專利名稱：：來自人類脂肪組織的多能干細(xì)胞和包含該多能干細(xì)胞的細(xì)胞治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及來自人類脂肪組織的多能成體干細(xì)胞，具體涉及來自人類乳房脂肪組織的多能成體干細(xì)胞，其可通過形成球體而長時(shí)間保持未分化狀態(tài)，并具有較高的增殖率。此外，本發(fā)明還涉及用于分離和保持成體干細(xì)胞的方法，用于將成體干細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和胰島素釋放胰腺I3細(xì)胞的方法，用于治療骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥和糖尿病的細(xì)胞治療劑，以及用于形成乳房組織的細(xì)胞治療劑。
背景技術(shù)：
：21世紀(jì)生物技術(shù)以提高人類繁榮為最終目標(biāo)提供了食物、環(huán)境和健康問題上新解決辦法的可能性。近年來，使用干細(xì)胞的技術(shù)已經(jīng)被認(rèn)為是治療不可治愈的疾病的新途徑。以前，器官移植、基因治療等被提出用于治療不可治愈的人類疾病，但是由于免疫排斥、器官源短缺、載體發(fā)展的不足以及缺乏對疾病基因知識，不能將它們高效地使用。由于這種原因，隨著對干細(xì)胞研究興趣的增加，人們己經(jīng)認(rèn)識到通過增殖和分化具有形成所有器官的能力的全能干細(xì)胞不僅能夠治療絕大多數(shù)疾病，而且基本治愈器官損傷。而且，許多科學(xué)家已經(jīng)提出干細(xì)胞用于再生所有器官和治療不可治愈疾病的適用性，包括帕金森癥、各種癌癥、糖尿病和脊柱損傷。干細(xì)胞指的是不僅具有自我復(fù)制能力而且具有分化成至少兩種細(xì)胞的能力的細(xì)胞，其可被分成全能干細(xì)胞、亞全能干細(xì)胞和多能干細(xì)胞。全能干細(xì)胞是具有能夠形成一個(gè)完整個(gè)體的全能性的細(xì)胞，卵母細(xì)胞和精子受精后到8細(xì)胞期的細(xì)胞具有這些性質(zhì)。當(dāng)這些細(xì)胞被分離并移植到子宮中時(shí)，它們可發(fā)育成一個(gè)完整個(gè)體。亞全能干細(xì)胞是能夠形成來源于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的各種細(xì)胞和組織的細(xì)胞，亞全能干細(xì)胞來自定位在受精4-5天后產(chǎn)生的胚泡內(nèi)的內(nèi)部球團(tuán)。這些細(xì)胞被稱為"胚胎干細(xì)胞"，并可分化成各種其它組織細(xì)胞，但不能形成新的活體組織。多能干細(xì)胞是僅能分化成對含有這些細(xì)胞的組織和器官具有特異性的細(xì)胞，多能干細(xì)胞不僅在胎兒、新生兒和成人階段的各種組織和器官的生長和發(fā)育中涉及，而且還在保持成人組織的內(nèi)環(huán)境平衡和當(dāng)組織損傷時(shí)誘導(dǎo)再生的功能中涉及。組織特異性多能細(xì)胞統(tǒng)稱為"成體干細(xì)胞"。成體干細(xì)胞通過從各種人類器官中收集細(xì)胞并使細(xì)胞發(fā)育成干細(xì)胞而獲得，其特征在于它們僅僅分化成特定組織。但是，近年來，用于將成體干細(xì)胞分化成各種組織包括肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)也明顯獲得成功。多能干細(xì)胞首先從成人骨髓細(xì)胞中分離(Jiang等人，Nature,418:41，2002)，然后在其它各種成人組織中均被發(fā)現(xiàn)(Verfaillie，TrendsCellBiol.，12:502，2002)。換言之，雖然骨髓是最廣為人知的干細(xì)胞源，但多能干細(xì)胞在皮膚、血管、肌肉和腦中也被發(fā)現(xiàn)(Tomas等人，Nat.CellBiol.，3:778，2001;Sampaolesi等人，Science,301:487，2003;Jiang等人，Exp.Hematol.，30:896，2002)。但是，成人組織諸如骨髓中的干細(xì)胞存在非常少，這些細(xì)胞在不誘導(dǎo)分化的情況下難以培養(yǎng)，在不存在特定篩選培養(yǎng)基的情況下同樣也難以培養(yǎng)。也就是說，在體外保持這些分離的干細(xì)胞非常困難。近年來，發(fā)現(xiàn)脂肪組織是一種新的多能干細(xì)胞源(Cousin等人，BBRC.，301:1016，2003;Miranville等人，Circulation,110:349，2004;Gronthos等人，J.CellPhysiol.，189:54，2001;Seo等人，BBRC.，328:258，2005)。也就是說，據(jù)報(bào)道通過吸脂術(shù)得到的人類脂肪組織中含有一組未分化細(xì)胞。其具有分化成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞的能力(Zuk等人，TissueEng.,7:211，2001;Rodriguez等人，BBRC.，315:255，2004)。這種脂肪組織具有的優(yōu)點(diǎn)是可以被大量提取，因此，作為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)的新干細(xì)胞源而引起注意。而且，使用動物模型實(shí)驗(yàn)所進(jìn)行的新近研究表明，脂肪組織源細(xì)胞具有再生肌肉并刺激神經(jīng)血管分化的能力。因此，這些脂肪組織源細(xì)胞作為新的干細(xì)胞源而引起注意。