專利名稱：一種抑制血管生成作用的中藥土槿皮有效部位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通過獨(dú)特的制備方法，獲得具有抑制血管生成作用的高純度的土槿皮總萜背景技術(shù)土槿皮(Cortex Pseudolaricis)為松科植物金錢松Pseudolarix amabilis(Nelson)Rehd.的根皮或近根樹皮。最早見于清代趙學(xué)敏所著《本草綱目拾遺》，性辛、溫、有毒。歸肺、脾經(jīng)；功能殺蟲止癢。用于疥癬瘙癢?，F(xiàn)代化學(xué)研究證明土槿皮藥材中含有二萜類、三萜類、三萜內(nèi)酯及甾醇類等成分，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，其具有抗真菌、抗腫瘤、抗生育等作用。1960年有人從土槿皮中分離出的土槿酸，而土槿酸并非單體，經(jīng)進(jìn)一步分離的土槿皮甲酸、土槿皮乙酸、土槿皮丙酸、土槿甲酸苷、土槿乙酸苷[1]；80年代中期又有人分到兩個新二萜成分土槿丁酸、土槿戊酸[2]、，以及兩個三萜成分金錢松呋喃酸、白樺脂酸[3]，同時發(fā)現(xiàn)土槿皮水提取物具有抗腫瘤作用[1]。我們對此進(jìn)行了機(jī)理研究，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)土槿皮提取物具有抑制血管生成作用，通過抑制血管生成達(dá)到抗腫瘤效果。
1971年Folkman提出了腫瘤生長依賴于血管新生的假說。其后，他又證實(shí)腫瘤初期生長不伴有新血管生成(neovascularization)，該期稱為無血管期(avascular phase)，但到腫瘤生長至1～2mm后，若其大小體積要繼續(xù)增長就必須靠新血管生成來維持。這些成果清楚地說明無論是在癌前期還是癌變轉(zhuǎn)化期都必須發(fā)生從非血管新生性到血管新生性的表型轉(zhuǎn)換，腫瘤才能得以生長。
以血管生成各個環(huán)節(jié)為靶點(diǎn)，抑制血管生成是治療血管生成性疾病(傷口愈合中的瘢痕形成、糖尿病視網(wǎng)膜病變、風(fēng)濕性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、血管瘤、動脈粥樣硬化等)的新途徑。由于它針對新生血管，具有特異性，而異常增殖的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞暴露于血流中，藥物直接作用，因而藥物劑量較小，療效較高，毒副作用少；同時由于血管內(nèi)皮細(xì)胞基因穩(wěn)定，還具有無變異，不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。
對于血管生成性疾病，例如，腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)是具有血管生成依賴性的，使用血管生成抑制劑，可以有效地抑制腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，這已成為腫瘤防治的新途徑。
為了得到有效抑制血管生成作用的高純度的土槿皮總萜我們進(jìn)行了提取純化工藝研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的在于，研制的土槿皮總萜的制備方法，是以土槿皮為原料，取土槿皮飲片，加水提取，提取液濃縮成浸膏，加入乙醇使含醇量達(dá)40％～90％，靜置，用過濾或離心方法除去沉淀，藥液濃縮成浸膏狀，干燥，得土槿皮總萜粗品；或取土槿皮飲片，用乙醇提取，得土槿皮乙醇浸膏，將浸膏用熱水溶解，過濾或離心去除雜質(zhì)，濃縮至浸膏狀，干燥，得土槿皮總萜粗品；將土槿皮總萜粗品加水溶解，用低極性溶劑萃取，萃取液適當(dāng)回收溶劑，加入稀堿液萃?。辉賹⑾A液加入無機(jī)酸或有機(jī)酸調(diào)PH值為3～7，析出沉淀，離心，得沉淀物，即為以土槿皮總萜為主的有效部位，減壓真空干燥，用常規(guī)方法制成固體劑型或液體劑型。
