專利名稱：一種苦參堿磁性微球的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有治療肝癌藥物的磁性微球的制備方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)幾千年來形成了自己獨(dú)特的較為系統(tǒng)的腫瘤病因、病機(jī)理論，并積累了中草藥抗癌、治癌的豐富經(jīng)驗(yàn)，中草藥在人類與腫瘤的斗爭(zhēng)中發(fā)揮著巨大的作用?？鄥A(matrine)是從豆科槐屬植物苦豆子苦參根中分離得到的生物堿，在眾多的苦參類生物堿中以苦參堿的抗腫瘤活性最強(qiáng)。研究表明，苦參堿能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)其凋亡、及向正常細(xì)胞分化，具有抗腫瘤的活性，對(duì)實(shí)驗(yàn)性腫瘤有抑制作用。
苦參堿的主要藥理作用如下1)、保肝、護(hù)肝作用苦參堿可減少肝細(xì)胞損傷，并促進(jìn)其再生，改善肝臟微循環(huán)，以利膽紅素的攝取、結(jié)合與排泄，從而達(dá)到抗炎、保肝擴(kuò)肝以及退黃降酶的功效，最終使肝病理組織學(xué)得到明顯改善；2)、抗病毒苦參堿對(duì)HBV-DNA的復(fù)制有明顯的抑制作用，使肝炎患HBeAg轉(zhuǎn)陰率達(dá)51％，抗HBc--lgM轉(zhuǎn)陰率達(dá)50％；3)、抗腫纖維化主要通過保護(hù)肝細(xì)胞膜，抑制纖維化因子的釋放，調(diào)控貯脂細(xì)胞(HSC)的功能等多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮抗肝纖維化的作用；4)、雙向調(diào)控免疫，有效改善病理性組織；5)、抗腫瘤作用主要通過抑制細(xì)胞膜上Na，k-ATP酶并激活腺苷酸環(huán)化酶，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用；同時(shí)，苦參堿還可抑制腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，從而減少腫瘤的轉(zhuǎn)移等；6)、毒理試驗(yàn)證實(shí)苦參堿對(duì)動(dòng)物呼吸系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)無明顯影響，急性毒性LD50為64.4mg/kg。長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)有毒理意義的病理損傷，致突變?cè)囼?yàn)均為陰性，表明本品沒有明顯毒性。
臨床應(yīng)用主要用來治療癌癥，病毒性肝炎，白細(xì)胞減少癥等。
磁性靶向制劑是將藥物與微粒鐵磁性物質(zhì)共同包裹于高分子聚合物載體中，采用體外磁場(chǎng)引導(dǎo)藥物在體內(nèi)定向移動(dòng)和定位集中到靶部位的給藥系統(tǒng)。主要用作抗癌藥物的載體。它是近年來國(guó)內(nèi)外大力研究的一種新型的靶向制劑，主要有磁性微球、磁性微囊、磁性乳劑、磁性納米粒、磁性脂質(zhì)體、磁性脂質(zhì)微球、磁性片劑或膠囊劑等。
磁流體是借助于表面活性劑將強(qiáng)磁性超微粒子分散到液相中所得到的非常穩(wěn)定且?guī)в写判缘哪z態(tài)溶液，它將固體的強(qiáng)磁性和液體的流變性巧妙地結(jié)合起來。目前較為成熟的磁流體制備方法包括化學(xué)共沉淀法、機(jī)械研磨法、熱分解法、火花電蝕法、還原法、電沉淀法、真空蒸鍍法等。化學(xué)共沉淀法因具有操作簡(jiǎn)便、成本低、對(duì)設(shè)備要求不高等優(yōu)點(diǎn)，是目前制備磁流體最常使用的方法。