到目前為止已知的脂肪組織源干細(xì)胞包括可分化成上皮細(xì)胞的人脂肪源成體干細(xì)胞(Brzoska等人，BBRC，330:142，2005)，可分化成成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的人脂肪源成體干細(xì)胞(Cao等人，BBRC，332:370，2005)，可分化成神經(jīng)細(xì)胞的人脂肪源成體干細(xì)胞(Safford等人，BBRC，294:371，2002)，可分化成脂肪細(xì)胞的鼠脂肪源干細(xì)胞(Ogawa等人，BBRC，319:511，2004)，可分化成成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞的鼠脂肪源干細(xì)胞(Ogawa等人，BBRC，313:871，2004)，可分化成軟骨細(xì)胞的人脂肪源干細(xì)胞(Biomaterials，25:3211，2004)，可分化成神經(jīng)細(xì)胞的鼠脂肪源干細(xì)胞(Fujimura等人，BBRC，333:116，2005)，可分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞或者肌肉細(xì)胞的脂肪源干細(xì)胞(美國專利US6777231)。但是，到目前為止絕大多數(shù)已知的脂肪源干細(xì)胞是來源于除人類以外的其它動物的脂肪組織的干細(xì)胞。即便它們是來源于人類脂肪組織的干細(xì)胞，它們也被限制在通過腹部脂肪吸脂術(shù)獲得的組織來源，并且由這些干細(xì)胞分化而成的細(xì)胞的種類也是有限的。特別地，分離的干細(xì)胞具有低增殖率，并且難以長期保持在未分化狀態(tài)，因此，在應(yīng)用方面受到限制。因此，本發(fā)明的發(fā)明人付出了極大的努力來開發(fā)具有高增殖率的成人多能干細(xì)胞，它們可通過形成球體而長期保持在未分化狀態(tài)，并可分化成更多種細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從人類脂肪組織中分離的多能干細(xì)胞可分化成各種細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、星形細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和胰島素釋放胰腺卩細(xì)胞，具有非常高的增殖率，并可通過形成球體長期保持在未分化狀態(tài)，由此完成本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的在于，提供脂肪組織源多能成體干細(xì)胞，其具有高增殖率并可通過形成球體長時(shí)間保持在未分化狀態(tài)，本發(fā)明還提供了這種多能干細(xì)胞的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供將所述多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞、星形細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及胰島素釋放胰腺(3細(xì)胞的方法，以及含有所述分化細(xì)胞或者成體干細(xì)胞的治療劑。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)成體干細(xì)胞的方法，包括在含有N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人脂肪組織源球團(tuán)，然后收集培養(yǎng)的細(xì)胞，所述成體干細(xì)胞的特征在于(a)對所有CD73、CD90、CD29、CD44和CD105產(chǎn)生陽性免疫應(yīng)答，并對所有CD33、CD34、CD45、CD4、CD31、CD62p、CD14和HLA-DR產(chǎn)生陰性免疫應(yīng)答；(b)附著于塑料生長，顯示梭狀形態(tài)學(xué)特征，并在含有CORM-2的培養(yǎng)基中形成球體，從而能夠長時(shí)間保持為在分化狀態(tài)；和(c)具有分化成中胚層源細(xì)胞的能力。在本發(fā)明中，含NAC的培養(yǎng)基另外包括抗壞血酸、鈣、rEGF、BPE、胰島素和皮質(zhì)醇。另一方面，本發(fā)明提供了一種將成體干細(xì)胞細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)的方法，該方法包括在含有CORM-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)由所述方法制備的成體干細(xì)胞使其形成球體。在本發(fā)明中，含有CROM-2的培養(yǎng)基優(yōu)選為無血清培養(yǎng)基，其另外包含抗真菌抗生素溶液、皮質(zhì)醇、胰島素、rEGF、FGF、B27和p-巰基乙醇。在又一方面，本發(fā)明提供了由所述方法生產(chǎn)的成體干細(xì)胞，其特征在于(a)對所有CD73、CD卯、CD29、CD44和CD105產(chǎn)生陽性免疫應(yīng)答，并對所有CD33、CD34、CD45、CD4、CD31、CD62p、CD14和HLA-DR產(chǎn)生陰性免疫應(yīng)答；(b)附著于塑料生長，顯示梭狀形態(tài)學(xué)特征，并在含有CORM-2的培養(yǎng)基中形成球體，從而能夠長時(shí)間保持在未分化狀態(tài)；和(c)具有分化成中胚層源細(xì)胞的能力。在本發(fā)明中，成體干細(xì)胞優(yōu)選以未分化狀態(tài)培養(yǎng)到至少16代，中胚層源細(xì)胞優(yōu)選為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、星形細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、以及胰島素釋放胰腺P細(xì)胞。在再一方面，本發(fā)明提供了將成體干細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞的方法，所述方法包括下列歩驟(a)在含有BME和FBS的DEME培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)成體干細(xì)胞；和(b)用DMSO和BHA處理預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)液以便誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞。而且，本發(fā)明提供了用于治療神經(jīng)疾病的細(xì)胞治療劑，其含有所述分化的神經(jīng)細(xì)胞作為活性成分。在還一方面，本發(fā)明提供了用于將成體干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞的方法，所述方法包括在含有TFG-f31、L-抗壞血酸鹽-2-磷酸鹽和胰島素的a-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)成體干細(xì)胞。而且，本發(fā)明提供了用于治療骨關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞治療劑，其含有所述分化的軟骨細(xì)胞作為活性成分。在又一方面，本發(fā)明提供了用于將成體干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞的方法，所述方法包括將成體干細(xì)胞與磷酸三鈣(TCP)混合并同基因移植(isotransplanting)該混合物。而且，本發(fā)明提供了用于治療骨缺損的細(xì)胞治療劑，其含有所述分化的成骨細(xì)胞作為活性成分。在還一方面，本發(fā)明提供了用于將成體干細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞的方法，所述方法包括在含有地塞米松、抗炎吲哚酸、胰島素和IBMX的a-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)成體干細(xì)胞。而且，本發(fā)明提供了用于形成乳房組織的細(xì)胞治療劑，其含有所述分化的脂肪細(xì)胞作為活性成分。在再一方面，本發(fā)明提供了將成體干細(xì)胞分化成胰島素釋放胰腺卩細(xì)胞的方法，所述方法包括下列步驟(a)將成體干細(xì)胞在含有尼克酰胺、(3-巰基乙醇和FBS的低葡萄糖DEME培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-72小時(shí)；和(b)將培養(yǎng)的細(xì)胞在含有尼克酰胺、(3-巰基乙醇和FBS的高葡萄糖DEME培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-7天。而且，本發(fā)明提供了用于治療糖尿病的細(xì)胞治療劑，其含有所述胰島素釋放胰腺p細(xì)胞作為活性成分。在又一方面，本發(fā)明提供了用于治療神經(jīng)疾病的細(xì)胞治療劑，其含有具有分化成神經(jīng)細(xì)胞能力的成體干細(xì)胞作為活性成分。在又一方面，本發(fā)明提供了用于治療糖尿病的細(xì)胞治療劑，其含有具有分化成胰島素釋放胰腺(3細(xì)胞能力的成體干細(xì)胞作為活性成分。在又一方面，本發(fā)明提供了用于治療骨關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞治療劑，其含有具有分化成軟骨細(xì)胞能力的成體干細(xì)胞作為活性成分。在又一方面，本發(fā)明提供了用于治療骨缺損的細(xì)胞治療劑，其含有具有分化成成骨細(xì)胞能力的成體干細(xì)胞作為活性成分。在又一方面，本發(fā)明提供了用于形成乳房組織的細(xì)胞治療劑，其含有具有分化成脂肪細(xì)胞能力的成體干細(xì)胞作為活性成分。通過下列詳細(xì)描述和所附的權(quán)利要求書，本發(fā)明的上述和其它目的、特征和實(shí)施方式將會更顯而易見地被理解。圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細(xì)胞的放大100倍拍攝的照片。圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細(xì)胞的累計(jì)倍增數(shù)目水平(CPDL)。A-l和A-2:根據(jù)本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細(xì)胞；B和C:根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的脂肪源干細(xì)胞。圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的人乳房脂肪組織源多能干細(xì)胞培養(yǎng)7天后形成的球體的放大200倍拍攝的照片。圖4顯示了通過干細(xì)胞在瓊脂中增殖形成的球體形狀的放大200倍拍攝的照片。圖5示出了放大100倍拍攝的照片，其顯示了巢蛋白，Oct4，SH2，SH3/4在本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細(xì)胞中的表達(dá)，該人脂肪組織源多能干細(xì)胞在含有MEBM的CORM-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)成球體然后免疫染色。圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞和星形細(xì)胞。圖7顯示了由根據(jù)本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細(xì)胞分化而成的脂肪細(xì)胞的放大200倍拍攝的照片。A:分化階段對比；B:通過油紅O染色法染色。圖8顯示了由根據(jù)本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細(xì)胞分化而成的軟骨細(xì)胞的放大100倍拍攝的照片。A:分化階段對比；B:愛爾新藍(lán)染色結(jié)果，顯示分化成軟骨細(xì)胞。圖9顯示了由根據(jù)本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細(xì)胞分化而成的成骨細(xì)胞。