專利名稱：G蛋白耦合受體激動(dòng)劑和拮抗劑及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及到G蛋白耦合受體(GPCRs)且尤其涉及GPCR激動(dòng)劑和拮抗劑、這種化合物及其藥物組合物的使用，例如用于治療、調(diào)節(jié)和/或預(yù)防與GPCRs有關(guān)的生理病況，例如在治療趨化因子受體起作用的病況中使用，其中趨化因子受體起作用的病況例如敗血病、關(guān)節(jié)炎、發(fā)炎和自身免疫系統(tǒng)疾病。
背景技術(shù)：
多種激素、神經(jīng)傳遞介質(zhì)和生理活性物質(zhì)能夠通過(guò)位于細(xì)胞膜上的特異性受體控制、調(diào)節(jié)或調(diào)整活體功能。這些受體中有許多能夠通過(guò)活化的鳥苷酸-結(jié)合蛋白(G蛋白)與受體耦合，調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號(hào)的傳遞。這種受體通常被認(rèn)為是G蛋白耦合受體(″GPCRs″)。特異性信號(hào)分子與GPCR結(jié)合，可以促使受體構(gòu)象變化，產(chǎn)生能夠結(jié)合并活化G蛋白的形式，從而引起細(xì)胞內(nèi)串連反應(yīng)，最終引起生物反應(yīng)。一般地，GPCRs與G蛋白相互作用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)第二信使的合成，其中細(xì)胞內(nèi)第二信使例如環(huán)化AMP、肌醇磷酸、二脂酰甘油和鈣離子。
趨化因子是白血球引誘劑，且對(duì)包括白細(xì)胞游出的器官發(fā)生免疫過(guò)程有貢獻(xiàn)。白血球的運(yùn)輸被很好地協(xié)調(diào)，下層控制機(jī)理的故障可能造成累積的先天免疫活化作用，例如全身性發(fā)炎反應(yīng)綜合癥或自身免疫疾病。通過(guò)GPCRs調(diào)節(jié)趨化因子誘導(dǎo)的信號(hào)，且根據(jù)定義，它們的標(biāo)志是白血球的趨化性。此外，趨化因子導(dǎo)致與白細(xì)胞游出無(wú)關(guān)的細(xì)胞反應(yīng)，例如細(xì)胞殘余物、病毒-宿主相互作用、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、器官發(fā)生和血管新生。
GPCRs在控制細(xì)胞代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)和游動(dòng)、粘著、發(fā)炎神經(jīng)元信號(hào)和血液凝固的信號(hào)處理方面起著重要作用。GPCR蛋白還可以用作多種信號(hào)分子的靶分子而起到重要的作用，其中所述信號(hào)分子能夠控制、調(diào)節(jié)、或調(diào)整活體功能。GPCRs涉及本領(lǐng)域內(nèi)已知的多種不適。新型GPCR調(diào)節(jié)器，例如，激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑和拮抗劑的發(fā)展也許可以作為治療劑應(yīng)用，用于治療與GPCR有關(guān)的不適，包括敗血病、關(guān)節(jié)炎、發(fā)炎和自身免疫疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于對(duì)叫做“pepducin”的修飾肽的發(fā)現(xiàn)，pepducin包括一種細(xì)胞穿透部分或膜限制部分，這部分能與衍生自GPCR第一胞內(nèi)線圈結(jié)構(gòu)的肽相附著。Pepducin可以被認(rèn)為是嵌合肽/多肽，且是G信號(hào)蛋白受體的激動(dòng)劑和/或拮抗劑。這種組合物對(duì)它們的同源受體顯示選擇性。
因此，本發(fā)明提供了一種pepducin組合物和一種嵌合多肽，這種嵌合多肽包括GPCR第一胞內(nèi)環(huán)(i1環(huán))的第一區(qū)域或其片段，和附著于第一區(qū)域的第二區(qū)域。第二區(qū)域是一種天然發(fā)生或非天然發(fā)生的細(xì)胞穿透部分和/或膜限制疏水部分。優(yōu)選地，第一區(qū)域不包括GPCR天然的胞外部分。本發(fā)明的pepducin理想地與衍生自第一區(qū)域的同源GPCR結(jié)合。
第一區(qū)域(G蛋白耦合受體(GPCR)的第一胞內(nèi)環(huán)(i1環(huán))或其片段)包括促黃體生成激素受體；促卵泡激素受體；促甲狀腺激素受體；降血鈣素受體；胰高血糖素受體；胰高血糖素樣肽1受體(GLP-I)；代謝型谷氨酸受體；甲狀旁腺激素受體；血管活性腸肽受體；分泌素受體；生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)受體；蛋白酶-活化受體(PARs)；縮膽囊肽受體；促血栓素受體；血小板活化因子受體；腎上腺素能受體；5-HT受體；趨化因子受體；神經(jīng)肽受體；鴉片樣物質(zhì)受體；甲狀旁腺激素(PTH)受體；或血管活性腸肽(VIP)受體的氨基酸序列。
例如，第一區(qū)域(G蛋白耦合受體(GPCR)的第一胞內(nèi)環(huán)(i1環(huán))或其片段)包含蛋白酶-活化受體(PAR)或趨化因子受體的氨基酸序列。蛋白酶-活化受體可能是，例如，PAR1，PAR2，PAR3，或PAR4。趨化因子受體可以分別是CC受體或CXC受體，例如CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8或CCR9；或CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6或CX3CR1。在另一實(shí)施方案中，第一區(qū)域(G蛋白耦合受體(GPCR)的第一胞內(nèi)環(huán)(i1環(huán))或其片段)可以得自例如，縮膽囊肽A和B(CCKA、CCKB)；生長(zhǎng)激素釋放的抑制因子-2(SSTR2)；黑色素細(xì)胞刺激激素-4(MC4R)；胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-IR)；P2Y12ADP受體；或得自″非典型的″趨化因子受體例如NK1、NK2、GRP/韓蛙皮素受體、FPR1、FPRL-I、C3aR或C5aR。在一種特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的pepducin包括PAR2、CXCR1、CXCR2、CXCR4和CCR5趨化因子受體。
第二區(qū)域(細(xì)胞穿透部分和/或膜限制疏水部分)附著于N-末端、C-末端、C-末端氨基酸和N-末端氨基酸之間的氨基酸、或第一區(qū)域的N-末端和C-末端。理想地細(xì)胞穿透部分和/或膜限制疏水部分是一種脂質(zhì)體，例如直鏈脂肪酸，例如，壬酰(C9)；辛酰基(C10)；十一酰(C11)；月桂酰(C12)；十三烷酰(C13)；十四酰(C14)；十五酰(C15)；十六酰(C16)；植烷酰(甲基取代的C16)；十七酰(C17)；硬脂酰(C18)；十九酰(C19)；arachidoyl(C20)；heniecosanoyl(C21)；behenoyl(C22)；trucisanoyl(C23)；和一種lignoceroyl(C24)部分。細(xì)胞穿透部分和/或膜限制疏水部分可能附著于具有，例如，酰胺鍵、巰基、胺、醇類、苯酚基或碳-碳鍵的嵌合多肽。特定的實(shí)施方案包括作為疏水性部分的十六酰或石膽酸(或其鹽)。其他細(xì)胞穿透部分和/或膜限制疏水部分包括膽固醇、磷脂、類固醇、神經(jīng)鞘氨醇、N-脂?；拾贝?、辛基-甘氨酸、2-環(huán)己基丙氨酸、安息香苯基丙氨酸、C1或C2?；鶊F(tuán)、或C3-C8脂肪酸。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括本發(fā)明pepducin組合物的藥物組合物和一種藥學(xué)可接受的載體，本發(fā)明還涉及在一個(gè)或一個(gè)以上容器中包括這種藥物組合物的試劑盒。
本發(fā)明包括例如，通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物主體給藥pepducin來(lái)治療、減少敗血病的嚴(yán)重性或預(yù)防敗血病的方法，其中pepducin包括G蛋白耦合受體(GPCR)的第一胞內(nèi)環(huán)(i1環(huán))或其片段的第一區(qū)域和附著于第一區(qū)域的第二區(qū)域。第二區(qū)域是一種自然或非自然發(fā)生的細(xì)胞穿透部分和/或膜限制疏水部分。所述主體已經(jīng)確診患有敗血病或有發(fā)展成為敗血病的危險(xiǎn)。
本發(fā)明的組合物還可以用于治療、減少發(fā)炎和/或血管新生的嚴(yán)重性或預(yù)防發(fā)炎和/或血管新生。通過(guò)給藥趨化因子-抑制的pepducin進(jìn)行治療或預(yù)防發(fā)炎和/或血管新生的方法，其中趨化因子-抑制的pepducin包括一種嵌合多肽，該嵌合多肽包括G蛋白耦合受體(GPCR)的第一胞內(nèi)環(huán)(i1環(huán))或其片段的第一區(qū)域和附著于第一區(qū)域的第二區(qū)域，其中第二區(qū)域是一種自然或非自然發(fā)生的細(xì)胞-穿透的、膜-限制疏水性部分。
該組合物還可以用于治療或減少癌癥的嚴(yán)重性。通過(guò)給藥pepducin，進(jìn)行治療或減少癌癥嚴(yán)重性的方法，其中pepducin包括一種嵌合多肽，這種嵌合多肽包括G蛋白耦合受體(GPCR)的第一胞內(nèi)環(huán)(i1環(huán))或其片段的第一區(qū)域和附著于第一區(qū)域的第二區(qū)域，第二區(qū)域是一種自然或非自然發(fā)生的細(xì)胞穿透部分和/或膜限制疏水部分。
該組合物還可以用于治療或減少血栓癥，例如，冠狀血栓癥、動(dòng)脈血栓癥和靜脈(例如深層靜脈或腸系膜靜脈)血栓癥的嚴(yán)重性。通過(guò)給藥pepducin，進(jìn)行治療或減少血栓癥嚴(yán)重性的方法，pepducin包括一種嵌合多肽，這種嵌合多肽包括G蛋白耦合受體(GPCR)的第一胞內(nèi)環(huán)(i1環(huán))或其片段的第一區(qū)域和附著于第一區(qū)域的第二區(qū)域，第二區(qū)域是一種自然或非自然發(fā)生的細(xì)胞穿透部分和/或膜限制疏水部分。
本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防發(fā)炎不適的方法，其中對(duì)需要的主體給藥pepducin，pepducin包括G蛋白耦合受體(GPCR)的第一胞內(nèi)環(huán)(i1環(huán))或其片段的第一區(qū)域和附著于第一區(qū)域的第二區(qū)域，第二區(qū)域是一種自然或非自然發(fā)生的細(xì)胞穿透、膜限制疏水性部分。適于治療的發(fā)炎不適可能包括慢性阻塞性肺病(COPD)、僵直性脊椎炎、頸關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、局部缺血再灌注創(chuàng)傷、內(nèi)臟局部缺血、青年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰骶關(guān)節(jié)炎骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性疾病、變形性關(guān)節(jié)炎、濕疹、牛皮癬、皮炎、葡萄膜炎和結(jié)膜炎、哮喘和支氣管炎、潰瘍、齒齦炎、克羅恩氏病、萎縮性胃炎、胃炎varialoforme、潰瘍性結(jié)腸炎、乳糜瀉、節(jié)段性回腸炎、消化性潰瘍生成、pyresis、膀胱疼痛和膀胱炎、中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的炎性神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、多發(fā)性硬化、炎癥性神經(jīng)病和AIDS神經(jīng)學(xué)上的并發(fā)癥、自身免疫炎癥、或外科創(chuàng)傷。在此描述的組合物能夠預(yù)防、逆轉(zhuǎn)、或減少敗血病和相關(guān)病變的嚴(yán)重性，其中相關(guān)病變例如彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)、纖維蛋白溶解作用、和/或全身性炎癥反應(yīng)(SIRS)。
本發(fā)明的pepducin組合物能夠有效活化或抑制大量GPCRs的活性。依照本發(fā)明，Pepducins包括作用于趨化因子CXC受體的肽，包括CXCR1，CXCR2，CXCR3，CXCR4，CXCR5，CXCR6和CX3CR1；作用于趨化因子CC受體的肽，包括CCR1，CCR2，CCR3，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR8和CCR9；作用于蛋白酶-活化受體(PARs)的肽，例如，PAR1，PAR2，PAR4；縮膽囊肽A和B受體(CCKA、1CCKB)，生長(zhǎng)激素釋放的抑制因子-2(SSTR2)受體，黑色素細(xì)胞刺激激素-4(MC4R)受體。胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-IR)，神經(jīng)鞘氨醇1-磷酸鹽(S1P)受體，例如，S1P1子型和S1P3，EDG受體，內(nèi)皮素(ET)受體，例如，ET-I子型、ET-2、ET-3、ET-，ETB，EDG受體，例如，EDG-I子型，EDG-2，EDG-3，EDG-4，EDG-5，EDG-6，和P2Y12ADP受體。用于″非典型性″趨化因子受體的pepducins，例如NK1、NK2、GRP/韓蛙皮素受體，F(xiàn)PR1，F(xiàn)PRL-I，C3aR和C5aR也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一種特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明Pepducins包括用于PAR2，CXCR1，CXCR2，CXCR4和CCR5趨化因子受體的肽。
在患有全身性炎癥、COPD和/或敗血病的情況下，優(yōu)選進(jìn)行全身給藥，例如靜脈內(nèi)給藥。做為選擇，組合物可以以例如粘性片、或膏劑、泡沫劑、軟膏劑(例如，用于減輕皮炎、牛皮癬或其他皮膚炎癥病況)的形式皮下給藥、口服給藥、經(jīng)鼻給藥(例如，用于治療哮喘)或局部給藥。


圖1是表示GPCR微地形學(xué)的圖表。i1環(huán)在此圖中進(jìn)行了解釋。
圖2是顯示包括橫跨膜側(cè)面部分的CXCR1和CXCR2 i1環(huán)序列的圖表，該圖表進(jìn)行了調(diào)整以說(shuō)明結(jié)構(gòu)中的相似性。
圖3顯示了依照本發(fā)明可能與pepducins作用的趨化因子受體，它們各自的配體和可能在其中發(fā)現(xiàn)受體的各自的細(xì)胞型。
圖4顯示了依照本發(fā)明可能與pepducins作用的其他趨化因子受體，它們各自的配體和可能在其中發(fā)現(xiàn)受體的各自的細(xì)胞型。
圖5是線性圖，顯示了在實(shí)施例1所描述的實(shí)驗(yàn)中，在CLP的時(shí)候動(dòng)物到pepducin治療劑的反應(yīng)。
圖6是線性圖，顯示了實(shí)施例1所描述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，圖中顯示了CLP之后8小時(shí)起始的pepducin治療劑作用結(jié)果。
圖7A-C描述了對(duì)白細(xì)胞對(duì)肺的滲透作用；和pepducin治療之后沉積在肺中的TNF-α產(chǎn)物和纖維蛋白，實(shí)施例3進(jìn)一步對(duì)此進(jìn)行了陳述。圖7A和圖7B是棒狀圖且圖7C是顯微鏡照片。
圖8A-D是顯示pepducin治療之后，患有敗血病的小鼠體內(nèi)出血時(shí)間縮短的棒狀圖。
圖9顯示了如何通過(guò)pepducin治療抑制嗜中性白細(xì)胞趨化反應(yīng)，實(shí)施例5對(duì)此進(jìn)行了更詳細(xì)的表示。
圖10顯示了如何通過(guò)體內(nèi)pepducin治療抑制白細(xì)胞趨化反應(yīng)，實(shí)施例6對(duì)此進(jìn)行了更詳細(xì)的表示。
圖11是一種線性圖，表示了如實(shí)施例7詳細(xì)描述的實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖12通過(guò)說(shuō)明人類嗜中性白細(xì)胞趨化反應(yīng)的抑制作用，顯示了本發(fā)明pepducins如何選擇性地減少炎癥，實(shí)施例8對(duì)此方面進(jìn)行了更為詳細(xì)的說(shuō)明。
圖13通過(guò)說(shuō)明人類單核細(xì)胞趨化反應(yīng)的抑制作用，顯示了本發(fā)明pepducins如何選擇性地減少炎癥，實(shí)施例9對(duì)此方面進(jìn)行了更為詳細(xì)的說(shuō)明。
圖14顯示了包括橫跨膜側(cè)面部分的CXCR4 i1環(huán)序列，此序列按照本發(fā)明，可能用于pepducins。
圖15顯示了包括橫跨膜側(cè)面部分的CCR1 i1環(huán)序列，此序列按照本發(fā)明，可能用于pepducins。
圖16顯示了包括橫跨膜側(cè)面部分的CCR2 i1環(huán)序列，此序列按照本發(fā)明，可能用于pepducins。
圖17顯示了包括橫跨膜側(cè)面部分的CCR4 i1環(huán)序列，此序列按照本發(fā)明，可能用于pepducins。
圖18顯示了包括橫跨膜側(cè)面部分的CCR5i1環(huán)序列，此序列按照本發(fā)明，可能用于pepducins。
圖19顯示了包括橫跨膜側(cè)面部分的PAR1 i1環(huán)序列，此序列按照本發(fā)明，可能用于pepducins。
圖20顯示了包括橫跨膜側(cè)面部分的EDG i1環(huán)序列，此序列按照本發(fā)明，可能用于pepducins。
圖21顯示了包括橫跨膜側(cè)面部分的NK1-R i1環(huán)序列，此序列按照本發(fā)明，可能用于pepducins。
圖22是一種棒狀圖，表示了如實(shí)施例10詳細(xì)描述的實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖23是表示了如實(shí)施例10詳細(xì)描述的實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖表。
圖24A是一種顯示HEK細(xì)胞的棒狀圖，其中HEK細(xì)胞用PAR1和/或PAR4瞬時(shí)感染，在300nM P4 pal-i1存在或不存在的條件下向0.5uM TFLLRN(SEQ ID NO.33)或500μMAYPGKF(SEQ ID NO.34)移動(dòng)24小時(shí)；圖24B是顯示人血小板的圖表，其中在加入160μM AYPGKF之前，用3μM P4pal-i1或緩沖液(未處理的)預(yù)培養(yǎng)人類血小板2分鐘；圖24C圖24B是顯示人血小板的圖表，其中在加入13μM SFLLRN之前，用3μMP4pal-i1或緩沖液(未處理的)預(yù)培養(yǎng)人類血小板2分鐘；圖24D是顯示血小板的圖表，其中在加入3nM thrombin(T)之前，用1μM RWJ-56110，5μM P4pal-i1，或1μM RWJ-56110加5μMP4pal-i1預(yù)培養(yǎng)人類血小板2分鐘。這些圖表中顯示的數(shù)據(jù)是實(shí)施例12所描述實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖25A圖示了比伐蘆定(bivalirudin)和P4pal-i1阻斷凝血酶依賴的凝聚作用；在加入20pM-20nM凝血酶之前，用緩沖液(未處理的)、比伐蘆定(bivalirudin)(200nM)，RWJ-56110(1μM)和/或PAR1-Ab(74μg/mL)預(yù)培養(yǎng)人類血小板2min；圖25B圖示了，在加入指明濃度的凝血酶之前，用200nM比伐蘆定(bivalirudin)加或減5μM P4pal-i1預(yù)培養(yǎng)血小板2min。這些圖表中顯示的數(shù)據(jù)是實(shí)施例13所描述實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖26是一種棒狀圖，闡明了比伐蘆定(bivalirudin)加能夠阻斷豚鼠體內(nèi)頸動(dòng)脈堵塞的P4pal-i1的結(jié)合。如實(shí)施例14所述，在用FeCl3傷害頸動(dòng)脈之前，用比伐蘆定(bivalirudin)、P4pal-i1和/或P1pal-7處理豚鼠(對(duì)于每個(gè)試驗(yàn)組n＝3-5)5min。相對(duì)于治療介質(zhì)的P值在底部指出。
圖27是闡明i1-環(huán)pepducins如何阻斷乳腺癌和卵巢癌癥細(xì)胞趨化性遷徙的圖表。從NIH3T3中制備條件培養(yǎng)基。使用48blindwell微趨化反應(yīng)室(Neuroprobe)進(jìn)行趨化反應(yīng)試驗(yàn)(20h)，該48 blindwell微趨化反應(yīng)室裝備有8 mm的小孔硝化纖維素過(guò)濾器，用于OVCAR-4人卵巢癌細(xì)胞和MDA-MB-231人乳腺癌癌細(xì)胞。用數(shù)據(jù)來(lái)表示趨化反應(yīng)指數(shù)，這一數(shù)據(jù)是向NIH3T3條件培養(yǎng)基遷徙的距離與向只有RPMI的價(jià)質(zhì)遷徙距離的比值。
具體實(shí)施例方式
定義為了方便起見，這里集中了在說(shuō)明書、實(shí)施例和所附權(quán)利要求中使用的某些術(shù)語(yǔ)。
″治療″，包括任意作用，例如減輕、減少、調(diào)節(jié)或除去，這些作用能夠改善病況、疾病、不適等等或其癥狀。
″GPCR片段″包括具有GPCR蛋白的一部分序列的肽，這部分序列小于GPCR天然氨基酸序列整體?！宸蛛x的GPCR片段″包括具有GPCR蛋白的一部分序列的肽，這部分序列小于GPCR天然氨基酸序列整體，且不包含天然的側(cè)面區(qū)域。分離的GPCR片段缺少一種或一種以上能夠立即側(cè)面連接參比片段天然分子的氨基酸。
″分離的胞內(nèi)GPCR片段″包括具有GPCR蛋白胞內(nèi)i1環(huán)氨基酸序列的肽，而不包含胞外環(huán)序列或側(cè)面結(jié)合胞內(nèi)i1的環(huán)橫跨膜螺旋形序列。″分離的胞外GPCR片段″包括具有GPCR蛋白胞外環(huán)氨基酸序列的肽，，而不包含胞內(nèi)環(huán)氨基酸或胞外環(huán)橫跨膜序列側(cè)面區(qū)域。
″連接″是指附著。例如，在pepducin中，穿透細(xì)胞部分或限制膜部分通過(guò)連接體，即，共價(jià)鍵相互附著。優(yōu)選地，連接體是一種不穩(wěn)定鍵，例如硫鍵或酯鍵。由于身體組織蓄積作用的降低，具有不穩(wěn)定連接體的Pepducin化合物與具有穩(wěn)定連接體的化合物相比，是有益的。對(duì)主體給藥后，在身體組織中減少的蓄積作用與主體內(nèi)不良副作用的拮抗劑減少相關(guān)。
″GPCR激動(dòng)劑″包括能夠活化GPCR來(lái)模仿對(duì)其受體有特異性的內(nèi)生信號(hào)分子作用的組合物?！錑PCR拮抗劑″包括能夠抑制GPCR活性的組合物。通過(guò)與信號(hào)分子效應(yīng)子，例如G-蛋白，結(jié)合的能力來(lái)調(diào)節(jié)GPCR活性。″活化的GPCR″是能夠與活化的G-蛋白相互作用的分子。抑制性受體具有減少的胞外配體結(jié)合能力和/或高效地與G-蛋白相互作用，并活化G-蛋白。
