專利名稱：Lna寡核苷酸和癌癥治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了用于治療癌癥的藥物組合物。該組合物包含特定LNA寡核苷酸，后者在抑制存活素的表達(dá)方面具有優(yōu)越的性能。本發(fā)明也提供了治療癌癥的方法和多種試劑盒。
背景技術(shù)：
生存蛋白是最有吸引力的新癌癥靶物之一。在幾乎所有腫瘤類型中檢測(cè)到高水平的生存蛋白，強(qiáng)調(diào)了該蛋白在癌癥中的臨床作用。生存蛋白在腫瘤中的升高表達(dá)，通常與預(yù)后不良、增加的癌癥復(fù)發(fā)和對(duì)治療(放療和化療)的抗性有關(guān)。生存蛋白不在正常成年組織中表達(dá)(有少數(shù)例外)的事實(shí)，使得生存蛋白成為關(guān)鍵的癌基因。
細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑(IAP)生存蛋白參與2個(gè)關(guān)鍵的生物學(xué)事件(i)控制細(xì)胞增殖(有絲分裂)，和(ii)調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡(細(xì)胞凋亡)。另外，生存蛋白在腫瘤血管發(fā)生中起重要作用。
與單獨(dú)的siRNA和紫杉醇相比，靶向生存蛋白的siRNA和紫杉醇的組合在SHEP細(xì)胞中導(dǎo)致增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)(Zangemeister-Wittke 2003；Ann.N.Y.Acad.Sci.100290-94)。
Wang等，2003；Zhonghua Xue Ye Za Zhi 24，351-54.″Survivinantisense RNA enhances TaxoHnduced apoptosis in leukemia cellline HL-60″。
在申請(qǐng)人更早的國(guó)際專利申請(qǐng)公開號(hào)WO 2004/069991 A2中，描述了許多可能的反義LNA寡核苷酸。但是，在現(xiàn)有技術(shù)中，尚未描述本文公開的LNA寡核苷酸的令人驚奇的良好性能。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的第一個(gè)主要方面涉及液體藥物組合物，其包含在水性載體中的LNA寡核苷酸，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵；且所述水性載體包含用于將pH維持在4.0-8.5范圍內(nèi)的緩沖劑，并具有20-2000mM的離子強(qiáng)度。
本發(fā)明的第二個(gè)主要方面涉及液體藥物組合物，其包含在水性載體中的綴合物，所述綴合物由LNA寡核苷酸和至少一個(gè)共價(jià)結(jié)合到所述寡核苷酸上的非核苷酸/非多核苷酸部分組成，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵；且所述水性載體包含用于將pH維持在4.0-8.5范圍內(nèi)的緩沖劑，并具有20-2000mM的離子強(qiáng)度。
本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及藥物組合物，其包含在可藥用載體中的至少一種紫杉烷化合物和LNA寡核苷酸，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵；且其中所述組合物中紫杉烷化合物與LNA寡核苷酸之間的重量比是在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的第四個(gè)主要方面涉及藥物組合物，其包含在可藥用載體中的至少一種紫杉烷化合物和綴合物，所述綴合物由LNA寡核苷酸和至少一個(gè)共價(jià)結(jié)合到所述寡核苷酸上的非核苷酸/非多核苷酸部分組成，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵；且其中所述組合物中紫杉烷化合物和LNA寡核苷酸的重量比是在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)。
其中所述組合物中紫杉烷化合物與綴合物的LNA寡核苷酸部分之間的重量比是在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的第五個(gè)主要方面涉及LNA寡核苷酸在制備藥物組合物中的應(yīng)用，所述藥物組合物用于治療患有或易患癌癥疾病的哺乳動(dòng)物，尤其是人，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵。
本發(fā)明的第六個(gè)主要方面涉及綴合物在制備藥物組合物中的應(yīng)用，所述藥物組合物用于治療患有或易患癌癥疾病的哺乳動(dòng)物，尤其是人，所述綴合物由LNA寡核苷酸和至少一個(gè)共價(jià)結(jié)合到所述寡核苷酸上的非核苷酸/非多核苷酸部分組成，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列
5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵。
本發(fā)明的第七個(gè)主要方面涉及治療患有或易患癌癥疾病的哺乳動(dòng)物(尤其是人)的方法，該方法包括下述步驟給哺乳動(dòng)物施用一個(gè)或多個(gè)治療有效劑量的包含LNA寡核苷酸的第一種藥物組合物，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵。
本發(fā)明的第八個(gè)主要方面涉及治療患有或易患癌癥疾病的哺乳動(dòng)物(尤其是人)的方法，該方法包括下述步驟給哺乳動(dòng)物施用一個(gè)或多個(gè)治療有效劑量的包含綴合物的第一種藥物組合物，所述綴合物由LNA寡核苷酸和至少一個(gè)共價(jià)結(jié)合到所述寡核苷酸上的非核苷酸/非多核苷酸部分組成，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列
5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵。
本發(fā)明的第九個(gè)主要方面涉及試劑盒，其包含(a)第一種組分，其含有一個(gè)或多個(gè)注射溶液劑量的LNA寡核苷酸，和(b)第二種組分，其含有一種或多種紫杉烷化合物的一種或多種注射溶液；其中所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵；且其中第二種組分的一種溶液中的至少一種紫杉烷化合物與第一種組分的一個(gè)溶液劑量中的至少一種LNA寡核苷酸之間的重量比是在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的第十個(gè)主要方面涉及試劑盒，其包含(a)第一種組分，其含有固體形式的LNA寡核苷酸，和(b)第二種組分，其含有適合重配(例如，溶解或懸浮)所述LNA寡核苷酸的緩沖溶液；其中所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了與對(duì)照SEQ ID NO.25相比，SEQ ID NO.2在人和小鼠血漿中的穩(wěn)定性。在37℃，在20μM濃度，溫育寡核苷酸0-，1-，2-，4-，24-，48-或96-小時(shí)。甚至在任一種血清中消化96小時(shí)后，也沒有檢測(cè)到SEQ ID NO.2的降解產(chǎn)物。
圖2A顯示了在SEQ ID NO.2轉(zhuǎn)染的15PC3前列腺癌細(xì)胞中的生存蛋白減量調(diào)節(jié)。用1，10，和25nM SEQ ID NO.2轉(zhuǎn)染15PC3細(xì)胞，并在時(shí)間點(diǎn)12，24和48小時(shí)，通過蛋白印跡分析生存蛋白減量調(diào)節(jié)。收獲SEQ ID NO.2或模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并對(duì)比生存蛋白表達(dá)。同時(shí)監(jiān)測(cè)Bcl-2蛋白。
圖2B顯示了與陰性對(duì)照SEQ ID NO.24和模擬處理相比，在用SEQID NO.2處理15PC3細(xì)胞24小時(shí)后，使用ELISA對(duì)生存蛋白的定量。使用0.04-5nM的4個(gè)濃度的SEQ ID NO.2，或5nM的陰性對(duì)照SEQID NO.24，轉(zhuǎn)染15PC3細(xì)胞。
圖2C顯示了與5nM SEQ ID NO.24或模擬品相比，在用5nM SEQID NO.2處理后，15PC3細(xì)胞中生存蛋白mRNA的3個(gè)不同同種型(生存蛋白全長(zhǎng)，生存蛋白2B和生存蛋白Δex3)的表達(dá)。將表達(dá)相對(duì)于GAPDH的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化，并與模擬處理的細(xì)胞中的平均表達(dá)相比。顯然，SEQ ID NO.2能減量調(diào)節(jié)所有表達(dá)的人生存蛋白同種型，而陰性對(duì)照SEQ ID NO.24不能。
圖3顯示了在15PC3細(xì)胞中用SEQ ID NO.2處理13-72小時(shí)后，通過誘導(dǎo)的半胱天冬酶3/7活性測(cè)得的細(xì)胞凋亡。在0.2-100nM的5個(gè)濃度，用SEQ ID NO.2或陰性對(duì)照SEQ ID NO.24轉(zhuǎn)染15PC3細(xì)胞。作為來自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，相對(duì)于模擬處理呈現(xiàn)誘導(dǎo)倍數(shù)。在每個(gè)條上顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖4顯示了用5nM或25nM SEQ ID NO.2處理HeLa細(xì)胞，導(dǎo)致早期和晚期細(xì)胞凋亡的劑量依賴性誘導(dǎo)，如通過流式細(xì)胞術(shù)分析的膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI染色所測(cè)得的。相同濃度的陰性對(duì)照寡核苷酸SEQ ID NO.24不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
圖5顯示了轉(zhuǎn)染后用SEQ ID NO.2處理13-72小時(shí)后，15PC3前列腺癌細(xì)胞的增殖。用0.2，1，5，25和100nM的SEQ ID NO.2或陰性對(duì)照寡核苷酸SEQ ID NO.24，轉(zhuǎn)染15PC3細(xì)胞。顯示了與未處理的模擬細(xì)胞相比，活細(xì)胞的相對(duì)數(shù)。數(shù)據(jù)源自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。在每個(gè)條上顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差。SEQ ID NO.2導(dǎo)致對(duì)增殖的劑量依賴性抑制，而陰性對(duì)照SEQ ID NO.24不會(huì)。
圖6A顯示了在15PC3前列腺癌細(xì)胞中用SEQ ID NO.22、SEQ IDNO.2或紫杉醇處理24-72小時(shí)后，通過誘導(dǎo)的半胱天冬酶3/7活性測(cè)得的細(xì)胞凋亡。用10nM的SEQ ID NO.22或SEQ ID NO.2與紫杉醇(10nM或100nM)相組合地處理細(xì)胞，0.1％ DMSO用作載體。作為平均值，相對(duì)于模擬處理呈現(xiàn)誘導(dǎo)倍數(shù)。在48小時(shí)和72小時(shí)后，SEQID NO.2與紫杉醇的組合對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)均表現(xiàn)出了清楚的累加效應(yīng)。
圖6B顯示了在用2nM SEQ ID NO.2或2nM SEQ ID NO.2聯(lián)合10nM紫杉醇處理24小時(shí)和48小時(shí)后，15PC3細(xì)胞中的生存蛋白mRNA表達(dá)。通過qPCR分析表達(dá)，將表達(dá)相對(duì)于GAPDH的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化，并與模擬(0.1％ DMSO)處理的細(xì)胞中的表達(dá)水平相比。發(fā)現(xiàn)在兩種處理方案和兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，生存蛋白mRNA都受到減量調(diào)節(jié)。
圖6C顯示了在用10nM SEQ ID NO.26(Bcl-2特異性的)、10nMSEQ ID NO.2、10nM對(duì)照SEQ ID NO.24、10nM SEQ ID NO.27(SEQID NO.26的陰性對(duì)照)或10nM每種寡核苷酸的組合處理24小時(shí)后，15PC3細(xì)胞中的生存蛋白mRNA和Bcl-2 mRNA表達(dá)。通過qPCR分析所有表達(dá)，將表達(dá)相對(duì)于GAPDH的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化，并與模擬處理的細(xì)胞中的表達(dá)水平相比。SEQ ID NO.26是Bcl-2特異性的，且無論是作為單獨(dú)的試劑還是與對(duì)照化合物(SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.27)相組合，對(duì)生存蛋白都不具有任何作用。SEQ ID NO.2是一種強(qiáng)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，且無論是作為單獨(dú)的試劑還是與對(duì)照化合物(SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.27)相組合，對(duì)生存蛋白和Bcl-2表達(dá)都有作用。
圖7A和7B顯示了用SEQ ID NO.2和紫杉醇處理的15PC3細(xì)胞的細(xì)胞周期分析。用2nM SEQ ID NO.2轉(zhuǎn)染15PC3細(xì)胞，并暴露于10nM紫杉醇(在0.1％ DMSO中)或載體(0.1％ DMSO)。用碘化丙啶染色細(xì)胞，并在24小時(shí)和48小時(shí)(圖7a)、或24小時(shí)(圖7b)后通過FACS分析，與用10nM陰性對(duì)照SEQ ID NO.24類似處理的15PC3細(xì)胞相比較。該測(cè)定顯示了單獨(dú)的和與紫杉醇相組合的SEQ ID NO.2的特異性作用。當(dāng)細(xì)胞周期停滯時(shí)，在G2或甚至G4期的細(xì)胞級(jí)分增加。用SEQ ID NO.2處理的細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期中，導(dǎo)致G1∶G2比為1∶1(相比之下，模擬處理的為1∶0.25)，而陰性對(duì)照SEQ ID.NO 24對(duì)細(xì)胞周期沒有作用。與SEQ ID NO.2相組合的紫杉醇導(dǎo)致進(jìn)一步停滯，觀察到G1∶G2比為1∶3。
圖8顯示了SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.2聯(lián)合紫杉醇的體內(nèi)性質(zhì)。以該圖的下面小圖中給出的2個(gè)不同給藥方案(A和B)，施用化合物。使用兩個(gè)方案，通過在27天后對(duì)比接受與紫杉醇相組合的SEQ ID NO.2的組和單試劑處理或鹽水(模擬品)的組，都觀察腫瘤重量減少。
圖9顯示了腫瘤分析，在腫瘤內(nèi)注射SEQ ID NO.2后，顯示了降低的mRNA和生存蛋白的水平。在2周中，6次向腫瘤內(nèi)施用鹽水或25mg/kg SEQ ID NO.2(50μl體積)。最后一次給藥后24小時(shí)，進(jìn)行取樣。