A:TCP單獨(dú)處理組；B:TCP和骨髓干細(xì)胞處理組；和C:TCP和脂肪源干細(xì)胞處理組D圖10顯示了由根據(jù)本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細(xì)胞分化而成的胰島素釋放胰腺P細(xì)胞的免疫染色結(jié)果。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及從人乳房脂肪組織分離的多能干細(xì)胞。在本發(fā)明中，多能干細(xì)胞首先以下列方式從人乳房脂肪組織中分離并純化。分離的人脂肪組織用PBS清洗，并精細(xì)地切割然后在添加了1型膠原酶(lmg/ml)的DMEM培養(yǎng)基中在37r消化2小時(shí)。用PBS清洗后，將組織以1000rpm離心5分鐘。吸去上清，用PBS清洗保留在底部的球團(tuán)，然后以1000rpm離心5分鐘。得到的球團(tuán)通過100/^i篩過濾除去殘?jiān)?，接著用PBS清洗。然后，球團(tuán)在DMEM培養(yǎng)基(10。/aFBS，2mMNAC，0.2mM抗壞血酸)中培養(yǎng)。過一夜后，用PBS將未附著的細(xì)胞洗去，剩余細(xì)胞在K-NAC培養(yǎng)基(角質(zhì)化細(xì)胞-SFM培養(yǎng)基+2mMNAC+0.2mM抗壞血酸+0.09mM1丐+5ng/mlrEGF+50〃g/mlBPE+5港/1111胰島素+74ng/ml皮質(zhì)醇)中培養(yǎng)，同時(shí)每隔兩天更換一次培養(yǎng)基，從而得到人乳房脂肪組織源多能干細(xì)胞溶液。檢查分離的人乳房脂肪組織源多能干細(xì)胞的增殖率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPDL逐漸增加到16代數(shù)，表明干細(xì)胞具有高增殖率。同時(shí)，對于干細(xì)胞的球體培養(yǎng)物，將5xlO、lxl()S細(xì)胞/ml分離的人乳房脂肪組織源多能干細(xì)胞接種到含有MEBM培養(yǎng)基(10|iMC0RM-2(三羰基二氯代釕(n)二聚體)、B27、5ml抗真菌抗生素溶液(IOOX)，1颼/ml皮質(zhì)醇、5〃g/ml胰島素，20ng/mlEGF,40ng/mlFGF和p-巰基乙醇)的6孔板的每個(gè)孔中，結(jié)果，它們從接種3天后就開始形成球體。這顯示干細(xì)胞具有高增殖率并保持在未分化狀態(tài)。從上述得到的人脂肪組織源干細(xì)胞培養(yǎng)液中獲得表達(dá)所需表面抗原的多能干細(xì)胞的方法包括，使用具有分選功能的流式細(xì)胞儀的FACS方法(Int.Immunol.,10(3):275，1998)，使用磁珠的方法和使用抗體特異地識別多能干細(xì)胞的淘選方法(J.Immunol.,141(8):2797，1998)。而且，用于從大量培養(yǎng)液中獲得多能干細(xì)胞的方法包括其中在細(xì)胞表面上表達(dá)的抗體特異地識別分子(此后稱為"表面抗原")被單獨(dú)使用或者結(jié)合成列(ascolumn)使用的方法。流式細(xì)胞儀可包括水滴電荷法和細(xì)胞捕獲法。在這些方法的任何一種中，特異地識別細(xì)胞表面上的抗原的抗體被熒光標(biāo)記，將與細(xì)胞表面上表達(dá)的分子結(jié)合的抗體發(fā)出的熒光強(qiáng)度轉(zhuǎn)化成電信號，從而對抗原的表達(dá)量進(jìn)行定量。還能夠通過結(jié)合使用的熒光類型來分離表達(dá)多個(gè)表面抗原的細(xì)胞。在這種情況下可使用的熒光的例子包括FITC(熒光異硫氰酸酯)、PE(藻紅蛋白)、APC(別藻藍(lán)蛋白)、TR(TexasRed)、Cy3、CyCh腿e、Red613、Red670、TRI-Color、QuantumRed等。使用流式細(xì)胞儀的FACS方法包括其中從分離的細(xì)胞中通過例如離心并直接用抗體染色來收集上述干細(xì)胞培養(yǎng)液的方法；和其中細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并生長然后用抗體染色的方法。細(xì)胞的染色通過將識別表面抗原的初級抗體與耙細(xì)胞樣品混合并在冰上將混合物培養(yǎng)30分鐘到1小時(shí)。當(dāng)初級抗體被標(biāo)記上熒光后，清洗后用流式細(xì)胞儀分離細(xì)胞。當(dāng)初級抗體沒有被標(biāo)記上熒光時(shí)，清洗后混合與初級抗體反應(yīng)的細(xì)胞和熒光標(biāo)記的對初級抗體具有結(jié)合活性的第二抗體，并在冰上培養(yǎng)30分鐘到1小時(shí)。清洗后，由初級抗體和第二抗體染色的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀分離。各種表面抗原可包括造血相關(guān)抗原、間葉細(xì)胞的表面抗原和對神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元特異的抗原。造血相關(guān)抗原包括CD34、CD35等，間葉細(xì)胞的表面抗原包括SH-2、SH-3等，對神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元特異的抗原包括NSE、GFAP等。識別上述表面抗原的抗體單獨(dú)或結(jié)合使用允許獲得所需細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的分離的多能成年干細(xì)胞使用流式細(xì)胞術(shù)分析，結(jié)果，對CD73、CD卯、CD29、CD44和CD105顯示陽性應(yīng)答。而且，多能干細(xì)胞對所有的CD33、CD34、CD45、CD4，CD31、CD62p、CD14和HLA-DR顯示陰性免疫應(yīng)答。另外發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的分離多能干細(xì)胞是可分化成神經(jīng)細(xì)胞、星形細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及胰島素釋放胰腺P細(xì)胞的多能干細(xì)胞。