″細(xì)胞穿透部分″包括能夠調(diào)節(jié)物質(zhì)從細(xì)胞的細(xì)胞間隙傳遞到胞內(nèi)層的化合物或功能基團(tuán)。細(xì)胞穿透部分作往復(fù)運(yùn)動(dòng)，將被連接的物質(zhì)(例如，本發(fā)明的GPCR肽或片段)帶入細(xì)胞質(zhì)中或帶到細(xì)胞膜的細(xì)胞間隔。例如，細(xì)胞穿透部分是一種疏水部分。這種疏水部分是，例如，一種肽的混合序列或肽的同聚物，例如具有至少大約11個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的聚亮氨酸或聚精氨酸。這種物質(zhì)可以是肽，例如本發(fā)明的GPCR片段或擬肽。細(xì)胞穿透部分可能包括至少10個(gè)鄰近的氨基酸，例如GPCR橫跨膜螺旋區(qū)域的1-15個(gè)氨基酸。
″膜限制部分″包括能夠聯(lián)合或結(jié)合細(xì)胞膜的化合物或功能基團(tuán)。因此，膜限制部分使能夠附著膜限制部分的物質(zhì)(即，本發(fā)明的GPCR片段或擬肽)充分接近靶細(xì)胞的細(xì)胞膜。細(xì)胞膜可以是真核細(xì)胞膜或原核細(xì)胞膜。理想的膜限制部分是一種疏水部分。疏水部分可以包括一種肽的混合序列或肽的同聚物例如長(zhǎng)度小于10個(gè)氨基酸的聚亮氨酸或聚精氨酸。膜限制部分可以包括GPCR橫跨膜螺旋區(qū)域的至少一個(gè)到七個(gè)鄰近的氨基酸。優(yōu)選地，膜限制部分是GPCR橫跨膜區(qū)域的至少10個(gè)鄰近的氨基酸(但小于16個(gè)氨基酸)；更優(yōu)選地，膜限制部分是GPCR橫跨膜區(qū)域的至少15個(gè)鄰近的氨基酸。膜限制部分還包括膽固醇、磷脂、類固醇、神經(jīng)鞘氨醇、神經(jīng)酰胺、辛基-甘氨酸、2-環(huán)己基丙氨酸、或安息香苯基丙氨酸。其他膜限制部分包括C1或C2酰基基團(tuán)，或C3-C8脂肪酸部分例如丙酰基(C3)；丁酰基(C4)；正戊酰基(C5)；己?；?C6)；庚?；?C7)；和辛酰(C8)。在pepducin中，膜限制部分可能附著于GPCR片段的C-末端氨基酸、N-末端氨基酸或N-末端和C-末端氨基酸之間的氨基酸。
″藥學(xué)或藥理學(xué)可接受的″包括對(duì)動(dòng)物或人酌情給藥時(shí)不發(fā)生有害的、過(guò)敏的或其他不良反應(yīng)的分子和組合物。藥學(xué)可接受的載體包括任意和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。在本領(lǐng)域中，對(duì)這種介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)是眾所周知的。除了某些常見的與活性成分不相容的介質(zhì)或試劑之外，這些介質(zhì)或試劑在治療劑組合物中的應(yīng)用是可預(yù)見的。輔助的活性成分還可以被引入組合物。
″小分子″包括分子量小于大約5kD且最優(yōu)選小于大約4kD的組合物。小分子可以是核酸、肽、多肽、擬肽、碳水化合物、脂質(zhì)體或其他有機(jī)或無(wú)機(jī)分子?；瘜W(xué)和/或生物混合物文庫(kù)，例如真菌、細(xì)菌、或藻類提取物在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，可以用本發(fā)明任意實(shí)驗(yàn)篩選。
″靶分子″包括能夠結(jié)合GPCR蛋白或與GPCR蛋白天然相互作用的分子，例如，在細(xì)胞表面上能夠表達(dá)與GPCR相互作用的蛋白的分子；在第二細(xì)胞表面上的分子；在胞外環(huán)境中的分子；與細(xì)胞膜內(nèi)表面有關(guān)的分子；或細(xì)胞質(zhì)分子。GPCR靶分子可以是一種非GPCR分子或本發(fā)明的GPCR肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，GPCR靶分子是能夠促進(jìn)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的成分，所述胞外信號(hào)例如化合物與膜結(jié)合的GPCR結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞所產(chǎn)生的信號(hào)。靶分子可以是具有催化活性的第二細(xì)胞間蛋白或能夠促進(jìn)下游信號(hào)分子與GPCR聯(lián)合的蛋白。
″結(jié)合治療″(或″聯(lián)合治療″)包括給藥本發(fā)明pepducin和至少一種第二試劑作為特定治療方式的一部分，從而由這些治療劑之間的相互作用提供有益影響。這種結(jié)合有益的作用包括，但不局限于，由于治療劑結(jié)合產(chǎn)生的藥代動(dòng)力學(xué)或藥效的相互作用。一般地，在給定的時(shí)間段內(nèi)(根據(jù)挑選的結(jié)合物不同，通常為幾分鐘、幾小時(shí)、幾天或幾周)給藥這種結(jié)合治療劑?！褰Y(jié)合治療″可能，但一般不包括給藥兩個(gè)或兩個(gè)以上的治療劑作為分開的單獨(dú)治療方式，這種單獨(dú)治療方式偶爾且任意產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)合?！褰Y(jié)合治療″包含以一種連續(xù)的方式給藥這些治療劑，那就是說(shuō)，各個(gè)治療劑在不同的時(shí)間給藥，″結(jié)合治療″還包含在基本上相同的時(shí)間給藥這些治療劑，或至少二個(gè)這種治療劑。例如，通過(guò)向主體給藥含有固定比率的各個(gè)治療劑的單一膠囊劑，或給藥多個(gè)分別含有單一治療劑的膠囊劑，來(lái)完成基本上同時(shí)給藥。任何適當(dāng)?shù)慕o藥途徑都可以影響各個(gè)治療劑的連續(xù)給藥或基本上同時(shí)給藥，其中適當(dāng)?shù)慕o藥途徑包括但不限于，口服途徑、靜脈給藥途徑、肌肉注射途徑和直接通過(guò)粘膜組織吸收。治療劑可以通過(guò)相同途徑或不同途徑給藥。例如，選擇結(jié)合物的第一治療劑可以通過(guò)靜脈注射給藥，而結(jié)合物的另一治療劑可以口服給藥。做為選擇，例如所有的治療劑可以口服給藥或所有的治療劑可以靜脈注射給藥。并不嚴(yán)格限制治療劑的給藥順序。″結(jié)合治療″還可以包含如上所述的給藥治療劑與其他生物活性成分和非藥物治療法(例如，外科手術(shù)或照射處理)的結(jié)合。在進(jìn)一步包括非藥物治療的結(jié)合治療中，非藥物治療可以在任何合適的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，直到與治療劑結(jié)合發(fā)生相互作用產(chǎn)生有益效果，并完成非藥物治療。例如，在適當(dāng)?shù)那闆r下，非藥物治療可以短暫的從治療劑給藥過(guò)程中除去幾天乃至幾周，也可以實(shí)現(xiàn)有益效果。
″同源氨基酸序列″是指在本發(fā)明pepducin中的一種氨基酸序列，這種氨基酸序列與參比氨基酸序列的區(qū)別僅在于一種或一種以上(例如，1、2、3、4或5種)保守性氨基酸取代、缺失、或在不對(duì)多肽活性產(chǎn)生不利影響的位點(diǎn)上的添加。優(yōu)選地，這種序列與參比氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、或95％的同源性。
同源氨基酸序列包括與參比氨基酸序列同源或基本上同源的肽序列?！寤旧贤吹陌被嵝蛄小迨侵概c參比氨基酸序列有至少90％、優(yōu)選95％、更優(yōu)選97％、最優(yōu)選99％的同源性的序列，這種序列如果與參比序列有所不同的話，所述不同也僅僅是通過(guò)大多數(shù)保守性氨基酸取代造成的。
保守性氨基酸取代一般包括在同類氨基酸之間的取代。這種種類包括，例如，(a)具有不帶電的極性側(cè)鏈的氨基酸，例如天門冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、和酪氨酸；(b)具有堿性側(cè)鏈的氨基酸，例如賴氨酸、精氨酸、和組氨酸；(c)具有酸性側(cè)鏈的氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨酸；和(d)具有非極性側(cè)鏈的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸。
同源性一般使用序列分析軟件(例如，遺傳計(jì)算機(jī)集團(tuán)的序列分析程序包，威斯康辛州立大學(xué)生物技術(shù)中心，1710 UniversityAvenue，Madison，WI 53705)。調(diào)整相似氨基酸序列直到獲得最大的同源程度(即，同源性)。為此，必須在序列中人工引入缺口。一旦建立了最優(yōu)序列，通過(guò)記錄兩個(gè)氨基酸序列所有的吻合位點(diǎn)，相對(duì)于位點(diǎn)的總數(shù)，就可以獲得同源程度(即，同源性)。
相似因素包括相似尺寸、相似形狀和相似電荷。確定氨基酸相似性的一個(gè)特別優(yōu)選的方法是Dayhoff et al，5 ATLAS OFPROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE 345-352(1978&Suppl.)描述的PAM25O矩陣，該文獻(xiàn)通過(guò)引證在此并入本文。首先計(jì)算相似值，作為調(diào)整好的成對(duì)氨基酸相似性數(shù)值的總和。為了達(dá)到同源性和同一性的目的，在此忽視序列中的插入和缺失。因此，在計(jì)算過(guò)程中不使用間隔扣分。用相似值除以多個(gè)候選化合物和參比序列的幾何平均數(shù)，得到標(biāo)準(zhǔn)化的原始數(shù)值。
優(yōu)選地，同源序列是與參比氨基酸序列具有至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同源性的序列。具有與說(shuō)明書，例如表3所表示的序列之一相同的序列的多肽包括自然產(chǎn)生的等位變異體，和突變體和變異體或其他任何非自然產(chǎn)生的具有類似功能的變異體，例如，擬肽。
本申請(qǐng)相關(guān)于共懸待審的名為“G蛋白耦合受體激動(dòng)劑和拮抗劑和用來(lái)活化并抑制G蛋白耦合受體的方法”的美國(guó)專利申請(qǐng)第10/251,703號(hào)，該專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引證在此并入本文。
本發(fā)明基于對(duì)叫做pepducins的修飾肽的發(fā)現(xiàn)，pepducins包括細(xì)胞穿透部分或膜限制部分，所述細(xì)胞穿透部分或膜限制部分附著于衍生自i1環(huán)的肽上。Pepducins可以是嵌合肽/多肽、和是G蛋白信號(hào)受體的激動(dòng)劑和/或拮抗劑并對(duì)它們的同族受體顯示選擇性。
本發(fā)明的pepducins包括一種衍生自GPCR第一胞內(nèi)環(huán)(i1)的GPCR部分或其片段，和一種細(xì)胞穿透部分或膜限制部分，這種細(xì)胞穿透部分或膜限制部分能夠分離結(jié)合物使其進(jìn)入靶細(xì)胞的雙分子脂膜并與雙分子脂膜交叉；本發(fā)明的pepducins還包括用于治療GPCR調(diào)節(jié)的病況的方法。細(xì)胞穿透部分是，例如，一種GPCR片段本身的疏水性區(qū)域。細(xì)胞穿透部分或膜限制部分將結(jié)合物固定于雙分子脂膜中(或固定到細(xì)胞表面)，在胞內(nèi)受體附近，例如，在G蛋白受體接觸面，提高結(jié)合物的有效摩爾濃度。pepducin的外源GPCR部分干擾G蛋白受體的相互作用并引起信號(hào)活化作用和/或抑制作用(即，競(jìng)爭(zhēng)活性或拮抗活性)。
Pepducins作為受體調(diào)節(jié)劑，以受體的胞內(nèi)表面為目標(biāo)。例如，本發(fā)明的pepducins包括PAR1-和PAR4-為基礎(chǔ)的拮抗劑，在體內(nèi)條件下用于抗止血?jiǎng)┖涂寡ㄐ纬?。因?yàn)槟蜃邮茄“遄钣行У幕罨瘎x擇PAR1(Vu et al.Cell 64，1057(1991))和PAR4(Xu et al.Proc.Nαtl.Acαd.ScI(USA)95，6642(1998)；Covic et al.Biochemistry 39，5458(2000)；和Covic et al.Thromb.Hαemost.87，722(2002))作為靶分子。這二個(gè)受體的拮抗劑可以有效預(yù)防急性冠心病的血栓形成性并發(fā)癥和增生性并發(fā)癥，包括敗血病。
當(dāng)持續(xù)缺血之后修復(fù)流血傷口，會(huì)發(fā)生缺血再灌注損傷。這是例如心肌梗塞、中風(fēng)、內(nèi)臟缺血和凡肺分流術(shù)情況中常見的發(fā)病和致死原因；而對(duì)于這些情況，往往沒有專門的療法。靜脈給藥本發(fā)明的pepducins從而針對(duì)心肌試驗(yàn)性再灌注傷害提供有效的保護(hù)措施。
通過(guò)對(duì)心肌限制供應(yīng)動(dòng)脈血引發(fā)心肌梗塞，心肌梗塞是心力衰竭和死亡的主要原因。因此緊急恢復(fù)正常循環(huán)對(duì)預(yù)防心臟組織供氧不足產(chǎn)生的不可逆損害是十分重要的。用特效藥物治療心肌梗塞(MI)病人之后，正常的血流量可以自然地重新建立或人工地重新建立。然而，在很多情況下，血管梗塞面積的再灌注引發(fā)炎癥反應(yīng)，加速對(duì)心臟細(xì)胞的損害且從而削弱修復(fù)循環(huán)的積極效果。據(jù)證實(shí)，再灌注組織低含氧量區(qū)域吸收的白血球明顯促進(jìn)了這些病態(tài)炎癥反應(yīng)。
器官移植目前十分常見，2001年，在美國(guó)進(jìn)行了超過(guò)22,000個(gè)器官移植手術(shù)。最常見的被移植器官是腎臟、肝臟和心臟。目前，大量進(jìn)行的器官移植手術(shù)部分由于免疫調(diào)節(jié)劑的控制急性排異能力。缺血再灌注損傷引起的延遲移植功能和宿主抗移植作用是移植手術(shù)后急性排異反應(yīng)的基本機(jī)制。免疫抑制劑的使用能夠成功的處理急性排異反應(yīng)，即使免疫抑制藥物的劑量降低到非常低的水平，也能使同種異體移植物能夠普遍的存活較長(zhǎng)的時(shí)間。
然而，免疫抑制劑抑制所有的免疫反應(yīng)，在移植受體中產(chǎn)生成為導(dǎo)致死亡主要原因的不可抵抗的傳染病。免疫抑制劑還與劇毒性有關(guān)。對(duì)移植病人使用藥物產(chǎn)生的最主要的包括腎中毒、神經(jīng)中毒、移植后新發(fā)病的糖尿病、高脂血癥、和高血壓。這些副作用的存在，部分的由于目前使用免疫抑制劑靶分子的普遍存在的表達(dá)。治療策略包括的本發(fā)明的pepducins能夠特異性針對(duì)缺血再灌注傷害及隨后的單核細(xì)胞滲入，其中單核細(xì)胞滲入是急性排斥反應(yīng)的根本原因。
嚴(yán)重的敗血病是急性入院的主要原因，且經(jīng)常使具有其他疾病的病人的臨床治療過(guò)程復(fù)雜化。敗血病起病時(shí)，細(xì)菌和細(xì)菌產(chǎn)物的存在，例如內(nèi)毒素的存在，能夠刺激免疫防御機(jī)制。未能除去的侵入性病原體起始極度活躍的炎癥反應(yīng)，術(shù)語(yǔ)叫做全身性炎癥反應(yīng)綜合癥(SIRS)，全身性炎癥反應(yīng)綜合癥是通過(guò)細(xì)胞因子和趨化因子調(diào)節(jié)的。在炎癥中，趨化因子被視為治療劑靶分子。CXCR1和CXCR2是重要的趨化因子受體，負(fù)責(zé)嗜中性白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其他細(xì)胞的活化作用。由于其單獨(dú)的IL-8受體、CXCR2遺傳性缺失，小鼠顯示IL-8信號(hào)缺陷，保護(hù)小鼠避免發(fā)展為敗血病。
在人體內(nèi)，暴露于高全身性IL-8水平條件下能夠引起內(nèi)皮功能紊亂且損失內(nèi)皮正常的抗凝血?jiǎng)顟B(tài)。在30-50％的敗血病病人中存在凝血作用擾亂，并明顯的彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)的發(fā)展是一種不祥的前兆。與CXCR1/2的作用相反，CXCR4直接除去衰老的嗜中性白細(xì)胞且在骨髓中維持不成熟的白血球。CXCR4還在淋巴細(xì)胞和癌細(xì)胞的自動(dòng)引導(dǎo)裝置中起到突出的作用，但CXCR4的功能和它的配體SDF-1α在急性炎癥中的作用仍然是未知的。
除了給藥抗生素之外，敗血病和膿毒性休克的治療基本上局限于支援性方法。目前針對(duì)趨化因子受體非特異性治療的介入對(duì)治療敗血病十分有效，盡管針對(duì)CXCR1/2的小分子抑制劑可以防止再灌注傷害和肺損傷。本發(fā)明的Pepducins可用于中斷已建立的全身性炎癥和血管損傷，同時(shí)在沒有宿主防御干涉的情況下預(yù)防階式凝血作用的活化。
人PARs包括PAR1(Genbank登記號(hào)碼AFO 19616)；PAR2(Genbank登記號(hào)碼XM_003671)；PAR3(Genbank登錄號(hào)NM_004101)；和PAR4(Genbank登記號(hào)碼NM_003950.1)，其序列通過(guò)引證在此并入本文。
這里描述了pepducins活化并抑制G蛋白信號(hào)受體的二位點(diǎn)機(jī)理，但發(fā)明人的發(fā)明并不僅限于這種機(jī)理或以此機(jī)理為基礎(chǔ)的理論。此機(jī)理調(diào)節(jié)激動(dòng)劑的雙相活化作用和抑制作用，和拮抗劑的抑制作用。Pepducins憑借其疏水性限制，迅速地傳感原生質(zhì)膜并在膜周型接觸面達(dá)到非常有效的摩爾濃度。pepducin激動(dòng)劑首先在GPCR胞內(nèi)平面占領(lǐng)一種高親合性位點(diǎn)。結(jié)合激動(dòng)劑穩(wěn)定或者導(dǎo)致受體活化，從而刺激相關(guān)的G蛋白。在第一位點(diǎn)飽和之后，高濃度的pepducin開始占領(lǐng)第二位點(diǎn)，第二位點(diǎn)是一種低親合性的抑制位點(diǎn)，能夠通過(guò)模仿基態(tài)GPCR(例如，i1環(huán)受體)與G蛋白相互作用妨礙信號(hào)以主要方式傳遞。pepducin拮抗劑的抑制作用與激動(dòng)劑的抑制狀態(tài)向符合，因此拮抗劑也可以結(jié)合此低親合性位點(diǎn)。受體通過(guò)pepducins的外源活化作用或抑制作用反映出一種潛在的二聚作用方式，通過(guò)這種方式一個(gè)受體向其相鄰受體貢獻(xiàn)出它的胞內(nèi)環(huán)。能夠產(chǎn)生清晰的信號(hào)傳輸性質(zhì)(Milligan，Science 288，65-67(2000))的受體二聚物的實(shí)施例包括細(xì)胞因子/GPCRs，例如EPO受體(Guillard et al，J.Biol.Chem.(2001)276，2007-2013)，然而，受體交叉調(diào)節(jié)的機(jī)理是未知的。
天然存在的GPCR是一種細(xì)胞表面分子能夠至少一次地穿過(guò)細(xì)胞膜。例如，許多天然存在的GPCRs穿過(guò)細(xì)胞膜七次并且包含若干胞內(nèi)區(qū)域。本發(fā)明分離的GPCR片段包括GPCR第一胞內(nèi)環(huán)區(qū)域。胞內(nèi)部分選自細(xì)胞因子GPCR的G蛋白耦合受體橫跨膜區(qū)域的第一胞內(nèi)環(huán)區(qū)域，或其片段，或多肽GPCR，例如GPIbAAZIX受體或者膠原蛋白受體的第一胞內(nèi)環(huán)區(qū)域。
本發(fā)明還包括可溶性pepducins，其中第二區(qū)域(細(xì)胞穿透部分或膜限制部分)任選地包括一種來(lái)自靠近胞外或胞內(nèi)片段橫跨膜區(qū)域的一種天然存在的鄰近氨基酸。例如，構(gòu)建物可能包含至少3個(gè)，但小于16個(gè)GPCR橫跨膜螺旋區(qū)域的鄰近氨基酸。此橫跨膜區(qū)域不是CXCR4的橫跨膜區(qū)域1-7、CCKA受體的橫跨膜區(qū)域1-7、或CCR5受體的橫跨膜2。在一種實(shí)施方案中，第二區(qū)域包括1-15個(gè)接近胞外或胞內(nèi)片段的天然存在的橫跨膜螺旋區(qū)域的鄰近氨基酸。
除了以肽為基礎(chǔ)的pepducins，本發(fā)明包括組合物，在組合物中GPCR片段包含一種擬肽。例如，本發(fā)明包括pepducin化合物，其中一種或一種以上肽鍵被擇一型共價(jià)鍵取代，該擇一型共價(jià)鍵不易受peptidases(一種″模仿肽″或″擬肽″)分裂。在對(duì)主體注射之后發(fā)生肽蛋白水解降解的地方，用一種不可裂解的肽模擬物置換格外靈敏的肽鍵，能夠致使所得肽更加穩(wěn)定且因此作為治療劑更為有效。這種模擬物和將它們并入肽中的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。同樣，(例如，用D-氨基酸)置換L-氨基酸殘基能夠減少肽對(duì)蛋白水解作用的敏感性。
本發(fā)明的Pepducin化合物可以作為逆反異構(gòu)體合成，逆反異構(gòu)體包括肽的逆反序列和手性肽。參見，例如Jameson et al.Nature368744-746(1994)and Brady et al.Nature 368692-693(1994).D-對(duì)映體和逆反合成結(jié)合的最后結(jié)果是每個(gè)酰胺鍵中的羰基和氨基位點(diǎn)進(jìn)行了交換，而每個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)的α碳原子被保存。例如，如果模型肽是一種由具有序列ABC的L-氨基酸形成肽，則逆反異構(gòu)體肽類似物由具有序列CBA的D-氨基酸形成。合成D-氨基酸序列從而形成逆反異構(gòu)體肽的步驟在本領(lǐng)域中是已知的。
氨基末端封閉基團(tuán)例如t-苯甲氧基碳酰、乙?；?、theyl、丁二酰、甲氧基琥珀酰胺、環(huán)庚基、己二酰、azelayl、丹酰、苯甲氧基羰基、芴基甲氧基碳酰，甲氧基azelayl，甲氧基己二酰，甲氧基環(huán)庚基，和2，4-二硝基苯也是有效的。阻斷肽的帶電荷的氨基和羧基末端能夠提高肽穿過(guò)疏水性細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞的能力，從而帶來(lái)額外利益。
分離的GPCR片段可能來(lái)源于A類GPCR或B類GPCR。分離的GPCR片段是得自任何已知的或未知的GPCR的片段，已知的或未知的GPCR的片段包括但不限于蛋白酶活化受體(PARs，例如，一種凝血酶受體)、促黃體生成激素受體、促卵泡激素受體、促甲狀腺激素受體、降血鈣素受體、胰高血糖素受體、胰高血糖素樣肽1受體(GLP-I)、代謝型谷氨酸受體、甲狀旁腺激素受體、血管活性腸肽(VIP)受體、分泌素受體、生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)受體、縮膽囊肽受體、生長(zhǎng)激素釋放的抑制因子受體、黑色素細(xì)胞刺激激素受體、核苷酸(例如，ADP受體)、腺苷酸受體、促血栓素受體、血小板活化因子受體、腎上腺素能受體、5-羥基色胺(5-HT)受體、趨化因子受體(例如，CXCR4、CCR5)、神經(jīng)肽受體、鴉片樣物質(zhì)受體、促紅細(xì)胞生成素受體、和甲狀旁腺激素(PTH)受體。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，GPCR是一種蛋白酶活化受體、一種肽受體、或一種核苷酸受體。在特殊的實(shí)施方案中，GPCR是PAR1、PAR2、PAR3、或PAR4受體。在其他的實(shí)施方案中，GPCR是一種胰高血糖素樣受體、一種核苷酸受體，例如P2Y-12 ADP受體、一種MC4肥胖受體、一種CXCR受體例如、CXCR4)或CCR5趨化因子受體、CCKA、或CCKB.