圖10A顯示了根據(jù)實(shí)施例19，用PBS緩沖的SEQ ID NO.2制劑進(jìn)行全身治療后，靈長(zhǎng)類動(dòng)物短尾猴肝中的SEQ ID NO.2的含量。痊愈動(dòng)物(R)保持不處理4周，且顯示該階段以后組織中可檢測(cè)到SEQID NO.2。
圖10B顯示了與10A相同的結(jié)果，但是在腎中，而不是在肝中。
發(fā)明詳述發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，特定類別的LNA寡核苷酸會(huì)通過反義機(jī)理，在抑制生存蛋白表達(dá)方面表現(xiàn)出令人驚奇的良好性質(zhì)。從實(shí)施例中可以看出，該特定類別的LNA寡核苷酸(無論單獨(dú)地還是與紫杉烷化合物相組合地)會(huì)抑制生存蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致體內(nèi)腫瘤發(fā)展的減少或抑制。
本文所述的LNA寡核苷酸由有力的靶向生存蛋白的LNA寡核苷酸SEQ ID NO.2代表。通過功能解讀(read out)(例如細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)和增殖抑制)測(cè)得，該化合物優(yōu)于靶向生存蛋白mRNA的其它LNA寡核苷酸。另外，SEQ ID NO.2先導(dǎo)候選物在減量調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞系中的生存蛋白mRNA和蛋白方面是有效的。另外，先導(dǎo)候選物SEQ ID NO.2與紫杉醇相組合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，比如此組合的其它LNA寡核苷酸更優(yōu)。在實(shí)施例21中，顯示了對(duì)SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.23，SEQ IDNO.22，和SEQ ID NO.21得到的體外數(shù)據(jù)的概述。
裸鼠中的體內(nèi)異種移植研究顯示了單試劑處理的小鼠腫瘤中的生存蛋白減少，當(dāng)與化療藥物聯(lián)合使用時(shí)，導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)抑制。這是靶向生存蛋白的反義寡核苷酸首次在體內(nèi)與紫杉醇組合表現(xiàn)出作用。使用人小鼠前列腺癌異種移植物模型PC3，進(jìn)行體內(nèi)功效測(cè)試。而且，SEQ ID NO.2具有良好的毒理學(xué)性能，在短尾猴的靜脈內(nèi)MTD研究中沒有觀察到顯著的臨床跡象。
LNA寡核苷酸有用的LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線(即MeC和G)代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵，且其中在括號(hào)中的核苷酸單元(即(MeCx)，(Tx)，(Gx)和(c))各自代表一個(gè)可選存在的單元。
術(shù)語″本文定義的LNA寡核苷酸″，″根據(jù)本發(fā)明的LNA寡核苷酸″，等，指上面定義的″LNA寡核苷酸″，參見SEQ ID NO.1和28，以及下述的實(shí)施方案、變體、鹽、前藥等。
LNA核苷酸類似物選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA。下圖解釋了這些修飾的核苷酸類似物
其中B代表核堿基，即腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)，鳥嘌呤(G)，或甲基-胞嘧啶(MeC)。對(duì)于β-D-氨基-LNA，R是環(huán)氮原子上的取代基或氫。R可以是，例如，氫，甲基，乙基，丙基，芐基，等，或可以代表與官能團(tuán)的連接(link)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，LNA核苷酸類似物選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA和β-D-氨基-LNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，LNA核苷酸類似物選自β-D-氧-LNA和α-L-氧-LNA。在目前最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所有LNA核苷酸類似物都是β-D-氧-LNA。
當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語″核苷酸″指2-脫氧核糖(或核糖)單元，其通過它的第一號(hào)碳原子鍵合到含氮堿基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)或鳥嘌呤(G)之一上，且其通過它的第三號(hào)和/或第五號(hào)碳原子鍵合到核苷間磷酸二酯或硫代磷酸酯基團(tuán)上。
(子)序列SEQ ID NO.28具有至少12個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，但是優(yōu)選地，該(子)序列由至少13個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物代表，特別是至少14個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物。除了(子)序列SEQID NO.28以外，上面定義的LNA寡核苷酸可以包含1-4個(gè)額外的核苷酸和/或LNA核苷酸類似物，尤其是額外的核苷酸，例如1，2，3，或4個(gè)額外的2-脫氧核苷酸。因而典型地，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20，或13-20，或14-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物。優(yōu)選地，LNA寡核苷酸具有共計(jì)14-19個(gè)、例如14-18、或15-18、或16-18、或14-17、或15-17、或16-17個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物。最優(yōu)選地，LNA寡核苷酸是序列SEQ ID NO.28的化合物，即LNA寡核苷酸具有共計(jì)14-16個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，例如14個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物、15個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物、或16個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物。
因此，當(dāng)括號(hào)中的所有核苷酸單元并非都存在時(shí)，一個(gè)優(yōu)選的變體是這樣的，其中存在5′-末端的(MeCx)(Tx)，且(i)缺少3′-末端的(Gx)(c)(提供14-聚物)，或(ii)存在(Gx)，且缺少(c)(提供15-聚物)，或(iii)其中存在(Gx)(c)(提供16-聚物)。另一個(gè)更優(yōu)選的變體是這樣的，其中存在3′-末端的(Gx)(c)，且(i)缺少5′-末端的(MeCx)(Tx)(提供14-聚物)，或(ii)存在(Tx)，且缺少(MeCx)(提供15-聚物)。一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案是這樣的，其中存在5′-末端的(Tx)，且其中存在3′-末端的(Gx)(提供14-聚物)。
關(guān)于加下劃線的單元，優(yōu)選地，MeCx代表LNA核苷酸類似物。因而，所有MeCx，A和G都可以代表LNA核苷酸類似物，或MeCx可以代表脫氧核苷酸，且A和G可以代表LNA核苷酸類似物，等。
優(yōu)選的(子)序列SEQ ID NO.1具有16個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物。除了(子)序列SEQ ID NO.1以外，上面定義的LNA寡核苷酸可以包含1-4個(gè)額外的核苷酸和/或LNA核苷酸類似物，尤其是額外的核苷酸，例如1，2，3，或4個(gè)額外的2-脫氧核苷酸。因而典型地，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物。優(yōu)選地，LNA寡核苷酸具有共計(jì)16-19個(gè)、例如16-18、或16-17個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物。最優(yōu)選地，LNA寡核苷酸是序列SEQ ID NO.1的化合物，即LNA寡核苷酸具有共計(jì)16個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物。
應(yīng)當(dāng)注意，SEQ ID NO.28的子序列AsAstscscsastsgsgsMeC和SEQ ID NO.1的子序列AsastscscsastsgsgsMeC表示為完全硫代磷酸酯化的，參見下標(biāo)″s″。盡管目前不是優(yōu)選的，認(rèn)為一個(gè)、且也可能兩個(gè)所述硫代磷酸酯鍵可以被替換為其它鍵，尤其是磷酸二酯鍵，而不嚴(yán)重有損所述LNA寡核苷酸的穩(wěn)定性。因而，這樣的變體，其中一個(gè)或兩個(gè)硫代磷酸酯鍵被替換為例如磷酸二酯鍵，也在本發(fā)明的預(yù)期范圍內(nèi)。
SEQ ID NO.28和1的特定(子)序列的解釋性實(shí)例是在表1中列出的SEQ ID NO.2-20。
表1-LNA寡核苷酸
在表1中，大寫字母(沒有上標(biāo))代表β-D-氧-LNA核苷酸類似物(β-D-氧-LNA)；但是，大寫字母后面的上標(biāo)″α″(例如Gα)表示，LNA核苷酸類似物是α-L-LNA核苷酸類似物(α-L-氧-LNA)，小寫字母代表脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間沒有下標(biāo)代表磷酸二酯鍵。所有LNA-C單體是5-甲基-C(MeC)。
在有吸引力的實(shí)施方案中，LNA寡核苷酸包含選自下述的(子)序列SEQ ID NO.2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，和20，尤其是選自SEQ ID NO.2，3，4，5，6，7，8，9，和10。更特別地，LNA寡核苷酸是選自下述的化合物SEQ IDNO.2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，和20，尤其是選自SEQ ID NO.2，3，4，5，6，7，8，9，和10。在目前最優(yōu)選的實(shí)施方案中，LNA寡核苷酸包含(子)序列SEQ ID NO.2。甚至更優(yōu)選地，LNA寡核苷酸是具有SEQ ID NO.2的化合物。
LNA寡核苷酸的制備遵循公開的方法和其中引用的文獻(xiàn)，可以制備LNA核苷酸類似物構(gòu)件(β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA)，參見，例如，WO 03/095467 A1；D.S.Pedersen，C.Rosenbohm，T.Koch(2002)Preparation of LNA Phosphoramidites，Synthesis 6，802-808；M.D.Srensen，L Kvrn，T.Bryld，A.E.Hkansson，B.Verbeure，G.Gaubert，P.Herdewijn，J.Wengel(2002)α-L-ribo-configured Locked Nucleic Acid(α-L-LNA)Synthesis and Properties，J.Am.Chem.Soc.，124，2164-2176；S.K.Singh，R.Kumar，J.Wengel(1998)Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1]Ribonucleosides2′-Amino-and 2′-Thio-LNA Monomeric Nucleosides，J.Org.Chem.1998，63，6078-6079；C.Rosenbohm，S.M.Christensen，M.D.Srensen，D.S.Pedersen，L，E.Larsen，J.Wengel.T.Koch(2003)Synthesis of 2′-amino-LNA；a new strategy，Org.Biomol.Chem.1，655-663；和WO 2004/069991 A2.
可以如實(shí)施例和WO 99/14226，WO 00/56746，WO 00/56748，WO00/66604，WO 00/125248，WO 02/28875，WO 2002/094250和WO03/006475所述，制備LNA寡核苷酸。因而，可以使用有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的核酸化學(xué)寡聚技術(shù)，制備LNA寡核苷酸。通常，使用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺寡聚循環(huán)方法(S.L.Beaucage和R.P.Iyer，Tetrahedron，1993，49，6123；S.L.Beaucage和R.P.Iyer，Tetrahedron，1992，48，2223)，但是也可以使用例如H-膦酸酯化學(xué)、磷酸三酯化學(xué)。
對(duì)于有些單體，更長(zhǎng)的偶合時(shí)間、和/或重復(fù)偶合和/或使用更濃縮的偶合試劑可能是必要的或有益的。
使用的亞磷酰胺典型地以令人滿意的＞95％的分步產(chǎn)率進(jìn)行偶合。通常，用例如碘/吡啶/H2O實(shí)現(xiàn)三價(jià)磷(III)向五價(jià)磷(V)的氧化。去保護(hù)以后，這會(huì)產(chǎn)生天然的核苷間磷酸二酯鍵。在制備核苷間硫代磷酸酯鍵的情況下，如下進(jìn)行硫化(thiolation)步驟將用于合成核苷間磷酸二酯鍵的通常的(例如碘/吡啶/H2O)氧化替換為使用ADTT試劑(蒼耳烷氫化物(0.01M，在乙腈∶吡啶9∶1 v/v中)的氧化。也可使用其它硫化試劑，例如Beaucage和PADS。有效地合成硫代磷酸LNA寡核苷酸，分步偶合產(chǎn)率＞＝98％。
使用亞磷酰胺方法，也可以有效地合成包含β-D-氨基-LNA、β-D-硫-LNA、和/或α-L-LNA的LNA寡核苷酸，分步偶合產(chǎn)率≥98％。
使用一次性反相純化柱和/或反相HPLC和/或從乙醇或丁醇中沉淀，可以實(shí)現(xiàn)LNA寡核苷酸的純化。使用毛細(xì)管凝膠電泳，反相HPLC，MALDI-MS，和ESI-MS，來證實(shí)合成的LNA寡核苷酸的純度。
鹽LNA寡核苷酸可以以多種可藥用鹽使用。如本文使用的該術(shù)語是指，保留LNA寡核苷酸的期望生物活性并顯示最小的不期望的毒理作用的鹽。這類鹽的非限定性實(shí)例可與有機(jī)氨基酸形成，堿加成鹽與金屬陽離子例如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、鎘、鈉、鉀等形成，或與由氨、N，N-二芐基乙二胺、D-葡糖胺、四乙銨或乙二胺形成的陽離子形成；或其組合，例如單寧酸鋅鹽等。
這類鹽是由具有磷酸二酯基團(tuán)和/或硫代磷酸酯基團(tuán)的LNA寡核苷酸形成的，且是例如與合適堿形成的鹽。這些鹽包括，例如源自元素周期表第Ia、Ib、IIa和IIB族金屬的無毒金屬鹽，特別是合適的堿金屬鹽，例如鋰鹽、鈉鹽或鉀鹽，或堿土金屬鹽，例如鎂鹽或鈣鹽。它們還包括鋅鹽和銨鹽，以及與適合的有機(jī)胺形成的鹽，所述胺例如未取代的或羥基取代的一-、二-或三-烷基胺，特別是一-、二-或三-烷基胺，或與季銨化合物形成的鹽，例如與N-甲基-N-乙基胺、二乙胺、三乙胺、單-、雙-或三-(2-羥基-低級(jí)烷基)胺例如單-、雙-或三-(2-羥乙基)胺、2-羥基-叔丁基胺或三(羥甲基)甲胺、N，N-二低級(jí)烷基-N-(羥基-低級(jí)烷基)胺例如N，N-二甲基-N-(2-羥乙基)胺或三-(2-羥乙基)胺或N-甲基-D-葡糖胺或季銨化合物形成的鹽例如四丁基銨鹽。優(yōu)選鋰鹽、鈉鹽、鎂鹽、鋅鹽或鉀鹽，特別優(yōu)選鈉鹽。
