥物組合物的制備方法，其特征在于，所述濃縮液上大孔樹脂柱吸附2～3次，每次1～2小時，流出速度為0.5～0.6mL/min。
全文摘要
本發(fā)明涉及中醫(yī)藥防治慢性腎小球疾病領(lǐng)域，公開了一種治療慢性腎炎的中藥復(fù)方通脈口服液有效部位的藥物組合物及其制備方法。該藥物組合物由下列按重量份計黃芪10～30份和三七3～9份或黃芪10～30份、三七3～9份和丹參12～15份或黃芪10～30份、三七3～9份、丹參12～15份和當(dāng)歸12～15份中提取有效部位復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙配制而成，復(fù)方多糖與復(fù)方皂甙的配伍比為12～1∶1。本發(fā)明藥物組合物具有益氣活血作用，增強免疫穩(wěn)定性，減輕免疫復(fù)合物對腎小球的直接損傷，降低腎小球濾過膜的通透性；改善體內(nèi)微循環(huán)，降低血液高凝狀態(tài)并抑制系膜細(xì)胞增生和系膜基質(zhì)的分泌，緩解腎小球纖維、硬化的發(fā)生，并最終改善或穩(wěn)定腎功能。
文檔編號A61P13/12GK1857394SQ200610034480
公開日2006年11月8日 申請日期2006年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月22日
發(fā)明者楊霓芝, 劉旭生, 林勵, 黃兆勝, 林煌權(quán), 鐘丹, 趙代鑫, 趙玲, 包崑, 王立新, 劉明平 申請人:廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院