分離的GPCR片段可能包括一種具有小于50個(gè)來(lái)自GPCR5的鄰近氨基酸的GPCR片段，但不包含GPCR的天然胞外配體。例如，該GPCR片段包括具有3到30(包括)個(gè)GPCR的鄰近氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該GPCR片段包括具有7到24(包括)個(gè)GPCR的鄰近氨基酸。例如，片段包括7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，或24個(gè)GPCR的鄰近氨基酸。
任選地，GPCR的氨基酸序列不同于天然存在的氨基酸序列。例如，給定區(qū)域的個(gè)體殘基，例如橫跨膜螺旋區(qū)域、胞外區(qū)域、或胞內(nèi)環(huán)區(qū)域，是變化的或用修飾氨基酸取代，從而改進(jìn)pepducin的活性。優(yōu)選地，這種GPCR類似物的氨基酸序列的不同之處僅僅在于保守性氨基酸取代，那就是說(shuō)，用同一種類的一個(gè)氨基酸取代另一個(gè)氨基酸，或在于非保存性置換、缺失、或在不損壞蛋白功能的位點(diǎn)的插入。
本發(fā)明pepducins的GPCR部分起源于人或其他生物體(例如，豚鼠、小鼠、小鼠、雞、兔、豬、羊、牛、猴子、病毒、真菌、昆蟲、植物、細(xì)菌，等等)的任何細(xì)胞，例如，脾細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、胰腺的β-細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、系膜細(xì)胞、Langerhans′細(xì)胞、表皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞(例如，巨噬細(xì)胞，T細(xì)胞，B細(xì)胞，天然的殺傷細(xì)胞，肥大細(xì)胞，嗜中性白細(xì)胞，嗜堿細(xì)胞，嗜酸性白血球，單核細(xì)胞，等等)、巨核細(xì)胞、滑膜細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞，乳腺細(xì)胞，肝細(xì)胞，或間質(zhì)細(xì)胞或前體細(xì)胞，干細(xì)胞或癌細(xì)胞等等；和任何包含這些細(xì)胞的組織，例如，腦，腦的各個(gè)部分(例如，嗅球，扁桃，大腦基底神經(jīng)節(jié)，塔蘭氏筋膜，丘腦，下丘腦，substhanlamicnucleus，大腦皮層，腦髓，小腦枕極，額葉，殼膜，尾狀核，胼胝體，黑質(zhì))，脊髓，垂體，胃，胰腺，腎，肝，生殖器官，甲狀腺，膽囊，骨髓，腎上腺，皮膚，肌肉，肺，消化道，血管，心臟，胸腺，脾臟，下頜下腺，外周血液，外周血白血球，腸道，前列腺，睪丸，睪丸，卵巢，胎盤，子宮，骨，關(guān)節(jié)，小腸，大腸，骨骼肌等等，尤其是，腦和腦的各個(gè)部分。
細(xì)胞穿透部分包括脂質(zhì)體、膽固醇、磷脂、類固醇、神經(jīng)鞘氨醇、神經(jīng)酰胺、或脂肪酸部分。脂肪酸部分可以是，例如，包含至少八個(gè)碳原子的任何脂肪酸。例如，脂肪酸可以是，例如，壬酰(C9)；辛?；?C10)；十一酰(C11)；月桂酰(C12)；十三烷酰(C^)；十四酰(C14)；十五酰(C15；十六酰(C16)；植烷酰(甲基取代的C16)；十七酰(C17)；硬脂酰(C18)；十九酰(C19)；arachidoyl(C20)；heniecosanoyl(C21)；behenoyl(C22)；trucisanoyl(C23)；或lignoceroyl(C24)部分。細(xì)胞穿透部分細(xì)胞穿透部分包括辛基-甘氨酸、2-環(huán)己基丙氨酸、或安息香苯基丙氨酸的多聚體(例如，包含一個(gè)以上單元的組合物)。細(xì)胞穿透部分包含一種未被取代的或鹵素-取代(例如，氯代)的二苯聯(lián)苯部分。與未取代的二苯聯(lián)苯相比，取代的二苯聯(lián)苯與減少身體組織蓄積作用有關(guān)。對(duì)主體給藥之后，減少的身體組織蓄積作用與主體體內(nèi)減少的不良副作用有關(guān)。
優(yōu)選地，細(xì)胞穿透部分是天然存在的或非天然存在的十六酰部分。具有長(zhǎng)于C15脂肪酸，例如十六酰的Pepducins部分在體內(nèi)具有驚人地存活時(shí)間，且適合于皮下注射給藥。在另一實(shí)施方案中，具有短于C15，例如，十四烷基的pepducins可用于短期應(yīng)用，例如，這里使用的外科應(yīng)用和靜脈注射給藥。
細(xì)胞穿透部分或膜限制部分可能附著于GPCR片段的C-末端氨基酸、N-末端氨基酸、或N-末端和C-末端氨基酸之間的氨基酸。
本發(fā)明還包括一種組合物，這種組合物包括一種具有SEQ IDNOs1-14的氨基酸序列或其部分序列的多肽，這種組合物與細(xì)胞穿透部分或膜限制部分相連。表1列出了尤其適合本發(fā)明的pepducins。
表1

該組合物用來(lái)治療、預(yù)防、或改善(減少嚴(yán)重性)一種或一種以上疾病或病況的癥狀，所述疾病或病況的特征是異常的GPCR活性。這種疾病和病況包括血栓癥、心臟病發(fā)作、中風(fēng)、大量出血、哮喘、炎癥、疼痛、炎癥性疼痛、內(nèi)臟疼痛、神經(jīng)原疼痛、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、HIV傳染病、焦慮癥、憂郁癥、肺動(dòng)脈瓣閉鎖不全、和各種型式的癌癥。通過(guò)將病理上過(guò)表達(dá)GPCR的細(xì)胞與pepducin GPCR拮抗劑相接觸，進(jìn)行這種方法。例如，方法包括對(duì)需要治療或預(yù)防得主體，例如病人給藥足夠量的pepducin，從而減少主體病變的嚴(yán)重性。本發(fā)明還包括藥物組合物，該藥物組合物包含任意pepducin組合物和一種藥學(xué)可接受載體。本發(fā)明還包括包含藥物組合物的試劑盒。本發(fā)明進(jìn)一步包括通過(guò)給藥本發(fā)明任意多肽來(lái)治療哺乳動(dòng)物病理狀態(tài)的方法。
構(gòu)建物還可以用于抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。乳腺癌細(xì)胞入侵是一種復(fù)雜的過(guò)程，其中，發(fā)生細(xì)胞轉(zhuǎn)移、組織基礎(chǔ)膜蛋白水解修飾和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)造成的降解作用。被MMP1活化的PAR1在乳腺癌細(xì)胞入侵和腫瘤發(fā)生過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用(Boire et al.Cell，120(3)，303(2005))。PAR1 i1環(huán)pepducin拮抗劑，例如P1i1pal1 1，被單獨(dú)用于癌癥治療，或在給藥例如多烯紫杉醇化合物，例如Taxotere時(shí)，作為輔助試劑用于癌癥治療。優(yōu)選地，達(dá)到一種增效抗癌作用。通過(guò)使用人轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231來(lái)說(shuō)明PAR1的胞內(nèi)抑制作用。使用MTT實(shí)驗(yàn)和異種移植鼠模型來(lái)分析Pepducin的單獨(dú)功效及與Taxotere聯(lián)合治療的功效。在分別或同時(shí)給藥組合物之后確定pepducin P1i1pal1 1和Taxotere的IC50。使用等效線圖解技術(shù)和組合系數(shù)(CI)方法來(lái)定量協(xié)同作用，使用異種移植物數(shù)據(jù)來(lái)確定用P1i1pal1 1和Taxotere治療的小鼠與只用Taxotere治療的小鼠相比，其體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)速率是否受到抑制?；衔锝档土四[瘤發(fā)展各個(gè)階段，例如，在腫瘤發(fā)展初期和腫瘤發(fā)展末期的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
例如，參見圖27，基于CXCR1/2(x1/2pal-i1)和CXCR4(x4pal-i1)的趨化因子受體I1-環(huán)pepducins阻礙乳腺癌和卵巢癌趨藥性轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明確定的pepducins是血小板活化抑制劑。該抑制劑包含一種蛋白酶活化受體的分離片斷和與GPCR多肽連接的細(xì)胞滲透部分。在一些實(shí)施方案中，蛋白酶活化受體是凝血酶受體、胰島素受體、凝結(jié)因子Xa受體、活化蛋白C受體，類胰蛋白酶受體，或血纖維蛋白溶血酶受體。凝血酶受體優(yōu)選是PAR-4或PAR-I。
本發(fā)明還包括通過(guò)將血小板與組合物接觸抑制血小板凝聚的方法，其中組合物是上面所述的與細(xì)胞滲透部分連接的蛋白酶活化受體的分離片斷的組合物。例如，蛋白酶活化受體是凝血酶受體，例如，PAR-I受體或PAR-4受體。本發(fā)明還包括在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物給藥本發(fā)明組合物來(lái)抑制血栓形成，其中本發(fā)明組合物包括與細(xì)胞滲透部分連接的蛋白酶活化受體的分離片斷。
本發(fā)明的方法通過(guò)將本發(fā)明的抑制組合物注入血管腔進(jìn)行，例如，注入頸靜脈血管、外周血管或血管周部分。外周血管可以是例如，位于肢體末端的血管，例如手、肘關(guān)節(jié)或腳。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物被注入哺乳動(dòng)物的肺部，例如，作為一種氣霧劑。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物注射給藥。在不同的實(shí)施方案中，注射劑可以皮下注入哺乳動(dòng)物的腹膜腔內(nèi)。本發(fā)明組合物還可以透皮給藥。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物還可以進(jìn)行陰道給藥和直腸給藥。組合物可以通過(guò)向傷口植入包覆有或注有本發(fā)明組合物的包裹材料或栓劑給藥。
在醫(yī)療裝置中使用凝塊形成或血小板凝聚抑制劑，例如，作為包覆材料。例如，血管人工關(guān)節(jié)器，例如，掃描器、模具或?qū)Ч埽ㄑㄐ纬梢种苿?，該血栓形成抑制劑是與細(xì)胞滲透部分連接的凝血酶受體分離片斷。將該組合物注入醫(yī)療裝置，當(dāng)此醫(yī)療裝置與組織接觸或植入時(shí)，該組合物分散與身體組織當(dāng)中；作為選擇，該裝置用pepducin包覆。
Pepducin還可以通過(guò)將腫瘤細(xì)胞與和細(xì)胞滲透部分連接的蛋白酶活化受體分離片斷相接觸，用于抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和入侵。蛋白酶活化受體是PAR-4，PAR-2，或PAR-I受體。通過(guò)將腫瘤細(xì)胞與和細(xì)胞滲透部分連接的蛋白酶活化受體分離片斷相接觸來(lái)進(jìn)行抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法。腫瘤細(xì)胞可以是黑素瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、惡性毒瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞或淋巴細(xì)胞。
通過(guò)給藥凝血酶或胰島素/類胰蛋白酶GPCR基pepducin來(lái)緩解哮喘癥狀。因此，通過(guò)給藥組合物來(lái)完成抑制哮喘病的方法，其中所述組合物包含與細(xì)胞滲透部分連接的凝血酶或胰島素/類胰蛋白酶GPCR的分離片斷。優(yōu)選地，胰島素/類胰蛋白酶受體是PAR-I，PAR-2或PAR-4受體。在不同的實(shí)施方案中，將組合物注入血管腔，例如外周血管腔，或通過(guò)吸入(例如，作為氣霧劑)將組合物被注入哺乳動(dòng)物的肺部，或通過(guò)透皮途徑給藥。
血小板活化作用抑制劑包括與細(xì)胞滲透部分連接的核苷活化的GPCR分離片斷，例如P2Y12受體。這種組合物在抑制血小板凝聚的方法中十分有效。
在其他方面，本發(fā)明包括通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物給藥組合物抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)血栓形成的方法，其中該組合物包括與細(xì)胞滲透部分連接的核苷活化受體分離片斷。在一些實(shí)施方案中，凝血酶受體是P2Y12受體。本發(fā)明的發(fā)明通過(guò)將本發(fā)明的抑制組合物注入血管腔進(jìn)行，例如，注入頸靜脈血管、外周血管。外周血管可以是例如，位于肢體末端的血管，例如手、肘關(guān)節(jié)或腳。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物被注入哺乳動(dòng)物的肺部，例如，作為一種氣霧劑。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物注射給藥。在不同的實(shí)施方案中，注射劑可以皮下注入哺乳動(dòng)物的腹膜腔內(nèi)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物還可以透皮給藥。組合物可以通過(guò)向傷口植入包覆有或注有本發(fā)明組合物的包裹材料或栓劑給藥。
在另一方面，本發(fā)明包括血管人工關(guān)節(jié)器，血管人工關(guān)節(jié)器包括一種血栓形成抑制劑，該抑制劑是與細(xì)胞滲透部分連接的核苷活化受體分離片斷。在不同的實(shí)施方案中，該裝置可以是一種模具或一種導(dǎo)管。在一些實(shí)施方案中，該裝置裝滿抑制劑或被抑制劑所包覆。
本發(fā)明一個(gè)或一個(gè)以上實(shí)施方案的細(xì)節(jié)在下面的描述中進(jìn)行了介紹。盡管任何與這里描述的相似或相等的方法和材料都可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)或檢測(cè)本發(fā)明，但是這里描述的是優(yōu)選的方法和材料。根據(jù)說(shuō)明書，本發(fā)明的其他的特點(diǎn)、目標(biāo)和優(yōu)勢(shì)顯而易見。在說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書中，除非上下文明確指出，單數(shù)形式同時(shí)包括復(fù)數(shù)的意思。除非另有定義，這里使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的意義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的意義相同。如果有矛盾的話，以本說(shuō)明書，包括定義部分的解釋為準(zhǔn)。另外，這里的材料、方法、和實(shí)施例只起到指示說(shuō)明的作用，并不構(gòu)成限制。本說(shuō)明書所引用的所有專利和出版物通過(guò)引證在此全部并入本文。
G蛋白耦合受體G蛋白耦合受體是固有的細(xì)胞膜蛋白，細(xì)胞膜蛋白包括一大類受體。G蛋白耦合受體家族(GPCRs)具有至少250個(gè)成員(Strader et a FASEB J.，9745-754，1995；Strader et al.Annu.Rev.Biochem.，63101-32，1994)。據(jù)估計(jì)，百分之一的人類基因可以編碼GPCRs。很多GPCRs具有相同的分子結(jié)構(gòu)和相同的信號(hào)發(fā)送機(jī)制。歷史上將，GPCRs通常被分為6個(gè)家族，通常這認(rèn)為這6個(gè)族是沒有關(guān)系的，其中在脊椎動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)族。目前的工作已經(jīng)確認(rèn)了一些新的GPCR族，并提出所有這些族具有相同的進(jìn)化起源的可能性。
很多GPCRs具有7個(gè)跨膜螺旋區(qū)域相同的結(jié)構(gòu)基序。但是，一些GPCRs不具有7個(gè)跨膜螺旋區(qū)域，取而代之的是單一分散型跨膜受體。
單一分散型GPCRs包括細(xì)胞因子受體，例如促紅細(xì)胞生成素受體，EGF受體、胰島素受體、胰島素樣生長(zhǎng)因子I和II受體，和TGF。
GPCR族包括A類似視網(wǎng)膜紫質(zhì)、B類似分泌素、C類代謝型谷氨酸/信息激素、D類真菌信息激素、E類cAMP受體(盤基網(wǎng)柄菌)、和卷曲/光滑族。假定族包括眼部白化病蛋白、果蠅臭氣物質(zhì)受體、植物MIo受體、線蟲化學(xué)受體、和犁鼻骨受體(V1R&V3R)。
A類似視紫紅質(zhì)受體包括胺類受體乙酰膽堿、α腎上腺素能受體、β腎上腺素能受體、多巴胺、組胺、5-羥色胺、對(duì)羥苯β羥乙胺、和Trace胺；肽受體血管緊張素、韓蛙皮素、血管舒緩激肽、C5a過(guò)敏毒素、Fmet-亮氨酸-苯丙氨酸、似APJ、白細(xì)胞間介素-8、趨化因子受體(C-C趨化因子、C-X-C趨化因子、BONZO受體(CXC6R)、C-X3-C趨化因子、和XC趨化因子)、CCK受體、內(nèi)皮素受體、黑色素細(xì)胞刺激激素受體、神經(jīng)肽Y受體、神經(jīng)降壓素受體、鴉片樣物質(zhì)受體、生長(zhǎng)激素釋放的抑制因子受體、速激肽受體、(P物質(zhì)(NK1)、K物質(zhì)(NK2)、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽K(NK3)、似速激肽1、和似速激肽2)、似增血壓素受體(增血壓素、催產(chǎn)素、和血管加壓素)、似抗神經(jīng)節(jié)肽受體(抗神經(jīng)節(jié)肽、昆蟲神經(jīng)肽咽側(cè)體抑制激素、和GPCR 54)、似蛋白酶活化受體(例如，凝血酶)、增食欲素和神經(jīng)肽FF、尾加壓素II受體、腎上腺髓質(zhì)素(GlOD)受體、似GPR37/內(nèi)皮素B受體、趨化因子受體樣受體、和神經(jīng)調(diào)節(jié)肽U受體；激素蛋白受體促卵泡激素、促黃體素-絨毛膜激素、促甲狀腺激素、和促性腺激素；(Rhod)視蛋白受體；嗅覺感受體；前列腺素類受體前列腺素、環(huán)前列腺素、和促血栓素；似核苷酸受體腺苷酸和嘌呤受體；大麻受體；血小板活化因子受體；促性腺激素釋放激素受體；促甲狀腺激素釋放激素和促分泌素受體促甲狀腺激素釋放激素、生長(zhǎng)激素促分泌素、和似生長(zhǎng)激素促分泌劑；N-乙酰-5-甲氧基色胺受體；病毒受體；Lysosphingolipid&LPA(EDG)受體；白細(xì)胞三烯B4受體白細(xì)胞三烯B4受體BLT1和白細(xì)胞三烯B4受體BLT2；和A類單獨(dú)/其他受體血小板ADP&K101受體、SREB、Mas原致癌基因、RDC1、ORPH、似LGR(激素受體)、GPR、似GPR45、半胱氨酰白細(xì)胞三烯、Mas相關(guān)受體(MRGs)、和似GP40受體。
B類(分泌素受體族或′2族′)GPCRs是一種較小的，但結(jié)構(gòu)功能各異的蛋白組，包括多肽激素受體(降血鈣素、促皮質(zhì)釋放素、胃抑制肽、胰高血糖素、胰高糖素樣肽-1、胰高糖素樣肽-2、生長(zhǎng)激素-釋放激素、甲狀旁腺激索、PACAP、分泌素、腸血管活性肽、利尿激素、EMR1 Latrophilin)，能夠在原生質(zhì)膜(腦特異性血管新生抑制劑(BAI))上調(diào)節(jié)細(xì)胞間相互作用的分子，及調(diào)節(jié)壓迫反應(yīng)和壽命的果蠅蛋白組(Methuselah樣蛋白)。
C類代謝型谷氨酸/分泌信息素受體包括代謝型谷氨酸、代謝型谷氨酸基團(tuán)I、代謝型谷氨酸集團(tuán)II、代謝型谷氨酸基團(tuán)III、其他代謝型谷氨酸、胞外鈣傳感、假定的分泌信息素受體、GABA-B、GABA-B亞類1、GABA-B亞類2、和GPRC5孤兒受體。
GPCRs可以是通過(guò)G蛋白顯示從外側(cè)向內(nèi)側(cè)信號(hào)傳輸?shù)亩喾N多肽受體，例如GPIb-V-IX、或膠原蛋白受體。
盡管已經(jīng)克隆了許多G蛋白耦合受體基因或cDNAs序列，但是普遍相信還有許多沒有被看作GPCRs的未定性的G蛋白耦合受體。
GPCRs在信號(hào)處理方面起了十分重要的作用，能夠控制細(xì)胞代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)和游動(dòng)、粘附、炎癥、神經(jīng)元的信號(hào)傳輸、和血液凝固。G蛋白耦合受體蛋白還可以作為許多信號(hào)傳輸分子的靶分子，從而具有非常重要的作用，其中信號(hào)傳輸分子能夠控制、調(diào)節(jié)、或調(diào)整活體功能。信號(hào)傳輸類物質(zhì)可以是內(nèi)源分子(例如，神經(jīng)傳遞介質(zhì)或激素)、外源分子(例如，香料)、或在視覺傳遞的情況下，信號(hào)傳輸類物質(zhì)是光。