實(shí)施例隨后將通過實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。但是應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明的目的，而不構(gòu)成對本發(fā)明的范圍的限制。實(shí)施例l:從脂肪組織中分離多能干細(xì)胞脂肪組織由首爾國立大學(xué)乳腺癌中心提供的婦女乳房組織中分離，用PBS清洗然后精細(xì)切割。切割的組織在添加了1型膠原酶(lmg/ml)的DMEM培養(yǎng)基中在37"C下消化2小時(shí)。消化的組織用PBS清洗然后以1000rpm離心5分鐘，吸去上清，并用PBS清洗保留在底部的球團(tuán)，然后以1000rpm離心5分鐘。得到的球團(tuán)經(jīng)100，篩過濾除去殘?jiān)缓笥肞BS清洗。得到的細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基(10%FBS，2mMNAC，0.2mM抗壞血酸)中培養(yǎng)。過一夜后，用PBS洗去未附著的細(xì)胞，并在角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM培養(yǎng)基(含有2mMNAC,0.2mM抗壞血酸，0.09mM鈣，5ng/mlrEGF,50〃g/mlBPE,5〃g/ml胰島素和74ng/ml皮質(zhì)醇)中培養(yǎng)，同時(shí)以兩天為間隔更換培養(yǎng)基，由此分離多能干細(xì)胞。圖1顯示了上述分離的人脂肪組織源多能干細(xì)胞放大IOO倍拍攝的照片。實(shí)施例2:脂肪組織源干細(xì)胞的增殖率檢査脂肪組織根據(jù)上述實(shí)施例1中描述的分離方法從每種不同人乳房組織樣品獲得。為了檢査來自分離的人乳房脂肪組織的多能干細(xì)胞的增殖率，將2xl05個(gè)細(xì)胞接種到T-75燒瓶中并測定CPDL(累計(jì)倍增數(shù)目水平)并表示為代數(shù)的函數(shù)。CPDL是細(xì)胞增殖率的指數(shù)表示并表示為下列方程。CPDL=ln(Nf/Ni)/ln2，其中Ni:初始接種細(xì)胞數(shù);和Nf:最終細(xì)胞數(shù)。結(jié)果，如圖2的"A-l"和"A-2"中所示，根據(jù)本發(fā)明的成體干細(xì)胞(hMAD-MCSl和hMAD-MCS2)在傳代16代數(shù)時(shí)顯示了大約50的CPDL值。同時(shí)，圖2的"B"和"C"顯示了作為代數(shù)的函數(shù)的現(xiàn)有技術(shù)的人脂肪組織源干細(xì)胞的CPDL值(Lin等人，StemCellsandDevelopment,14:92,2005;Zuk等人，TissueEng.,7:211，2001)。如圖2所示，在代數(shù)為7和13時(shí)細(xì)胞的CPDL值分別為30-35和21。這些結(jié)果顯示根據(jù)本發(fā)明的成體干細(xì)胞具有非常高的增殖率。實(shí)施例3:脂肪源多能干細(xì)胞的免疫學(xué)特性在實(shí)施例1中得到的脂肪組織源多能干細(xì)胞用PBS清洗并用胰蛋白酶處理。收集處理的細(xì)胞并以lOOOrpm離心5分鐘。除去上清然后用2%FBS和PBS的混合物清洗，然后以lOOOrpm離心5分鐘。除去上清，將細(xì)胞懸浮于PBS中，對每種樣品將lx105個(gè)細(xì)胞分散到孔板中，將抗體(R-藻紅蛋白結(jié)合的鼠抗人單克隆抗體)放置到每個(gè)孔中并在冰上培養(yǎng)40分鐘。培養(yǎng)后，將培養(yǎng)基以lOOOrpm離心5分鐘。除去上清并用PBS清洗細(xì)胞并以lOOOrpm離心5分鐘。再次除去上清，用PBS清洗細(xì)胞并以lOOOrpm離心5分鐘。除去上清后，將細(xì)胞與1%的多聚甲醛混合并使用流式細(xì)胞儀分析。表l:脂肪源干細(xì)胞的表面抗原的FACS分析<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>結(jié)果，如表1所示，根據(jù)本發(fā)明的脂肪組織源成體干細(xì)胞顯示了對CD73為91%，對CD90為97%,對CD29為96%，對CD44為83%，以及對CD105為80%的陽性應(yīng)答。而且，本發(fā)明的干細(xì)胞對所有CD33、CD34、CD45、CD4、CD31,CD62p、CD14和HLA-DR顯示陰性免疫應(yīng)答。實(shí)施例4:脂肪組織源多能干細(xì)胞的球體形成將實(shí)施例1中得到的5><104-1><105/1111人乳房脂肪組織源多能干細(xì)胞接種到含有10pMCORM-2，5ml抗生素溶液(100X)，1巡/ml皮質(zhì)醇，5〃g/ml胰島素，20ng/mlEGF，40ng/mlFGF,B27和p-巰基乙醇的無血清MEBM培養(yǎng)基的6孔板的每個(gè)孔中。結(jié)果，接種后3-7天細(xì)胞開始形成球體，如圖3和圖4所示，甚至在接種后7-10天細(xì)胞增殖形成球體。而且，根據(jù)本發(fā)明的干細(xì)胞在瓊脂中培養(yǎng)。結(jié)果，如圖4所示，細(xì)胞形成球體。同時(shí)，將實(shí)施例1中得到的5><104個(gè)干細(xì)胞接種到24孔板的每個(gè)孔中并在每個(gè)代數(shù)測定球體的數(shù)目(見表2)。結(jié)果，如表2所示，細(xì)胞保持球體，表明細(xì)胞可增殖并長期保持。而且，如圖5所示，Oct4陽性表達(dá)，表明細(xì)胞具有高增殖率并保持在未分化狀態(tài)。表2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>22603271實(shí)施例5:脂肪組織源干細(xì)胞的免疫染色分析將實(shí)施例4中得到的脂肪組織源干細(xì)胞球用PBS清洗3次并與含PBS的4%多聚甲醛混合30分鐘。