本發(fā)明所述的土槿皮總萜的制備方法，該方法按下列步驟進(jìn)行步驟一取土槿皮飲片，加水提取1～3次，每次加6～12倍水，提取1～3小時，提取液濃縮成浸膏，加入乙醇使含醇量達(dá)40％～90％，靜置，用過濾或離心方法除去沉淀，藥液濃縮成浸膏狀，干燥，得土槿皮總萜粗品；或者，將土槿皮飲片直接用40％～90％乙醇加熱回流提取1～3次，每次加4～10倍乙醇，提取0.5～3小時，提取液回收乙醇至無醇味，濃縮成浸膏，加熱水溶解，過濾或離心除去不溶物，濃縮至浸膏狀，干燥，得土槿皮總萜粗品；步驟二將土槿皮總萜粗品加水溶解，用鹵代烴或乙酸乙酯、正丁醇萃取1～6次，萃取液適當(dāng)回收溶劑，得低極性溶劑部位；步驟三將低極性溶劑部位加稀堿液萃取1～4次，合并稀堿液，攪拌加入無機(jī)酸或有機(jī)酸調(diào)PH值為3～7，使析出沉淀，離心，得沉淀物，即為以土槿皮總萜為主的有效部位；步驟四將以土槿皮總萜為主的有效部位減壓真空干燥，用常規(guī)方法制成固體劑型或液體劑型本發(fā)明所訴的制備方法制得的土槿皮總萜進(jìn)行藥效學(xué)試驗(yàn)如下一、土槿皮總萜對雞胚絨毛尿囊膜血管生成抑制試驗(yàn)取土槿皮總萜配置的五個樣品(每毫升含原生藥材量7mg/ml、3.5mg/ml、1.75mg/ml、0.875mg/ml、0.4375mg/ml)，每個樣品取藥液200μl，浸入預(yù)先制備消毒好的0.2×0.2×0.2cm左右的明膠海綿，無菌置于雞胚絨毛尿囊膜，每一樣品接種5枚雞胚，共設(shè)陰性對照5枚；接種后的雞胚用高壓消毒的半透明封口膜封口，放回到37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，每12小時觀察一次。雞胚孵化至第12天，打開封口膜，觀察絨毛尿囊膜新生血管生成情況。結(jié)果顯示土槿皮總萜各濃度均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制新生血管生成的作用，其中0.875和0.4375mg/ml的無血管區(qū)為最顯著。
二、土槿皮總萜對小鼠移植性宮頸癌U14模型新生血管形成的抑制作用昆明種雌性小鼠300只按體重分層隨機(jī)分為10組，即空白組、模型組、陽性藥物3組、土槿皮總萜高、中、低劑量組、土槿皮總萜預(yù)防口服組、土槿皮總萜預(yù)防注射組，每組30只。
U14腫瘤株按常規(guī)條件復(fù)蘇傳代，并制備成1×107細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液后，小鼠右腋下消毒后0.1ml/10g皮下接種造模。
土槿皮總萜高、中、低劑量組分別按8g、4g和2g原生藥/(kg·d)口服給藥；預(yù)防組給藥均為4g原生藥/(kg·d)；陽性藥物組按0.02 g/(kg·d)注射給藥；每天一次給藥。預(yù)防組實(shí)驗(yàn)前3天開始給藥，其余各組造模后第2天開始給藥。
試驗(yàn)結(jié)果顯示模型組動物腫瘤組織中VEGF(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子)高度表達(dá)，給藥14天和21天時，各組VEGF均較模型組表達(dá)顯著降低，與模型組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001)，提示土槿皮總萜對腫瘤組織中VEGF的表達(dá)均具有較好的抑制作用；各給藥組之間相比雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；口服治療組的抑制作用略強(qiáng)于預(yù)防組；給藥14d與28d對VEGF的抑制作用有隨著給藥時間增加有增強(qiáng)的趨勢。提示土槿皮總萜對新生血管的形成有確切的抑制作用。