60年代初國(guó)外首次提出將抗癌藥物與磁性物質(zhì)共包于或分散于載體(骨架)材料中，通過加熱固化或交聯(lián)固化形成磁性載藥微球。磁性微球在足夠的外加磁場(chǎng)作用下，可以引導(dǎo)負(fù)載藥物在體內(nèi)定向移動(dòng)、定位、濃集。而微球作為靶向給藥的載體，采用生物可降解的高分子物如白蛋白、聚乳酸、殼聚糖、聚乳酸聚乙醇酸共聚物等，將藥物包裹或嵌入，制備出載藥的微球或微囊。根據(jù)微粒的直徑大小不同，可以被肺、肝、腎、脾等截留，從而實(shí)現(xiàn)生物物理靶向作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種苦參堿磁性微球的制備方法，該方法可以獲得磁定位與藥物緩釋功能的苦參堿磁性微球。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種苦參堿磁性微球的制備方法，其特征在于它包括如下步驟1)、磁流體的制備將FeCl3、FeCl2按摩爾比1-3∶1混合，加入FeCl3和FeCl2總質(zhì)量30-100倍的蒸餾水，在40-80℃攪拌下加入NaOH溶液或氨水至溶液體系pH≥8，保溫反應(yīng)0.5-2h后加入FeCl3和FeCl2總質(zhì)量1-2倍的油酸，反應(yīng)1-3h后，加入HCl或HAC溶液至pH為7，反應(yīng)0.5-2h后用蒸餾水洗滌即得磁流體；2)、苦參堿磁性微球的制備采用離子凝聚法制備苦參堿磁性微球，用質(zhì)量濃度為0.5％-5％的醋酸溶液配制1-10mg/mL的殼聚糖溶液，用蒸餾水配制0.5-10mg/mL的多聚磷酸鹽，取殼聚糖溶液，分別加入殼聚糖溶液體積0.02-0.15倍的磁流體和殼聚糖質(zhì)量0.2-2倍的苦參堿，在高速攪拌下(500-1500r/min)，將殼聚糖溶液體積0.2-1倍的多聚磷酸鹽注入到殼聚糖溶液，攪拌5-30min，離心分離微球，干燥即得粒徑小(500-1500nm)、分布均勻的苦參堿磁性微球。
所述的NaOH溶液的濃度為0.5-3mol/L，氨水的濃度為1％-25％。
本發(fā)明采用殼聚糖作為靶向給藥的載體，殼聚糖為陽離子聚合物，可與帶負(fù)電荷的聚合物(多聚磷酸鹽)相互作用形成聚電解質(zhì)復(fù)合物，將藥物包埋于復(fù)合膜內(nèi)，制備成緩釋微球，此過程簡(jiǎn)單。本發(fā)明采用離子凝聚法，采用靜電引發(fā)物理交聯(lián)避免在化學(xué)交聯(lián)過程中引入有毒的試劑和不必要的影響。多聚磷酸鹽(TPP)是多聚陰離子，能于陽離子的殼聚糖在靜電作用下發(fā)生發(fā)應(yīng)，在離子凝聚方法中，將多聚磷酸鹽溶液逐滴滴入不斷攪拌中的殼聚糖醋酸溶液，具有相反電荷的殼聚糖和多聚磷酸鹽發(fā)生反應(yīng)，殼聚糖即凝聚從溶液中沉淀出來形成微球。
苦參堿磁性微球兼具磁定位與藥物緩釋功能，其磁靶向定位作用確定了藥物主要在病灶部位聚集，在體內(nèi)循環(huán)時(shí)可使藥物微球到達(dá)靶部位，實(shí)現(xiàn)靶向作用，減少了藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用；并具有明顯的緩釋功能，可延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間；苦參堿磁性微球也本身具有良好的生物體內(nèi)相容性，對(duì)于細(xì)胞的毒性很小，細(xì)胞的生長(zhǎng)受磁性微球的影響不大。