前藥在一個(gè)實(shí)施方案中，LNA寡核苷酸可以是前藥的形式。實(shí)際上，寡核苷酸是帶負(fù)電荷的離子。由于細(xì)胞膜的親脂性質(zhì)，與中性的或親脂的等同物相比，寡核苷酸的細(xì)胞攝入減少。通過使用前藥方案(參見例如Crooke，R.M.(1998)in Crooke，S.T.Antisense researchand Application.Springer-Verlag，Berlin，Germany，vol.131，pp.103-140)，可以避免該極性″障礙″。在該方案中，以受保護(hù)的方式制備LNA寡核苷酸，使得LNA寡核苷酸在施用時(shí)是中性的。以細(xì)胞攝入LNA寡核苷酸時(shí)可去除保護(hù)基團(tuán)的方式，設(shè)計(jì)這些保護(hù)基團(tuán)。這些保護(hù)基團(tuán)的實(shí)例是S-乙?；虼一?SATE)或S-新戊酰基硫代乙基(叔丁基-SATE)。這些保護(hù)基團(tuán)是核酸酶抗性的，會(huì)在細(xì)胞內(nèi)被選擇性地去除。
綴合物在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“綴合物”旨在表示異質(zhì)分子，其通過共價(jià)連接本文描述的LNA寡核苷酸(即，包含核苷或核苷類似物序列的化合物)和一個(gè)或多個(gè)非核苷酸或非多核苷酸部分而形成。
因此，LNA寡核苷酸可以例如是與非核苷酸或非多核苷酸部分綴合的或形成嵌合體，所述非核苷酸或非多核苷酸部分包括肽核酸(PNA)、蛋白(例如靶蛋白的抗體)、大分子、低分子量藥物物質(zhì)、脂肪酸鏈、糖殘基、糖蛋白、聚合物(例如聚乙二醇)、膠束形成基團(tuán)、抗體、碳水化合物、受體結(jié)合基團(tuán)、甾族化合物例如膽固醇、多肽、嵌入劑例如吖啶衍生物、長(zhǎng)鏈醇、樹枝狀聚合物、磷脂和其它親脂基或它們的組合等，正如該寡聚化合物可以以二聚化或樹枝狀結(jié)構(gòu)排列。LNA寡核苷酸或綴合物也可綴合或進(jìn)一步綴合至活性藥物物質(zhì)，例如阿司匹林、布洛芬、磺胺藥、抗糖尿病藥、抗菌劑、化療化合物或抗生素。
這種方式的綴合會(huì)在LNA寡核苷酸的藥物動(dòng)力學(xué)特征方面賦予有益性質(zhì)。特別是，這種方式的綴合實(shí)現(xiàn)了增加的細(xì)胞攝入。
在一個(gè)實(shí)施方案中，LNA寡核苷酸連接到配體上形成綴合物，所述配體是為了增加綴合物相對(duì)于反義LNA寡核苷酸的細(xì)胞攝入。該綴合可出現(xiàn)在末端位置5′/3′-OH，但是配體也可以出現(xiàn)在糖和/或堿基處。更具體地，反義LNA寡核苷酸可以綴合的生長(zhǎng)因子可以包含轉(zhuǎn)鐵蛋白或葉酸?？梢灾苽滢D(zhuǎn)鐵蛋白-聚賴氨酸-寡核苷酸復(fù)合物或葉酸-聚賴氨酸-寡核苷酸復(fù)合物，用于由表達(dá)高水平的轉(zhuǎn)鐵蛋白或葉酸受體的細(xì)胞攝入。綴合物/配體的其它實(shí)例是膽固醇部分，雙鏈體嵌入劑例如吖啶，聚-L-賴氨酸，以一個(gè)或多個(gè)核酸酶抗性的連接基團(tuán)例如單硫代磷酸酯等“封端”。
Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，3410-3414(1990)描述了作為寡核苷酸攝入細(xì)胞中的載體的轉(zhuǎn)鐵蛋白復(fù)合物的制備。Low等，美國(guó)專利5,108,921描述了通過葉酸受體胞吞作用細(xì)胞遞送葉酸-大分子綴合物，包括遞送反義寡核苷酸。也參見，Leamon等，Proc.Natl.Acad.Sci.88，5572(1991)。
藥物組合物應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含如上定義的LNA寡核苷酸或綴合物，和可藥用載體，例如水性載體。該藥物組合物優(yōu)選地適于注射。
藥物組合物制備的指導(dǎo)，可見于Alfonso R.Gennaro的“RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy”和下文中。
可藥用載體，例如粘合劑和輔劑，是藥物組合物的一部分。膠囊劑、片劑和丸劑等可含有例如下列化合物作為粘合劑的微晶纖維素、樹膠或明膠；作為賦形劑的淀粉或乳糖；作為潤(rùn)滑劑的硬脂酸鹽；各種甜味劑或矯味劑。對(duì)于膠囊劑，劑量單位可含有液體載體，例如脂肪油。同樣，糖劑或腸劑的包衣可以是劑量單位的一部分。藥物組合物也可以是活性藥物成分(包括LNA寡核苷酸)和會(huì)形成微膠粒乳劑的脂類的乳劑。
LNA寡核苷酸可以與不損害期望作用的任何物質(zhì)混合，或與補(bǔ)充期望作用的物質(zhì)混合。這些物質(zhì)可包括其它藥物，包括其它核苷化合物。
對(duì)于腸胃外、皮下、皮內(nèi)或局部施用，該制劑可包括無菌稀釋劑(例如水)、緩沖劑、張力和離子強(qiáng)度的調(diào)節(jié)劑和抗菌劑?；钚曰衔锟梢院洼d體一起制備，該載體可以促進(jìn)攝入、保護(hù)免于降解或保護(hù)免于立即從機(jī)體排出，包括具有控釋性質(zhì)的植入物或微膠囊。對(duì)于靜脈內(nèi)施用，優(yōu)選的載體是生理鹽水(0.9％)或磷酸鹽緩沖鹽水。
優(yōu)選地，LNA寡核苷酸以足以向患者遞送治療有效量而在該被治療患者中不產(chǎn)生嚴(yán)重副作用的量包括在單位制劑中，例如在藥學(xué)可接受載體或稀釋劑中。
在藥物組合物的優(yōu)選實(shí)施方案中，LNA寡核苷酸被配制在水性載體中，更特別地，該水性載體包含用于將pH維持在4.0-8.5范圍內(nèi)的緩沖劑，并具有20-2000mM的離子強(qiáng)度。
術(shù)語“水性載體”是指所討論的藥物組合物是液體形式，并且該液體載體主要由水組成，即至少80％(w/w)、或至少90％(w/w)、或甚至至少95％(w/w)的載體由水組成。也可以使用其它液體成分，例如乙醇、DMSO、乙二醇等。
該水性載體優(yōu)選包含保持pH在4.0-8.5范圍內(nèi)的緩沖劑。優(yōu)選地，該緩沖劑將保持pH在5.0-8.0的范圍內(nèi)，例如在6.0-7.5的范圍內(nèi)。
藥物組合物的離子強(qiáng)度/張力也是重要的。因此，該液體藥物組合物一般具有20-2000mM范圍內(nèi)的離子強(qiáng)度，例如在50-1500mM的范圍內(nèi)，或者在100-1000mM的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的第一個(gè)主要方面涉及液體藥物組合物，其包含在水性載體中的LNA寡核苷酸，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵；且所述水性載體包含用于將pH維持在4.0-8.5范圍內(nèi)的緩沖劑，并具有20-2000mM的離子強(qiáng)度。
本發(fā)明的第二個(gè)主要方面涉及液體藥物組合物，其包含在水性載體中的綴合物，所述綴合物由LNA寡核苷酸和至少一個(gè)共價(jià)結(jié)合到所述寡核苷酸上的非核苷酸/非多核苷酸部分組成，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵；且所述水性載體包含用于將pH維持在4.0-8.5范圍內(nèi)的緩沖劑，并具有20-2000mM的離子強(qiáng)度。
第一個(gè)和第二個(gè)主要方面有利地與上面進(jìn)一步給出的關(guān)于LNA寡核苷酸、綴合物和藥物組合物的說明和優(yōu)選相組合。認(rèn)為下面的實(shí)施方案充分地代表了本發(fā)明的益處。
在一個(gè)實(shí)施方案中，LNA核苷酸類似物選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA和β-D-氨基-LNA，或選自β-D-氧-LNA和α-L-氧-LNA，特別是，所有LNA核苷酸類似物都是β-D-氧-LNA。
在另一個(gè)可以與上述內(nèi)容相組合的實(shí)施方案中，LNA寡核苷酸具有共計(jì)16-19、例如16-18、或16-17、更特別是16個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物?；蛘撸琇NA寡核苷酸具有共計(jì)12-18、例如13-18、或14-17、更特別是14或15個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物。
在另一個(gè)可以與上述內(nèi)容相組合的實(shí)施方案中，LNA寡核苷酸包含選自下述的(子)序列SEQ ID NO.2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，和20，尤其是選自SEQ ID NO.2，3，4，5，6，7，8，9，和10。更具體地，LNA寡核苷酸是選自下述的化合物SEQ ID NO.2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，和20，尤其是選自SEQ ID NO.2，3，4，5，6，7，8，9，和10。更優(yōu)選地，LNA寡核苷酸包含(子)序列SEQ ID NO.2，且最優(yōu)選地，LNA寡核苷酸是具有SEQ ID NO.2的化合物。
在另一個(gè)可以與上述內(nèi)容相組合的實(shí)施方案中，組合物還包含至少一種紫杉烷化合物(進(jìn)一步細(xì)節(jié)參見下面的″聯(lián)合藥物″)。更具體地，所述組合物中紫杉烷化合物與LNA寡核苷酸(綴合物的LNA寡核苷酸部分)之間的重量比是在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)。關(guān)于第二個(gè)方面，如果所述至少一個(gè)非核苷酸/非多核苷酸部分包含紫杉烷化合物，其可能是優(yōu)選的。
聯(lián)合藥物藥物組合物還可以包含其它藥劑，其選自化療化合物、抗炎化合物、抗病毒化合物、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制化合物、抗血管生成化合物、抗增殖化合物、促凋亡化合物、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑和激酶抑制劑。
在一個(gè)令人感興趣的變體中，其它藥劑是至少一種化療化合物。這類化療化合物的合適實(shí)例是選自下列的化合物腎上腺皮質(zhì)激素類藥物，例如強(qiáng)的松、地塞米松(dexamethasone)或地塞米松(decadron)；六甲蜜胺(克瘤靈、hexamethylmelamine(HMM))；氨磷汀(氨磷汀針粉劑)；氨魯米特(氨魯米特片劑)；安吖啶(M-AMSA)；阿那曲唑(瑞寧得)；雄激素，例如睪酮；天冬酰胺酶(愛施巴)；卡介苗；比卡魯氨(康士德)；博來霉素(硫酸博來霉素)；白消安(馬利蘭)；碳鉑(伯爾定)；卡莫斯汀(BCNU；BiCNU)；苯丁酸氮芥(留可然)；氯脫氧腺嘌呤(2-CDA，克拉屈濱，leustatin)；順鉑(platinol)；阿糖胞苷(cytarabine)；達(dá)卡包嗪(DTIC)；放線霉素D(actinomycin-D，cosmegen)；柔紅霉素(鹽酸柔紅霉素)；多西他賽(泰索帝)；阿霉素(adriomycin)；表柔比星；雌莫司汀(emcyt)；雌激素，例如己烯雌酸(DES)；etopside(VP-16，依托泊甙，凡畢復(fù))；氟達(dá)拉濱(fludara)；氟他胺(eulexin)；5-FUDR(氟尿苷)；5-氟尿嘧啶(5-FU)；吉西他濱(健擇)；戈舍瑞林(zodalex)；曲妥單抗(司徒曼布)；羥基脲(hydrea)；依達(dá)比星(鹽酸依達(dá)比星)；異環(huán)磷酰胺；IL-2(重組白細(xì)胞介素-2，阿地白介素)；干擾素α(intronA，roferon A)；依立替康(camptosar)；醋酸亮丙瑞林(亮丙瑞林)；左旋咪唑(ergamisole)；洛莫司汀(CCNU)；鹽酸氮芥(mustargen，氮芥)；美法侖(愛克蘭)；巰嘌呤(purinethol，6-MP)；氨甲蝶呤(mexate)；絲裂霉素-C(mutamucin)；米托蒽醌(novantrone)；奧曲肽(善寧)；脫氧助間型霉素(2-噴斯他丁，nipent)；普卡霉素(光輝霉素，mithracin)；prorocarbazine(鹽酸甲基芐肼)；鏈脲霉素；他莫昔芬(諾瓦得士)；泰素(紫杉醇)；替尼泊苷(衛(wèi)萌，VM-26)；噻替哌；托泊替康(鹽酸拓?fù)涮婵?；維A酸(vesanoid，全反式維A酸)；長(zhǎng)春堿(valban)；長(zhǎng)春新堿(硫酸長(zhǎng)春新堿)和長(zhǎng)春瑞濱(諾維本)。
在一個(gè)變體中，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含(a)一種或多種LNA寡核苷酸及(b)一種或多種通過非反義機(jī)理起作用的其它化療化合物。當(dāng)與LNA寡核苷酸一起使用時(shí)，這類化療化合物可以單獨(dú)使用(例如光輝霉素和寡核苷酸)、序貫使用(例如，使用光輝霉素和寡核苷酸一段時(shí)間，再使用另一種藥劑和寡核苷酸)、或與一種或多種其它這類化療化合物組合或與放療組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有化療化合物，包括上面清楚描述的那些化合物，都被引入本文，作為與本發(fā)明的化合物的聯(lián)合治療。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物和紫杉烷化合物組合施用。
術(shù)語“紫杉烷化合物”旨在包括紫杉醇(Taxol)、紫杉醇衍生物、多西他賽、泰索帝、經(jīng)修飾的紫杉烷和紫杉烷類似物。紫杉醇(Taxol)是分離自西方(太平洋)紫杉即短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)的樹皮的二萜，并代表具有紫杉烷環(huán)系的一類治療劑。紫杉烷及其類似物已通過從10-去乙?；鶟{果赤霉素III(獲自紅豆杉針葉和小枝的前體)部分合成及通過全合成得到制備。見Holton.，等，J.Am.Chem.Soc.1161597-1601(1994)和Nicolaou等，Nature 367630(1994)。紫杉醇已在幾種人類腫瘤的臨床試驗(yàn)中顯示出療效。見McGuire等，Ann.Int.Med.11237-279(1989)；Holmes等，J.Natl.Cancer Inst.831797-1805(1991)；Kohn等J.Natl.Cancer Inst.8618-24(1994)；和Kohn等，American Society for Clinical Oncology 12(1993)。經(jīng)修飾的紫杉烷或紫杉烷類似物是那些具有帶經(jīng)修飾側(cè)鏈的紫杉烷環(huán)的化合物。許多這些類似物具有改進(jìn)的性質(zhì)，例如比天然存在的紫杉醇更高的水溶性和穩(wěn)定性。這些類似物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并公開于例如美國(guó)專利第5,278,324號(hào)、5,272,171號(hào)、5,254,580、5,250,683號(hào)、5,248,796號(hào)和5,227,400號(hào)中，它們的公開內(nèi)容在此全部引用作為參考。紫杉醇和泰索帝可以通過WO93/18210、EP0 253 739、EP 0 253 739和WO92/09589中的方法制備，它們的公開內(nèi)容在此全部引用作為參考。在具體的實(shí)施方案中，紫杉烷化合物是紫杉醇或泰索帝。
所述組合物中紫杉烷化合物與LNA寡核苷酸之間的重量比典型地是在下述范圍內(nèi)50∶1至1∶25，例如25∶1至1∶25、或10∶1至1∶25、或1∶1至1∶25、或50∶1至1∶10、或1∶1至1∶50、或25∶1至1∶10。
