專利名稱：沙眼衣原體e型dna疫苗及制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及一種沙眼衣原體E型DNA疫苗及其制備方法與用途。
背景技術(shù)：
沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，C.t)曾引起世界范圍沙眼的廣泛流行，造成嚴(yán)重危害，迄今仍是一些發(fā)展中國(guó)家致盲的首要原因。80年代中期，又成為性傳播感染的主要病原菌，發(fā)病率居性傳播感染的首位。近年來(lái)由沙眼衣原體引起的性傳播感染的發(fā)病率正迅速上升。更為嚴(yán)重的是C.t感染常常癥狀輕微甚至沒(méi)有癥狀，不能引起人們的足夠注意，不能及時(shí)地被診斷和治療，持續(xù)存在數(shù)月甚至數(shù)年，最終引起盆腔炎、不孕癥、異位妊娠、附睪炎等一系列比較嚴(yán)重的并發(fā)癥和后遺癥，還可以造成垂直傳播，引起新生兒圍產(chǎn)期感染。此外耐藥C.t株的報(bào)道不斷出現(xiàn)，相當(dāng)一部分C.t感染對(duì)治療不敏感，治療后容易復(fù)發(fā)，同時(shí)還存在著相當(dāng)高的C.t再感染率，因此預(yù)防C.t感染尤為重要，控制C.t傳播和流行的根本措施就在于預(yù)防。人們一直在孜孜不倦的尋求一種有效的疫苗希望能夠從根本上預(yù)防和控制C.t的感染。
C.t疫苗分為蛋白或多肽疫苗和核酸疫苗兩類。前一種疫苗曾為全菌疫苗、亞單位疫苗和合成的多肽疫苗，由于這類疫苗所激發(fā)的機(jī)體特異性免疫反應(yīng)較弱而短暫，因而不足以預(yù)防C.t的再感染；近年來(lái)新興的核酸疫苗所表現(xiàn)出來(lái)的其他類疫苗不可比擬的優(yōu)越性為C.t的預(yù)防開(kāi)拓了一個(gè)最有希望的領(lǐng)域。
C.t種共有三個(gè)生物變種，分別是沙眼生物變種、LGV生物變種和鼠生物變種。沙眼生物變種中的A～C型引起沙眼，D～K型引起泌尿生殖道感染；性病性淋巴肉芽腫生物變種的L1～L3型導(dǎo)致性病性淋巴肉芽腫；鼠生物變種中的鼠肺炎株主要引起鼠的感染，不侵襲人類。
C.t DNA疫苗的研究已有十余年時(shí)間，絕大多數(shù)是選擇C.t種中的鼠肺炎株(MoPn)去感染小鼠呼吸道的動(dòng)物模型來(lái)研究DNA疫苗的免疫效果，而引起人類非淋菌性尿道炎的C.t型的DNA疫苗研究只見(jiàn)到一篇報(bào)道。該文章構(gòu)建了C.t D型DNA疫苗，免疫小鼠后通過(guò)血清抗體檢測(cè)、脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中γ-干擾素的水平來(lái)評(píng)價(jià)DNA疫苗的免疫效果，結(jié)果證實(shí)能刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫。但很多資料顯示，泌尿生殖道感染的C.t以E型最多，即E型是感染的優(yōu)勢(shì)型，由于C.t感染產(chǎn)生的保護(hù)作用是“型特異性”的，因此C.t D型的DNA疫苗對(duì)C.t E型感染的保護(hù)作用不強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的旨在為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，選擇C.t E型這個(gè)優(yōu)勢(shì)型作為研究對(duì)象，提供一種沙眼衣原體E型DNA疫苗及其制備方法與用途。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，所構(gòu)建的C.t E型DNA疫苗切實(shí)的免疫效果和保護(hù)作用，為C.t DNA疫苗的深入研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，具有重要的科研和臨床價(jià)值。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明公開(kāi)了一種沙眼衣原體E型DNA疫苗，其特征在于包括沙眼衣原體E型ompl基因和真核表達(dá)載體，ompl基因編碼產(chǎn)物是沙眼衣原體主要外膜蛋白，所說(shuō)的ompl基因核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，所說(shuō)的真核表達(dá)載體為pcDNA3.1(+)。
本發(fā)明還公開(kāi)了一種制備所述沙眼衣原體E型DNA疫苗的方法，其特征在于從沙眼衣原體E型BOUR株中提取染色體DNA，PCR擴(kuò)增出編碼主要外膜蛋白的ompl基因，克隆到pcDNA3.1(+)載體質(zhì)粒中構(gòu)建成沙眼衣原體DNA疫苗。其目的基因的5′端從BamHI位點(diǎn)插入，目的基因的3′端從NotI位點(diǎn)插入。