例如，GPCRs包括生物胺受體，例如，多巴胺、腎上腺素、組胺、谷氨酸(代謝型作用)、乙酰膽堿(毒蕈堿樣作用)、和5-羥色胺；炎癥的脂質(zhì)體介質(zhì)受體，例如前列腺素、血小板活化因子、和白細(xì)胞三烯；肽類激素受體例如降血鈣素、C5a過(guò)敏毒素、促卵泡激素、促性腺激素釋放激素、神經(jīng)激肽、催產(chǎn)素；蛋白酶受體例如凝血酶、胰蛋白酶、類胰蛋白酶、活化蛋白C、和因子Vlla/Xa；和感官信號(hào)傳輸介質(zhì)受體，例如，視網(wǎng)膜的感光色素和嗅覺刺激分子。每個(gè)分子對(duì)于一種受體蛋白都是具有特異性的，從而確定個(gè)體生理活性物質(zhì)的特異性(包括特定的靶細(xì)胞和器官)、特異性藥理作用、特異性作用強(qiáng)度、作用時(shí)間、等等。因此，GPCRs是對(duì)于藥物作用和發(fā)展的主要靶分子。
依據(jù)配體結(jié)合，GPCRs能夠通過(guò)活化鳥苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白)調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號(hào)傳輸途徑。GPCRs區(qū)域結(jié)構(gòu)在GPCR族成員之間是保守的。GPCRS的TM螺旋區(qū)域、胞內(nèi)環(huán)區(qū)域、和胞外區(qū)域的區(qū)域邊界在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。通過(guò)與原型GPCR、視紫紅質(zhì)相比，使用已知的方法，例如Palczewski et al.，Science289739(2000)描述的方法，可以確定未畫出的GPCRs結(jié)構(gòu)，該文獻(xiàn)通過(guò)引證在此并入本文。
大部分GPCRs的一個(gè)特征要素是位于一級(jí)結(jié)構(gòu)和其每個(gè)穿過(guò)(橫跨)細(xì)胞膜區(qū)域中的七個(gè)疏水性氨基酸殘基，或橫跨膜區(qū)域(TMs，這七個(gè)橫跨膜區(qū)域被命名為TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6、和TM7)。這些區(qū)域被認(rèn)為可以表示為橫跨膜α螺旋，這種橫跨膜α螺旋被三個(gè)胞內(nèi)環(huán)(i1、i2、和i3)，三個(gè)胞外環(huán)(e1、e2和e3)，和氨基(N)和羧基(C)末端區(qū)域連接(Palczewskiet al.，Science 289，739-45(2000))。大部分的GPCRs在開始二個(gè)胞外環(huán)處具有單一的保守性半胱氨酸殘基，這兩個(gè)胞外環(huán)形成被認(rèn)為能夠穩(wěn)定功能蛋白結(jié)構(gòu)的二硫鍵。已知上面描述的這些結(jié)構(gòu)在G蛋白耦合受體蛋白之中是常見的，而且在蛋白穿過(guò)細(xì)胞膜區(qū)域(膜橫跨區(qū)域或橫跨膜區(qū)域)中相應(yīng)的氨基酸序列和靠近膜橫跨區(qū)域的氨基酸序列通常在受體中具有很高的保守性。因此由于在GPCRs中高度的同源性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地識(shí)別出新穎的GPCRs，同時(shí)識(shí)別出這種新成員的胞內(nèi)和胞外部分。
通常認(rèn)為G蛋白耦合受體小配體的結(jié)合位點(diǎn)包括一種親水性槽，該親水性槽位于由若干GPCR橫跨膜區(qū)域形成的胞外表面附近。親水性槽被G蛋白耦合受體的疏水性殘基圍繞。假定每個(gè)G蛋白耦合受體橫跨膜螺旋親水性側(cè)基面向內(nèi)部，且形成極性配體結(jié)合位點(diǎn)。由于一些GPCRs具有包括TM3天冬氨酸殘基的配體結(jié)合位點(diǎn)，因此認(rèn)為TM3與這些GPCRs有關(guān)。TM5絲氨酸、TM6天門冬酰胺和TM6或TM7苯基丙氨酸或酪氨酸也與配體結(jié)合有關(guān)。對(duì)于肽類激素受體的配體結(jié)合位點(diǎn)和對(duì)于其他大的配體，例如糖蛋白(例如、促黃體生成激素、促卵泡激素、人絨毛膜促性腺激素、促甲狀腺激素(促甲狀腺激素))受體，和Ca2+/谷氨酸/GABA(γ-氨基丁酸)類受體可能存在于胞外區(qū)域和環(huán)中。
非活性受體向活性型受體轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵在于配體導(dǎo)致的GPCRs橫跨膜螺旋3(TM3)和6(TM6)的構(gòu)象變化，其中GPCRs具有7個(gè)橫跨膜跨度螺旋(Gether and Kolbilka，J.Biol.Chem.273，17979-17982(1998)).這些螺旋的移動(dòng)依次改變受體胞內(nèi)環(huán)的構(gòu)造，從而促進(jìn)相關(guān)異三聚體G蛋白的活化作用。突變研究(Cotecchia et al，J.Biol.Chem.2671633-1639(1992)；Kostenis etal，Biochemistry 361487-1495(1997)；Kjelsberg et al，J.Biol.Chem.2671430-1433(1992))說(shuō)明，第三胞內(nèi)環(huán)(i3)能夠調(diào)節(jié)大部分受體和G蛋白間的耦合作用。i3環(huán)可以表示為微基因，其還能夠直接與腎上腺素能受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Gq(Luttrel et al，Science2591453-1457(1993))，或可以活化G蛋白，作為細(xì)胞自由狀態(tài)的可溶性肽(Okamoto et al，Cell 67，723-730(1991)).
一個(gè)特定種類的GPCR是蛋白酶活化受體(PARs)。蛋白酶活化受體(PARs)是G蛋白耦合受體總科的成員，G蛋白耦合受體能夠通過(guò)胞外絲氨酸蛋白酶的蛋白質(zhì)分解活性起始細(xì)胞信號(hào)傳輸。使用內(nèi)源蛋白酶，包括凝血酶(PAR-I、PAR-3、和PAR-4)和胰蛋白酶/類胰蛋白酶(PAR-2和PAR-4)蛋白水解裂解受體氨基末端之后，活化PARs。其中，PAR2(Nystedt et al，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)919208-9212(1994))是一種胰蛋白酶/類胰蛋白酶活化受體，對(duì)炎癥和疼痛十分重要，PAR4(Xu et al，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)956642-6646(1998)；Kahn et al，Nature(London)394690-694(1998))是一種第二凝血酶受體，在血小板凝聚過(guò)程中起到一種獨(dú)特的作用(Covic et al，Biochemistry 39，5458-5467(2000))。
由于凝血酶、胰蛋白酶和類胰蛋白酶存在于發(fā)炎氣道，PARs很可能在氣道炎癥中起到重要作用。Knight et al，J.Allergy Clin.Immunol.108797-803(2001).
除了在止血方面的關(guān)鍵作用之外，凝血酶能夠通過(guò)蛋白水解裂解特異性細(xì)胞表面受體(PARs)，活化各種各樣的細(xì)胞型，例如血小板和血管平滑肌細(xì)胞，其中，特異性細(xì)胞表面受體(PARs)的原型是PAR-I。凝血酶受體活化作用很可能在心血管失調(diào)方面，例如血栓癥、動(dòng)脈粥樣硬化和心室狹隘方面起到重要作用，同樣地，凝血酶受體拮抗體在治療這些病癥方面具有潛在功效，Chackalamannil，Curr.Opin.Drug Discov.Devel.4417-27(2001).
在損傷哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)之后，普遍認(rèn)為凝血酶與功能損失有關(guān)。PAR-1的減量調(diào)節(jié)能夠提高外傷后的CNS神經(jīng)元的存活量，可以通過(guò)適當(dāng)?shù)腜AR-I受體調(diào)整微量調(diào)節(jié)外傷后的凝血酶的毒性。Friedmann et al，Neuroimmunol.，12112-21(2001).
PARS還涉及許多其他疾病或適應(yīng)癥，包括各種癌癥、細(xì)胞增殖、和疼痛。
GPCR區(qū)域大多數(shù)的GPCRs具有7個(gè)疏水性氨基酸殘基簇或7個(gè)橫跨膜區(qū)域(TMs，這7個(gè)橫跨膜區(qū)域被命名為TM1、TM2、TM3、TM4，TM5，TM6，和TM7)的特點(diǎn)，這7個(gè)疏水性氨基酸殘基簇或橫跨膜區(qū)域位于初級(jí)結(jié)構(gòu)中，穿過(guò)(橫跨)細(xì)胞膜(圖A)。通常認(rèn)為TM區(qū)域呈現(xiàn)出與三個(gè)胞內(nèi)環(huán)(i1，i2和i3)、三個(gè)胞外環(huán)(e1，e2，和e3)相連的橫跨膜α螺旋區(qū)域。GPCR還包含氨基(N)-末端和羧基(C)-末端(Palczewski et al，Science 289，739-45(2000))。橫跨膜螺旋區(qū)域之間的序列與GPCR環(huán)相對(duì)應(yīng)，環(huán)在細(xì)胞內(nèi)的位置決定了該環(huán)是胞內(nèi)環(huán)還是胞外環(huán)。大多數(shù)GPCRs在每頭兩個(gè)胞外環(huán)中，具有單一保守性半胱氨酸殘基，這兩個(gè)胞外環(huán)之間形成二硫鍵，通常認(rèn)為二硫鍵能夠穩(wěn)定功能性蛋白的結(jié)構(gòu)。PAR1 GPCR的橫跨膜和環(huán)區(qū)域的示意圖在圖1A中進(jìn)行了表示。
GPCR的一個(gè)例子是CXCR4受體，在表2中表示為SEQ IDNO15。7個(gè)帶有下劃線的序列對(duì)應(yīng)于GPCR的7個(gè)橫跨膜區(qū)域。因此，序列IFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILV(SEQ ID NO16)對(duì)應(yīng)于第一橫跨膜區(qū)域(TM1)。

分離的GPCR片段是小于其全長(zhǎng)蛋白的GPCR任意部分。包含分離的GPCR片段的肽包含對(duì)于GPCR序列的N末端和/或C末端氨基酸序列而不是天然存在的氨基酸序列。包含分離的GPCR橫跨膜序列的肽可能只包含對(duì)用于GPCR橫跨膜區(qū)域的序列，或者還包含對(duì)于橫跨膜序列N-末端和/或C-末端的序列，這些序列不是天然存在的側(cè)基序列(即，不是臨近天然存在的GPCR的環(huán)序列)。
因此，包含CXCR4受體分離的橫跨膜區(qū)域的肽是任何包括表2中所示的帶下劃線序列的任意或全部相鄰氨基酸的肽。這種肽不包括任何天然存在的(未劃線)側(cè)基序列，該側(cè)基序列與位于GPCR天然存在序列中TM區(qū)域附近的環(huán)序列相對(duì)應(yīng)。
同樣的，包含CXCR4受體分離的(胞內(nèi)或胞外)環(huán)區(qū)域的肽是任何包括表2中所示的不帶下劃線序列的任意或全部相鄰氨基酸的肽。這種肽不包含任何天然存在的橫跨膜序列，所述橫跨膜序列是在表2中用下劃線表示的側(cè)基序列，該序列鄰近天然存在的序列中的環(huán)區(qū)域。
包含分離的胞外區(qū)域或分離的胞內(nèi)區(qū)域的肽可能包括任何得自(胞外或胞內(nèi))環(huán)和/或N末端或C末端區(qū)域的氨基酸序列。這種肽不包括任何橫跨膜區(qū)域的序列，其中，所述橫跨膜區(qū)域鄰近天然存在的GPCR序列中的胞外區(qū)域或胞內(nèi)區(qū)域。
藥物組合物本發(fā)明的pepducins(在這里也叫做“活性化合物”)及其衍生物、片段、類似物和同類物，可以并入適于給藥的藥物組合物中，這種組合物通常包括pepducin和一種藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的藥物組合物被配制成與其預(yù)計(jì)的給藥途徑相協(xié)調(diào)的劑型。給藥途徑的例子包括腸胃外給藥，例如，靜脈注射(例如，外周血管，例如位于肢體末端的外周血管注射)、腹膜內(nèi)給藥、皮內(nèi)給藥、皮下給藥，外皮給藥、口服給藥、鼻內(nèi)給藥、氣霧劑(例如，吸入)、經(jīng)皮膚給藥(即，局部給藥)、透皮給藥、陰道給藥、子宮給藥和直腸給藥(例如，栓劑)。包含本發(fā)明活性化合物的可注射溶液可以向血管(例如大動(dòng)脈或頸動(dòng)脈)的血管腔給藥。作為選擇，本發(fā)明的活性化合物可以通過(guò)某種器械給藥，例如，被活性化合物填滿或包覆的模具或?qū)Ч堋?br> 用于給藥(例如，腸胃外給藥)的溶液或懸浮液可以包括下列成分一種無(wú)菌稀釋劑，例如注射用水、鹽溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，例如苯甲基乙醇或甲基苯甲酸酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸維生素C或重亞硫酸鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩沖液，例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；和用于調(diào)整毒性的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖?？梢杂盟峄驂A例如，鹽酸或氫氧化鈉來(lái)調(diào)節(jié)pH值。本發(fā)明藥物組合物的制備可以被裝入安瓿、可隨意使用的耳咽管或由玻璃或塑料制成的多劑量小瓶中。
適于注射使用的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液(對(duì)于水可溶的情況)、懸浮液或用于臨時(shí)制備無(wú)菌可注射溶液或懸浮液的無(wú)菌粉末。為了靜脈內(nèi)給藥，合適的載體包括生理鹽水、無(wú)菌水、Cremophor EL(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。在所有情況下，組合物必須是無(wú)菌的，且被液化到具有方便注射能力存在的程度。組合物在制備和儲(chǔ)藏條件下必須穩(wěn)定且能夠防止微生物，例如細(xì)菌和真菌的污染。載體可以是一種溶劑或懸浮劑介質(zhì)，所述溶劑或懸浮劑介質(zhì)包含例如水、乙醇、多羥基化合物(例如，丙三醇、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等等)，和其適合的混合物。通過(guò)使用包衣材料，例如卵磷脂，在懸浮液中通過(guò)維持合適的顆粒尺寸或通過(guò)使用表面活性劑來(lái)維持適合的流動(dòng)性。通過(guò)使用不同的抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，例如，苯甲酸酯，氯化丁醇、苯酚、抗壞血酸維生素C、噻汞撒等等可以實(shí)現(xiàn)預(yù)防微生物的目的。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，例如，糖，多元醇，例如木糖醇，山梨醇，鹽酸鈉。通過(guò)向組合物中加入一種延緩吸收的試劑，例如，單硬脂酸鋁和明膠，就可以延緩可注射組合物的吸收。
可以通過(guò)將所需量的活性化合物與一個(gè)或上面所列舉的成分的混合物結(jié)合制備無(wú)菌的可注射溶液，如果需要的話，之后進(jìn)行過(guò)濾滅菌步驟。通常，通過(guò)將活性成分與包含基本分散介質(zhì)的無(wú)菌載體和其他上面列舉的成分結(jié)合，來(lái)制備懸浮液。在制備無(wú)菌可注射溶液無(wú)菌粉末的情況下，制備方法是真空干燥和凍干，這樣能夠產(chǎn)生粉末，該粉末包括活性成分和之前無(wú)菌過(guò)濾溶液的任何附加理想成分。
口服組合物通常包括一種惰性稀釋劑或一種可食用載體。口服組合物可以被裝入明膠膠囊或壓成片劑。為了實(shí)現(xiàn)口服治療劑的目的，活性成分可以與賦形劑結(jié)合，以片劑、藥片或膠囊的形式被使用?？诜M合物還可以使用液體載體制備，用作漱口水，其中液態(tài)載體中的化合物被口服使用、漱口后吐出或咽下。組合物中包括藥學(xué)上相容的結(jié)合劑、和/或助劑，作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊劑、藥片等等可以包含下列任意成分，或相似天然產(chǎn)物化合物結(jié)合劑，例如微晶纖維素、黃原膠或明膠；賦形劑，例如淀粉或乳糖；崩解劑，例如藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑，例如膠狀二氧化硅；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或增味劑，例如薄荷油、甲基水楊酸或橙味增味劑。
為了用于吸入給藥或經(jīng)鼻給藥，化合物被帶壓力容器或分散器以氣霧劑的形式輸送，其中所述容器或分散器包含適當(dāng)推出物，例如，二氧化碳?xì)怏w，或噴霧器(例如，輸送到肺部)。
通過(guò)經(jīng)皮膚或透皮方式進(jìn)行全身性給藥。為了實(shí)現(xiàn)經(jīng)皮膚或透皮方式給藥，在配方中使用對(duì)于障礙物適當(dāng)?shù)臐B透劑。這種滲透劑在本領(lǐng)域中通常是已知的，包括，例如，用于經(jīng)皮膚給藥滲透劑、去污劑、膽鹽、和梭鏈孢酸衍生物。經(jīng)皮膚給藥可以通過(guò)使用鼻噴入法或栓劑完成。對(duì)于透皮給藥，活性化合物被配制成領(lǐng)域內(nèi)已知的軟膏劑、軟膏、凝膠劑、或膏狀物。
活性化合物還可以制成栓劑(例如，與慣用的栓劑主要成分一起配制成栓劑，慣用的栓劑主要成分例如可可脂及其他甘油酯)、包衣栓劑或用于直腸給藥的持續(xù)灌腸劑的形式?；钚曰衔锿瑯涌梢员恢瞥申幍纼?nèi)或子宮內(nèi)給藥的制劑?；钚曰衔镞€可能通過(guò)浸滿或包覆傷口包扎材料來(lái)給藥(例如，減少出血)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，活性化合物可以與能夠防止化合物快速?gòu)纳眢w內(nèi)排出的載體一起制備，例如一種控制釋放制劑，包括植入物和微囊給藥系統(tǒng)。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯共聚物、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)講，制備這些制劑的方法是顯而易見的。這些材料可以從Alza公司和諾華醫(yī)藥有限公司商業(yè)購(gòu)得。脂質(zhì)體懸浮液(包括對(duì)于受帶有病毒抗原單克隆抗體的感染細(xì)胞靶分子脂質(zhì)體)還可以被用作藥學(xué)可接受的載體。這些可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)制備，例如，在美國(guó)專利第4,522,811號(hào)所描述的。
配制成單位劑量形式的口服的或腸胃外給藥的組合物是十分有利的，能夠便于給藥和保證劑量一致性。這里使用的單位劑量形式涉及適于作為單一劑量對(duì)主體給藥用于治療的物理離散單元；每個(gè)單位包含預(yù)定量的活性化合物，通過(guò)計(jì)算可知，該活性化合物與需要的藥物載體結(jié)合能夠產(chǎn)生所需治療效果。本發(fā)明單位劑量形式的使用方法由活性化合物獨(dú)特的性質(zhì)、需要達(dá)到的特定治療效果和此活性化合物用于治療個(gè)體的本領(lǐng)域固有局限性決定，且直接取決于這些因素。
以藥物組合物的形式給藥pepducins和GPCR肽可以用于治療各種各樣的病癥。在Remington藥劑學(xué)科學(xué)和實(shí)踐，第十九版(Alfonso R.Gennaro，et al.，編輯)Mack出版公司，Easton，Pa.1995；促進(jìn)藥物吸收概念、可能性、局限性和趨勢(shì)，Harwood學(xué)院出版社，Langhorne，Pa.，1994；和肽和蛋白藥物傳遞(腸胃外的科學(xué)發(fā)展，卷4)，1991，M.Dekker，New York中提供了制備這種組合物涉及的原理和需要考慮的事項(xiàng)，以及在選擇成分方面的指導(dǎo)。這里的制劑還可以包含一個(gè)以上作為用于治療特定適應(yīng)癥必需品的活性化合物，優(yōu)選那些具有互補(bǔ)活性且不會(huì)產(chǎn)生不利影響的活性化合物。做為選擇，或另外，組合物可以包括一種能夠提高其功能的試劑，例如，細(xì)胞毒劑、細(xì)胞因子、化療劑、或抑制生長(zhǎng)試劑。這些試劑以能夠達(dá)到預(yù)定目標(biāo)的有效量適當(dāng)?shù)拇嬖谟诮Y(jié)合物中。通過(guò)例如凝聚技術(shù)或界面聚合作用，活性成分還可以被包覆在制備好的微膠囊中，例如分別在膠體藥物傳遞系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳狀液、納米顆粒和納米微囊劑)或粗乳液中的羥甲基纖維素或明膠微膠囊，和聚異丁烯酸甲脂微膠囊。