因此，本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及藥物組合物，其包含在可藥用載體中的至少一種紫杉烷化合物和LNA寡核苷酸，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵；且其中所述組合物中紫杉烷化合物與LNA寡核苷酸之間的重量比是在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的第四個(gè)主要方面涉及藥物組合物，其包含在可藥用載體中的至少一種紫杉烷化合物和綴合物，所述綴合物由LNA寡核苷酸和至少一個(gè)共價(jià)結(jié)合到所述寡核苷酸上的非核苷酸/非多核苷酸部分組成，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵；且其中所述組合物中紫杉烷化合物與綴合物的LNA寡核苷酸部分之間的重量比是在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)。
第三個(gè)和第四個(gè)主要方面有利地與上面進(jìn)一步給出的關(guān)于LNA寡核苷酸、綴合物和藥物組合物的說明和優(yōu)選相組合。認(rèn)為下面的實(shí)施方案充分地代表了本發(fā)明的益處。
在一個(gè)實(shí)施方案中，LNA核苷酸類似物選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA和β-D-氨基-LNA，或選自β-D-氧-LNA和α-L-氧-LNA，特別是，所有LNA核苷酸類似物都是β-D-氧-LNA。
在另一個(gè)可以與上述內(nèi)容相組合的實(shí)施方案中，LNA寡核苷酸具有共計(jì)16-19、例如16-18、或16-17、更特別是16個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物。或者，LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-18、例如13-18、或14-17、更特別是14或15個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物。
在另一個(gè)可以與上述內(nèi)容相組合的實(shí)施方案中，LNA寡核苷酸包含選自下述的(子)序列SEQ ID NO.2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，和20，尤其是選自SEQ ID NO.2，3，4，5，6，7，8，9，和10。更具體地，LNA寡核苷酸是選自下述的化合物SEQ ID NO.2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，和20，尤其是選自SEQ ID NO.2，3，4，5，6，7，8，9，和10。更優(yōu)選地，LNA寡核苷酸包含(子)序列SEQ ID NO.2，且最優(yōu)選地，LNA寡核苷酸是具有SEQ ID NO.2的化合物。
在另一個(gè)可以與上述內(nèi)容相組合的實(shí)施方案中，LNA寡核苷酸(或綴合物)和紫杉烷化合物存在于水性載體中。優(yōu)選地，所述水性載體包含用于將pH維持在4.0-8.5范圍內(nèi)的緩沖劑，并具有20-2000mM的離子強(qiáng)度(關(guān)于緩沖劑的其它細(xì)節(jié)也參見上面)。
關(guān)于第四個(gè)方面，所述至少一個(gè)非核苷酸/非多核苷酸部分包含紫杉烷化合物可能是優(yōu)選的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以含有一種或多種LNA寡核苷酸和一種或多種靶向第二種核酸靶物的另外的反義化合物?？梢砸黄鸹蛳群蟮厥褂?種或多種組合的化合物。
而且，可以與放療等聯(lián)合使用包含LNA寡核苷酸的藥物，也參見實(shí)驗(yàn)部分。
治療方法藥物組合物特別與癌癥的治療相關(guān)。
本發(fā)明的藥物組合物和方法優(yōu)選地用于治療或預(yù)防癌癥造成的疾病，尤其是用于治療可能發(fā)生在組織中的癌癥，例如肺癌、乳癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、甲狀腺癌、腎癌、腦癌、睪丸癌、胃癌、腸(intestine)癌、腸(bowel)癌、脊髓癌、竇癌、膀胱癌、泌尿道癌、卵巢癌、頭頸部癌、血液系統(tǒng)癌、皮膚癌、胃癌或骨癌。
本文所述的發(fā)明包括預(yù)防或治療癌癥的方法，其包含向需要該治療的人施用治療有效量的調(diào)節(jié)生存蛋白的LNA寡核苷酸，包括但不限于高劑量的LNA寡核苷酸。本發(fā)明還包括短期施用調(diào)節(jié)生存蛋白的LNA寡核苷酸的應(yīng)用。正常的、非癌的細(xì)胞以特定細(xì)胞類型特征性的頻率進(jìn)行分裂。當(dāng)細(xì)胞已經(jīng)轉(zhuǎn)化成癌狀態(tài)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生不受控的細(xì)胞增殖和減少的細(xì)胞死亡，因此雜亂的細(xì)胞分裂或細(xì)胞生長(zhǎng)是癌性細(xì)胞類型的標(biāo)志。癌癥類型的實(shí)例包括但不限于，非何杰金淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、白血病(例如急性白血病，例如急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病、慢性髓細(xì)胞樣白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤)、結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、子宮頸癌、睪丸癌、肺癌、膀胱癌、黑素瘤、頭頸部癌、腦癌、未知原發(fā)部位的癌、瘤、外周神經(jīng)系統(tǒng)癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、腫瘤(例如，纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管肺癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯瘤、小細(xì)胞肺癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腦膜瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)、重鏈病、轉(zhuǎn)移或以不受控制的或異常細(xì)胞生長(zhǎng)為特征的任何疾病或病癥。
特別相關(guān)的癌癥疾病是選自下述的那些急性髓細(xì)胞性白血病，彌漫性B細(xì)胞淋巴瘤，急性淋巴細(xì)胞性白血病，肝癌，腎癌，泌尿道癌，和結(jié)腸直腸癌。
術(shù)語“癌”是指上皮來源的惡性腫瘤。上皮組織覆蓋或襯在機(jī)體內(nèi)外的體表面。上皮組織的實(shí)例是皮膚及襯在體腔和內(nèi)部器官(例如腸、膀胱、子宮等)的粘膜和漿膜。上皮組織也可以延伸入更深的組織層以形成腺體，例如粘液分泌腺。術(shù)語“肉瘤”是指由結(jié)締組織(例如軟骨、脂肪、肌肉、腱和骨)長(zhǎng)出的惡性腫瘤。本文使用的術(shù)語“神經(jīng)膠質(zhì)瘤”旨在涵蓋起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的惡性腫瘤。
認(rèn)為本發(fā)明的組合物對(duì)治療腫瘤相關(guān)的癌癥形式特別適當(dāng)。這樣的治療可以與放療相組合。
本發(fā)明的第五個(gè)主要方面涉及LNA寡核苷酸在制備藥物組合物中的應(yīng)用，所述藥物組合物用于治療患有或易患癌癥疾病的哺乳動(dòng)物，尤其是人，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，
其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵。
本發(fā)明的第六個(gè)主要方面涉及綴合物在制備藥物組合物中的應(yīng)用，所述藥物組合物用于治療患有或易患癌癥疾病的哺乳動(dòng)物，尤其是人，所述綴合物由LNA寡核苷酸和至少一個(gè)共價(jià)結(jié)合到所述寡核苷酸上的非核苷酸/非多核苷酸部分組成，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵。
本發(fā)明的第七個(gè)主要方面涉及治療患有或易患癌癥疾病的哺乳動(dòng)物(尤其是人)的方法，該方法包括下述步驟給哺乳動(dòng)物施用一個(gè)或多個(gè)治療有效劑量的包含LNA寡核苷酸的第一種藥物組合物，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列
5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵。
本發(fā)明的第八個(gè)主要方面涉及治療患有或易患癌癥疾病的哺乳動(dòng)物(尤其是人)的方法，該方法包括下述步驟給哺乳動(dòng)物施用一個(gè)或多個(gè)治療有效劑量的包含綴合物的第一種藥物組合物，所述綴合物由LNA寡核苷酸和至少一個(gè)共價(jià)結(jié)合到所述寡核苷酸上的非核苷酸/非多核苷酸部分組成，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵。
第五個(gè)、第六個(gè)、第七個(gè)和第八個(gè)主要方面有利地與上面進(jìn)一步給出的關(guān)于LNA寡核苷酸、綴合物和藥物組合物的說明和優(yōu)選相組合。因此，在第五個(gè)、第六個(gè)、第七個(gè)和第八個(gè)主要方面提及的組合物優(yōu)選地如對(duì)上面在″藥物組合物″和″聯(lián)合藥物″下定義的藥物組合物所定義。進(jìn)一步認(rèn)為下面的實(shí)施方案充分地代表了本發(fā)明的益處。
提及的疾病可以是任何上面定義的疾病，但是優(yōu)選地選自急性髓細(xì)胞性白血病，彌漫性B細(xì)胞淋巴瘤，急性淋巴細(xì)胞性白血病，肝癌，腎癌，泌尿道癌，和結(jié)腸直腸癌。
在一個(gè)實(shí)施方案中，LNA核苷酸類似物選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA和β-D-氨基-LNA，或選自β-D-氧-LNA和α-L-氧-LNA，特別是，所有LNA核苷酸類似物都是β-D-氧-LNA。
在另一個(gè)可以與上述內(nèi)容相組合的實(shí)施方案中，LNA寡核苷酸具有共計(jì)16-19、例如16-18、或16-17、更特別是16個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物?；蛘撸琇NA寡核苷酸具有共計(jì)12-18、例如13-18、或14-17、更特別是14或15個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物。
在另一個(gè)可以與上述內(nèi)容相組合的實(shí)施方案中，LNA寡核苷酸包含選自下述的(子)序列SEQ ID NO.2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，和20，尤其是選自SEQ ID NO.2，3，4，5，6，7，8，9，和10。更具體地，LNA寡核苷酸是選自下述的化合物SEQ ID NO.2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，和20，尤其是選自SEQ ID NO.2，3，4，5，6，7，8，9，和10。更優(yōu)選地，LNA寡核苷酸包含(子)序列SEQID NO.2，且最優(yōu)選地，LNA寡核苷酸是具有SEQ ID NO.2的化合物。
在第五個(gè)和第六個(gè)主要方面的另一個(gè)可以與上述內(nèi)容相組合的實(shí)施方案中，組合物還包含至少一種紫杉烷化合物(其它細(xì)節(jié)參見上面的”聯(lián)合藥物”)。更具體地，所述組合物中紫杉烷化合物與LNA寡核苷酸(綴合物的LNA寡核苷酸部分)之間的重量比是在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)。關(guān)于第二個(gè)方面，所述至少一個(gè)非核苷酸/非多核苷酸部分包含紫杉烷化合物可能是優(yōu)選的。
在第七個(gè)和第八個(gè)主要方面的另一個(gè)可以與上述內(nèi)容相組合的實(shí)施方案中，與LNA寡核苷酸或綴合物聯(lián)合施用所述至少一種紫杉烷化合物(其它細(xì)節(jié)參見上面的”聯(lián)合藥物”)。更具體地，施用的紫杉烷化合物與LNA寡核苷酸(綴合物的LNA寡核苷酸部分)之間的重量比是在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)。關(guān)于第八個(gè)方面，所述至少一個(gè)非核苷酸/非多核苷酸部分包含紫杉烷化合物可能是優(yōu)選的。
參考前面提及的實(shí)施方案，紫杉烷化合物可以存在于包含LNA寡核苷酸(或綴合物)的第一種藥物組合物中。在該情況下，所述組合物中紫杉烷化合物與LNA寡核苷酸(或綴合物的LNA寡核苷酸部分)之間的重量比優(yōu)選地是在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)。或者，紫杉烷化合物可以存在于不包含LNA寡核苷酸(或綴合物)的第二種藥物組合物中。在該情況下，第一種藥物組合物和第二種藥物組合物可以同時(shí)地施用，或者第一種藥物組合物和第二種藥物組合物先后地施用。
在另一個(gè)可以與上述內(nèi)容相組合的實(shí)施方案中，LNA寡核苷酸(或綴合物)和任何紫杉烷化合物存在于水性載體中。優(yōu)選地，所述水性載體包含用于將pH維持在4.0-8.5范圍內(nèi)的緩沖劑，并具有20-2000mM的離子強(qiáng)度(關(guān)于緩沖劑的其它細(xì)節(jié)也參見上面)。
關(guān)于第六個(gè)和第八個(gè)主要方面，所述至少一個(gè)非核苷酸/非多核苷酸部分包含紫杉烷化合物可能是優(yōu)選的。
試劑盒本發(fā)明也提供了多種試劑盒，其可以用于對(duì)有此需要的患者的醫(yī)學(xué)治療。
在一個(gè)變體中，該試劑盒包含用于聯(lián)合治療的集合，所述聯(lián)合治療即用LNA寡核苷酸(或其綴合物)和一種或多種紫杉烷化合物進(jìn)行治療。
因此，本發(fā)明的第九個(gè)主要方面涉及試劑盒，其包含(a)第一種組分，其含有一個(gè)或多個(gè)注射溶液劑量的LNA寡核苷酸，和(b)第二種組分，其含有一種或多種紫杉烷化合物的一種或多種注射溶液；其中所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，
優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵；且其中所述第二種組分的一種溶液中的至少一種紫杉烷化合物與第一種組分的一個(gè)劑量中的至少一種LNA寡核苷酸之間的重量比是在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)，和/或其中LNA寡核苷酸的注射溶液劑量包含用于將pH維持在4.0-8.5范圍內(nèi)的緩沖劑，并具有20-2000mM的離子強(qiáng)度。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，緩沖劑(例如鹽水或緩沖鹽水)具有6.0-8.0的pH和100-500mM的離子強(qiáng)度。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，鹽水或緩沖鹽水具有7.0-8.0的pH和120-250mM的離子強(qiáng)度。
包含LNA寡核苷酸與非核苷酸/非多核苷酸部分的綴合物的類似試劑盒，經(jīng)適當(dāng)變化也構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面。
應(yīng)當(dāng)理解，注射溶液劑量的LNA寡核苷酸(或LNA寡核苷酸與非核苷酸/非多核苷酸部分的綴合物)和紫杉烷化合物優(yōu)選地分別如上面在″藥物組合物″和″聯(lián)合藥物″下所定義。