本發(fā)明的有益效果是制備方法簡(jiǎn)單，通過納米技術(shù)制備納米磁流體(四氧化三鐵納米粒子)作為磁核，用殼聚糖包載苦參堿和磁流體制備成微球，從而制備出苦參堿靶向藥物新劑型，具有較好的靶向(磁定位)及緩控釋作用，能很好的發(fā)揮苦參堿的抗腫瘤作用，提高其抗腫瘤活性，同時(shí)最大限度的降低其毒副作用，使其成為真正的極具前途的抗腫瘤靶向給藥系統(tǒng)新劑型。苦參堿磁性微球具有磁響應(yīng)性強(qiáng)(原子吸收結(jié)果)、粒徑小(500-1500nm)的特點(diǎn)。
本發(fā)明采用靜脈滴注的形式，劑量與用法用量為每次以100mg(以苦參堿含量計(jì))加入10％葡萄糖注射液500ml中滴注，一日1次，療程為2周。滴注速度以每分鐘約60滴為宜。
本發(fā)明制備的苦參堿磁性微球用于治療肝癌。


圖1是離子凝聚法示意2是苦參堿磁性微球的釋放曲線3是磁流體的粒徑4是實(shí)施例1的苦參堿磁性微球的粒徑5是磁流體顯微鏡照片圖6是苦參堿磁性微球顯微鏡照片圖7是磁流體的X-射線衍射圖譜圖8是實(shí)施例2的苦參堿磁性微球的粒徑9是實(shí)施例3的苦參堿磁性微球的粒徑中1-多聚磷酸鹽溶液，2-攪拌器，3-殼聚糖溶液(含磁流體)，4-苦參堿磁性微球。
具體實(shí)施例方式
為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。
實(shí)施例1一種苦參堿磁性微球的制備方法，它包括如下步驟1、磁流體的制備用化學(xué)共沉淀法制備磁流體。稱取2.703g FeCl3·6H2O與0.994g FeCl2·4H2O按照1∶2mol充分溶解在200mL二次蒸餾水里，超聲脫氣10min后，在攪拌和保溫40℃的條件下，滴加2mol/L的NaOH溶液。當(dāng)溶液pH值升高到6-7時(shí)，鐵鹽水解產(chǎn)生大量的黑色Fe3O4粒子，繼續(xù)滴加NaOH至pH約11，在40℃下陳化30min，用注射器在5min內(nèi)滴入5mL油酸，再繼續(xù)2h后，用質(zhì)量濃度為5％乙酸中和至pH＝7，用蒸餾水反復(fù)洗滌，并以1000r/min的速度離心10min除去較大顆粒，即得到穩(wěn)定的磁流體。
2、苦參堿磁性微球的制備如圖1所示，離子凝聚法。用質(zhì)量濃度為1.5％的醋酸溶液配制4mg/mL的殼聚糖溶液，用蒸餾水配制1mg/mL的多聚磷酸鈉，取10mL的殼聚糖溶液，分別加入0.5mL磁流體和40mg苦參堿，在高速攪拌下(1000r/min)，將5mL的多聚磷酸鹽注入到殼聚糖溶液，攪拌10min，離心分離微球(將制備的磁性微球分離出來)，-80℃冷凍干燥即得粒徑小(平均粒徑為682.4nm)、分布均勻的苦參堿磁性微球。
苦參堿磁性微球的釋放曲線參照中國(guó)藥典2005年版附錄XI X D體外藥物釋放度試驗(yàn)項(xiàng)下測(cè)定，取苦參堿磁性微球0.1g，置藥物溶出度儀(RCZ-6C型，上海)中，分別于0.5、1、2、4、6、8、18小時(shí)取5mL溶液，并及時(shí)補(bǔ)充溶劑；用紫外分光光度計(jì)(760CRT，上海)在波長(zhǎng)215nm處測(cè)定苦參堿含量，結(jié)果見表1；并根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制釋放曲線，見圖2；結(jié)果顯示，苦參堿磁性微球呈緩慢釋放。
表1


磁流體和苦參堿磁性微球粒徑分布將磁流體和苦參堿磁性微球稀釋到50倍，用Zetasizer3000HSA激光粒度測(cè)試儀(英國(guó)Malvern)測(cè)試其粒徑分布，如圖3、圖4所示，磁流體的平均粒徑為152.2nm，分布均勻，苦參堿磁性微球的平均粒徑為682.4nm，分布均勻。
磁流體和苦參堿磁性微球的表面形貌用E200型Nikon ECLIPSE生物顯微鏡分別觀察磁流體和苦參堿磁性微球的表面形貌。圖5為磁流體的顯微鏡照片，如圖5所示，磁流體分布均勻，未發(fā)生團(tuán)聚；圖6為苦參堿磁性微球顯微鏡照片，如圖6所示，苦參堿磁性殼聚糖呈球形，形狀規(guī)整，分布均勻，未產(chǎn)生團(tuán)聚和絮凝。