本發(fā)明所述沙眼衣原體E型DNA疫苗，用于制備預(yù)防和治療泌尿生殖道沙眼衣原體感染性疾病的疫苗。
本發(fā)明基于現(xiàn)有技術(shù)的研究基礎(chǔ)，選擇C.t E型這個(gè)優(yōu)勢(shì)型作為研究對(duì)象，構(gòu)建沙眼衣原體E型DNA疫苗，通過(guò)一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)該DNA疫苗能夠刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生有效的體液免疫和細(xì)胞免疫，對(duì)沙眼衣原體E型的生殖道感染具有保護(hù)作用。通過(guò)肌肉注射的方式免疫，能夠有效激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，具有免疫過(guò)程簡(jiǎn)單、接種安全、效果明顯、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

圖1C.t E型DNA疫苗結(jié)構(gòu)模式2C.t E型完整ompl基因的擴(kuò)增；圖3ompl基因的雙酶切；圖4pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的雙酶切；圖5ompl-pcDNA3.1(+)重組質(zhì)粒雙酶切電泳鑒定；圖6ompl-pcDNA3.1(+)重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增鑒定。
具體實(shí)施方式本發(fā)明從沙眼衣原體E型BOUR株染色體基因中克隆出編碼主要外膜蛋白的ompl基因，并將它定向克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中構(gòu)建出DNA疫苗插入的外源沙眼衣原體E型ompl基因結(jié)構(gòu)描述如下(1)序列特征長(zhǎng)度1182bp類型核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性(2)分子類型DNA(3)沙眼衣原體E型BOUR株(Trachoma type E strain BOUR)，購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC)，商品編號(hào)VR-348BTM。
(4)ompl基因的核苷酸序列描述如下atgaaaaaac tcttgaaatc ggtattagta tttgccgctt tgagttctgc ttcctccttg60caagctctgc ctgtggggaa tcctgctgaa ccaagcctta tgatcgacgg aattctgtgg120gaaggtttcg gcggagatcc ttgcgatcct tgcaccactt ggtgtgacgc tatcagcatg180cgtatgggtt actatggtga ctttgttttc gaccgtgttt tgaaaacaga tgtgaataaa240
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表1ompl基因PCR擴(kuò)增體系
③使用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和NotI切割擴(kuò)增的ompl基因和pcDNA3.1(+)載體質(zhì)粒，37℃保溫6h。結(jié)果顯示未酶切的和雙酶切的ompl基因電泳速度基本一致，提示ompl基因中間沒(méi)有BamHI和NotI的酶切位點(diǎn)，見(jiàn)圖2(1未酶切ompl基因；2雙酶切ompl基因；MDNA 200bp ladder)；雙酶切載體后在約5400bp處有清晰的DNA條帶，BamHI單酶切和雙酶切的質(zhì)粒電泳速度一致，提示酶切后質(zhì)粒的環(huán)狀結(jié)構(gòu)斷開(kāi)成線狀，片段與pcDNA3.1(+)載體的理論大小一致，見(jiàn)圖3(1未酶切pcDNA3.1(+)質(zhì)粒；2BamHI單酶切pcDNA3.1(+)質(zhì)粒；3雙酶切pcDNA3.1(+)質(zhì)粒；MDNA MarkerIV)。將ompl基因和pcDNA3.1(+)載體的雙酶切產(chǎn)物分別在1％瓊脂糖凝膠中電泳后切下目的片段，按照瓊脂糖凝膠DNA片段回收試劑盒說(shuō)明操作，回收雙酶切片段，分別溶于20μl蒸餾水中。將上述酶切后回收的ompl基因與pcDNA3.1(+)質(zhì)粒按大約4∶1的分子比率建立反應(yīng)體系，16℃反應(yīng)16～24h，在T4 DNA連接酶作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建成DNA疫苗。