三、土槿皮總萜對小鼠移植性宮頸癌U14的抑制作用昆明種雌性小鼠240只按體重隨機(jī)分為8組，即空白組、模型組、陽性藥物組、土槿皮總萜高、中、低劑量組、土槿皮總萜預(yù)防口服組、土槿皮總萜預(yù)防注射組，每組30只；取液氮冷凍保存U14腫瘤株，水浴快速復(fù)蘇后用無菌生理鹽水制成細(xì)胞懸液，小鼠右腋下消毒后，取細(xì)胞懸液，按照0.2ml/只皮下接種造模。預(yù)防組造模前3天給藥，其余各組瘤株接種后第2天開始給藥，除預(yù)防注射組腹腔注射給藥外，其余各組均為口服給藥；第14天給藥后3h隨機(jī)選取10只處死，分離瘤重，稱重，計(jì)算抑瘤率。同時無菌摘取肺臟、肝臟，中性福爾馬林固定，常規(guī)制片后計(jì)算轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。21天后再隨機(jī)選取10只處死，同法計(jì)算抑瘤率和轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。
試驗(yàn)結(jié)果顯示
1、腫瘤接種第14天，各組腫瘤瘤重與模型組相比均顯著降低，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，土槿皮總萜高、中、低劑量組對U14瘤重均有顯著的抑制作用，給藥途徑和預(yù)防或治療抑制作用相當(dāng)，抑瘤率在65.28％～78.37％之間。腫瘤接種第21天，各組腫瘤瘤重與模型組相比均顯著降低，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.001)，土槿皮總萜高、中、低劑量組對U14瘤重均有顯著的抑制作用，給藥途徑和預(yù)防或治療抑制作用相當(dāng)，抑瘤率在48.77％～74.93％之間。提示土槿皮總萜對U14腫瘤早期作用優(yōu)于晚期。
2、給藥第14天和21天，其中模型組肺、肝組織轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較多，與各給藥組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.001)，各給藥組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但隨著腫瘤接種后時間的延長，轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)增多，提示土槿皮總萜在腫瘤的較早階段使用對U14腫瘤肝、肺轉(zhuǎn)移抑制作用較強(qiáng)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一土槿皮總萜的制備方法，其工藝步驟為1.水提取(煎煮法)稱取土槿皮飲片5公斤，加10倍量水，浸泡0.5小時，加熱煎煮2.5小時，濾過，藥渣再加水煎煮2次，每次加8倍水，煎煮1.5小時，合并藥液，濾過，濾液濃縮成流浸膏(每g浸膏相當(dāng)于1g原生藥材)。
2.乙醇沉淀在流浸膏中加入乙醇使含醇量達(dá)70％，靜置過夜，過濾或離心，去除沉淀，回收乙醇，濃縮成浸膏狀，減壓真空干燥，得土槿皮總萜粗品。
3.氯仿萃取將土槿皮總萜粗品加純化水溶解，使每ml相當(dāng)原生藥材6g，加氯仿萃取3～5次，萃取液適當(dāng)回收溶劑，得氯仿部位(每ml相當(dāng)原生藥材6g)。
4.稀堿液萃取氯仿部位加入PH值為10～11的氨水溶液萃取2～3次，合并氨水溶液，5.提取液酸化在氨水溶液中攪拌加入稀鹽酸調(diào)PH值為3～5，靜置約10小時，使析出物充分沉降，離心或抽濾，得沉淀物。
6.將沉淀物采用減壓真空干燥，制得以土槿皮總萜為主的有效部位，含土槿皮總萜為68.7％。
實(shí)施例二土槿皮總萜的制備方法，其工藝步驟為1.乙醇提取(回流提取法)稱取土槿皮飲片5公斤，加8倍量50％乙醇，加熱回流提取2小時，濾過，藥渣再50％乙醇，加熱回流提取2次，每次加8倍乙醇，回流提取1小時，合并藥液，濾過，回收乙醇至無醇味，濃縮成浸膏，加2倍生藥材量的熱水溶解，離心或抽濾除去不溶物，保留上清液，濃縮成浸膏狀，干燥，得土槿皮總萜粗品。
2.乙酸乙酯萃取將土槿皮總萜粗品加純化水溶解，使每ml相當(dāng)原生藥材6g，加乙酸乙酯萃取3～5次，萃取液適當(dāng)回收溶劑，得乙酸乙酯部位(每ml相當(dāng)原生藥材6g)。
3.稀堿液萃取乙酸乙酯部位加入1％NaOH溶液萃取2～3次，合并1％NaOH溶液。
4.提取液酸化在1％NaOH溶液中攪拌加入稀鹽酸調(diào)PH值為3～5，靜置約10小時，使析出物充分沉降，離心或抽濾，得沉淀物。