磁流體X-射線衍射試驗(yàn)取100mL磁流體，冷凍干燥后，取粉末進(jìn)行X-射線衍射試驗(yàn)，測(cè)試條件為島津XRD-6000型X-射線衍射儀；掃描方式定性，步進(jìn)掃描；電壓/電流40kV/30mA；掃描速度4.0000deg/min；步長(zhǎng)0.02°(2θ)；預(yù)置時(shí)間0.3s；靶Cu靶；掃描范圍(2θ)10-60°。結(jié)果如圖7所示，其特征峰與Fe3O4標(biāo)注卡特征峰吻合。
苦參堿磁性微球中鐵含量的定量測(cè)定采用WFX-110原子吸收分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)測(cè)定苦參堿磁性微球中鐵的含量。分析條件用空氣乙炔加熱方式對(duì)待測(cè)元素進(jìn)行原子化。儀器工作參數(shù)波長(zhǎng)248.3nm；光譜通帶寬0.2nm；燈電流12mA；空氣流量10L/min；乙炔流量3L/min。
從表2可以看出磁性微球中的含量為26.38％。
表2苦參堿磁性微球的原子吸收檢測(cè)結(jié)果

苦參堿磁性微球增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，體重20～25g，雌雄兼有。由湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。符合三級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
1.2藥物苦參堿磁性微球(MCSM)，自制；環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)，上海華聯(lián)制藥有限公司。
1.3動(dòng)物移殖性腫瘤小鼠S180，武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
2方法與結(jié)果取生長(zhǎng)好的昆明種小鼠S180肉瘤腹水，用生理鹽水稀釋，調(diào)整濃度為1×107/ml，經(jīng)胎盼藍(lán)染色，證實(shí)獲細(xì)胞率95％，每只小鼠腋皮下注射0.2ml，隨機(jī)分組，設(shè)生理鹽水(NS)對(duì)照組、環(huán)磷酰胺(CTX)陽性對(duì)照、苦參堿磁性微球(MCSM)設(shè)高、中、低三個(gè)劑量組，分別為100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg，次日起腹腔注射給藥，隔日1次，連續(xù)16天，解剖取瘤體、胸腺、脾臟，稱重，計(jì)算抑瘤率，根據(jù)以下公式判定結(jié)果腫瘤抑制率(％)＝(對(duì)照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重×100％試驗(yàn)結(jié)果表明，苦參堿磁性微球中劑量組對(duì)小鼠S180的抑瘤作用有明顯的增效，抑瘤率達(dá)56.12％，結(jié)果見表3表3苦參堿磁性微球?qū)π∈骃180的作用(X±S)

結(jié)果表明，苦參堿磁性微球高劑量有明顯的增強(qiáng)抗瘤效應(yīng)，與同劑量的CTX相比(p＜0.05)，中劑量與CTX相比(p＞0.05)，低劑量增強(qiáng)抗瘤效應(yīng)不明顯，與生理鹽水相比仍有抗瘤效應(yīng)(p＜0.05)；同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，瘤重與胸腺、脾重負(fù)相關(guān)，瘤重越小，胸腺、脾重越大，反之，瘤重越大，胸腺、脾重越小。