④氯化鈣法將DNA疫苗轉(zhuǎn)化制備感受態(tài)E.coli DH5α，此步驟設(shè)立兩個(gè)對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照，取10μl(約40ng)pcDNA3.1(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli；陰性對(duì)照，不加質(zhì)粒，代以10μl蒸餾水轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli。結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照平板與連接轉(zhuǎn)化平板都有菌落生長(zhǎng)，而且前者較后者菌落密集，陰性對(duì)照平板無(wú)菌落生長(zhǎng)。
2.C.t E型DNA疫苗的鑒定①酶切鑒定堿裂解法小量提取轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α中的重組質(zhì)粒，BamHI和NotI限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，37℃保溫過(guò)夜，1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示雙酶切后ompl-pcDNA3.1(+)重組質(zhì)粒被切成1.2Kb和5.4Kb兩個(gè)片段，證明ompl基因插入到了pcDNA3.1(+)質(zhì)粒內(nèi)，見(jiàn)圖4(1-6重組質(zhì)粒的雙酶切；7pcDNA3.1(+)載體質(zhì)粒的雙酶切；MDNA Marker IV)。
②擴(kuò)增鑒定以轉(zhuǎn)化后提取的“重組質(zhì)?！睘槟０澹肞1、P2引物PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒omp1-pcDNA3.1(+)中的ompl基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示在約1202bp位置有清晰的擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度與ompl基因相一致，證實(shí)重組質(zhì)粒中有ompl基因片斷插入，見(jiàn)圖5(1-7重組質(zhì)粒的擴(kuò)增；MDNA Marker IV)。
③基因序列分析經(jīng)過(guò)重組質(zhì)粒的序列測(cè)定分析，結(jié)果與Genbank登陸的C.t E型BOUR標(biāo)準(zhǔn)株ompl基因全序列(登陸號(hào)X52557)相比較其相似性為99.92％，第489位A被G取代，是同義突變，故氨基酸序列同源性為100％。序列分析結(jié)果也顯示插入位點(diǎn)處插入的方向和讀碼框均正確無(wú)誤。
二、沙眼衣原體E型DNA疫苗的免疫效果1.C.t E型DNA疫苗誘發(fā)的免疫應(yīng)答①BALB/C雌性小鼠隨機(jī)分為三組pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒免疫組(陰性對(duì)照組)、DNA疫苗免疫組和滅活原體免疫組(陽(yáng)性對(duì)照組)。分別于0、2、4周肌內(nèi)注射pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒150μg/DNA疫苗150μg/滅活原體150μl。
最后一次免疫后2周，所有組的小鼠取靜脈血、生殖道分泌物沖洗液、小鼠生殖道脫落上皮、小鼠脾淋巴細(xì)胞和小鼠子宮標(biāo)本。
②Bradford法對(duì)純化的C.t E型原體進(jìn)行蛋白定量按照蛋白標(biāo)準(zhǔn)的處理方式，取待測(cè)樣品即滅活后C.t EB液進(jìn)行系列稀釋。根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖計(jì)算待測(cè)樣品三種稀釋比例下的蛋白濃度，推算出原液的蛋白濃度，取三者的平均值作為最終的C.t EB原液濃度。