用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無(wú)菌的。這一點(diǎn)很容易地通過(guò)經(jīng)由無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾實(shí)現(xiàn)。
可以制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑適合的例子包括包含抗體的半透性基質(zhì)固體疏水性聚合物，其中基質(zhì)以定形物品形式存在，例如，薄膜、或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯基乙醇))、聚交酯(美國(guó)專利第3,773,919號(hào))、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物例如LUPRON DEPOT(由乳酸-羥基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射的微球)、和聚-D-(-)-3-羥丁酸。雖然聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能夠在超過(guò)100天的時(shí)間里釋放分子，但是其水凝膠在較短的時(shí)間內(nèi)釋放蛋白。
活性化合物的控制釋放可以利用多種不同的技術(shù)。已知裝置，例如，模具或?qū)Ч?，帶有單片集成電路層或與聚合基質(zhì)中活性試劑的異類溶液和/或懸浮液結(jié)合的包衣材料，在這里，當(dāng)試劑擴(kuò)散穿過(guò)聚合物到達(dá)聚合物-液體臨界面并釋放進(jìn)入周圍的液體中時(shí)，治療劑的擴(kuò)散是限速的?；钚曰衔锟梢匀芙庥诨驍U(kuò)散于合適的聚合材料中，因此，材料溶解后，留下附加的小孔或管道?；|(zhì)裝置通常也是控制擴(kuò)散的，但是，帶有管道或其他內(nèi)在形狀的裝置對(duì)試劑向液體中的擴(kuò)散起到一定作用。這些管道可以是預(yù)先存在的管道，也可以是釋放劑或其他可溶物質(zhì)釋放后留下的管道。
易侵蝕或易降解的裝置一般在聚合物中固定有活性化合物，活性化合物能夠溶解和/或擴(kuò)散穿過(guò)聚合材料。聚合材料可以通過(guò)水解不穩(wěn)定的邊界，使聚合物被液體侵蝕而在一定時(shí)間內(nèi)水解降解，向液體中釋放活性化合物。相對(duì)于疏水性聚合物而言，親水性聚合物通常具有較快的侵蝕速度。通常認(rèn)為，疏水性聚合物具有幾乎完全的活性化合物表面擴(kuò)散，其侵蝕作用從表面向內(nèi)部進(jìn)行。通常認(rèn)為親水性聚合物允許水滲入聚合物表面，造成表面下部不穩(wěn)定邊界的水解，從而導(dǎo)致均勻的或大量的聚合物侵蝕作用。
藥物組合物可以與使用說(shuō)明一起被包括在容器、包裝、或自動(dòng)售貨機(jī)中。
根據(jù)本發(fā)明的pepducin方法賦予胞內(nèi)受體結(jié)構(gòu)豐富的多樣性，用于開發(fā)新治療劑的生成和描述體內(nèi)條件下G蛋白耦合受體的機(jī)理。經(jīng)證明，根據(jù)本方法發(fā)現(xiàn)的pepducin對(duì)pepducin最初靶向非G蛋白受體的程度更具有選擇性。另外，通過(guò)基因和遺傳學(xué)途徑確定了許多受體，這些受體對(duì)許多疾病過(guò)程是十分重要的，但是沒有已知的配體-因此叫做孤兒受體。可以生成與其受體十分匹配的Pepducin激動(dòng)劑和拮抗劑，當(dāng)確定在其天然環(huán)境下那個(gè)信號(hào)途徑被孤兒受體活化的時(shí)候，Pepducin激動(dòng)劑和拮抗劑是有用的。因此，在后基因時(shí)代，pepducin方法廣泛應(yīng)用于靶向膜蛋白，且為之前不適用于傳統(tǒng)分子技術(shù)的系統(tǒng)開辟了新的實(shí)驗(yàn)道路。
本發(fā)明的化合物和其他藥物活性劑可以同時(shí)、相繼或結(jié)合對(duì)患者給藥。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)使用本發(fā)明的結(jié)合物時(shí)，本發(fā)明的化合物和其他藥物活性劑可以位于同樣的藥學(xué)上可接受的載體中，因此實(shí)現(xiàn)同時(shí)給藥。他們可以在分離的藥物載體中，例如同時(shí)服用的常見的口服劑量形式。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合物”進(jìn)一步涉及化合物在分離的劑量形式中被提供并相繼給藥的情況。
本發(fā)明的化合物可以對(duì)需要這種治療的病人(動(dòng)物和人類)以能夠提供優(yōu)化藥效的劑量給藥。可以理解，在任意特定的應(yīng)用過(guò)程中，每位病人和每位病人需要的劑量不同，不僅是選擇的特定化合物或組合物不同，而且給藥途徑、治療的自然環(huán)境、年齡和病人情況、聯(lián)合給藥的藥物或病人隨后具體的飲食、及其他本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為的因素也不相同，最終合適的劑量是由提供服務(wù)的醫(yī)生來(lái)決定的。
在病況的治療過(guò)程中，適合的劑量水平通常在大約0.001到50mg每kg病人體重每天，該劑量可以以單一劑量或多劑量形式給藥。優(yōu)選地，該劑量水平是大約0.01到大約25mg/kg每天；更優(yōu)選地，大約0.05到大約10mg/kg每天。例如，合適的劑量水平是大約0.001到大約10mg/kg每天，優(yōu)選大約0.005到大約5mg/kg每天，且特別是大約0.01到大約1mg/kg每天。
例如，在患有急性心肌梗塞的病人體內(nèi)，適合的pepducin(例如，x1/2pal-i1)可以以丸劑的形式立即靜脈注射給藥(i.v.注射)，隨后在2-3天內(nèi)每天進(jìn)行一次或兩次附加的i.v.注射。劑量大約在0.1-0.5mg/kg。
可以理解，在任意治療過(guò)程中需要使用的本發(fā)明化合物的量是不同的，不僅是選擇的特定化合物或組合物不同，而且給藥途徑、治療的自然環(huán)境、年齡和病人情況、也不相同，最終合適的劑量是由提供服務(wù)的醫(yī)生來(lái)決定的。
本發(fā)明的組合物和結(jié)合物可以與多種藥學(xué)賦形劑結(jié)合使用，所述藥學(xué)賦形劑包括這里所描述的穩(wěn)定劑、載體和/或包覆膠囊。
本發(fā)明水性組合物包括有效量的本發(fā)明的肽，溶解或分散于藥學(xué)上可接受的載體或水性介質(zhì)中。
″藥學(xué)或藥理學(xué)可接受的″包括一些分子體和組合物，這些分子體和組合物在適當(dāng)情況下當(dāng)給藥動(dòng)物或人時(shí)，不會(huì)產(chǎn)生不利的、過(guò)敏的或其他不良反應(yīng)?！逅帉W(xué)可接受載體″包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣材料、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。使用這種介質(zhì)和試劑作為藥物活性物質(zhì)在領(lǐng)域內(nèi)是已知的。除去任何與活性成分不相容的常用介質(zhì)或試劑，其在治療劑組合物中的使用是可以預(yù)計(jì)的。組合物中還可以引入輔助的活性成分。
為了對(duì)人類給藥，制劑應(yīng)該滿足無(wú)菌、無(wú)熱原、普遍安全性和FDA局對(duì)于生物標(biāo)準(zhǔn)要求的純度標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明組合物和結(jié)合物治療劑通常被配制用于腸胃外給藥，例如，配制用于通過(guò)靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、內(nèi)切術(shù)乃至腹腔內(nèi)途徑。根據(jù)本申請(qǐng)公開的內(nèi)容，包含本發(fā)明組合物或活性組分或活性成分的水相組合物制劑對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。典型地，這種組合物可以被制備成血管注射劑，或者作為液體溶液或者作為懸浮液；還可以制備適于用作制備溶液或懸浮液的固體形式，在注射前向其中加入液體制成溶液或懸浮液；而且，該制劑還可以被乳化。
適于血管注射使用的藥物形式包括無(wú)菌水溶液或懸浮液；制劑包括芝麻油、花生油或水相丙二醇；和用于臨時(shí)配制無(wú)菌注射液或懸浮液的無(wú)菌粉末。在所有情況下，該形式必須是無(wú)菌的且必須被液化到易于注射的程度。它必須在制造和儲(chǔ)藏條件下穩(wěn)定，且在保存過(guò)程中免受微生物，例如細(xì)菌且真菌的污染作用。
作為游離基或藥理學(xué)可接受鹽的活性化合物溶液可以通過(guò)與適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣缌u丙基纖維素混合在水中制備。消散還可以在甘油、液體聚乙二醇、及其混合物和在油類物質(zhì)中制備。在常規(guī)的儲(chǔ)存和使用條件下，這些制劑包含一種能夠預(yù)防微生物生長(zhǎng)的防腐劑。
本發(fā)明的治療劑或藥理學(xué)組合物通常包括有效量的結(jié)合治療成分，這些成分溶解于或分散在藥學(xué)可接受的介質(zhì)中。藥學(xué)可接受的介質(zhì)或載體包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣材料、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。將這些介質(zhì)和試劑用作藥物活性物質(zhì)在領(lǐng)域中為大家所熟知。本發(fā)明的治療劑組合物中還可以引入輔助活性成分。
根據(jù)本申請(qǐng)所公開的內(nèi)容，藥物或藥理學(xué)組合物的制劑將被本領(lǐng)域技術(shù)人員所明了。典型地，這種組合物可以被制成血管注射劑，或者作為液體溶液或者作為懸浮液；還可以制備適于用作制備溶液或懸浮液的固體形式，在注射前向其中加入液體制成溶液或懸浮液；還可以制成片劑或其他固體制劑用于口服給藥；制成定時(shí)釋放的膠囊劑；或制成目前使用的任何其他形式，包括乳劑、洗液、漱口藥、吸入劑等等。
通過(guò)在適當(dāng)?shù)娜軇┲屑尤胄枰康幕钚曰衔铮c上面列舉的各種其他成分按需要結(jié)合，隨后過(guò)濾滅菌，制備無(wú)菌的血管注射劑溶液。通常，通過(guò)向包含堿性分散介質(zhì)和所需的上面列舉的各種其他成分的無(wú)菌介質(zhì)中加入滅菌的活性成分來(lái)制備懸浮液。就用于制備無(wú)菌血管注射劑溶液的無(wú)菌粉末來(lái)說(shuō)，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，真空干燥和冷凍干燥技術(shù)能夠產(chǎn)生活性成分粉末和上述無(wú)菌過(guò)濾溶液的任一附加理想成分。
還可以預(yù)計(jì)制備濃度更高或高濃度溶液用于肌肉注射。在這方面，優(yōu)選使用DMSO作為溶劑，因?yàn)镈MSO作溶劑能夠產(chǎn)生非常迅速的滲入過(guò)程，對(duì)小區(qū)域供給高濃度的活性化合物或試劑。
在外科手術(shù)領(lǐng)域，外科醫(yī)生、醫(yī)生或護(hù)理工人通過(guò)利用無(wú)菌制劑，例如以生理鹽水為基礎(chǔ)的洗滌液來(lái)凈化特定的區(qū)域是非常有效的。依照本發(fā)明的治療制劑還可以以嗽口水的形式重新組成，或與抗真菌劑連用。還可以預(yù)計(jì)制成吸入劑形式。本發(fā)明的治療制劑，例如在乳液和洗液中，還可以制備成適于局部給藥的形式。
在這種溶液中使用的適合的防腐劑包括氯化苯甲烴銨、氯化芐乙氧銨、氯代丁醇、硫柳汞等等。適合的緩沖液包括足夠維持pH在大約pH 6和pH 8之間，優(yōu)選在大約pH 7和pH 7.5之間的硼酸、碳酸氫鉀和碳酸氫鈉、硼酸鈉和硼酸鉀、碳酸鈉和碳酸鉀、醋酸鈉、磷酸二氫鈉等等。適合的張力劑是葡聚糖40、葡聚糖70、葡萄糖、甘油、氯化鉀、丙二醇、氯化鈉、等等，以致于眼用溶液的氯化鈉同等物的范圍在0.9加或減0.2％之內(nèi)。適合的抗氧化劑和穩(wěn)定劑包括亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、硫脲等等。適合的濕潤(rùn)劑和澄清劑包括聚山梨醇酯八十、聚山梨酸酯20、泊洛沙姆282和tyloxapol。適合的粘性增強(qiáng)試劑包括葡聚糖40、葡聚糖70、明膠、甘油、羥乙基纖維素、羥甲基丙基纖維素、羊毛脂、甲基纖維素、凡士林、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素等等。
依據(jù)制劑，治療劑應(yīng)當(dāng)以與制劑劑量不矛盾的方式給藥，且給藥量是藥理學(xué)有效的。制劑可以以多種劑型方便地給藥，例如上面描述的血管注射劑溶液類型，然而還可以使用藥物釋放膠囊劑等等。
在這方面，活性成分和組合物的給藥量取決于進(jìn)行治療的宿主。需要給藥的活性化合物的精確量取決于醫(yī)師的判斷，且對(duì)于每個(gè)個(gè)體都是不同的。
通常使用能夠分散活性化合物所需的最小量的組合物。適合的給藥方案也是可變的，但是會(huì)根據(jù)最初給藥化合物和檢測(cè)結(jié)果，和之后在進(jìn)一步間隔階段給于進(jìn)一步劑量控制而典型化。例如，為了進(jìn)行腸胃外給藥，如果需要的話，要制備合適的緩沖等滲水溶液，用于靜脈給藥、肌肉注射、皮下注射或甚至腹膜內(nèi)給藥。一個(gè)劑量可以溶解在1ml的等滲NaCl溶液中，要么加1000毫升hypodermolysis液體或在輸液位置注射。(參見，例如，Remington′s藥劑學(xué)第15版，第1035-1038和1570-1580頁(yè))。
在確定的實(shí)施方案中，活性化合物可以被口服給藥?？梢灶A(yù)計(jì)，通常具有抵抗力，或被賦予抵抗力的試劑能夠抵抗消化酶的蛋白質(zhì)水解作用。這些化合物預(yù)計(jì)包括化學(xué)設(shè)計(jì)或修飾試劑；右旋肽；和在控時(shí)釋放膠囊中避免肽酶和脂質(zhì)體酶降解作用的肽及脂質(zhì)體制劑。
藥學(xué)可接受的鹽包括酸加入鹽和無(wú)機(jī)酸形成的鹽，例如，鹽酸鹽，氫溴酸鹽、硼酸鹽、含磷的鹽、硫酸或磷酸，或與有機(jī)酸形成的鹽，例如乙酸鹽、草酸鹽、酒石酸鹽、馬來(lái)酸鹽、反丁烯二酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、mesylic、扁桃酸鹽、琥珀酸鹽、安息香酸鹽、抗壞血酸鹽、甲基磺酸鹽、a-酮基戊二酸鹽、a-甘油磷酸鹽、葡萄糖-1-磷酸鹽等等。與自由羧基形成的鹽還可以衍生于無(wú)機(jī)堿例如，鈉、鉀、銨、鈣、鎂、或氫氧化鐵，和衍生于這些有機(jī)堿，例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等等。藥學(xué)可接受的鹽的其他例子包括式(I)化合物的四元衍生物，例如被化合物Rx-T季銨化的化合物，其中Rx是C1-6烷基、苯基-C1-6烷基或C5-7環(huán)烷基、而T是一種相當(dāng)于酸的一種陰離子的自由基。Rx適合的例子包括甲基、乙基和n-丙基及異丙基；及苯甲基和苯乙基。T適合的例子包括鹵化物，例如，氯化物、溴化物或碘化物。此外，藥學(xué)可接受的鹽的其他例子還包括內(nèi)鹽，例如N-氧化物。
載體還可以是溶劑或分散介質(zhì)，所述溶劑或分散介質(zhì)包括，例如，水、乙醇、多羥基化合物(例如，丙三醇、丙二醇、和液態(tài)聚乙二醇等等)，其適合的混合物，以及植物油。通過(guò)使用包衣，例如卵磷脂包衣，或在分散液中通過(guò)維持所需的顆粒尺寸，和通過(guò)使用表面活性劑來(lái)維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。通過(guò)使用不同的抗菌劑或抗真菌劑，例如苯甲酸酯類、氯丁醇類、苯酚、山梨酸、局部抗菌劑等等來(lái)實(shí)現(xiàn)預(yù)防微生物作用。在許多情況下，優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖或氯化鈉。注射劑組合物的延長(zhǎng)吸收可以通過(guò)在組合物中使用吸收延遲劑來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中，吸收延遲劑例如，單硬脂酸鋁和明膠。
通過(guò)將所需量的活性化合物與帶有上面所述成分的適當(dāng)?shù)娜軇┙Y(jié)合來(lái)制備無(wú)菌注射劑溶液，如果需要的話，隨后進(jìn)行過(guò)濾滅菌步驟。通常，通過(guò)將不同的無(wú)菌活性成分加入到包含堿性分散介質(zhì)和上面所述其他所需成分的無(wú)菌載體中，制備懸浮液。對(duì)于用于制備無(wú)菌注射劑的無(wú)菌粉末的情況，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，真空干燥和冷凍干燥技術(shù)能夠產(chǎn)生活性成分加從前述無(wú)菌過(guò)濾溶液中得到的附加所需成分的粉末。
本發(fā)明還考慮了制備用于直接注射的濃度更高或高濃度的溶液，使用DMSO作為溶劑能夠預(yù)想到產(chǎn)生非?？焖俚臐B透，向小面積滲透高濃度的活性化合物。
在制劑中，溶液應(yīng)當(dāng)以與制劑劑量相匹配的方式給藥，并給藥能夠達(dá)到治療效果的劑量。制劑可以以不同的劑量形式方便的給藥，例如上面描述的注射劑溶液類型，但也可以使用藥物釋放膠囊等等。
為了在水溶液中進(jìn)行腸胃外給藥，例如，該溶液應(yīng)該具有適當(dāng)?shù)木彌_液性質(zhì)，如果需要的話，液體稀釋劑首先通過(guò)足量的生理鹽水或葡萄糖被賦予等滲性質(zhì)。這種特定的水溶液尤其適于靜脈注射、肌肉注射、皮下注射和腹膜內(nèi)給藥。關(guān)于這一點(diǎn)，根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)了解這里使用的無(wú)菌水溶液介質(zhì)。
此外，化合物被配制成腸胃外給藥的制劑，例如，靜脈注射、肌肉注射、或其他要學(xué)可接受的形式，例如，片劑或其他用于口服給藥的固體制劑；脂質(zhì)體制劑；控時(shí)釋放膠囊；和其他目前使用的劑型，包括乳劑。
適于其他方式給藥的另外的制劑包括栓劑。為了制備栓劑，常用的粘合劑和載體包括，例如，聚烷基乙二醇或甘油三酸酯；這種栓劑可以從包含0.5％到10％，優(yōu)選1％-2％活性成分的混合物制得。
口服制劑包括通常使用的賦形劑，例如，藥用級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等等。組合物可以表現(xiàn)為溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、持續(xù)釋放制劑或粉末的形式。
在明確定義的實(shí)施方案中，口服藥物組合物包括一種固有的稀釋劑或可同化可食用載體，或者，藥物組合物可以被密封在硬或軟殼凝膠膠囊中，或者被壓制成片劑，或者藥物組合物可以直接并入食物中。為了口服治療劑給藥，活性化合物可以與賦形劑結(jié)合，并以可吸收的片劑、口崩片、藥片、膠囊劑、西也劑、栓劑、糖漿、圓形片等等的形式被使用。這些組合物和制劑應(yīng)當(dāng)包含至少0.1％的活性化合物。組合物和制劑的百分比應(yīng)當(dāng)是可以變化的，通常占單位劑量總重的2％到75％之間，優(yōu)選25-60％之間。在治療有效的組合物中活性化合物的量是獲得合適劑量的制劑所需的量。
片劑、藥片、丸劑、膠囊劑等等還可以包括下列成分粘合劑，例如黃芪膠、阿拉伯樹膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，例如磷酸二鈣；崩解劑，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等等；潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂；和甜味劑，例如果糖、乳糖或可加入的糖精或調(diào)味劑，例如，薄荷油、冬青油、或櫻桃調(diào)味劑。當(dāng)單位劑量形式是膠囊時(shí)，除了上述材料，他可以包含，液態(tài)載體。多種其他材料可以以包衣形式存在或修飾劑量單位的物理形式。例如，片劑、丸劑、或用蟲膠、糖或二者包衣的膠囊。西也劑的糖漿可以包含作為甜味劑的活性化合物蔗糖，作為防腐劑的甲基或propylparabensas，作為染色劑或調(diào)味劑的櫻桃或橙味調(diào)味劑。