如果液體形式的藥物組合物處于會(huì)有損LNA寡核苷酸穩(wěn)定性的條件下的危險(xiǎn)中，可優(yōu)選地制備固體形式的含有LNA寡核苷酸的成品，例如作為凍干材料，并以這樣的固體形式保藏產(chǎn)品。然后，在施用前，可以重配(例如，溶解或懸浮)該產(chǎn)品。
因此，本發(fā)明的第十個(gè)主要方面涉及試劑盒，其包含(a)第一種組分，其含有固體形式的LNA寡核苷酸，和(b)第二種組分，其含有適合重配(例如，溶解或懸浮)所述LNA寡核苷酸的鹽水或緩沖溶液(例如緩沖鹽水)，優(yōu)選地，所述緩沖溶液具有4.0-8.5的pH和20-2000mM的離子強(qiáng)度；其中所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，優(yōu)選地，具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵。
上述試劑盒優(yōu)選地還包括關(guān)于組合第一種和第二種組分的書面指南。
施用本發(fā)明的藥物組合物可以多種方式施用，這取決于期望的是局部還是系統(tǒng)性治療及待治療的區(qū)域。施用可以是(a)口服(b)經(jīng)肺，例如通過吸入或吹入粉末或氣溶膠，包括通過噴霧器；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)；(c)局部，包括表皮、透皮、眼和包括陰道和直腸的粘膜遞送；或(d)腸胃外的，包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)注射或輸注；或顱內(nèi)，例如鞘內(nèi)或腦室內(nèi)施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，LNA寡核苷酸通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)口、局部地或作為推注施用或直接施用到靶器官。
目前認(rèn)為，最合適的給藥形式是通過靜脈內(nèi)輸注或口服。
劑量給藥量取決于待治療的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性和反應(yīng)性，且療程可持續(xù)幾天至幾個(gè)月，或直至實(shí)現(xiàn)治愈或達(dá)到疾病狀態(tài)的減輕。通過測(cè)量患者體內(nèi)的藥物或通過代用品標(biāo)記，也可以評(píng)價(jià)最佳給藥方案。
最佳劑量可隨各寡核苷酸的相對(duì)功效而變化。一般而言，它可基于在體外和體內(nèi)動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)有效的EC50來估計(jì)。一般地，劑量為每公斤體重0.01μg至1g，并且可以每天、每周、每月或每年施用一次或多次，或甚至每2至10年施用一次，或連續(xù)輸注幾小時(shí)直至幾個(gè)月。給藥的重復(fù)頻率可根據(jù)所測(cè)定的藥物在體液或組織中的停留時(shí)間和濃度估計(jì)。成功治療后，可能希望患者接受維持治療以預(yù)防疾病狀態(tài)的復(fù)發(fā)。目前認(rèn)為，最適當(dāng)?shù)膭┝渴敲抗矬w重0.01mg至100mg，例如0.1mg至40mg、或0.5mg至10mg。這樣的劑量可以每天施用一次，但是更優(yōu)選更低的頻率，例如每周1-3次，持續(xù)1-4周?？梢岳^續(xù)維持治療，例如每月1-4次，或甚至更低的頻率，例如每年1-10次。
并不局限于任何具體的理論，預(yù)計(jì)化療化合物和本發(fā)明的LNA寡核苷酸的聯(lián)合效果(及潛在地協(xié)同效果)將使得有可能降低化療化合物或LNA寡核苷酸或此兩者的劑量。
其它用途本發(fā)明的LNA寡核苷酸還可用作研究試劑，用于診斷、治療和預(yù)防中。在研究中，該反義LNA寡核苷酸可用于特異性抑制細(xì)胞和試驗(yàn)動(dòng)物中生存蛋白的合成，由此便于對(duì)靶的功能分析，或評(píng)價(jià)其作為治療干預(yù)靶標(biāo)的有用性。在診斷中，該反義LNA寡核苷酸可用于檢測(cè)和定量細(xì)胞和組織中的生存蛋白表達(dá)，這通過RNA印跡、原位雜交或類似的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于治療，疑似患有可通過調(diào)節(jié)生存蛋白表達(dá)進(jìn)行治療的疾病或病癥的動(dòng)物或人，可通過施用本發(fā)明的反義LNA寡核苷酸來治療。
還提供了治療動(dòng)物(特別是小鼠和大鼠)和治療人的方法，所述動(dòng)物和人懷疑患有或傾向于患與生存蛋白表達(dá)相關(guān)的疾病或病癥，所述方法通過施用治療或預(yù)防有效量的一種或多種反義LNA寡核苷酸或綴合物來實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)細(xì)胞或組織中生存蛋白表達(dá)的方法，該方法包括用本文定義的LNA寡核苷酸或綴合物、特別是本文定義的藥物組合物接觸該細(xì)胞或組織，以便調(diào)節(jié)生存蛋白表達(dá)。
另外，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)癌癥疾病中涉及的基因的表達(dá)的方法，其包括將本文定義的LNA寡核苷酸或綴合物、特別是本文定義的藥物組合物與該基因或來自該基因的RNA相接觸，由此調(diào)節(jié)基因表達(dá)。該基因優(yōu)選是生存蛋白基因。
本發(fā)明的另一方面涉及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，其包括將本文定義的藥物組合物與該細(xì)胞或來自該細(xì)胞的RNA相接觸，由此誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。凋亡的誘導(dǎo)可以在體外或體內(nèi)。該誘導(dǎo)可以在細(xì)胞測(cè)定中或組織樣品內(nèi)或活的哺乳動(dòng)物內(nèi)引發(fā)。
本發(fā)明的另一方面涉及防止或減少細(xì)胞增殖的方法，其包括將本文定義的藥物組合物與該細(xì)胞或來自該細(xì)胞的RNA相接觸，由此防止或減少細(xì)胞增殖。增殖的防止或減少可以是在體外或體內(nèi)。該防止可以在細(xì)胞測(cè)定中或組織樣品內(nèi)或活的哺乳動(dòng)物內(nèi)進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)本文定義的LNA寡核苷酸的目前優(yōu)選的實(shí)例是LNA寡核苷酸SEQID NO.2。下面的實(shí)施例解釋了該LNA寡核苷酸的令人驚奇的良好性質(zhì)，但是認(rèn)為包含(或具有)序列SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.28的其它LNA寡核苷酸具有類似令人感興趣的性質(zhì)。
實(shí)施例1單體合成按照公開的方法和其中引用的文獻(xiàn)，制備LNA單體構(gòu)件及其衍生物，參見
WO 03/095467 A1D.S.Pedersen，C.Rosenbohm，T.Koch(2002)Preparation of LNA Phosphoramidites，Synthesis 6，802-808.
M.D.Srensen，L.Kvrn，T.Bryld，A.E.Hkansson，B.Verbeure，G.Gaubert，P.Herdewijn，J.Wengel(2002)α-L-ribo-configured Locked Nucleic Acid(α-L-LNA)Synthesisand Properties，J.Am.Chem.Soc.，124，2164-2176.
S.K.Singh，R.Kumar，J.Wengel(1998)Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1]Ribonucleosides2′-Amino-and 2′-Thio-LNA Monomeric Nucleosides，J.Org.Chem.1998，63，6078-6079.
C.Rosenbohm，S.M.Christensen，M.D.Srensen，D.S.Pedersen，L.E.Larsen，J.Wengel，T.Koch(2003)Synthesis of 2′-amino-LNAa new strategy，Org.Biomol.Chem.1，655-663.D.S.Pedersen，T.Koch(2003)Analogues of LNA(Locked Nucleic Acid).Synthesis of the 2′-Thio-LNA Thymine and 5-Methyl Cytosine Phosphoramidites，Synthesis 4，578-582.
實(shí)施例2寡核苷酸合成在Expedite 8900/MOSS合成儀(Multiple OligonucleotideSynthesis System)上使用亞磷酰胺方法，以1μmol或15μmol的規(guī)模合成寡核苷酸。對(duì)于更大規(guī)模的合成，使用kta Oligo Pilot。在合成結(jié)束時(shí)(具有DMT)，在室溫下使用氨水1-2小時(shí)，從固體支持物上裂解下寡核苷酸，并在65℃下進(jìn)一步脫保護(hù)4個(gè)小時(shí)。通過反相HPLC(RP-HPLC)純化該寡核苷酸。除去DMT基團(tuán)后，寡核苷酸通過AE-HPLC、RP-HPLC和CGE表征，并且進(jìn)一步通過ESI-MS證實(shí)分子量。更多細(xì)節(jié)見下。
LNA-固體支持物的制備LNA琥珀酰半酯的制備將5’-O-DMT-3’-羥基-LNA單體(500mg)、琥珀酸酐(1.2當(dāng)量)和DMAP(1.2當(dāng)量)溶解在DCM(35ml)中。該反應(yīng)物在室溫下攪拌過夜。用0.1M的NaH2PO4，pH5.5(2x)和鹽水(1x)萃取后，用無水Na2SO4進(jìn)一步干燥有機(jī)層，過濾并蒸發(fā)。以95％的收率獲得該半酯衍生物，其不經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。
LNA-支持物的制備將以上制備的半酯衍生物(90μmol)溶解在最少量DMF中，加入DIEA和pyBOP(90μmol)并在一起混合1分鐘。將該預(yù)激活的混合物與LCAA-CPG(500，80-120目徑，300mg)在手動(dòng)合成器里混合并攪拌。室溫下1.5小時(shí)后，濾掉支持物，并用DMF、DCM和MeOH洗滌。干燥后，上樣確定為57μmol/g(見Tom Brown，Dorcas J.S.Brown.Modernmachine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis.InF.Eckstein編，Oligonucleotides and Analogues A PracticalApproach.OxfordIRL Press，199113-14)。
寡核苷酸的延伸通過使用乙腈中0.1M 5’-O-DMT-保護(hù)的amidite溶液和乙腈中的DCI(4，5-二氰基咪唑)(0.25M)作為激活劑，進(jìn)行亞磷酰胺(A(bz)，G(ibu)，5-甲基-C(bz))或T-β-氰乙基-亞磷酰胺的偶聯(lián)。通過使用蒼耳烷氯化物(在乙腈∶吡啶10％中的0.01M)進(jìn)行硫化反應(yīng)。其余的試劑是寡核苷酸合成中常用的那些。將供應(yīng)商提供的方案合適地優(yōu)化。
RP-HPLC純化柱Xterra RP18流速3ml/min緩沖液0.1M醋酸銨pH 8和乙腈縮寫DMT二甲氧三苯甲基DCI4，5-二氰基咪唑DMAP4-二甲氨基吡啶
DCM二氯甲烷DMF二甲基甲酰胺THF四氫呋喃DIEAN，N-二異丙基乙胺PyBOP六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷鏻Bz苯甲?；鵌bu異丁酰基實(shí)施例3LNA寡核苷酸的設(shè)計(jì)表2-LNA寡核苷酸
在表2中，大寫字母(沒有上標(biāo))代表β-D-氧-LNA核苷酸類似物(β-D-氧-LNA)；但是，大寫字母后面的上標(biāo)″α″(例如Gα)表示，LNA核苷酸類似物是α-L-LNA核苷酸類似物(α-L-氧-LNA)，小寫字母代表脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間沒有下標(biāo)代表磷酸二酯鍵。所有LNA-C單體都是5-甲基-C(MeC)。使用公開的序列(Genbank登錄號(hào)NM_001168)，將化合物設(shè)計(jì)成靶向人生存蛋白R(shí)NA的不同區(qū)域，實(shí)施例4Tm的測(cè)量化合物的解鏈溫度(Tm)的測(cè)量將3μM SEQ ID NO.2在10mM磷酸鈉/100mM NaCl/0.1nM EDTA，pH 7.0中的溶液與它的互補(bǔ)DNA/RNA(3μM，在10mM磷酸鈉/100mM NaCl/0.1nM EDTA，pH 7.0中)在90℃混合1分鐘，并冷卻至室溫。然后，通過每分鐘升高1℃，把溫度從25升高至95℃，確定雙鏈體的Tm。在實(shí)施例21的表7中，顯示了SEQ ID NO.2的Tm。
實(shí)施例5SEQ ID NO.2在人和小鼠血漿中的穩(wěn)定性在37℃，在不同時(shí)間等分點(diǎn)，20μM SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.24在人和小鼠血漿(肝素鋰(Taconic，M&B))中的穩(wěn)定性0，1，2，4，24，48和96小時(shí)。還包括了商業(yè)上可得到的梯(在PAGE上可看到10和20聚物)(參見圖1)。
實(shí)施例6體外模型細(xì)胞培養(yǎng)反義化合物對(duì)靶核酸表達(dá)的影響，可在多種細(xì)胞類型中的任何一種中檢測(cè)，條件是目標(biāo)核酸以可測(cè)量的水平存在。靶物可內(nèi)源性表達(dá)，或通過編碼所述核酸的核酸的瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)。
靶核酸的表達(dá)水平可使用例如RNA印跡分析、定量PCR、核糖核酸酶保護(hù)測(cè)試按常規(guī)確定。為示例目的提供以下細(xì)胞類型，但是其它細(xì)胞類型也可按常規(guī)使用，條件是靶物在所選細(xì)胞類型中表達(dá)。
細(xì)胞在如以下所述的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并保持在37℃、95-98％濕度和5％ CO2中。細(xì)胞每周按常規(guī)傳代2-3次。
15PC3人前列腺癌細(xì)胞系15PC3由F.Baas博士，NeurozintuigenLaboratory，AMC，The Netherland惠贈(zèng)，并培養(yǎng)在DMEM(Sigma)+10％胎牛血清(FBS)+Glutamax I+慶大霉素中。
PC3人前列腺癌細(xì)胞系PC3購自ATCC，并培養(yǎng)在含有谷氨酰胺(Gibco)+10％ FBS+慶大霉素的F12 Coon’s中。
518A2人黑素瘤癌細(xì)胞系518A2由B.Jansen博士，Section ofexperimental Oncology，Molecular Pharmacology，Department ofClinical Pharmacology，University of Vienna惠贈(zèng)，并培養(yǎng)在DMEM(Sigma)+10％胎牛血清(FBS)+Glutamax I+慶大霉素中。