③血清C.t主要外膜蛋白特異性IgG和IgM抗體ELISA檢測(cè)用20μg/ml的C.t純化主要外膜蛋白溶液0.1ml包被聚苯乙烯板的反應(yīng)孔，加入1∶40比例稀釋的待檢血清0.1ml(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)，37℃溫育60min，再加酶標(biāo)抗體后TMB顯色，2M硫酸終止反應(yīng)，測(cè)得各孔的OD450nm值，結(jié)果顯示DNA疫苗組產(chǎn)生的C.t E型特異性IgG抗體水平高于陰性對(duì)照組(p＜0.05)，且滅活原體免疫組的IgG抗體高于DNA疫苗免疫組(p＜0.001)。DNA疫苗組產(chǎn)生的C.t E型特異性IgM抗體水平高于陰性對(duì)照組(p＜0.001)，且滅活原體免疫組的IgM抗體水平高于DNA疫苗免疫組(p＜0.001)。
④細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4檢測(cè)細(xì)胞因子的檢測(cè)包括小鼠血清和脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ和IL-4含量的檢測(cè)。結(jié)果顯示，DNA疫苗組血清IFN-γ水平高于陰性對(duì)照組(p＜0.05)，且滅活原體免疫組血清IFN-γ水平高于DNA疫苗免疫組(p＜0.001)。DNA疫苗組脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IFN-γ水平高于陰性對(duì)照組(p＜0.05)，滅活原體免疫組脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IFN-γ水平與DNA疫苗免疫組和陰性對(duì)照組差異無(wú)顯著性(p＜0.001)。滅活原體免疫組的血清IL-4水平高于DNA疫苗組和陰性對(duì)照組(p＜0.05)，除了DNA疫苗免疫組之外，另兩組沒(méi)有檢測(cè)到脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中有IL-4的存在。
⑤抗體中和試驗(yàn)用純化并稀釋的C.t E型EB與稀釋的血清充分混合，37℃保溫1h，用上述混合物感染已長(zhǎng)成致密單層的McCoy細(xì)胞，48～72h培養(yǎng)后計(jì)數(shù)形成的包涵體數(shù)量。結(jié)果顯示DNA疫苗組和滅活原體免疫組血清中和C.t EB的能力高于陰性對(duì)照組(p＜0.001)。
⑥遲發(fā)型超敏反應(yīng)每組的一半小鼠進(jìn)行此部分實(shí)驗(yàn)。用PBS液將純化的C.t E型EB稀釋后，56℃滅活30min，在小鼠的左后足墊注射25μl稀釋的C.t E型EB，右后足墊注射25μl 2SP液做對(duì)照，48h測(cè)量每只小鼠左右后足墊的厚度，結(jié)果顯示DNA疫苗組和滅活原體免疫組產(chǎn)生的遲發(fā)型超敏反應(yīng)強(qiáng)于陰性對(duì)照組(p＜0.05)。
⑦脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)觀察DTH反應(yīng)后，殺鼠取脾，得到濃度2～4×106個(gè)/ml小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液。用2SP液將純化的C.t E型EB稀釋至蛋白濃度為200～300μg/ml，56℃滅活30min。按每孔50μl將脾細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)液200μl，每只小鼠的脾細(xì)胞懸液設(shè)3個(gè)復(fù)孔，第一孔加入ConA作陽(yáng)性對(duì)照孔，第二孔加入C.t E型EB液，第三孔不加其他物質(zhì)作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)68h，MTT法檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)570nm的吸光度，并計(jì)算淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)，結(jié)果顯示DNA疫苗組和滅活原體免疫組的脾淋巴細(xì)胞增殖多于陰性對(duì)照組(p＜0.001)。
2.C.t E型DNA疫苗免疫同型C.t生殖道攻擊的保護(hù)作用每組的另一半小鼠進(jìn)行此部分實(shí)驗(yàn)觀察。
①C.t E型EB的生殖道攻擊約6.6×105IFU C.t E型EB從生殖道感染小鼠，C.t攻擊后第6天采集小鼠生殖道脫落細(xì)胞，攻擊后2周采集小鼠靜脈血、生殖道分泌物沖洗液、脾淋巴細(xì)胞和小鼠完整子宮標(biāo)本。
②C.t E型主要外膜蛋白特異性IgG、sIgA抗體檢測(cè)方法同上，結(jié)果顯示DNA疫苗組和滅活原體免疫組產(chǎn)生的血清C.t E特異性IgG抗體水平和生殖道局部C.t E特異性sIgA抗體水平均高于陰性對(duì)照組(p＜0.001)。
③脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)C.t E型EB攻擊小鼠生殖道后2周，殺鼠取脾進(jìn)行脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。結(jié)果顯示DNA疫苗組的淋巴細(xì)胞增殖比ConA刺激孔和陰性對(duì)照孔更為顯著；滅活原體組和空質(zhì)粒組各孔的細(xì)胞增殖情況較攻擊前變化不明顯。
④小鼠生殖道C.t培養(yǎng)和計(jì)數(shù)小鼠生殖道脫落上皮細(xì)胞破碎后接種致密單層McCoy細(xì)胞，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)48～72h后，計(jì)數(shù)各孔中形成的包涵體數(shù)量。結(jié)果空質(zhì)粒組小鼠生殖道脫落上皮接種的細(xì)胞孔中分別計(jì)數(shù)到64、18、41、54、38、41個(gè)包涵體外，其他各組沒(méi)有發(fā)現(xiàn)包涵體形成，證實(shí)DNA疫苗組和滅活原體組三組小鼠下生殖道的C.t均已被清除或者均已經(jīng)失去感染活性。
⑤子宮組織病理觀察采用常規(guī)石蠟切片，H-E染色方法。結(jié)果取空質(zhì)粒組小鼠生殖道組織作病理切片，可見(jiàn)在陰道復(fù)層鱗狀上皮和子宮內(nèi)膜單層柱狀上皮交界處(相當(dāng)于子宮頸處)的組織部分上皮細(xì)胞被破壞，上皮水腫，以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞侵入上皮細(xì)胞中形成小膿瘍，固有層中可見(jiàn)一些中性粒細(xì)胞、組織細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，證實(shí)C.t的生殖道攻擊導(dǎo)致該組小鼠局部組織出現(xiàn)明顯的損害。
取DNA疫苗組和滅活原體組小鼠生殖道組織的病理切片，可見(jiàn)在陰道復(fù)層鱗狀上皮和子宮內(nèi)膜單層柱狀上皮交界處(相當(dāng)于子宮頸處)的組織完整，沒(méi)有破壞，固有層中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)輕微。
應(yīng)用構(gòu)建的沙眼衣原體E型DNA疫苗進(jìn)行了一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針對(duì)C.t ompl基因所編碼的主要外膜蛋白產(chǎn)生的抗體是保護(hù)性抗體，具有中和能力。
2.構(gòu)建的C.t E型DNA疫苗免疫小鼠能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生一定的C.t特異性細(xì)胞免疫和體液免疫，其中細(xì)胞免疫水平更顯著，以Th1反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)，對(duì)C.tE型生殖道的攻擊具有良好的保護(hù)作用，發(fā)揮了疫苗的效果。
沙眼衣原體E型DNA疫苗ompl基因核苷酸序列表<110>天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院<120>沙眼衣原體E型DNA疫苗及制備方法與用途<160>1<210>1<211>1182<212>DNA<213>沙眼衣原體種(Chlamydia trachomatis)<400>1atgaaaaaac tcttgaaatc ggtattagta tttgccgctt tgagttctgc ttcctccttg60caagctctgc ctgtggggaa tcctgctgaa ccaagcctta tgatcgacgg aattctgtgg120gaaggtttcg gcggagatcc ttgcgatcct tgcaccactt ggtgtgacgc tatcagcatg180cgtatgggtt actatggtga ctttgttttc gaccgtgttt tgaaaacaga tgtgaataaa240gaattccaaa tgggtgacaa gcctacaagt actacaggca atgctacagc tccaaccact300cttacagcaa gagagaatcc tgcttacggc cgacatatgc aggatgctga gatgtttaca360aatgccgctt gcatggcatt gaatatttgg gatcgctttg atgtattctg tacactagga420gcctctagcg gataccttaa aggaaactct gcttctttca atttagttgg