本發(fā)明的藥物組合物可能以藥物制劑的形式被使用，例如，包含一個(gè)或一個(gè)以上本發(fā)明化合物并將其作為活性成分的固體、半固體或液體，與適于外部應(yīng)用、腸內(nèi)應(yīng)用或腸胃外應(yīng)用的有機(jī)或無(wú)機(jī)載體或賦形劑混合?；钚猿煞挚赡苁腔衔?，例如，與常見的無(wú)毒的藥學(xué)可接受載體一起，用于制備片劑、丸劑、膠囊劑、栓劑、溶液、乳化液、懸浮液、和其他適于應(yīng)用的任何形式。可以使用的載體是水、葡萄糖、乳糖、阿拉伯樹膠、明膠、甘露醇、淀粉糊、三硅酸鎂、滑石粉、玉米淀粉、角蛋白、膠態(tài)氧化硅、馬鈴薯淀粉、尿素及其他適于在制造固體、半固體或液態(tài)制劑應(yīng)用的載體，和還可以使用其他助劑、穩(wěn)定劑、增稠劑和著色劑和芳香劑。依據(jù)疾病的過(guò)程或病況，將足夠產(chǎn)生預(yù)期效果的活性目標(biāo)化合物包括入藥物組合物中。
為了制備固體組合物，例如片劑，主要活性成分與藥物載體，例如，慣用的片劑成分例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠、及其他藥物稀釋劑例如，水混合，從而形成一種包含本發(fā)明化合物的均勻混合物或其無(wú)毒的藥學(xué)可接受鹽的固體預(yù)制劑組合物。當(dāng)涉及這些預(yù)制劑組合物是均勻組合物的時(shí)候，這意味著活性成分均勻地?cái)U(kuò)散到整個(gè)組合物以致組合物可以很容易的被分為相等的有效劑量形式，例如，片劑、丸劑和膠囊劑。然后，這些固體預(yù)制劑組合物再被分為上述劑型的單位劑量形式，該單位劑量形式包含0.1到500mg的本發(fā)明活性成分。新型組合物的片劑或丸劑可以是包衣的或不包衣的化合物，這種化合物能夠提供一種提供延長(zhǎng)作用優(yōu)勢(shì)的劑量形式。例如，片劑或丸劑可以包括一種內(nèi)部劑量成分和一種外面的劑量成分，后者以前者的包覆形式存在。這兩種組分可以被腸衣層分開，該腸衣層可以用來(lái)抵抗在胃中的崩解作用且允許內(nèi)部成分完整地通過(guò)進(jìn)入十二指腸或用來(lái)延遲釋放。許多材料可以用作這種腸衣層或包衣材料，這些材料包括許多聚合酸和聚合酸與下列材料的混合物蟲膠、十六烷醇和醋酸纖維素。
可以結(jié)合本發(fā)明組合物用于口服或注射給藥的液體包括水溶液、適當(dāng)調(diào)味的糖漿、水相或油相懸浮液、和與油類，例如棉花子油、芝麻油、椰子油或花生油相容的乳化液，或帶有適于靜脈注射使用的增溶劑或乳化劑的乳化液，和西也劑和類似藥物載體。合適用于水懸浮液的擴(kuò)散劑或懸浮劑包括合成的和天然的樹膠，例如黃芪膠、阿拉伯膠、藻酸鹽、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或明膠。
用于吸入劑或吹入劑的組合物包括在藥學(xué)可接受的水相或有機(jī)溶劑，或其混合物中的溶液和懸浮液，和粉末。液體或固體組合物可以包含上面所述適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)可接受賦形劑。優(yōu)選地，組合物通過(guò)口服或經(jīng)鼻呼吸途徑給藥，在局部或全身發(fā)揮作用。在優(yōu)選的無(wú)菌藥學(xué)可接受溶劑中的組合物可以通過(guò)使用惰性氣體霧化。被霧化的溶液可以直接從噴霧裝置吸入，或者該噴霧裝置可能附著在一種面具、護(hù)罩或間歇性正壓呼吸儀上。溶液、懸浮液或粉末組合物優(yōu)選地使用能夠以適當(dāng)?shù)姆绞教峁┲苿┑难b置口服或經(jīng)鼻給藥。
為了治療上面提到的臨床病況和疾病，本發(fā)明化合物可以通過(guò)吸入噴霧劑或直腸，以包含常用的無(wú)毒藥學(xué)可接受載體、助劑和載體的劑量單位制劑口服給藥、局部給藥、腸胃外給藥。這里使用的術(shù)語(yǔ)腸胃外給藥，包括皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、胸膜內(nèi)注射或輸液技術(shù)。
篩選和檢測(cè)方法本發(fā)明組合物可用于篩選藥物或化合物，所述藥物或化合物能夠調(diào)節(jié)GPCR活性或表達(dá)，同時(shí)治療病癥，所述病癥以GPCR蛋白不充分或過(guò)度生產(chǎn)為特征、或以產(chǎn)生與GPCR野生型蛋白相比具有減少的或異常的活性的GPCR蛋白形式為特征。
本發(fā)明提供了一種用于識(shí)別調(diào)節(jié)器，也就是說(shuō)，候補(bǔ)或試驗(yàn)化合物或試劑(例如，肽、擬肽、小分子或其他藥物)的方法(即這里提到的″篩選試驗(yàn)″)，所述候補(bǔ)或試驗(yàn)化合物或試劑能夠結(jié)合GPCRs或?qū)鏕PCR蛋白表達(dá)或GPCR活性具有刺激或抑制效果。本發(fā)明還包括在這里描述的篩選試驗(yàn)中識(shí)別的化合物。
本發(fā)明提供了用于篩選候補(bǔ)或試驗(yàn)化合物的試驗(yàn)，所述候補(bǔ)或試驗(yàn)化合物能夠結(jié)合pepducin-GPCR復(fù)合物膜結(jié)合形式或其生物活性部分或調(diào)節(jié)其活性。本發(fā)明的試驗(yàn)化合物可以通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的組合文庫(kù)方法中的任何途徑獲得，其中所述組合文庫(kù)方法包括例如，生物學(xué)文庫(kù)；空間可定位平行固相或液相文庫(kù)；合成文庫(kù)方法所需的重疊法；″一珠一化合物″文庫(kù)方法；和使用親和色譜法篩選的合成文庫(kù)方法。生物文庫(kù)途徑局限于肽文庫(kù)，同時(shí)，另外4種途徑適合于化合物的肽、非肽低聚物或小分子文庫(kù)。參見，例如，Lam，1997′.Anticancer Drug Design Y1145.
在本領(lǐng)域中可以發(fā)現(xiàn)分子文庫(kù)合成的實(shí)施例，例如，在DeWitt，et al，1993.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.906909；Erb，etal，1994.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9111422；Zuckermann，et al，1994.J.Med.Chem.372678；Cho，et al，1993.Science 2611303；Carrell，et al，1994.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carell，etal，1994.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；and Gallop，et al，1994.J.Med.Chem.371233中。
化合物文庫(kù)可以存在于溶液中(e.g.，Houghten，1992.Biotechniques 13412-421)，或在瓷珠上(Lam，1991.Nature35482-84)，在碎片上(Fodor，1993.Nature 364555-556)，細(xì)菌(Ladner，U.S.Patent No.5,223,409)，孢子(Ladner，U.S.Patent5,233,409)，質(zhì)粒(Cull，et al，1992.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865-1869)或在噬菌體上(Scott and Smith，1990.Science 249386-390；Devlin，1990.Science 249404-406；Cwirla，et al，1990.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.876378-6382；Felici，1991.J.MoLBi0l.222301-310；Ladner，U.S.Patent No.5,233,409).
試驗(yàn)是以細(xì)胞為基礎(chǔ)的試驗(yàn)，其中表達(dá)GPCR膜結(jié)合形式的細(xì)胞或其細(xì)胞表面生物學(xué)活性部分，加上pepducin，與試驗(yàn)化合物相接觸，并確定試驗(yàn)化合物結(jié)合GPCR和置換pepducin的能力。試驗(yàn)化合物可以結(jié)合在GPCR靶分子胞外平面、橫跨膜區(qū)域、或胞內(nèi)表面，同時(shí)抑制或提高GPCR的pepducin活化作用。例如，細(xì)胞可以源于哺乳動(dòng)物或酵母細(xì)胞。通過(guò)例如將pepducin與放射性同位素或酶催化標(biāo)記耦合來(lái)結(jié)合測(cè)試化合物，從GPCR中置換pepducin或其生物學(xué)活性部分，從而確定測(cè)試化合物從GPCR蛋白中置換pepducin的能力。做為選擇，測(cè)試化合物可以直接或間接地用125I、35S、14C，或3H，標(biāo)記，pepducin可以置換GPCR中的放射性標(biāo)記的試驗(yàn)化合物和通過(guò)射線傳播直接計(jì)數(shù)或閃爍計(jì)數(shù)檢測(cè)的游離的放射性標(biāo)記的試驗(yàn)化合物。做為選擇，試驗(yàn)化合物可以用例如，辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、或熒光素酶進(jìn)行酶催化標(biāo)記，依據(jù)pepducin的加入量，通過(guò)增加或減少適當(dāng)?shù)牡孜飳?duì)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)變檢測(cè)酶催化標(biāo)記。
在另一實(shí)施方案中，試驗(yàn)是以細(xì)胞為基礎(chǔ)的試驗(yàn)，包括在細(xì)胞表面上，將表達(dá)GPCR蛋白膜結(jié)合形式的細(xì)胞或其生物活性部分與試驗(yàn)化合物接觸，確定試驗(yàn)化合物調(diào)節(jié)(例如，刺激或抑制)用于GPCR的pepducin結(jié)合活性的能力。
確定試驗(yàn)分子對(duì)GPCR靶分子相互作用的能力可以通過(guò)上面描述的用于確定直接結(jié)合的方法之一完成。在一個(gè)實(shí)施方案中，確定試驗(yàn)分子抑制GPCR肽與GPCR靶分子相互作用的能力可以通過(guò)確定靶分子GCPR-pepducin復(fù)合物的活性來(lái)完成。例如，可以通過(guò)抑制GPCR靶分子細(xì)胞第二信使(即，胞內(nèi)Ca+、二脂酰甘油、IP3、等等)的GPCR-肽相互影響，檢測(cè)依賴于GPCR活化作用或抑制作用的催化/酶活性，檢測(cè)受體基因(包括與核酸編碼的可檢測(cè)標(biāo)記物，例如，熒光素酶可操作的連接的GPCR響應(yīng)性調(diào)節(jié)成分)的相互影響或抑制作用，或通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞反應(yīng)，例如，細(xì)胞生存，細(xì)胞分化，或細(xì)胞增殖，來(lái)確定靶分子的活性。
做為選擇，本發(fā)明的試驗(yàn)可以是一種細(xì)胞釋放試驗(yàn)，該試驗(yàn)包括將GPCR肽或其生物活性部分與試驗(yàn)化合物相接觸，確定試驗(yàn)化合物結(jié)合或調(diào)節(jié)(例如刺激或抑制)GPCR蛋白或其生物活性部分活性的能力。
試驗(yàn)化合物與GPCR的結(jié)合可以直接或間接地利用上述方法確定。例如，，試驗(yàn)包括將pepducin外加GPCR或其生物活性部分與一種已知的化合物相接觸，該已知的化合物能結(jié)合GPCR，從而形式一種試驗(yàn)混合物，將試驗(yàn)混合物與試驗(yàn)化合物相接觸，且確定試驗(yàn)化合物與GPCR蛋白相互作用的能力，其中確定試驗(yàn)化合物與GPCR蛋白相互作用的能力包括確定與已知的化合物相比，試驗(yàn)化合物優(yōu)選的結(jié)合GPCR或者其生物活性部分的能力。
例如，通過(guò)確定GPCR肽通過(guò)上面描述的用于確定直接結(jié)合的方法之一結(jié)合GPCR靶分子的能力，來(lái)確定試驗(yàn)化合物調(diào)節(jié)GPCR活性的能力。做為選擇，在確定試驗(yàn)化合物調(diào)節(jié)GPCR肽活性能力的同時(shí)，可以確定GPCR肽進(jìn)一步調(diào)節(jié)GPCR靶分子的能力。例如，如上所述，可以確定靶分子對(duì)適當(dāng)?shù)孜锏拇呋?酶活性。
細(xì)胞釋放試驗(yàn)包括將GPCR肽或其生物活性部分與一種已知化合物相接觸，該已知化合物能夠結(jié)合GPCR從而形成試驗(yàn)混合物，將試驗(yàn)混合物與試驗(yàn)化合物相接觸，并確定試驗(yàn)化合物與GPCR相互作用的能力，其中確定試驗(yàn)化合物與GPCR相互作用的能力包括確定GPCR肽優(yōu)選的結(jié)合或調(diào)節(jié)GPCR靶分子活性的能力。
本發(fā)明的細(xì)胞釋放試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)既能夠使用可溶形式的GPCR蛋白也能夠使用膜結(jié)合形式的GPCR蛋白。對(duì)于包括GPCR蛋白膜結(jié)合形式的細(xì)胞釋放試驗(yàn)，理想的是利用一種增溶劑，從而在溶液中維持GPCR蛋白的膜結(jié)合形式。這種增溶劑的例子包括非離子型洗滌劑例如n-辛烷基葡糖苷、n-十二烷基葡糖苷、n-十二烷基麥芽糖苷、辛酸-N-甲基葡萄糖酰胺、癸?；?N-甲基葡萄糖酰胺、Triton X-100、Triton X-114、Thesit、Isotridecypoly(乙二醇醚)n、N-十二烷基-N，N-二甲基-3-胺基-1-丙基磺酸鹽、3-(3-膽酰胺丙基)-1-丙基磺酸鹽(CHAPS)、或3-(3-膽酰胺丙基)二甲氨基-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CHAPSO)。
理想的情況是固定化GPCR肽或其靶分子，從而有利于復(fù)合物從一種或兩種蛋白的未復(fù)合形式中分離出來(lái)，同時(shí)調(diào)節(jié)試驗(yàn)的自動(dòng)化程度。在任何適于包含反應(yīng)物的導(dǎo)管中，可以完成試驗(yàn)化合物與GPCR蛋白的結(jié)合、或在存在候補(bǔ)化合物或不存在候補(bǔ)化合物的情況下GPCR蛋白與pepducin的相互作用。這些導(dǎo)管的例子包括微量滴定板、試管、和微離心管。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以提供一種融合蛋白，從而加入一種允許一個(gè)或兩個(gè)蛋白與基質(zhì)結(jié)合的區(qū)域。例如，GST-GPCR融合肽或GST-靶分子融合蛋白可以被吸附在谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，然后，與試驗(yàn)化合物結(jié)合，或與試驗(yàn)化合物和非吸附的靶分子蛋白或GPCR肽結(jié)合，在有助于復(fù)合物形成情況下(例如，在生理?xiàng)l件的鹽和pH條件下)培養(yǎng)混合物。培養(yǎng)之后，洗滌凝膠珠或微量滴定板小孔去掉任何未結(jié)合成分，在使用凝膠珠的情況下去除固定化的基質(zhì)，去除使用如上文所述直接或間接地確定的復(fù)合物。做為選擇，復(fù)合物可以從基質(zhì)處分離，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定GPCR肽結(jié)合水平或活性。
在本發(fā)明的篩選試驗(yàn)中同時(shí)使用了用于在基質(zhì)上固定化蛋白的其他技術(shù)。例如，利用生物素和抗生蛋白鏈菌素的結(jié)合可以固定化GPCR肽或它的靶分子。生物素化的GPCR肽或靶分子可以從生物素-NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)中使用本領(lǐng)域內(nèi)公知的技術(shù)(例如，生物素化試劑盒，Pierce Chemicals，Rockford，111)制備，并固定在抗生蛋白鏈菌素包衣的96孔板(Pierce Chemical)中。做為選擇，與GPCR肽或靶分子反應(yīng)，但不妨礙GPCR肽與其同族GPCR結(jié)合的抗體可以被衍生入孔板的小孔中，通過(guò)抗體結(jié)合在小孔中俘獲未結(jié)合的靶分子或GPCR肽。用于檢測(cè)這種復(fù)合物的方法，除了上面描述的用于GST固定化的復(fù)合物之外，還包括使用與GPCR肽靶分子反應(yīng)的抗體進(jìn)行的復(fù)合物的免疫檢測(cè)，和酶連接試驗(yàn)，所述酶連接試驗(yàn)依靠檢測(cè)與GPCR肽或者靶分子有關(guān)的酶活性。
在一種方法中能夠識(shí)別GPCR蛋白表達(dá)的調(diào)整基因，在該方法中，將細(xì)胞與一種候補(bǔ)化合物接觸并確定GPCR mRNA或蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)。存在候選化合物時(shí)的GPCR mRNA或蛋白的表達(dá)水平與不存在候選化合物時(shí)的GPCR mRNA或蛋白的表達(dá)水平相比較?；谶@種比較，可以識(shí)別作為GPCR mRNA或蛋白表達(dá)調(diào)整基因的候選化合物。例如，當(dāng)與不存在候選化合物相比，存在化合物時(shí)GPCR mRNA或蛋白的表達(dá)增大時(shí)(即，統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地增加)，候選化合物被鑒定為GPCR mRNA或蛋白表達(dá)的激發(fā)劑。做為選擇，當(dāng)與不存在候選化合物相比，存在化合物時(shí)GPCR mRNA或蛋白的表達(dá)減小時(shí)(即，統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地增加)，候選化合物被鑒定為GPCR mRNA或蛋白表達(dá)的抑制劑。通過(guò)這里描述的用于檢測(cè)GPCR mRNA或蛋白的方法可以確定在細(xì)胞中GPCR mRNA或蛋白表達(dá)的水平。
這里討論的肽的序列表示在下面的表3中





pepducin的肽部分，例如，來(lái)自i1環(huán)的肽部分，可能是能夠產(chǎn)生預(yù)定有益效果的任何適當(dāng)長(zhǎng)度的肽，通常長(zhǎng)度為5到15，或，例如，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30。
下面的合成方案和實(shí)施例描述了用于制備本發(fā)明pepducin化合物的方法。下面給出的方案、實(shí)施例和生物學(xué)數(shù)據(jù)是為了闡明本發(fā)明，而不是為了限定本發(fā)明的范圍或精神。
Pepducin組合物的制造和特性Covic et al.PNAS 99643-648(2002)描述了通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)Fmoc固相合成方法合成和制備的十六烷?；痯epducin肽。使用C18或C4逆相色譜法純化Pepducins達(dá)到＞95％純凈度并溶解于DMSO中。
腹膜內(nèi)注射甲苯噻嗪(10mg/kg)加氯胺酮(50mg/kg)麻醉6-8周大的成年雄性CF-I小鼠，用來(lái)進(jìn)行出血時(shí)間測(cè)定。用0.28×1.52mm規(guī)格的導(dǎo)管和P1pal-12(3μmoles/L)、P4pal-10(3μmoles/L)或單獨(dú)的介質(zhì)(DMSO)插入頸內(nèi)靜脈，在超過(guò)1min的時(shí)間內(nèi)輸入100μL的量。不看注射物質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。5min之后，從尾部切斷2mm。將切斷的尾部浸入裝有溫度維持在37度的磷酸鹽緩沖鹽水的燒杯中，隨后從視覺上測(cè)定出血和出血時(shí)間。如果在5min之內(nèi)重新開始出血，則被記錄為重出血并標(biāo)記為前述的不穩(wěn)定的止血情況。Lawet al，Nature 401，808(1999)。尾部被燒灼之后允許的最大出血時(shí)間是10min。
實(shí)施例1用溶于20％DMSO、或介質(zhì)(20％DMSO)中的2.5mg/kgpepducin制劑處理6到8周大的雌性CF-I小鼠，從而說(shuō)明如何通過(guò)本發(fā)明的pepducins有效地治療敗血病。選擇用于治療的時(shí)間點(diǎn)是通過(guò)盲腸結(jié)扎和穿刺(CLP)感應(yīng)到非致死性敗血病的時(shí)間點(diǎn)。在注射2.5mg/kg的首次劑量之后，連續(xù)6天每天對(duì)小鼠皮下注射1mg/kg的pepducin(或介質(zhì))。*4只出自介質(zhì)治療組的小鼠六天之后死亡；#一只出自x1/2i1LCA10 pepducin治療組的小鼠在第6天死亡，所有生存的小鼠在第17天死亡。圖5表示了結(jié)果。在左邊的示圖中，用x1/2pal16、x1/2i1LCA10或介質(zhì)(20％DMSO)在CLP點(diǎn)處理小鼠。在右邊的示圖中，每天都檢測(cè)小鼠體重。介質(zhì)治療的小鼠體重減輕非常嚴(yán)重，而pepducin治療的小鼠在開始減掉一部分重量之后，又有一定的增重。