實(shí)施例7體外模型用反義寡核苷酸處理細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染將15PC3細(xì)胞接種于12-孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃(5％ CO2)，在添加了10％ FBS，Glutamax I和慶大霉素的DMEM中生長(zhǎng)2天。當(dāng)細(xì)胞60-70％匯合時(shí)，使用Lipofectamine 2000(10μg/ml)，用不同濃度的寡核苷酸(0.2-25nM)一式兩份地轉(zhuǎn)染它們?；旧先鏒ean等(1994，JBC 26916416-16424)所述，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)而言之，用在OptiMEM中的Lipofectamine溫育細(xì)胞10分鐘，隨后加入寡核苷酸至總體積0.5ml轉(zhuǎn)染混合物/孔。4小時(shí)后，去除轉(zhuǎn)染混合物，洗滌細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中，在37℃生長(zhǎng)約20小時(shí)(mRNA分析)或12-72小時(shí)(蛋白分析)。然后，收獲細(xì)胞進(jìn)行蛋白和RNA分析。
實(shí)施例8體外模型RNA的提取和cDNA合成總RNA分離使用RNeasy mini試劑盒(Qiagen)，分離總RNA。用PBS洗滌細(xì)胞，將添加了1％巰基乙醇的細(xì)胞裂解緩沖液(RTL，Qiagen)直接加入孔中。幾分鐘后，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，處理樣品。
第一鏈的合成按照生產(chǎn)商的說明書(Qiagen)，使用OmniScript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進(jìn)行第一鏈的合成。對(duì)每個(gè)樣品，將0.5μg總RNA調(diào)整到12μl，并與0.2μl多(dT)12-18(0.5μg/ml)(Life Technologies)、2μl dNTP混合物(每種5mM)、2μl 10X RT緩沖液、0.5μl RNAguardTMRNA酶抑制劑(33單位/ml，Amersham)和1μl OmniScript逆轉(zhuǎn)錄酶混合，隨后在37℃溫育60分鐘，并在93℃熱滅活5分鐘。
實(shí)施例9體外模型通過實(shí)時(shí)PCR分析生存蛋白、Bcl-2或生存蛋白剪接變體表達(dá)的寡核苷酸抑制為了確定寡核苷酸處理的和未處理的細(xì)胞中的相對(duì)生存蛋白mRNA水平，使用來自BioRad的iCycler，在定量PCR分析中使用所產(chǎn)生的cDNA。將cDNA稀釋5倍，取8μl與52μl Taqman探針master混合物相混合，后者含有30μl Platinum Quantitative PCRSuperMix UDG 2x PCR master混合物(Invitrogen)，3μl 20x Taqman探針和引物混合物(正向引物5′AAGGACCACCGCATCTCTACA(SEQ IDNO29)，終濃度0.9μM.反向引物5′CCAAGTCTGGCTCGTTCTCAGT(SEQ ID NO30)，終濃度0.6μM，和taqman探針FAM-CGAGGCTGGCTTCATCCACTGCC-TAMRA(SEQ ID NO31)，終濃度0.1μM)和19μl H2O。將60μl分配在2個(gè)孔(96孔平板)中，每個(gè)孔25μl。對(duì)于人Bcl-2，PCR引物是正向引物5′CATGTGTGTGGAGAGCGTCAA 3′(測(cè)定中的終濃度；0.6μM)(SEQ ID NO32)反向引物5′GCCGGTTCAGGTACTCAGTCA 3′(測(cè)定中的終濃度；0.6μM)(SEQ ID NO33)，PCR探針是5′FAM-CCTGGTGGACAACATCGCCCTGT-TAMRA 3′(測(cè)定中的終濃度；0.1μM)(SEQ ID NO34)。對(duì)于生存蛋白剪接變體PCR，使用下面的引物和濃度。剪接變體1(完全)正向引物5′-GGCCGAGGCTGGCTTCAT-3′(SEQ IDNO35)(測(cè)定中的終濃度0,6μM)反向引物5′-TGCTTTTTATGTTCCTCTATGGG-3′(SEQ ID NO36)(測(cè)定中的終濃度0,6μM)。剪接變體2(2B)正向引物5′-GGCCGAGGCTGGCTTCAT-3′(SEQ ID NO35)(測(cè)定中的終濃度0,3μM)反向引物5′-AAGTGCTGGTATTACAGGCGT-S′(SEQ ID NO37)(測(cè)定中的終濃度0,3μM)。剪接變體3(ΔEx3)正向引物5′-GGCCGAGGCTGGCTTCAT-3′(SEQ ID NO35)(測(cè)定中的終濃度0,3μM)反向引物5′-ATTGTTGGTTTCCTTTGCATG-S′(SEQ ID NO38)(測(cè)定中的終濃度0.3μM)。taqman探針5′-FAM-CACTGCCCCACTGAGAACGAGCCAGACT-TAMRA-3′(SEQ ID NO39)(測(cè)定中的終濃度0.1μM)。
引物和探針獲自Proligonucleotide(France)。為了使樣品制備中的任何變異標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用來自AppliedBiosystems的預(yù)開發(fā)的Taqman測(cè)定試劑(4310884E)，定量?jī)?nèi)源的GAPDH mRNA。使用從未處理的15PC3細(xì)胞(表達(dá)生存蛋白和GAPDH)合成的cDNA的2倍稀釋液，制備測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR程序如下50℃進(jìn)行2min，95℃進(jìn)行10min，然后40個(gè)95℃ 15秒、60℃ 1min的循環(huán)。使用iCycler iQ實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)軟件，從計(jì)算的閥值循環(huán)確定生存蛋白mRNA的相對(duì)量。參見圖6B，6C，9和2C。
實(shí)施例10體外分析生存蛋白水平的蛋白印跡分析蛋白印跡通過蛋白印跡，確定生存蛋白寡聚體對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中生存蛋白水平的體外影響。
收獲細(xì)胞，在添加了蛋白酶抑制劑混合物(Roche)的50mMTris-HCl pH 6.8、10％甘油、2.5％ SDS、5mM DTT和6M尿素中裂解。使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒(Pierce)，測(cè)量總蛋白濃度。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Invitrogen)，在MOPS緩沖液中的12％ Bis-Tris凝膠上，跑50μg總蛋白，并印跡到PVDF膜上。在封閉緩沖液(添加了5％低脂奶粉的PBS-T)中溫育過夜后，將膜與多克隆抗-生存蛋白抗體Novus500-201的1∶500稀釋液一起溫育過夜，然后與抗-Bcl(DAKO)的1∶1000稀釋液一起溫育1小時(shí)。然后將膜與二抗(1∶1000稀釋的HRP綴合的來自DAKO的二抗或AP綴合的來自Invitrogen的抗體)一起溫育，并使用發(fā)色免疫檢測(cè)試劑盒(Invitrogen)或化學(xué)發(fā)光ECL+檢測(cè)試劑盒(Amersham)，顯現(xiàn)生存蛋白和Bcl2。參見圖2A。
實(shí)施例11體外分析生存蛋白水平的ELISA分析裂解收獲的細(xì)胞，并根據(jù)生產(chǎn)商的推薦，使用R&D Systems人生存蛋白DuoSet IC ELISA(目錄號(hào)DYC647)測(cè)定生存蛋白。參見圖2B。
實(shí)施例12體外分析使用反義寡核苷酸對(duì)人生存蛋白表達(dá)的反義抑制根據(jù)本發(fā)明，使用公開的序列(GenBank登錄號(hào)NM_001168)，設(shè)計(jì)了一系列靶向人生存蛋白R(shí)NA的不同區(qū)域的寡核苷酸。參見表2-LNA寡核苷酸。
評(píng)價(jià)LNA寡核苷酸在15PC3細(xì)胞中擊倒(knockdown)生存蛋白mRNA的潛力。將數(shù)據(jù)表達(dá)為相對(duì)于模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的減量調(diào)節(jié)百分比。通過實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定狀態(tài)，并相對(duì)于GAPDH轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定狀態(tài)標(biāo)準(zhǔn)化，參見表3。注意到，所有LNA C都是5-甲基-胞嘧啶。
表3
實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至少3次。括號(hào)中的數(shù)字是標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實(shí)施例13反義LNA寡核苷酸的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)和增殖抑制細(xì)胞的培養(yǎng)在37℃，95％濕度和5％ CO2，在含有10％胎牛血清、Glutamax I和慶大霉素的DMEM(Sigma)中培養(yǎng)15PC3。在37℃，95％濕度和5％ CO2，在含有10％胎牛血清、Glutamax I和慶大霉素的MEM(Sigma)中培養(yǎng)子宮頸癌細(xì)胞系HeLa。當(dāng)達(dá)到60-70％匯合時(shí)，使用Lipofectamine 2000(5μg/ml)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
有活性的半胱天冬酶3/7活性的測(cè)量轉(zhuǎn)染前日，將15PC3細(xì)胞以每孔10000個(gè)細(xì)胞的密度接種在白色96孔板(Nunc 136101)內(nèi)的DMEM中。次日，在預(yù)熱的OptiMEM里洗滌細(xì)胞一次，隨后加入72μl含有5μg/ml Lipofectamine 2000(Invitrogen)的OptiMEM。將細(xì)胞溫育7分鐘后，加入18μl在OptiMEM中稀釋的寡核苷酸。最終寡核苷酸濃度在0.2nM到100nM的范圍內(nèi)。處理4小時(shí)后，將細(xì)胞在OptiMEM中洗滌，并加入100μl含血清的DMEM。用寡核苷酸處理后，使細(xì)胞恢復(fù)指定的時(shí)間，然后從CO2培養(yǎng)箱取出它們，并平衡至室溫15min。將100μl高度敏感的半胱天冬酶3/7-GloTM試劑(Promega)直接加給細(xì)胞，并將平板溫育20min。在Luminoskan Ascent裝置(Thermo Labsystems)中記錄發(fā)光(螢光素酶活性)。將螢光素酶活性測(cè)量為每秒的相對(duì)光單位(RLU/s)。使用Ascent軟件2.4.2，分析數(shù)據(jù)。使用MS Excel，生成相對(duì)于模擬品的誘導(dǎo)倍數(shù)圖。
通過與半胱天冬酶3/7抑制劑一起溫育轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，證實(shí)細(xì)胞凋亡反應(yīng)的半胱天冬酶3/7特異性。十字孢堿、喜樹堿或紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞用作陽性對(duì)照(參見圖3，6A和表4加上實(shí)施例21)。
表4-轉(zhuǎn)染15PC3細(xì)胞后24小時(shí)，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的半胱天冬酶3/7測(cè)量
膜聯(lián)蛋白V-FITC流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染前日，將0.4×106HeLa細(xì)胞接種進(jìn)T25燒瓶。在轉(zhuǎn)染的當(dāng)天，在37℃ OptiMEM里洗滌細(xì)胞一次，隨后加入2.8ml含有5μg/mlLipofectamine 2000(Invitrogen)的OptiMEM。將細(xì)胞溫育7分鐘后，加入700μl在OptiMEM中稀釋的寡核苷酸，至終濃度5nM或25nM。模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用作對(duì)照。處理4小時(shí)后，將細(xì)胞在OptiMEM中洗滌，并加入3ml培養(yǎng)基。用寡核苷酸處理后，使細(xì)胞恢復(fù)48小時(shí)，然后通過刮取收獲它們，并在PBS中洗滌2次。將0.2×106細(xì)胞與5μl膜聯(lián)蛋白V-FITC和10μl碘化丙啶(PI-10mg/ml)一起在室溫、在黑暗中溫育15min。與純化的重組膜聯(lián)蛋白V一起溫育轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，然后加入膜聯(lián)蛋白V-FITC，證實(shí)染色的特異性和選擇性。另外，使用TRAIL(Apo2L)誘導(dǎo)的HeLA細(xì)胞(0.5μg/ml)作為陽性對(duì)照(參見圖4)。
使用MTS測(cè)定測(cè)量增殖的活細(xì)胞轉(zhuǎn)染前日，將細(xì)胞以每孔10000個(gè)細(xì)胞的密度接種在透明96孔板(Scientific Orange no.1472030100)內(nèi)的DMEM中。次日，在預(yù)熱的OptiMEM里洗滌細(xì)胞一次，隨后加入72μl含有5μg/mlLipofectamine 2000(Invitrogen)的OptiMEM。將細(xì)胞溫育7分鐘后，加入18μl在OptiMEM中稀釋的寡核苷酸。最終寡核苷酸濃度在5nM到100nM的范圍內(nèi)。處理4小時(shí)后，將細(xì)胞在OptiMEM中洗滌，并加入100μl含血清的DMEM。用寡核苷酸處理后，使細(xì)胞恢復(fù)指定的時(shí)間，通過加入20μl四唑鎓化合物[3-(4，5-二甲基-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓，內(nèi)鹽；MTS]和電子偶聯(lián)試劑(吩嗪硫酸乙酯，PES；CellTiter 96AQueous One Solution CellProliferation Assay，Promega)，測(cè)量活細(xì)胞。在Powerwave(BiotekInstruments)中，在490nm和650nm測(cè)量活細(xì)胞。
相對(duì)于模擬品(設(shè)定為100％)，針對(duì)寡核苷酸濃度，繪制對(duì)生長(zhǎng)速率的抑制ΔOD(490-650nm)/h的圖。在MTS測(cè)定中觀察到的對(duì)增殖的最大抑制是70％(最小30％)。(表5和圖5)。
表5-寡核苷酸轉(zhuǎn)染的15PC3細(xì)胞的增殖抑制
實(shí)施例14與紫杉醇相組合的SEQ ID NO.2的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)將人前列腺癌15PC3細(xì)胞(由Dr.F Baas，Neurozintuigen Laboratory，AMC，The Netherlands慷慨提供)接種到T75-燒瓶中，達(dá)到8×105細(xì)胞的密度，并在37℃和5％ CO2中，在添加了10％FBS、Glutamax和慶大霉素的DMEM中生長(zhǎng)2天。接種后2天，使用終濃度為7.5μg/ml的Lipofectamine，用2-10nM SEQ ID NO.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞。如Dean等(1994，JBC 269 p.16416 16424)所述，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)而言之，用在OptiMEM中稀釋的Lipofectamine溫育細(xì)胞7-10min，隨后加入寡核苷酸至總體積8.7ml/T75燒瓶。轉(zhuǎn)染后4小時(shí)，在OptiMEM中洗滌細(xì)胞，在加入或不加入2-100nM紫杉醇(Sigma Aldrich)的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在37℃生長(zhǎng)12-96小時(shí)。收獲細(xì)胞進(jìn)行mRNA提取、半胱天冬酶3/7測(cè)定，或固定、用PI染色、并通過FACS分析。