attgtttgga480gataatgaaa atcaaagcac ggtcaaaacg aattctgtac caaatatgag cttagatcaa540tctgttgttg aactttacac agatactgcc ttctcttgga gcgtgggcgc tcgagcagct600ttgtgggagt gcggatgtgc gactttaggg gcttctttcc aatacgctca atctaaacct660aaagtcgaag aattaaacgt tctctgtaac gcagctgagt ttactatcaa taagcctaaa720ggatatgtag ggcaagaatt ccctcttgca ctcatagcag gaactgatgc agcgacgggc780actaaagatg cctctattga ttaccatgag tggcaagcaa gtttagctct ctcttacaga840ttgaatatgt tcactcccta cattggagtt aaatggtctc gagcaagttt tgatgccgat900acgattcgta tagcccagcc aaaatcagct acagctatct ttgatactac cacgcttaac960ccaactattg ctggagctgg cgatgtgaaa gctagcgcag agggtcagct cggagatacc1020atgcaaatcg tctccttgca attgaacaag atgaaatcta gaaaatcttg cggtattgca1080gtaggaacga ctattgtaga tgcagacaaa tacgcagtta cagttgagac tcgcttgatc1140gatgagagag ctgctcacgt aaatgcacaa ttccgcttct aa 118權(quán)利要求
1.一種沙眼衣原體E型DNA疫苗，其特征在于包括沙眼衣原體E型omp1基因和真核表達(dá)載體，omp1基因編碼產(chǎn)物是沙眼衣原體主要外膜蛋白。
2.按照權(quán)利要求1所述的沙眼衣原體E型DNA疫苗，其特征在于所說(shuō)的omp1基因核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
3.按照權(quán)利要求1所述的沙眼衣原體E型DNA疫苗，其特征在于所說(shuō)的真核表達(dá)載體為pcDNA3.1(+)。
4.一種按照權(quán)利要求1所述沙眼衣原體E型DNA疫苗的制備方法，其特征在于從沙眼衣原體E型BOUR株提取染色體DNA，PCR擴(kuò)增出編碼主要外膜蛋白的omp1基因，克隆到pcDNA3.1(+)載體質(zhì)粒中構(gòu)建成沙眼衣原體DNA疫苗。
5.按照權(quán)利要求4所述的沙眼衣原體E型DNA疫苗的制備方法，其特征在于目的基因的5′端從BamHI位點(diǎn)插入，目的基因的3′端從NotI位點(diǎn)插入。
6.一種按照權(quán)利要求1所述沙眼衣原體E型DNA疫苗，用于制備預(yù)防和治療泌尿生殖道沙眼衣原體感染性疾病的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種沙眼衣原體E型DNA疫苗及制備方法與用途。本發(fā)明應(yīng)用分子克隆等基因工程技術(shù)，從沙眼衣原體E型染色體基因中PCR克隆出主要外膜蛋白基因(omp1基因)，與真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)定向連接構(gòu)建成DNA疫苗。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，構(gòu)建的沙眼衣原體E型DNA疫苗免疫小鼠能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定的沙眼衣原體特異性細(xì)胞免疫和體液免疫，其中細(xì)胞免疫水平更顯著，以Th1反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)，對(duì)沙眼衣原體E型生殖道的攻擊具有保護(hù)作用。該疫苗有望改善沙眼衣原體泌尿生殖道感染發(fā)病率高、遷延難治、易于復(fù)發(fā)和耗資巨大的現(xiàn)狀。
文檔編號(hào)A61P15/00GK1943788SQ200610016248
公開(kāi)日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2006年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月24日
發(fā)明者劉全忠, 齊蔓莉, 王敬, 陳錦英 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院