用PBS清洗3次后，將球體用含有0.1%Triton-XlOO的PBS滲透10分鐘。用PBS清洗3次后，允許球體與10%NGS反應(yīng)1小時(shí)，然后與含有初級抗體的PBS反應(yīng)過夜。用PBS清洗3次后，允許球體與第二抗體在暗室中反應(yīng)1小時(shí)。用PBS清洗3次后，對球體進(jìn)行測定(mount)。結(jié)果，如圖5所示，根據(jù)本發(fā)明的多能干細(xì)胞球?qū)λ锌杀徽J(rèn)為是神經(jīng)祖細(xì)胞的標(biāo)記物的巢蛋白、可被認(rèn)為是未分化細(xì)胞的標(biāo)記物的Oct4和間葉細(xì)胞的標(biāo)記物SH2(CD105)及SH3/4(CD73)都顯示陽性應(yīng)答。實(shí)施例6:脂肪源多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞和星形細(xì)胞實(shí)施例1中得到的脂肪組織源多能干細(xì)胞在添加了1mMBME和10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)。預(yù)培養(yǎng)后，為了誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化，將干細(xì)胞在含有P/。DMSO和100pMBHA(丁基羥基茴香醚)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)90分鐘以便誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞，接著進(jìn)行免疫染色(圖6)。結(jié)果，如圖6所示，根據(jù)本發(fā)明的人脂肪組織源多能干細(xì)胞對神經(jīng)系統(tǒng)中的星形細(xì)胞特異的抗原GFAP(神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白)和神經(jīng)細(xì)胞特異性物質(zhì)MAP2(微管相關(guān)蛋白2)都顯示陽性應(yīng)答。圖6中第一行的照片顯示陰性對照組的結(jié)果，表示分化的細(xì)胞本身沒有顯示FITC和TRITC的熒光。第二行左側(cè)的MAP2照片顯示TRITC紅色熒光，表明MAP2表達(dá)。通過這些階段對比照片和融合照片發(fā)現(xiàn)，紅色熒光是由其中表達(dá)MAP2的細(xì)胞發(fā)出的熒光。而且，第三行左側(cè)的GFAP照片顯示FITC綠色熒光，從階段對比照片和融合照片可以看出，綠色熒光是由表達(dá)GFAP的細(xì)胞發(fā)出的熒光。這些結(jié)果表明，根據(jù)本發(fā)明的人脂肪源多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞和星形細(xì)胞。實(shí)施例7:脂肪源多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞實(shí)施例1中得到的脂肪組織源多能干細(xì)胞在含有5%FBS，lpM地塞米松，200pM抗炎叼l哚酸、]0巡/ml胰島素和0.5mMIBMX(3-異丁基-l-甲基黃嘌呤)的a-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周以便誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞然后使用油紅O染色法進(jìn)行分析。結(jié)果，如圖7所示，觀察到人脂肪組織源多能干細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞。實(shí)施例8:脂肪源多能干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞將實(shí)施例1中得到的107個(gè)干細(xì)胞以1(HU的量接種到24孔板的每個(gè)中心。然后，將細(xì)胞在含有5。/。FBS，10ng/mlTFG-J31，50)iML-抗壞血酸鹽-2-磷酸鹽和6.25巡/ml胰島素的a-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周，以便誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞。然后，多能干細(xì)胞是否分化成軟骨細(xì)胞使用愛爾新藍(lán)染色法進(jìn)行分析。結(jié)果，如圖8所示，人脂肪組織源多能干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞。實(shí)施例9:脂肪源多能干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞將實(shí)施例1中得到的107個(gè)干細(xì)胞與TCP(磷酸三鈣)混合并皮下同基因移植到狗的身體中。14天后，使用H&E染色法處理并分析。結(jié)果，如圖9所示，用TCP單獨(dú)處理的組(A)顯示炎性細(xì)胞滲透到部分周圍的TCP中，用TCP和骨髓干細(xì)胞的混合物處理的組(B)顯示炎性響應(yīng)保持與周圍TCP未接觸。但是，在用TCP和脂肪源干細(xì)胞的混合物處理的組(C)中，絕大多數(shù)TCP被吸收，并觀察到典型的初始骨生成，還觀察到成骨細(xì)胞狀細(xì)胞、多核破骨細(xì)胞狀細(xì)胞和骨基質(zhì)。這些結(jié)果表明，人脂肪組織源多能干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞。實(shí)施例10:脂肪源多能干細(xì)胞分化成胰島素釋放胰腺!3細(xì)胞實(shí)施例1中得到的脂肪組織源多能干細(xì)胞在含有1Ommol/L尼克酰胺、1mmol/LP-巰基乙醇和10°/。