半胱天冬酶3/7測(cè)定通過離心指定的時(shí)間，收獲等量的15PC3細(xì)胞，從2500至10000個(gè)細(xì)胞，并平板接種在白色96孔平板(Nunc 136101)的DMEM中。將100μl高度敏感的半胱天冬酶3/7-GloTM試劑(Promega)直接加給在96孔中的細(xì)胞，并將平板溫育1小時(shí)，并在另外延遲1分鐘后，在Luminoskan Ascent裝置(Thermo Labsystems)中記錄發(fā)光(螢光素酶活性)。將螢光素酶活性測(cè)量為每秒的相對(duì)光單位(RLU/s)。使用Ascent軟件2.4.2，處理數(shù)據(jù)，并在Excel中，建立相對(duì)于模擬品的誘導(dǎo)倍數(shù)圖。通過與半胱天冬酶3/7抑制劑(它會(huì)阻斷有活性的半胱天冬酶3/7活性)一起溫育轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，證實(shí)細(xì)胞凋亡反應(yīng)的特異性。另外，十字孢堿、喜樹堿或紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞用作陽性對(duì)照。參見圖6。
實(shí)施例15與紫杉醇相組合的SEQ ID NO.2的細(xì)胞周期分析細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染與實(shí)施例13相同。
固定化和PI染色在PBS中洗滌細(xì)胞，收獲，并重新懸浮于100μl冰冷的PBS。加入900μl冰冷的70％，將固定化的細(xì)胞保藏在-20℃?zhèn)溆谩?br> 收獲固定化的細(xì)胞，并重新懸浮于700μl PBS(室溫)。加入300μl磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(0.19M Na2PO4，4mM檸檬酸pH 7.8)，在室溫溫育細(xì)胞5min。再次收獲細(xì)胞，在PI染色溶液(1mg/ml RNA酶A，33mg/ml碘化丙啶，0.2％(v/v)Triton-X-100，在PBS pH 7.4中)中溫育30min。
使用Becton Dickinson FACS Calibur，進(jìn)行FACS分析。
將SEQ ID NO.2轉(zhuǎn)染的15PC3細(xì)胞暴露于不同濃度的紫杉醇，并通過碘化丙啶染色和隨后的FACS分析進(jìn)行分析(圖7a-c)。該測(cè)定也證實(shí)了SEQ ID NO.2和紫杉醇的累加效應(yīng)，增加量的細(xì)胞陷在G2或甚至G4期。參見圖7A和7B以及實(shí)施例21。
實(shí)施例16體內(nèi)模型通過用反義寡核苷酸處理，對(duì)體內(nèi)生長(zhǎng)的人腫瘤細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)抑制模型在第0天，將PC-3人前列腺癌細(xì)胞(ECACC)與Matrigel相混合，并皮下注射進(jìn)雌性Balb/cA-nu小鼠的兩脅側(cè)。
給藥根據(jù)方案的SEQ ID NO.2的鹽水溶液，2mg/ml工作溶液，給藥體積10ml/kg；在臨床制劑中使用紫杉醇。在第0天，根據(jù)平均組體重，向動(dòng)物給藥。
施用寡核苷酸是腹膜內(nèi)地(參見圖8)或腫瘤內(nèi)地施用(參見圖9)，紫杉醇是靜脈內(nèi)地施用，都根據(jù)方案。
觀察死亡率(每天)，體重(每周2次)，腫瘤體積在實(shí)驗(yàn)過程中，每周測(cè)量腫瘤體積2次，并根據(jù)公式(L×D2×0.5)計(jì)算，其中L代表最大直徑，D是與L垂直的腫瘤直徑(mm)。
抗腫瘤活性與對(duì)照組對(duì)比處理的腫瘤的平均腫瘤重量。
研究結(jié)束通過頸脫位，處死動(dòng)物。稱量腫瘤、肝和脾。
腫瘤分析總RNA分離在400μl添加了1％巰基乙醇的RTL緩沖液(Qiagen)中，勻漿約20mg腫瘤組織。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用RNeasy mini試劑盒(Qiagen)，分離總RNA。
cDNA合成按照生產(chǎn)商的說明書(Qiagen)，使用OmniScript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進(jìn)行第一鏈的合成。對(duì)每個(gè)樣品，將0.5μg總RNA調(diào)整到12μl，并與0.2μl多(dT)12-18(0.5μg/μl)(LifeTechnologies)、2μl dNTP混合物(每種5mM)、2μl 10X RT緩沖液、0.5μl RNAguardTMRNA酶抑制劑(33單位/ml，Amersham)和1μlOmniScript逆轉(zhuǎn)錄酶混合，隨后在37℃溫育60分鐘，并在93℃熱滅活5分鐘。
腫瘤內(nèi)給藥經(jīng)2周，施用25mg/kg SEQ ID NO.2或鹽水6次(50μl體積)。在最后一次給藥后24小時(shí)進(jìn)行取樣。用9個(gè)腫瘤(SEQID NO.2)相對(duì)于8個(gè)腫瘤(鹽水)，對(duì)mRNA水平建立表達(dá)水平。通過蛋白印跡，分析各個(gè)腫瘤的蛋白水平(參見圖9)。
實(shí)時(shí)PCR分析為了確定處理的和未處理的腫瘤中的相對(duì)生存蛋白mRNA水平，使用來自BioRad的iCycler，在定量PCR分析中使用產(chǎn)生的cDNA。將cDNA稀釋5倍，取8μl與52μl Taqman探針master混合物相混合，后者含有30μl Platinum Quantitative PCRSuperMix UDG 2x PCR master混合物(Invitrogen)，3μl 20x Taqman探針和引物混合物(正向引物5′AAGGACCACCGCATCTCTACA(SEQ IDNO29)，終濃度0.9μM.反向引物5′CCAAGTCTGGCTCGTTCTCAGT(SEQ ID NO30)，終濃度0.6μM和taqman探針FAM-CGAGGCTGGCTTCATCCACTGCC-TAMRA-3′(SEQ ID NO31)，終濃度0.1μM)和19μl H2O。將60μl分配在2個(gè)孔(96孔平板)中，每個(gè)孔25μl。引物和探針購自Proligonucleotide(France)。為了使樣品制備中的任何變異標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用來自Applied Biosystems的預(yù)開發(fā)的Taqman測(cè)定試劑(4310884E)，定量?jī)?nèi)源的GAPDH mRNA。使用從未處理的15PC3細(xì)胞(表達(dá)生存蛋白和GAPDH)合成的cDNA的2倍稀釋液，制備測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR程序如下50℃進(jìn)行2min，95℃進(jìn)行10min，然后40個(gè)95℃ 15秒、60℃ 1min的循環(huán)。使用iCycler iQ實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)軟件，從計(jì)算的閥值循環(huán)確定生存蛋白mRNA的相對(duì)量。參見圖9。
總蛋白分離和蛋白印跡在添加了蛋白酶抑制劑混合物(Roche)的50mM Tris-HCl pH 6.8、10％甘油、2.5％ SDS、5mM DTT和6M尿素中，使用Retsch勻漿機(jī)勻漿化約50mg腫瘤組織。使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒(Pierce)，測(cè)量總蛋白濃度。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Invitrogen)，在MOPS緩沖液中的12％ Bis-Tris凝膠上，跑50μg總蛋白，并印跡到PVDF膜上。在封閉緩沖液(添加了5％低脂奶粉的PBS-T)中溫育過夜后，將膜與多克隆抗-生存蛋白抗體Novus 500-201的1∶500稀釋液一起溫育過夜，然后與抗-Bcl(DAKO)的1∶1000稀釋液一起溫育1小時(shí)。然后將膜與二抗(1∶1000稀釋的HRP綴合的來自DAKO的二抗或AP綴合的來自Invitrogen的抗體)一起溫育，并使用發(fā)色免疫檢測(cè)試劑盒(Invitrogen)或化學(xué)發(fā)光ECL+檢測(cè)試劑盒(Amersham)，觀察生存蛋白和Bcl2。參見圖9。
實(shí)施例17生存蛋白反義寡核苷酸和輻射的體外組合科學(xué)文獻(xiàn)中有越來越多的證據(jù)證實(shí)了細(xì)胞凋亡抑制劑蛋白(IAP)生存蛋白的過表達(dá)和輻射耐受性之間的關(guān)聯(lián)。而且已經(jīng)顯示，生存蛋白的減量調(diào)節(jié)在體外造成癌細(xì)胞系的輻射敏化。
用表達(dá)核酶(它靶向生存蛋白)的構(gòu)建體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的黑素瘤細(xì)胞系JR8和M14的轉(zhuǎn)染，導(dǎo)致生存蛋白的50-60％減量調(diào)節(jié)，通過半胱天冬酶3激活和碘化丙啶染色測(cè)得的增加的細(xì)胞凋亡，以及通過產(chǎn)克隆測(cè)定(Pennati等，2003；J.Invest.Dermatol.120，648-54)存活力的變化評(píng)估的增加的對(duì)γ-輻射的敏感性。
在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中，已經(jīng)證實(shí)了生存蛋白表達(dá)水平和輻射敏感性之間的明確關(guān)聯(lián)(Rodel等，2003；Int.J.Radiation OncologyBiol.Phys.55，1341-47)。具有最低輻射敏感性的SW 480細(xì)胞表現(xiàn)出生存蛋白的最高自發(fā)表達(dá)。實(shí)際上，在輻照SW 480細(xì)胞后48小時(shí)，生存蛋白甚至增量調(diào)節(jié)。相反地，在最為輻射敏感的細(xì)胞系SW48中，在未處理的細(xì)胞中生存蛋白表達(dá)低，且在輻照后未增加。
過表達(dá)重組生存蛋白的胰腺M(fèi)IAPaCa-2癌細(xì)胞的輻射敏感性不如未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。相反地，輻射耐受性的胰腺癌細(xì)胞系Panc-1，在用顯性陰性生存蛋白突變體轉(zhuǎn)化時(shí)，會(huì)增加輻射敏感性和半胱天冬酶3活性(Asanuma等，2002；Jpn.J.Cancer Res.93，1057-62)。
用生存蛋白反義寡核苷酸處理肺癌細(xì)胞系H460，在體外降低經(jīng)輻照的H460細(xì)胞的細(xì)胞生存力(Lu等，2004；Cancer Research 64，2840-45)。在體內(nèi)，在用生存蛋白反義寡核苷酸和輻照組合處理的裸鼠中的H460異種移植物的腫瘤生長(zhǎng)的延遲，大于用單獨(dú)的寡核苷酸或輻照處理的小鼠中(Cao等，2004；Oncogene 23，7047-52)。
這些數(shù)據(jù)清楚地表明，生存蛋白在輻射耐受性中起重要作用，且生存蛋白的減量調(diào)節(jié)可以導(dǎo)致在癌癥放射治療領(lǐng)域的治療益處。癌細(xì)胞對(duì)放療的敏化，可以導(dǎo)致減少的輻射劑量，從而減少嚴(yán)重的副作用，甚至增加功效。
通過用寡核苷酸轉(zhuǎn)染各種細(xì)胞系，包括U87和U373細(xì)胞(成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)，H460(NSCLC)和LS 174T(結(jié)腸癌)細(xì)胞，隨后輻照處理它們，可以實(shí)現(xiàn)SEQ ID NO.2和輻照的組合。作用將與接受相同治療方案的模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，后者將會(huì)表現(xiàn)出單獨(dú)輻射的作用。輻照后，使用MTT和產(chǎn)克隆測(cè)定，分析細(xì)胞的生存力。通過半胱天冬酶3活性測(cè)量、TUNEL測(cè)定和Hoechst染色，評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡。
實(shí)施例18裸鼠中皮下U87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤異種移植物中生存蛋白反義寡核苷酸SEQ ID NO.2和分次放療的體內(nèi)組合將2×106體外生長(zhǎng)的U87細(xì)胞注射進(jìn)6-7周齡雄性NMRI nu/nu小鼠的右脅側(cè)。當(dāng)腫瘤已經(jīng)達(dá)到200mm3的平均大小時(shí)，用SEQ ID NO.2、陰性對(duì)照寡核苷酸SEQ ID NO.24、或0.9％ NaCl(鹽水)腹膜內(nèi)地處理動(dòng)物。以20mg/kg/治療天的鹽水溶液注射寡核苷酸。
在研究中包括下面的組，每組包含8只小鼠。
1. 0.9％ NaCl腹膜內(nèi)地2.SEQ ID NO.2腹膜內(nèi)地3.SEQ ID NO.24腹膜內(nèi)地4.SEQ ID NO.2腹膜內(nèi)地+放療5.SEQ ID NO.24腹膜內(nèi)地+放療6. 0.9％ NaCl腹膜內(nèi)地+放療。
根據(jù)下面的治療方案，在4天，分成4份，以3戈瑞的單劑量，前后地施用放療，作為兩個(gè)相對(duì)的側(cè)場(chǎng)。在放射治療過程中，用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉動(dòng)物。以相同的方式麻醉不接受放療的動(dòng)物。
使用測(cè)徑器，通過兩個(gè)垂直的測(cè)量(d1和d2)確定腫瘤生長(zhǎng)。根據(jù)下式計(jì)算腫瘤體積[V(t)]V(t)＝0.35(d1(t)×d2(t))3/2測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)，直到腫瘤達(dá)到1000mm3的大小。
在治療開始時(shí)，測(cè)定所有動(dòng)物的體重，然后每周測(cè)量一次。
實(shí)施例19在嚙齒類動(dòng)物和短尾猴中進(jìn)行SEQ ID NO.2的臨床前GLP毒性研究關(guān)于SEQ ID NO.2，除了別的以外，在臨床前毒性研究中發(fā)現(xiàn)了下述結(jié)果在小鼠靜脈內(nèi)急性毒性研究中，發(fā)現(xiàn)最大非致死劑量是1000mg/kg。
在大鼠靜脈內(nèi)急性毒性研究中，發(fā)現(xiàn)最低致死劑量是1000mg/kg。
在短尾猴靜脈內(nèi)MTD研究中，沒有發(fā)現(xiàn)顯著的臨床跡象，但是在所有動(dòng)物中肝和腎毒性的證據(jù)是顯然的。以劑量遞增設(shè)計(jì)，經(jīng)2周，用最大劑量160mg/kg×3(總劑量為930mg/kg)或120mg/kg×5，處理動(dòng)物。
在短尾猴靜脈內(nèi)4周重復(fù)劑量毒性研究中，以0，6，15和60mg/kg/次(occasion)的劑量施用SEQ ID NO.2，每周2次，持續(xù)4周。在接受0，15或60mg/kg/次的動(dòng)物組中，對(duì)有些動(dòng)物追蹤4周無處理的恢復(fù)期。
快速冷凍組織，包括肝和腎樣品，并保藏在-70℃，用于后續(xù)分析。
實(shí)施例20短尾猴組織中的寡核苷酸含量樣品制備肝和腎組織提取化學(xué)物品/試劑蛋白酶K(25.1mg/ml)Sigma P4850苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1(v/v/v)，用10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA飽和Sigma P2069Igepal CA-630Sigma，I8896.