實(shí)施例2只有少數(shù)關(guān)于充分治療敗血病的報(bào)導(dǎo)，尤其是在全身性炎癥反應(yīng)綜合癥發(fā)病之后。為了說(shuō)明敗血病發(fā)病之后，通過(guò)本發(fā)明的pepducins能夠有效地治療敗血病，用在40％DMSO、或介質(zhì)(40％DMSO)中的5.0mg/kg pepducin制劑處理小鼠。選擇的用于治療的時(shí)間點(diǎn)是通過(guò)盲腸結(jié)扎和穿刺(CLP)感應(yīng)非致死敗血病之后八小時(shí)。在用5.0mg/kg的首次劑量處理之后，從第2天到第3天每天皮下注射2.5mg/kg的pepducin(或介質(zhì))，從第3天到第6天每天皮下注射1.0mg/kg的pepducin(或介質(zhì))。CLP之后八小時(shí)，小鼠已經(jīng)有以敗血病為特征的全身性疾病的跡象，例如，毛皮發(fā)皺、活動(dòng)能力降低、食品和水的飲用量減少、和閉眼、眼睛發(fā)炎。圖6顯示了結(jié)果。在左邊的示圖中，*兩個(gè)出自介質(zhì)治療組的小鼠在第6天死亡。幸存的小鼠在第17天死亡。在右邊的示圖中，每天檢測(cè)小鼠的體重。
實(shí)施例3用本發(fā)明的pepducins處理小鼠，從而說(shuō)明pepducin治療炎癥的效用。圖7顯示了結(jié)果。由于過(guò)度嗜中性白細(xì)胞滲入肺中并活化，引起纖維蛋白沉積，造成成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)。敗血病可以引起具有高致命性的ARDS。示圖A和B進(jìn)行CLP和BAL 24小時(shí)之后小鼠死亡。嗜中性白細(xì)胞用Giemsa染色后計(jì)數(shù)，用ELISA調(diào)節(jié)TNF。相對(duì)于介質(zhì)處理組C.肺組織學(xué)*p＜0.02。CLP之后48小時(shí)小鼠死亡。
實(shí)施例4本實(shí)施例說(shuō)明如何使用pepducin療法緩解敗血病的其他方面。全身性炎癥反應(yīng)，在DIC中，使用幾種促炎癥細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)纖維蛋白溶解和凝結(jié)物紊亂。流血時(shí)間的改變和D-二聚體的增加是纖維蛋白溶解過(guò)度負(fù)調(diào)節(jié)的產(chǎn)物，是分散的血管內(nèi)凝聚物的特點(diǎn)，導(dǎo)致循環(huán)中纖維蛋白的普遍沉淀，造成敗血病患者的多器官衰竭和死亡。圖8表示了結(jié)果。A.在CLP之后24小時(shí)測(cè)定流血時(shí)間，并馬上開始治療。在介質(zhì)治療的小鼠體內(nèi)流血時(shí)間縮短，而i1-環(huán)pepducin x1/2i1 LCA 10-或i3環(huán)pepducin x1/2pal16-治療的小鼠表現(xiàn)出正常的流血事件。B.CLP之后48小時(shí)測(cè)定D-二聚體水平。作為纖維蛋白沉淀量的代替標(biāo)志，CLP之后D-二聚體增加，在用介質(zhì)治療的小鼠體內(nèi)D-二聚體增加的程度大于用CXCR2 pepducin治療的小鼠體內(nèi)的增加程度。C.CLP之后8小時(shí)處理的小鼠流血時(shí)間的描述。D.CLP之后8小時(shí)處理的小鼠體內(nèi)D-二聚體水平的描述。
實(shí)施例5為了說(shuō)明炎癥疾病pepducin治療的效用，在修飾的48孔微趨化室中進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn)。1mio嗜中性粒細(xì)胞/ml允許向著下面小孔中細(xì)胞趨化因子方向移動(dòng)。用0.2％DMSO或pepducin在指示濃度下預(yù)處理嗜中性粒細(xì)胞。N＝3。圖9表示了結(jié)果。
實(shí)施例6為了說(shuō)明體內(nèi)炎癥疾病pepducin治療法的效用，在小鼠體內(nèi)進(jìn)行趨化試驗(yàn)。向小鼠注射1ml的3％硫代乙二醇酸i.p.。硫代乙二醇酸能夠誘導(dǎo)腹膜巨噬細(xì)胞成為秘密細(xì)胞因子，且白細(xì)胞重新進(jìn)入腹膜腔。按照指示的劑量注射i.v.pepducin。4小時(shí)之后，灌洗腹膜收集細(xì)胞，用Giemsa染色，在放大倍率為40的放大鏡下計(jì)數(shù)。
實(shí)施例7已經(jīng)證明SDF-1α和CXCR4涉及從骨髓中吸收未成熟的嗜中性粒細(xì)胞。高水平的CXCR4表達(dá)和活化能夠?qū)е滤ダ系氖戎行粤＜?xì)胞進(jìn)入骨髓，而趨化因子對(duì)嗜中性粒細(xì)胞CXCR2受體的作用，即，對(duì)KC，Gro-α或IL-8的作用能夠?qū)е率戎行粤＜?xì)胞遷移的增加。在CLP之后第1、3、5、7和17天取血，計(jì)算白血球數(shù)量。在用介質(zhì)治療的小鼠體內(nèi)觀察到白細(xì)胞的初始下降。但是，在敗血病3天后，這些小鼠顯示出較高的外周白細(xì)胞水平，外周白細(xì)胞一直維持較高的水平知道實(shí)驗(yàn)結(jié)束。在x4i1pal12治療的小鼠體內(nèi)，白細(xì)胞水平立即增加，但在CLP之后5天下降到非常低的水平。之前報(bào)道過(guò)CXCR4的阻礙作用和CXCR2的刺激作用導(dǎo)致小鼠外周血中嗜中性白細(xì)胞增多，這一觀察結(jié)果與之前的報(bào)道十分吻合。在x4i1pal12治療之后外周血白細(xì)胞的增多表示CXCR2阻塞預(yù)防外周血中嗜中性白細(xì)胞增多。圖11表示了結(jié)果。
實(shí)施例8在修飾的48孔微趨化室中進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn)。1mio嗜中性粒細(xì)胞/ml允許向著下面小孔中細(xì)胞趨化因子方向移動(dòng)。用0.2％DMSO或pepducin在指示濃度下預(yù)處理嗜中性粒細(xì)胞。N＝3。圖12表示本發(fā)明的i1環(huán)pepducin具有有效的和選擇性的抗炎癥反應(yīng)活性。
實(shí)施例9在修飾的48孔微趨化室中進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn)。1mio嗜中性粒細(xì)胞/ml允許向著下面小孔中CCR1，CCR3和CCR5(20ng/mL)的Rantes配體方向移動(dòng)。用0.2％DMSO或pepducin在指示濃度下預(yù)處理嗜中性粒細(xì)胞。N＝3。圖13表示本發(fā)明的i1環(huán)pepducin具有有效的和選擇性的抗炎癥反應(yīng)活性。
實(shí)施例10由于器官衰竭能夠決定患有SIRS的病人的結(jié)果，所以要觀察肝臟功能。在CLP處理之后24小時(shí)處死小鼠，并測(cè)定ALT的血漿水平，ALT是一種增加肝臟功能損失的酶。在空白治療組小鼠體內(nèi)，即，進(jìn)行腹部切割但不進(jìn)行盲腸結(jié)扎和穿刺的小鼠體內(nèi)，沒有觀察到ALT的升高。介質(zhì)和x4pal12治療的小鼠表現(xiàn)出ALT的增加，用x1/2pal16和x1/2LCA10治療的小鼠也可以觀察到增加，但與介質(zhì)處理的小鼠相比，這一增加非常少。圖22表示了結(jié)果，即CXCR2 pepducin可以用于改善肝臟功能。
實(shí)施例11對(duì)6到8周大的雌性CF-I小鼠進(jìn)行CLP。在右邊的示圖中，用x4i1pal12或介質(zhì)(20％DMSO)在CLP時(shí)間點(diǎn)處理小鼠。在2.5mg/kg的初始劑量之后，連續(xù)6天每天小鼠受到1mg/kg的pepducin或介質(zhì)。在左邊的示圖中，每天檢測(cè)小鼠體重。圖23表示了結(jié)果。
實(shí)施例12研發(fā)了一種基于受體第一胞內(nèi)環(huán)(i1)的更具選擇性的PAR4pepducin。由于i1環(huán)位于受體上相對(duì)于i3環(huán)相反的位置，基于PAR4的i1環(huán)pepducin顯示降低的或非交叉抑制的PAR1。PAR4在HEK細(xì)胞中單獨(dú)表達(dá)或與PAR1聯(lián)合表達(dá)。PAR4 i1 pepducin，P4pal-i1在HEK細(xì)胞中完全封鎖PAR4的趨化反應(yīng)，預(yù)防與圖24A-B所表示的肽配體AYPGKF(SEQ ID NO.34)的血小板凝聚作用。P4pal-i1對(duì)PAR4具有選擇性，它既不抑制PAR1的趨化反應(yīng)，也絲毫不抑制圖24A和C所示PAR1肽配體SFLLRN(SEQ IDNO.35)的血小板凝聚。PAR1與PAR4共表達(dá)說(shuō)明形成了PAR1與PAR4的復(fù)合物，即使在這種情況下，P4pal-i1也不抑制PAR1，結(jié)合i1 pepducin的PAR4一點(diǎn)也不影響來(lái)自PAR1的信號(hào)。同樣的，當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)，P4pal-i1僅對(duì)3nM凝血酶的血小板凝聚有較小的作用，這是因?yàn)槟高€活化PAR1(圖24D)。但是，當(dāng)與PAR1拮抗劑聯(lián)合使用時(shí)，RWJ-56110，P4pal-i1有效的抑制3nM凝血酶的凝聚。因此，單獨(dú)靶向PAR1或PAR4對(duì)凝血酶凝聚的作用有限，而PAR1和PAR4同時(shí)發(fā)生的抑制作用在妨礙凝血酶反應(yīng)方面是有效的，因此降低或抑制血栓癥。
實(shí)施例13考察比伐蘆定對(duì)血小板PAR1和PAR4反應(yīng)的作用，并評(píng)估凝血酶-PAR1相互作用抑制性結(jié)合PAR4封鎖對(duì)血小板凝聚的作用。為了防止凝血酶結(jié)合到PAR1的Hir位點(diǎn)，使用以納米摩爾的親和力結(jié)合凝血酶的比伐蘆定(aka Hirulog，AngiomaxTM)。盡管比伐蘆定已經(jīng)廣泛的用于治療患有急性冠脈綜合癥的病人，但是現(xiàn)有技術(shù)尚未確定比伐蘆定對(duì)PAR1和PAR4依賴型血小板活化的作用。單獨(dú)使用比伐蘆定或使用比伐蘆定與RWJ-56110的加合能夠使PAR4依賴型凝聚作用的凝血酶活化EC50值(10-11nM)與PAR1-Ab(圖25A)相同。在濃度大于11 nM的情況下，凝血酶恢復(fù)PAR4依賴型凝聚作用活性，即使在補(bǔ)充RWJ-56110和PAR1封閉抗體加比伐蘆定的時(shí)候。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，任何Hir封閉試劑都不能完全防止凝血酶活化位點(diǎn)與血小板PAR4的相互作用。但是，向比伐蘆定處理的血小板中加入PAR4 pepducin、P4pal-i1能夠極大地延緩和抑制凝聚作用，即使在很高的凝血酶(12-16nM)濃度下(圖25B)。這些數(shù)據(jù)揭露了這種凝血酶對(duì)接的PAR1 Hir基序提高PAR4活化作用的機(jī)制，但在足夠高的凝血酶濃度下，除非用PAR4 pepducin封閉下游，否則PAR4被凝血酶活化。
實(shí)施例14使用比伐蘆定與PAR4 pepducin的結(jié)合來(lái)預(yù)防豚鼠的動(dòng)脈血栓癥。使用標(biāo)準(zhǔn)頸動(dòng)脈傷害模型來(lái)評(píng)估同時(shí)給藥比伐蘆定與PAR4 pepducin對(duì)豚鼠動(dòng)脈血栓癥的療效。與血小板中缺少PAR1的小鼠不同，豚鼠的血小板與人類的血小板在功能上具有相似性，能夠表達(dá)PAR1和PAR4。與先前使用水蛭素的結(jié)果一致，單獨(dú)使用比伐蘆定(0.18mg/kg)能夠?qū)?dòng)脈閉合平均時(shí)間由13分鐘延長(zhǎng)至20分鐘，盡管并不顯著(圖26)。P4pal-i1(0.13mg/kg)以更小的程度延長(zhǎng)閉合時(shí)間。比伐蘆定與P4pal-i1共同給藥起到顯著的(p＝0.0001)保護(hù)作用，防止急性靜脈閉合。如RWJ-58259所顯示的一樣，使用PAR1 pepducin，P1pal-7的單獨(dú)PAR1封閉只能部分的抵御動(dòng)脈血栓。與P4pal-i1相比，補(bǔ)充帶有比伐蘆定的P1pal-7并不另外延長(zhǎng)動(dòng)脈的單獨(dú)閉合時(shí)間。這些體內(nèi)數(shù)據(jù)一起表明，PAR4必須被封閉才能達(dá)到顯著的預(yù)防血栓癥的效果。
這種實(shí)驗(yàn)支持早期用PAR1和PAR4 pepducin拮抗劑和阻斷抗體的觀測(cè)結(jié)果，即只靶向PAR1而非PAR4也許只能獲得有限的治療效果。作為可選擇的治療方案，預(yù)防PAR1 Hir基序與凝血酶的相互作用具有雙重的利益，既可以直接抑制PAR1有可以間接地抑制PAR4。這些數(shù)據(jù)第一次說(shuō)明普遍使用的抗血栓劑，比伐蘆定在妨礙PAR1和PAR4依賴的血小板凝聚的凝血酶活化方面是有效的。比伐蘆定(bivalirudin)與PAR4 pepducin而不是PAR1pepducin結(jié)合能夠預(yù)防急性動(dòng)脈血栓癥。
實(shí)施例15本發(fā)明的Pepducins用來(lái)中止已發(fā)生的全身性炎癥和血管損傷，同時(shí)在沒有宿主防衛(wèi)干預(yù)的情況下預(yù)防逐級(jí)凝聚，本發(fā)明的i1 pepducins，例如，基于CXCR1/2的i1 pepducins并不交叉抑制CXCR4.。i1 pepducins完全阻斷其同族受體對(duì)人類和小鼠嗜中性粒細(xì)胞的趨化反應(yīng)。x1/2LCA-i1對(duì)CXCR1/2 IL-8受體具有選擇性，不抑制人或小鼠白細(xì)胞向SDF-Iα的移動(dòng)。同樣，即使當(dāng)與CXCR1或CXCR2共同表達(dá)的時(shí)候，x1/2LCA-i1也不抑制CXCR4。這些數(shù)據(jù)表明，如果CXCR1和CXCR4受體形成了復(fù)合物，CXCR1的結(jié)合i1 pepducin也不會(huì)影響來(lái)自CXCR4的信號(hào)傳輸。
在小鼠體內(nèi)，評(píng)估CXCR1/2和CXCR4 pepducins對(duì)嗜中性白細(xì)胞在正常非促炎性情況下達(dá)到體內(nèi)平衡的效果。在巰基醋酸鹽腹膜炎模型中首先評(píng)估白細(xì)胞補(bǔ)充。x1/2pal-i3和x1/2LCA-i1-pepducins完全地抑制嗜中性白細(xì)胞移入腹膜腔，其IC50值分別為0.03mg/kg和0.15mg/kg。相反地，用CXCR4拮抗劑、x4pal-i1(EC50-0.1mg/kg)處理的小鼠其腹膜內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞顯示大幅度增加。
在健康且未經(jīng)治療的小鼠體內(nèi)評(píng)估趨化因子pepducins對(duì)外周的白細(xì)胞計(jì)數(shù)的長(zhǎng)期作用影響。Pepducins以sub-Q(第一天2.5mg/kg，第2-6天1.0mg/kg)的劑量每日注射一次，且在超過(guò)一星期之后測(cè)量循環(huán)的白細(xì)胞水平。在健康的小鼠體內(nèi)，與介質(zhì)治療老鼠相比，x1/2pal-i3或x1/2LCA-i1都不改變白細(xì)胞計(jì)數(shù)。相反，x4pal-i1引起外周血中白細(xì)胞增多，這一點(diǎn)與上述研究一致。趨化因子pepducins對(duì)外周白細(xì)胞計(jì)數(shù)的效果與在經(jīng)受盲腸結(jié)扎和穿刺(CLP)的患有敗血病的小鼠體內(nèi)的效果十分相似。CLP之后24小時(shí)，介質(zhì)治療的小鼠顯示最初的白血球減少，然后在第3天白細(xì)胞增多。每日一次給藥x1/2pal-i3或x1/2LCA-i1，保持CLP小鼠的嗜中性白細(xì)胞計(jì)數(shù)在正常范圍內(nèi)，而x4pal-i1導(dǎo)致第1天白細(xì)胞增多加速和第7天白血球減少。這些數(shù)據(jù)一起表明，在小鼠正常的和促炎癥狀態(tài)下，CXCR2和CXCR4受體對(duì)嗜中性白細(xì)胞體內(nèi)平衡起到相反作用。
試驗(yàn)趨化因子受體pepducins對(duì)于防止或有可能的話逆轉(zhuǎn)老鼠致命的CLP腹膜炎進(jìn)展的能力。在實(shí)驗(yàn)的第一步，CLP步驟之后立即給與2.5mg/kg.劑量的pepducins。隨后的劑量是1mg/kg，直到第6天停止治療。不對(duì)小鼠進(jìn)行抗生素療法。可以觀察到使用x1/2LCA-i1和x1/2pal-i3 pepducins治療的敗血病導(dǎo)致死亡率非常顯著的降低。令人驚訝的是，在超過(guò)17天的觀察期中，只有1/34只pepducin治療的小鼠死亡，而17/17只未經(jīng)治療的小鼠在第9天死亡。盡管在第6天停止給藥CXCR1/2pepducin治療劑，其后的存活率幾乎還保持100％。
敗血病的診斷經(jīng)常被耽擱，且試劑不容易以預(yù)防的方式給藥，所以，直到CLP步驟8小時(shí)之后再開始pepducin治療。即使延期治療，與未經(jīng)治療的老鼠相比，仍能觀察到高度顯著減少的死亡率。在延遲CXCR1/2 pepducin治療的小鼠中全部存活率是26/30，而與之相反，未經(jīng)治療的老鼠的存活率是0/20。給藥CXCR4 pepducin、x4pal-i1不會(huì)影響存活。即使pepducin治療劑被推遲給藥8小時(shí)，CXCR1/2-pepducin治療的小鼠體重增加，而且是有活力的，且在一天之后仍能維持正常的行為。
帶有pepducin的CXCR1/2信號(hào)傳遞的阻塞顛倒了許多敗血病小鼠體內(nèi)已經(jīng)建立的SIRS標(biāo)準(zhǔn)。首先，檢測(cè)CXCR1/2 pepducin對(duì)系統(tǒng)KC水平的作用和鼠IL-8直向同源物。在未治療的小鼠體內(nèi)，CLP之后16小時(shí)KC水平升高，且在至少48小時(shí)中保持上升趨勢(shì)。隨后，在第8小時(shí)時(shí)間點(diǎn)給藥CXCR1/2 pepducin，系統(tǒng)KC值快速下降，此后一直保持較低水平。許多未治療的CLP小鼠早在24小時(shí)就開始tachypnic和血氧不足，這些狀況與死亡率密切相關(guān)。在敗血病過(guò)程中，細(xì)菌內(nèi)毒素刺激肺上皮細(xì)胞分泌IL-8，IL-8能夠使白細(xì)胞復(fù)原并激活白細(xì)胞。造成的嗜中性白細(xì)胞貯備現(xiàn)象導(dǎo)致肺損傷。CLP之后4小時(shí)，未治療的小鼠體內(nèi)支氣管肺泡灌洗(BAL)液中嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量增加了100倍，在8小時(shí)后，上升到200-300倍。用x1/2pal-i3或x1/2LCA-i1治療8小時(shí)后，BAL中嗜中性粒細(xì)胞的量快速下降，并穩(wěn)定在較低水平。對(duì)未治療的CLP小鼠在48小時(shí)進(jìn)行腹部組織學(xué)分析，顯示出肺泡病變、白細(xì)胞滲透和大范圍的纖維蛋白沉淀。x1/2pal-i3和x1/2LCA-i1提供一種針對(duì)纖維蛋白沉淀的有效的保護(hù)，肺泡表現(xiàn)出組織學(xué)上正常。CXCR1/2 pepducin還能完全封鎖白細(xì)胞穿過(guò)LPS-模擬的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞層的遷徙。同樣的，CXCR1/2pepducin能夠預(yù)防人巨噬細(xì)胞的IL-8依賴型趨化現(xiàn)象，但不能預(yù)防單核細(xì)胞的，這一點(diǎn)與期望的一樣。CXCR1/2 pepducin顯著的抑制了小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞遷徙入腹膜腔。這些數(shù)據(jù)一起表明，pepducin通過(guò)阻礙任何細(xì)胞形式的CXCR1/2受體來(lái)發(fā)揮其治療效果。
肝功能衰竭是嚴(yán)重的敗血癥的常見后果。CLP后馬上用CXCR1/2 pepducin治療，能夠減少肝功能損傷，這一點(diǎn)可以由肝臟酶水平(AST、ALT)降低52％-87％證明，而CXCR4 pepducin、x4pal-i1則沒有這一功能。當(dāng)CXCR1/2 pepducin治療起始于CLP之后8小時(shí)時(shí)，血漿中AST和ALT水平的上升趨勢(shì)于第16小時(shí)停止，之后降低到正常水平附近。這些數(shù)據(jù)一起表明，帶有pepducin的CXCR1/2信號(hào)傳導(dǎo)的阻塞顛倒了許多敗血病小鼠體內(nèi)已經(jīng)建立的SIRS標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明這種途徑對(duì)于高級(jí)疾病的建立是有益的。