5.將沉淀物采用減壓真空干燥，制得以土槿皮總萜為主的有效部位，含土槿皮總萜為73.2％)。
實(shí)施例三與實(shí)施例二基本相同，所不同的是，乙醇提取過程為滲漉法；具體方法如下稱取土槿皮飲片5公斤，粉碎成粗粉，加適量70％乙醇潤濕，裝于滲漉筒中，邊裝邊適當(dāng)壓實(shí)，滲漉筒上端留出約1/5體積。加70％乙醇至所有藥材浸沒，靜置浸泡過夜，打開滲漉筒下端閥門，使?jié)B漉液緩緩流出，控制流速為3～5ml/min·kg生藥，同時不斷從滲漉筒上端加入70％乙醇，收集滲漉液，至滲漉液基本無色時停止?jié)B漉。
制得以土槿皮總萜為主的有效部位，含土槿皮總萜為66.5％。。
從上述實(shí)施例可以看出，選擇的參數(shù)不同所得的總萜含量都在60％以上。
參考文獻(xiàn)1、宋永鋒等，土槿皮的研究進(jìn)展，天津藥學(xué)，2001年第13卷第6期；2、李珠蓮等，土槿皮新二萜成分研究，化學(xué)學(xué)報ACTA CHIMICA SINICA1989，47，258-2613、李珠蓮等，土槿皮三萜成分研究，化學(xué)學(xué)報ACTA CHIMICA SINICA1990，48，591-59權(quán)利要求
1.一種土槿皮總萜，可以用下述方法得到1)取土槿皮的水提取物浸膏，加入乙醇使含醇量達(dá)40％～90％，靜置，用過濾或離心方法除去沉淀，藥液濃縮成浸膏狀，干燥，得土槿皮總萜粗品；2)或者，取土槿皮的乙醇提取物浸膏，用熱水溶解，采用過濾或離心方法除去溶液中的固體雜質(zhì)，濃縮至浸膏狀，干燥，得土槿皮總萜粗品；將得到的土槿皮總萜粗品，經(jīng)下述方法處理將1)或2)中得到的土槿皮總萜粗品，用水溶解，再用低極性溶劑萃取1～6次，萃取液適當(dāng)回收溶劑，加入PH值為9～12的稀堿液提取1～3次，合并稀堿液，無機(jī)酸或有機(jī)酸調(diào)PH值為3～7，靜置，析出沉淀，離心，取沉淀干燥，得土槿皮總萜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述土槿皮總萜，其特征在于提取物浸膏的提取方法可以是煎煮法、滲漉法或熱回流提取法；提取的具體方法為，加溶劑提取1～3次，每次加4～10倍溶劑提取0.5～3小時；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述土槿皮總萜，其特征在于低極性溶劑可以是鹵代烴、乙酸乙酯、正丁醇其中一種；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述土槿皮總萜，其特征在于干燥方法可以是烘干法、減壓真空干燥法、冷凍干燥法其中一種；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述土槿皮總萜，其特征在于堿液可以是氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水等其中一種；
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述土槿皮總萜，其特征在于無機(jī)酸或有機(jī)酸是鹽酸、硫酸、甲酸、乙酸等其中一種；
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述土槿皮總萜用于抑制血管生成作用。
全文摘要
一種抑制血管生成作用的中藥土槿皮總萜，將土槿皮水或醇提取物用低極性溶劑萃取1～6次，萃取液適當(dāng)回收溶劑，加入pH值為9～12的稀堿液提取1～3次，合并稀堿液，無機(jī)酸或有機(jī)酸調(diào)pH值為3～7，靜置，析出沉淀，離心，取沉淀干燥，即為以土槿皮總萜為主的有效部位。其總萜含量＞60％，總萜轉(zhuǎn)移率70－85％。將該方法研制的土槿皮總萜制成固體劑型或液體劑型，用于治療由于新生血管生成引起的疾病。
文檔編號A61K125/00GK1961896SQ20061002234
公開日2007年5月16日 申請日期2006年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月28日
發(fā)明者趙因, 楊松柏 申請人:趙因, 楊松柏