FBS的低葡萄糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，然后在含有10mmol/L尼克酰胺、1mmol/L卩-巰基乙醇和5%FBS的高葡萄糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天，以便誘導(dǎo)分化成胰島素釋放胰腺P細(xì)胞。誘導(dǎo)分化后，通過免疫染色法分析細(xì)胞，結(jié)果在圖10中顯示。如圖10所示，細(xì)胞中存在C-肽和胰島素。如同本領(lǐng)域已知的那樣，被分成胰島素和C-肽的胰島素原在胰島素釋放胰腺(3細(xì)胞中產(chǎn)生。因此，上述結(jié)果表明，根據(jù)本發(fā)明的脂肪組織源干細(xì)胞分化成了胰島素釋放胰腺(3細(xì)胞。雖然已經(jīng)參照特定特征對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，該描述僅僅是優(yōu)選實(shí)施方式，而不是對本發(fā)明的范圍的限制。因此，本發(fā)明的實(shí)際范圍將由所附的權(quán)利要求書及其等同物限定。工業(yè)實(shí)用性如上面詳細(xì)描述的那樣，雖然根據(jù)本發(fā)明的多能干細(xì)胞是成體干細(xì)胞，它們可分化成比現(xiàn)有脂肪源成體干細(xì)胞分化的那些細(xì)胞更多種類的細(xì)胞。特別地，本發(fā)明的成人多能干細(xì)胞具有分化成神經(jīng)細(xì)胞、星形細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞或者胰島素釋放胰腺P細(xì)胞的能力，并有效地治療骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)疾病、糖尿病等，還用于形成乳房組織。而且，本發(fā)明的成體干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中形成球體，使它們可被高純度地分離，長時(shí)間保持未分化狀態(tài)并具有高增殖率。因此，本發(fā)明的成體干細(xì)胞作為細(xì)胞治療劑是有用的。權(quán)利要求1、一種生產(chǎn)成體干細(xì)胞的方法，包括在含有N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人脂肪組織源球團(tuán)，然后收集培養(yǎng)的細(xì)胞，所述成體干細(xì)胞，其特征在于(a)對所有CD73、CD90、CD29、CD44和CD105產(chǎn)生陽性免疫應(yīng)答，并對所有CD33、CD34、CD45、CD4、CD31、CD62p、CD14和HLA-DR產(chǎn)生陰性免疫應(yīng)答；(b)附著于塑料生長，顯示梭狀形態(tài)學(xué)特征，并在含有CORM-2的培養(yǎng)基中形成球體，從而能夠長時(shí)間保持在未分化狀態(tài)；和(c)具有分化成中胚層源細(xì)胞的能力。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的產(chǎn)生成體干細(xì)胞的方法，其特征在于，含有NAC的培養(yǎng)基另外含有抗壞血酸、鈣、rEGF、BPE、胰島素和皮質(zhì)醇。3、一種將成體干細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)的方法，所述方法包括在含有CORM-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法制備的成體干細(xì)胞以便形成球體。4、一種將成體干細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)的方法，其特征在于，含有CROM-2的培養(yǎng)基優(yōu)選為無血清的培養(yǎng)基，其另外包含抗真菌抗生素溶液、皮質(zhì)醇、胰島素、rEGF、B27和p-巰基乙醇。5、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法產(chǎn)生的成體干細(xì)胞，其特征在于(a)對所有CD73、CD90、CD29、CD44和CD105產(chǎn)生陽性免疫應(yīng)答，并對所有CD33、CD34、CD45、CD4、CD31、CD62p、CD14和HLA-DR產(chǎn)生陰性免疫應(yīng)答；(b)附著于塑料生長，顯示梭狀形態(tài)學(xué)特征，并在含有CORM-2的培養(yǎng)基中形成球體，從而能夠長時(shí)間保持在未分化狀態(tài)；和(C)具有分化成中胚層源細(xì)胞的能力。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的成體干細(xì)胞，其特征在于，成體干細(xì)胞以未分化狀態(tài)培養(yǎng)至少16代。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的成體干細(xì)胞，其特征在于，中胚層源細(xì)胞選自下組包括軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、星形細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及胰島素釋放胰腺{3細(xì)胞。8、一種將成體干細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞的方法，所述方法包括下列步驟(a)在含有BME和FBS的DEME培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的成體干細(xì)胞；和(b)用DMSO和BHA處理預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)液以便誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞。9、一種用于治療神經(jīng)疾病的細(xì)胞治療劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法分化的神經(jīng)細(xì)胞作為活性成分。