在許多未治療的CLP小鼠體內(nèi)可以觀察到自然發(fā)生的流血和血栓癥的發(fā)展，這一點(diǎn)與分散的血管內(nèi)凝聚(DIC)一致。因此，通過(guò)測(cè)量血小板技術(shù)和D-二聚體水平，增加的纖維蛋白產(chǎn)物標(biāo)記物和和隨后DIC過(guò)程中發(fā)生的纖維蛋白溶解可以觀察到全身性血小板活化。CXCR1/2 pepducin在第24小時(shí)顯著的預(yù)防了血小板減少癥，即使pepducin治療延遲到CLP之后8小時(shí)才進(jìn)行。在未處理的小鼠體內(nèi)，CLP過(guò)程之后48小時(shí)，發(fā)現(xiàn)D-二聚體的水平有了顯著的提高。但是，x1/2pal-i3和x1/2LCA-i1治療的小鼠表現(xiàn)出D-二聚體水平的顯著降低。當(dāng)CXCR1/2 pepducin治療延遲到CLP過(guò)程之后8小時(shí)時(shí)，D-二聚體水平依舊降低60-70％。這些數(shù)據(jù)首次表明CXCR2的阻塞緩解了明顯的敗血病癥產(chǎn)生的凝血功能不全。
近來(lái)的研究使用缺乏功能性CXCR2受體的小鼠進(jìn)行，這一研究顯示出CLP敗血病模型增加的存活率，但是這一存活率仍然比本試驗(yàn)的觀察結(jié)果高3-4倍。與CXCR2消除作用相關(guān)的Pepducin治療之后改進(jìn)的存活結(jié)果是由于多種原因造成的。CXCR2(-/-)小鼠在其整個(gè)生命期內(nèi)都缺乏CXCR2，同時(shí)具有其他的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)缺陷，因此要分辨急性CXCR2特異性作用和非正常骨髓組織增生造成的補(bǔ)償性機(jī)制是十分困難的。使用的CF-I小鼠是野生型動(dòng)物的遠(yuǎn)系繁殖產(chǎn)物，對(duì)CLP帶來(lái)的嚴(yán)重的免疫系統(tǒng)挑戰(zhàn)具有生存優(yōu)勢(shì)。值得注意的是，抗-CXCR1/2pepducin不抑制白細(xì)胞向著其他趨化因子，例如細(xì)菌fMLP遷徙，因此，pepducin的作用是免疫調(diào)節(jié)而不是免疫抑制。而且，pepducin技術(shù)的應(yīng)用有助于驗(yàn)證基因敲除的作用，并提供關(guān)于復(fù)雜疾病，例如敗血病病因和治療方法的進(jìn)一步見解。
等價(jià)物本領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用不多于常規(guī)技術(shù)手段的實(shí)驗(yàn)方法就可以認(rèn)出，或能夠確認(rèn)這里描述的具體過(guò)程的多種等價(jià)物。這些等價(jià)物應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為處于在本發(fā)明的范圍內(nèi)且被所附權(quán)利要求書所包括。在不脫離權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明的范圍和精神的條件下，本發(fā)明還可以有多種替代、改變和修飾。本發(fā)明范圍內(nèi)還包括其他方面、優(yōu)點(diǎn)和修飾。本申請(qǐng)引用的所有參考文獻(xiàn)、授權(quán)的專利和公開專利通過(guò)引證在此全部并入本文?？梢赃x擇這些專利、申請(qǐng)和其他文件的適合的成分、過(guò)程和方法用于本發(fā)明和其實(shí)施方案。
權(quán)利要求
1.一種嵌合多肽，包括a)G蛋白耦合受體(GPCR)第一胞內(nèi)環(huán)(il-環(huán))的第一區(qū)域或其片段；和b)與第一區(qū)域相附著的第二區(qū)域，其中第二區(qū)域是天然存在的或非天然存在的細(xì)胞滲透、膜限制疏水性部分，其中，第一區(qū)域不包括GPCR的天然胞外環(huán)部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合多肽，其中，該嵌合多肽與與其同類GPCR結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合多肽，其中，疏水性部分附著于N-末端、C-末端、C-末端或N-末端之間的氨基酸或第一區(qū)域的N-末端和C-末端。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合多肽，其中，疏水性部分是脂質(zhì)體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的嵌合多肽，其中疏水性部分選自由壬酰(C9)；辛酰基(C10)；十一酰(C11)；月桂酰(C12)；十三烷酰(C13)；十四酰(C14)；十五酰(C15)；十六酰(C16)；植烷酰(甲基取代的C16)；十七酰(C17)；硬脂酰(C18)；十九酰(C19)；arachidoyl(C20)；heniecosanoyl(C21)；behenoyl(C22)；trucisanoyl(C23)；和一種lignoceroyl(C24)部分所組成的組，其中，疏水性部分附著與具有酰胺鍵、巰基、胺、醇類、苯酚基或碳-碳鍵的嵌合多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的嵌合多肽，其中疏水性部分是十六酰部分。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的嵌合多肽，其中疏水性部分是石膽酸或其鹽。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的嵌合多肽，其中疏水性部分選自由膽固醇、磷脂、類固醇、神經(jīng)鞘氨醇、N-脂?；拾贝?、辛基-甘氨酸、2-環(huán)己基丙氨酸、安息香苯基丙氨酸、C1或C2?；鶊F(tuán)、或C3-C8脂肪酸所組成的組。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合多肽，其中第一區(qū)域包括一種蛋白酶活化受體(PAR)或一種趨化因子受體；第二區(qū)域包括一種脂質(zhì)部分。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的嵌合多肽，其中，蛋白酶活化受體選自由PAR1，PAR2，PAR3，和PAR4所組成的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的嵌合多肽，其中趨化因子受體選擇由CCR或CXCR受體所組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的嵌合多肽，其中CCR受體選自由CCR1，CCR2，CCR3，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR8，和CCR9所組成的組。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的嵌合多肽，其中CCR受體選自由CXCR1，CXCR2，CXCR3，CXCR4，CXCR5，CXCR6和CX3CR1所組成的組。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的嵌合多肽，其中趨化因子受體選自由NK15 NK2，MLT2，GRP/韓蛙皮素受體，F(xiàn)PR1，F(xiàn)PRL-I，C3Ar，OR受體所組成的組。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合多肽，其中G蛋白耦合受體或其片斷選自由促黃體生成激素受體；促卵泡激素受體；促甲狀腺激素受體；降血鈣素受體；EDG受體；內(nèi)皮素(ET)受體；胰高血糖素受體；胰高血糖素樣肽1受體(GLP-I)；代謝型谷氨酸受體；甲狀旁腺激素受體；血管活性腸肽受體；分泌素受體；生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)受體；蛋白酶-活化受體(PARs)；縮膽囊肽受體；生長(zhǎng)刺激抑制素受體；黑皮質(zhì)素受體；ADP受體；腺苷受體；促血栓素受體；血小板活化因子受體；腎上腺素能受體；5-HT受體；CXCR4；CCR5；趨化因子受體；神經(jīng)肽受體；鴉片樣物質(zhì)受體；甲狀旁腺激素(PTH)受體；神經(jīng)鞘氨醇-1-磷酸受體或血管活性腸肽(VIP)受體所組成的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合多肽，其中該片斷是分離的胞內(nèi)片斷。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合多肽，其中該片斷是分離的胞外片斷。
18.一種藥物組合物，包括權(quán)利要求1所述嵌合多肽和一種藥學(xué)上可接受的載體。
19.一種試劑盒，包括在一個(gè)或一個(gè)以上的容器中的權(quán)利要求18所述的藥物組合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合多肽，其中G蛋白耦合受體是哺乳動(dòng)物的G蛋白耦合受體。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合多肽，其中，G蛋白耦合受體選自由CCKA、CCKB、SSTR2和SubP受體所組成的組。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合多肽，其中疏水性部分是類固醇。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合多肽，其中疏水性部分選自由磷脂、類固醇、神經(jīng)鞘氨醇、N-脂?；拾贝?、辛基-甘氨酸、2-環(huán)己基丙氨酸、安息香苯基丙氨酸所組成的組。
24.在哺乳動(dòng)物體內(nèi)治療或預(yù)防敗血病的方法，包括診斷需要治療的患者，并向需要治療的患者給藥嵌合多肽，該嵌合多肽包括G蛋白耦合受體(GPCR)第一胞內(nèi)環(huán)(il-環(huán))的第一區(qū)域或其片段；和與第一區(qū)域相附著的第二區(qū)域，其中第二區(qū)域是天然存在的或非天然存在的細(xì)胞滲透、膜限制疏水性部分。
25.治療或預(yù)防炎癥的方法，包括診斷需要治療的患者，并向向需要治療的患者給藥嵌合多肽，該嵌合多肽包括G蛋白耦合受體(GPCR)第一胞內(nèi)環(huán)(il-環(huán))的第一區(qū)域或其片段；和與第一區(qū)域相附著的第二區(qū)域，其中第二區(qū)域是天然存在的或非天然存在的細(xì)胞滲透、膜限制疏水性部分。
26.治療或預(yù)防血管新生的方法，包括診斷需要治療的患者，并向向需要治療的患者給藥趨化因子抑制性pepducin，趨化因子抑制性pepducin包括一種嵌合多肽，該嵌合多肽包括G蛋白耦合受體(GPCR)第一胞內(nèi)環(huán)(il-環(huán))的第一區(qū)域或其片段；和與第一區(qū)域相附著的第二區(qū)域，其中第二區(qū)域是天然存在的或非天然存在的細(xì)胞滲透、膜限制疏水性部分。
27.治療或預(yù)防炎癥性疾病的方法，包括診斷需要治療的患者，并向向需要治療的患者給藥嵌合多肽，該嵌合多肽包括G蛋白耦合受體(GPCR)第一胞內(nèi)環(huán)(il-環(huán))的第一區(qū)域或其片段；和與第一區(qū)域相附著的第二區(qū)域，其中第二區(qū)域是天然存在的或非天然存在的細(xì)胞滲透、膜限制疏水性部分。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述炎癥性疾病選自由僵直性脊椎炎、頸關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、內(nèi)臟局部缺血、青年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰骶關(guān)節(jié)炎骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性疾病、變形性關(guān)節(jié)炎、濕疹、牛皮癬、皮炎、葡萄膜炎和結(jié)膜炎、哮喘和支氣管炎、潰瘍、齒齦炎、克羅恩氏病、萎縮性胃炎、胃炎varialoforme、潰瘍性結(jié)腸炎、乳糜瀉、節(jié)段性回腸炎、消化性潰瘍生成、pyresis、膀胱疼痛和膀胱炎、中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的炎性神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、多發(fā)性硬化、炎癥性神經(jīng)病和AIDS神經(jīng)學(xué)上的并發(fā)癥、自身免疫炎癥、或外科創(chuàng)傷所組成的組。
29.治療或預(yù)防局部缺血再灌注創(chuàng)傷的方法，包括診斷需要治療的患者，并向向需要治療的患者給藥嵌合多肽，該嵌合多肽包括G蛋白耦合受體(GPCR)第一胞內(nèi)環(huán)(il-環(huán))的第一區(qū)域或其片段；和與第一區(qū)域相附著的第二區(qū)域，其中第二區(qū)域是天然存在的或非天然存在的細(xì)胞滲透、膜限制疏水性部分。
30.治療或減輕癌癥嚴(yán)重程度的方法，包括診斷需要治療的患者，并向向需要治療的患者給藥嵌合多肽，該嵌合多肽包括G蛋白耦合受體(GPCR)第一胞內(nèi)環(huán)(il-環(huán))的第一區(qū)域或其片段；和與第一區(qū)域相附著的第二區(qū)域，其中第二區(qū)域是天然存在的或非天然存在的細(xì)胞滲透、膜限制疏水性部分。
31.治療或減輕血栓癥嚴(yán)重程度的方法，包括診斷需要治療的患者，并向向需要治療的患者給藥嵌合多肽，該嵌合多肽包括G蛋白耦合受體(GPCR)第一胞內(nèi)環(huán)(il-環(huán))的第一區(qū)域或其片段；和與第一區(qū)域相附著的第二區(qū)域，其中第二區(qū)域是天然存在的或非天然存在的細(xì)胞滲透、膜限制疏水性部分。
32.一種嵌合抗體，包括D1(ILKMKVKKPAV)，其中D1是自然或非自然發(fā)生的細(xì)胞滲透部分膜限制疏水性部分，附著在多肽序列的任一末端。
33.一種嵌合抗體，包括D1(ATQAPRLPST)，其中D1是自然或非自然發(fā)生的細(xì)胞滲透部分膜限制疏水性部分，附著在多肽序列的任一末端。
34.一種嵌合抗體，包括D1(VLATGAPRLPST)，其中D1是自然或非自然發(fā)生的細(xì)胞滲透部分膜限制疏水性部分，附著在多肽序列的任一末端。
35.一種嵌合抗體，包括D1(ATGAPRLPST)，其中D1是自然或非自然發(fā)生的細(xì)胞滲透部分膜限制疏水性部分，附著在多肽序列的任一末端。
36.一種嵌合抗體，包括D1(FLFRTKKKHP AV)，其中D1是自然或非自然發(fā)生的細(xì)胞滲透部分膜限制疏水性部分，附著在多肽序列的任一末端。
37.一種嵌合抗體，包括D1(ILYSRV GRSVTD)，其中D1是自然或非自然發(fā)生的細(xì)胞滲透部分膜限制疏水性部分，附著在多肽序列的任一末端。
38.一種嵌合抗體，包括D1(YSRVGRS VTD)，其中D1是自然或非自然發(fā)生的細(xì)胞滲透部分膜限制疏水性部分，附著在多肽序列的任一末端。
39.一種嵌合抗體，包括D1(YQKKLRSMTD)，其中D1是自然或非自然發(fā)生的細(xì)胞滲透部分膜限制疏水性部分，附著在多肽序列的任一末端。
40.一種嵌合抗體，包括D1(MGYQKKLRSMTD)，其中D1是自然或非自然發(fā)生的細(xì)胞滲透部分膜限制疏水性部分，附著在多肽序列的任一末端。
41.一種嵌合抗體，包括D1(KRLKSMTD)，其中D1是自然或非自然發(fā)生的細(xì)胞滲透部分膜限制疏水性部分，附著在多肽序列的任一末端。
42.一種嵌合抗體，包括D1(LINCKRLKSMTD)，其中D1是自然或非自然發(fā)生的細(xì)胞滲透部分膜限制疏水性部分，附著在多肽序列的任一末端。
43.一種嵌合抗體，包括D1(VLATQAPRLPST)，其中D1是自然或非自然發(fā)生的細(xì)胞滲透部分膜限制疏水性部分，附著在多肽序列的任一末端。
44.嵌合多肽在制備用于治療或預(yù)防敗血病的藥物中的應(yīng)用，其中該嵌合多肽包括G蛋白耦合受體(GPCR)第一胞內(nèi)環(huán)(il-環(huán))的第一區(qū)域或其片段；和與第一區(qū)域相附著的第二區(qū)域，其中第二區(qū)域是天然存在的或非天然存在的細(xì)胞滲透、膜限制疏水性部分。
45.嵌合多肽在制備用于治療或預(yù)防炎癥的藥物中的應(yīng)用，其中該嵌合多肽包括G蛋白耦合受體(GPCR)第一胞內(nèi)環(huán)(il-環(huán))的第一區(qū)域或其片段；和與第一區(qū)域相附著的第二區(qū)域，其中第二區(qū)域是天然存在的或非天然存在的細(xì)胞滲透、膜限制疏水性部分。
46.包括嵌合多肽的趨化因子抑制性pepducin在制備用于治療或預(yù)防血管新生的藥物中的應(yīng)用，其中該嵌合多肽包括G蛋白耦合受體(GPCR)第一胞內(nèi)環(huán)(il-環(huán))的第一區(qū)域或其片段；和與第一區(qū)域相附著的第二區(qū)域，其中第二區(qū)域是天然存在的或非天然存在的細(xì)胞滲透、膜限制疏水性部分。
47.嵌合多肽在制備用于治療或預(yù)防炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用，其中該嵌合多肽包括G蛋白耦合受體(GPCR)第一胞內(nèi)環(huán)(il-環(huán))的第一區(qū)域或其片段；和與第一區(qū)域相附著的第二區(qū)域，其中第二區(qū)域是天然存在的或非天然存在的細(xì)胞滲透、膜限制疏水性部分。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的應(yīng)用，其中炎癥性疾病選自由僵直性脊椎炎、頸關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、局部缺血再灌注創(chuàng)傷、內(nèi)臟局部缺血、青年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰骶關(guān)節(jié)炎骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性疾病、變形性關(guān)節(jié)炎、濕疹、牛皮癬、皮炎、葡萄膜炎和結(jié)膜炎、哮喘和支氣管炎、潰瘍、齒齦炎、克羅恩氏病、萎縮性胃炎、胃炎varialoforme、潰瘍性結(jié)腸炎、乳糜瀉、節(jié)段性回腸炎、消化性潰瘍生成、pyresis、膀胱疼痛和膀胱炎、中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的炎性神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、多發(fā)性硬化、炎癥性神經(jīng)病和AIDS神經(jīng)學(xué)上的并發(fā)癥、自身免疫炎癥、或外科創(chuàng)傷所組成的組。
49.嵌合多肽在制備用于治療或減輕癌癥嚴(yán)重性的藥物中的應(yīng)用，其中該嵌合多肽包括G蛋白耦合受體(GPCR)第一胞內(nèi)環(huán)(il-環(huán))的第一區(qū)域或其片段；和與第一區(qū)域相附著的第二區(qū)域，其中第二區(qū)域是天然存在的或非天然存在的細(xì)胞滲透、膜限制疏水性部分。
50.嵌合多肽在制備用于治療或減輕血栓癥嚴(yán)重性的藥物中的應(yīng)用，其中該嵌合多肽包括G蛋白耦合受體(GPCR)第一胞內(nèi)環(huán)(il-環(huán))的第一區(qū)域或其片段；和與第一區(qū)域相附著的第二區(qū)域，其中第二區(qū)域是天然存在的或非天然存在的細(xì)胞滲透、膜限制疏水性部分。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及到G蛋白耦合受體(GPCRs)且尤其涉及GPCR激動(dòng)劑和拮抗劑、這種化合物及其藥物組合物的使用，例如用于治療、調(diào)節(jié)和/或預(yù)防與GPCRs有關(guān)的生理病況，例如在治療趨化因子受體起作用的病況中使用，其中趨化因子受體起作用的病況例如敗血病、關(guān)節(jié)炎、發(fā)炎和自身免疫系統(tǒng)疾病。
文檔編號(hào)A61K38/00GK101094866SQ200580045827
公開日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2005年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月4日
發(fā)明者阿森·庫(kù)里奧佩洛斯, 利吉亞·科維奇, 尼克·卡內(nèi)德 申請(qǐng)人:新英格蘭醫(yī)療中心醫(yī)院有限公司