實(shí)施例2一種苦參堿磁性微球的制備方法，它包括如下步驟1)、磁流體的制備將FeCl3、FeCl2按摩爾比1∶1混合，加入FeCl3和FeCl2總質(zhì)量30倍的蒸餾水，在40℃攪拌下加入濃度為0.5mol/L NaOH溶液至溶液體系pH＝8，保溫反應(yīng)0.5h后加入FeCl3和FeCl2總質(zhì)量1倍的油酸，反應(yīng)1h后，加入HCl溶液至pH為7，反應(yīng)0.5h后用蒸餾水洗滌即得磁流體；2)、苦參堿磁性微球的制備采用離子凝聚法制備苦參堿磁性微球，用質(zhì)量濃度為0.5％的醋酸溶液配制1mg/mL的殼聚糖溶液，用蒸餾水配制0.5mg/mL的多聚磷酸鹽，取殼聚糖溶液，分別加入殼聚糖溶液體積0.02倍的磁流體和殼聚糖質(zhì)量0.2倍的苦參堿，在高速攪拌下(500r/min)，將殼聚糖溶液體積0.2倍的多聚磷酸鹽注入到殼聚糖溶液，攪拌5min，離心分離微球，干燥即得粒徑小(平均粒徑為685.2，如圖8所示)、分布均勻的苦參堿磁性微球。
實(shí)施例3一種苦參堿磁性微球的制備方法，它包括如下步驟1)、磁流體的制備將FeCl3、FeCl2按摩爾比3∶1混合，加入FeCl3和FeCl2總質(zhì)量100倍的蒸餾水，在80℃攪拌下加入濃氨水至溶液體系pH＝14，保溫反應(yīng)2h后加入FeCl3和FeCl2總質(zhì)量2倍的油酸，反應(yīng)3h后，加入HAC溶液至pH為7，反應(yīng)2h后用蒸餾水洗滌即得磁流體；2)、苦參堿磁性微球的制備采用離子凝聚法制備苦參堿磁性微球，用質(zhì)量濃度為5％的醋酸溶液配制10mg/mL的殼聚糖溶液，用蒸餾水配制10mg/mL的多聚磷酸鹽，取殼聚糖溶液，分別加入殼聚糖溶液體積0.15倍的磁流體和殼聚糖質(zhì)量2倍的苦參堿，在高速攪拌下(1500r/min)，將殼聚糖溶液體積1倍的多聚磷酸鹽注入到殼聚糖溶液，攪拌30min，離心分離微球，干燥即得粒徑小(平均粒徑為1282.9nm，如圖9所示)、分布均勻的苦參堿磁性微球。
權(quán)利要求
1.一種苦參堿磁性微球的制備方法，其特征在于它包括如下步驟1)、磁流體的制備將FeCl3、FeCl2按摩爾比1-3∶1混合，加入FeCl3和FeCl2總質(zhì)量30-100倍的蒸餾水，在40-80℃攪拌下加入NaOH溶液或氨水至溶液體系pH≥8，保溫反應(yīng)0.5-2h后加入FeCl3和FeCl2總質(zhì)量1-2倍的油酸，反應(yīng)1-3h后，加入HCl或HAC溶液至pH為7，反應(yīng)0.5-2h后用蒸餾水洗滌即得磁流體；2)、苦參堿磁性微球的制備采用離子凝聚法制備苦參堿磁性微球，用質(zhì)量濃度為0.5％-5％的醋酸溶液配制1-10mg/mL的殼聚糖溶液，用蒸餾水配制0.5-10mg/mL的多聚磷酸鹽，取殼聚糖溶液，分別加入殼聚糖溶液體積0.02-0.15倍的磁流體和殼聚糖質(zhì)量0.2-2倍的苦參堿，在高速攪拌下，將殼聚糖溶液體積0.2-1倍的多聚磷酸鹽注入到殼聚糖溶液，攪拌5-30min，離心分離微球，干燥即得粒徑為500-1500nm、分布均勻的苦參堿磁性微球。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有治療肝癌藥物的磁性微球的制備方法。一種苦參堿磁性微球的制備方法，其特征在于它包括如下步驟1)、磁流體的制備將FeCl
文檔編號(hào)A61K47/24GK1868457SQ200610019300
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2006年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日
發(fā)明者劉小平, 王瑩, 耿丹清, 陳芬芬 申請(qǐng)人:武漢理工大學(xué)