提取緩沖液0.5％Igepal CA-630，25mM Tris pH 8.0，25mMEDTA，100mM NaCl，pH 8.0(用1N NaOH調(diào)節(jié))。
1mg/ml在提取緩沖液中的蛋白酶K在每次提取前制備。稱量組織(約100mg)(在稱量之前和之后，組織保藏在干冰上)。加入500μl含有蛋白酶K(1mg/ml)的提取緩沖液。機(jī)械地勻漿組織，將勻漿在37℃溫育過夜。
通過以適當(dāng)?shù)臐舛确秶瑢EQ ID NO.2溶于提取緩沖液中，制備參照樣品。準(zhǔn)確稱量100mg來自未處理的動(dòng)物的肝組織(在稱量之前和之后，保藏在干冰上)。將含有參照物的提取緩沖液(含有蛋白酶K，1mg/ml)加入組織樣品，至總體積0.5ml。機(jī)械地勻漿組織，將勻漿在37℃溫育過夜。用來自這些樣品的SEQ ID NO.2檢測(cè)信號(hào)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，其涵蓋在處理的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的最低和最高濃度。
將組織樣品轉(zhuǎn)移到具有螺帽的2ml微型管。加入1ml苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1(v/v/v))，劇烈搖動(dòng)5min。通過在4000RPM離心15min，實(shí)現(xiàn)相分離。將水相(上面相)轉(zhuǎn)移到新試管(適用于蒸發(fā)器)，向有機(jī)相(第一次提取的殘余物)加入500μl Milli-Q-H2O。再次劇烈攪拌試管5min，然后在4000RPM離心15min(SAN039，在115室)。合并水相(來自1.提取和洗滌的水相)，并蒸發(fā)至干(80℃，在氮?dú)庀?。將殘余物重配于200μl Milli-Q-水中，在4000RPM離心15min。將樣品轉(zhuǎn)移于HPLC-瓶，用于分析。
肝和腎組織中寡核苷酸的HPLC分析在提取后，通過離子交換HPLC分析SEQ ID NO.2柱Dionex，DNA pac PA 1002×50mm(保護(hù))，2×250mm(分析).
柱溫42℃.
注射體積50μl.
洗滌溶劑Milli-Q-H2O.
清洗溶劑Milli-Q-H2O.
檢測(cè)UV，260nm.
溶劑緩沖液A1mM EDTA，20mM TRIS-Cl，10mM NaClO4，pH7.6(1N NaOH)緩沖液B1mM EDTA，20mM TRIS-Cl，1M NaClO4，pH7.6(1N NaOH)參見圖10A和10B實(shí)施例21結(jié)果總結(jié)表7
SEQ ID NO.2導(dǎo)致Bcl-2的減量調(diào)節(jié)，這在陰性對(duì)照中未發(fā)現(xiàn)。
序列表<110>Santaris Pharma A/S<120>LNA寡核苷酸和癌癥治療<130>16018PCT00<160>34<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>16<212>DNA<213>人工<220>
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<221>misc_feature<222>(14)..(15)<223>LNA修飾的核苷酸<400>16ctcaatccat ggcagc16<210>17<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(12)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(14)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>硫代磷酸酯鍵<400>17ctcaatccat ggcagc16<210>18<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(12)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(15)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)
<223>硫代磷酸酯鍵<400>18ctcaatccat ggcagc16<210>19<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(12)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(14)<223>LNA修飾的核苷酸<400>19ctcaatccat ggcagc16<210>20<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(12)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(15)<223>LNA修飾的核苷酸<400>20ctcaatccat ggcagc16<210>21<211>18<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(4)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(17)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(18)<223>LNA修飾的核苷酸
<400>21tgtgctattc tgtgaatt 18<210>22<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(15)<223>LNA修飾的核苷酸<400>22gcacagttga aacatc16<210>23<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(4)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(15)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(16)<223>LNA修飾的核苷酸<400>23gcagtggatg aagcca16<210>24<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>硫代磷酸酯鍵
<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(15)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<400>24cgcagattag aaacct16<210>25<211>18<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(17)<223>硫代磷酸酯鍵<400>25tgtgctattc tgtgaatt 18<210>26<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(15)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<400>26ctcccagcgt gcgcca16<210>27<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(14)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>LNA修飾的核苷酸<400>27accgcgtgcg accctc16<210>28<211>16
<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(5)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(12)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(15)<223>LNA修飾的核苷酸<400>28ctcaatccat ggcagc16<210>29<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸序列<400>29aaggaccacc gcatctctac a 21<210>30<211>22
<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸序列<400>30ccaagtctgg ctcgttctca gt 22<210>31<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸序列<400>31cgaggctggc ttcatccact gcc23<210>32<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸序列<400>32catgtgtgtg gagagcgtca a 21<210>33<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸序列<400>33gccggttcag gtactcagtc a 21<210>34<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸序列<400>34cctggtggac aacatcgccc tgt2權(quán)利要求
1.液體藥物組合物，其包含在水性載體中的LNA寡核苷酸，所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)12-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-(MeCx)(Tx)MeCxAsAstscscsastsgsgsMeCxAx(Gx)(c)-3′(SEQ ID NO.28)，其中大寫字母代表選自β-D-氧-LNA、β-D-硫-LNA、β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA的LNA核苷酸類似物，小寫字母代表脫氧核苷酸，下劃線代表如上定義的LNA核苷酸類似物或脫氧核苷酸，下標(biāo)″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標(biāo)″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵；且其中在括號(hào)中的核苷酸單元各自代表一個(gè)可選存在的單元，所述水性載體包含用于將pH維持在4.0-8.5范圍內(nèi)的緩沖劑，并具有20-2000mM的離子強(qiáng)度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)的組合物，其中所有LNA核苷酸類似物都是β-D-氧-LNA。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)的組合物，其中所述LNA寡核苷酸是選自下述的化合物SEQ ID NO.2，3，4，5，6，7，8，9，和10。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中所述LNA寡核苷酸是具有SEQID NO.2的化合物。
6.液體藥物組合物，其包含在水性載體中的綴合物，所述綴合物由權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)中定義的LNA寡核苷酸和至少一個(gè)共價(jià)結(jié)合到所述寡核苷酸上的非核苷酸/非多核苷酸部分組成；且所述水性載體包含用于將pH維持在4.0-8.5范圍內(nèi)的緩沖劑，并具有20-2000mM的離子強(qiáng)度。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其中所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)。
8.藥物組合物，其包含在可藥用載體中的至少一種紫杉烷化合物和權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)中定義的LNA寡核苷酸，且其中所述組合物中紫杉烷化合物與LNA寡核苷酸之間的重量比是在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其中所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)。
10.藥物組合物，其包含在可藥用載體中的至少一種紫杉烷化合物和綴合物，所述綴合物由權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)中定義的LNA寡核苷酸和至少一個(gè)共價(jià)結(jié)合到所述寡核苷酸上的非核苷酸/非多核苷酸部分組成，且其中所述組合物中紫杉烷化合物與綴合物的LNA寡核苷酸部分之間的重量比是在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，其中所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)。
12.權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)中定義的LNA寡核苷酸在制備藥物組合物中的應(yīng)用，所述藥物組合物用于治療患有或易患癌癥疾病的哺乳動(dòng)物，尤其是人。
13.綴合物在制備藥物組合物中的應(yīng)用，所述藥物組合物用于治療患有或易患癌癥疾病的哺乳動(dòng)物，尤其是人，所述綴合物由權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)中定義的LNA寡核苷酸和至少一個(gè)共價(jià)結(jié)合到所述寡核苷酸上的非核苷酸/非多核苷酸部分組成。
14.根據(jù)權(quán)利要求12-13中的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)。
15.根據(jù)權(quán)利要求12-14中的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所有LNA核苷酸類似物都是β-D-氧-LNA。
16.根據(jù)權(quán)利要求12-15中的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述LNA寡核苷酸是選自下述的化合物SEQ ID NO.2，3，4，5，6，7，8，9，和10。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的應(yīng)用，其中所述LNA寡核苷酸是具有SEQID NO.2的化合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求12-17中的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述藥物組合物如權(quán)利要求1-11中的任一項(xiàng)所定義。
19.根據(jù)權(quán)利要求12-18中的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述癌癥疾病選自急性髓細(xì)胞性白血病，彌漫性B細(xì)胞淋巴瘤，急性淋巴細(xì)胞性白血病，肝癌，腎癌，泌尿道癌，和結(jié)腸直腸癌。
20.治療患有或易患癌癥疾病的哺乳動(dòng)物尤其是人的方法，該方法包括下述步驟給哺乳動(dòng)物施用一個(gè)或多個(gè)治療有效劑量的包含權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)中定義的LNA寡核苷酸的第一種藥物組合物。
21.治療患有或易患癌癥疾病的哺乳動(dòng)物尤其是人的方法，該方法包括下述步驟給哺乳動(dòng)物施用一個(gè)或多個(gè)治療有效劑量的包含綴合物的第一種藥物組合物，所述綴合物由權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)中定義的LNA寡核苷酸和至少一個(gè)共價(jià)結(jié)合到所述寡核苷酸上的非核苷酸/非多核苷酸部分組成。
22.根據(jù)權(quán)利要求20-21中的任一項(xiàng)的方法，其中所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-22中的任一項(xiàng)的方法，其中所有LNA核苷酸類似物都是β-D-氧-LNA。
24.根據(jù)權(quán)利要求20-23中的任一項(xiàng)的方法，其中所述LNA寡核苷酸是選自下述的化合物SEQ ID NO.2，3，4，5，6，7，8，9，和10。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述LNA寡核苷酸是具有SEQID NO.2的化合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求20-25中的任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥疾病選自急性髓細(xì)胞性白血病，彌漫性B細(xì)胞淋巴瘤，急性淋巴細(xì)胞性白血病，肝癌，腎癌，泌尿道癌，和結(jié)腸直腸癌。
27.試劑盒，其包含(a)第一種組分，其含有一個(gè)或多個(gè)注射溶液劑量的權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)中定義的LNA寡核苷酸，和(b)第二種組分，其含有一種或多種紫杉烷化合物的一種或多種注射溶液；且其中所述第二種組分的一種溶液中的至少一種紫杉烷化合物與第一種組分的一個(gè)溶液劑量中的至少一種LNA寡核苷酸的重量比是在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)，和/或其中所述LNA寡核苷酸的注射溶液劑量包含用于將pH維持在4.0-8.5范圍內(nèi)的緩沖劑，并具有20-2000mM的離子強(qiáng)度。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的試劑盒，其中所述LNA寡核苷酸的注射溶液劑量是權(quán)利要求1-11中的任一項(xiàng)定義的藥物組合物。
29.試劑盒，其包含(a)第一種組分，其含有固體形式的權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)中定義的LNA寡核苷酸，和(b)第二種組分，其含有鹽水或適合重配所述LNA寡核苷酸的緩沖溶液。
30.根據(jù)權(quán)利要求27-29中的任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述LNA寡核苷酸具有共計(jì)16-20個(gè)核苷酸/LNA核苷酸類似物，且包含下面的(子)序列5′-MeCxTxMeCxAsastscscsastsgsgsMeCxAxGxc-3′(SEQ ID NO.1)。
全文摘要
本發(fā)明涉及LNA寡核苷酸，其具有通式5′－(
文檔編號(hào)A61K31/7088GK101065485SQ200580040908
公開日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2005年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月9日
發(fā)明者L·S·卡耶洛夫, M·阿斯克倫德, M·韋斯特加德, C·羅森鮑姆, M·韋森巴赫, B·漢森 申請(qǐng)人:桑塔里斯制藥公司