10、一種將成體干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞的方法，所述方法包括在含有TFG-pi、L-抗壞血酸鹽-2-磷酸鹽和胰島素的a-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的成體干細(xì)胞。11、一種用于治療骨關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞治療劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求io所述的方法分化的軟骨細(xì)胞作為活性成分。12、一種將成體干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的成體干細(xì)胞與磷酸三鈣(TCP)混合并同基因移植該混合物。13、一種用于治療骨缺損的細(xì)胞治療劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法分化的成骨細(xì)胞作為活性成分。14、一種將成體干細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞的方法，所述方法包括在含有地塞米松、抗炎吲哚酸、胰島素和IBMX的a-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的成體干細(xì)胞。15、一種用于治療骨關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞治療劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法分化的脂肪細(xì)胞作為活性成分。16、一種將成體干細(xì)胞分化成胰島素釋放胰腺(3細(xì)胞的方法，所述方法包括下列步驟將根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的成體干細(xì)胞在含有尼克酰胺、J3-巰基乙醇和FBS的低葡萄糖DEME培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-72小時(shí)；和(b)將培養(yǎng)的細(xì)胞在含有尼克酰胺、p-巰基乙醇和FBS的高葡萄糖DEME培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-7天。17、一種用于治療糖尿病的細(xì)胞治療劑，其含有通過權(quán)利要求16的方法分化的胰島素釋放胰腺(3細(xì)胞作為活性成分。18、一種用于治療神經(jīng)疾病的細(xì)胞治療劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的成體干細(xì)胞作為活性成分，所述成體干細(xì)胞具有能分化成神經(jīng)細(xì)胞的能力。19、一種用于治療糖尿病的細(xì)胞治療劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的成體千細(xì)胞作為活性成分，所述成體干細(xì)胞具有能分化成胰島素釋放胰腺P細(xì)胞的能力。20、一種用于治療骨關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞治療劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的成體干細(xì)胞作為活性成分，所述成體干細(xì)胞具有能分化成軟骨細(xì)胞的能力。21—種用于治療骨缺損的細(xì)胞治療劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的成體干細(xì)胞作為活性成分，所述成體干細(xì)胞具有能分化成成骨細(xì)胞的能力。22、一種用于形成乳房組織的細(xì)胞治療劑，其含有其含有權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的成體干細(xì)胞作為活性成分，所述成體干細(xì)胞具有能分化成脂肪細(xì)胞的能力。全文摘要本發(fā)明涉及來自人類脂肪組織的多能成體干細(xì)胞，具體涉及來自人類乳房脂肪組織的多能成體干細(xì)胞，其可通過形成球體以未分化狀態(tài)保持很長一段時(shí)間，并具有較高的增殖率，本發(fā)明還涉及用于分離和保持成體干細(xì)胞的方法，用于將成體干細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和胰島素釋放胰腺β細(xì)胞的方法。而且，本發(fā)明涉及用于治療骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥和糖尿病的細(xì)胞治療劑，以及用于形成乳房組織的細(xì)胞治療劑，其含有分化的細(xì)胞或者成體干細(xì)胞。雖然多能干細(xì)胞是成體干細(xì)胞，但它們具有分化成成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、星形細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及胰島素釋放胰腺β細(xì)胞的能力，并有效地治療骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、神經(jīng)疾病、糖尿病等疾病的細(xì)胞治療劑。而且干細(xì)胞在含有CORM-2的培養(yǎng)基中形成球體，由此可長時(shí)間保持在未分化狀態(tài)。而且，干細(xì)胞具有非常高的增殖率。因此，干細(xì)胞作為細(xì)胞治療劑是有用的。文檔編號A61K35/12GK101300343SQ200580051945公開日2008年11月5日申請日期2005年12月20日優(yōu)先權(quán)日2005年11月16日發(fā)明者姜慶順,樸貞蘭,羅正燦申請人:Rnl生物技術(shù)株式會社