專利名稱：多價(jià)的腦膜炎球菌產(chǎn)生的多糖－蛋白質(zhì)偶聯(lián)物和疫苗的制作方法
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背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的來(lái)說(shuō)涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地涉及微生物學(xué)，免疫學(xué)，疫苗以及通過(guò)免疫學(xué)方法預(yù)防細(xì)菌病原體感染。
2.相關(guān)領(lǐng)域概述腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)是遍及世界的細(xì)菌性腦膜炎和膿毒癥的主要原因。最近30年，地方性腦膜炎球菌病發(fā)生率在發(fā)達(dá)國(guó)家范圍是每100,000人1至5例，在發(fā)展中國(guó)家范圍是每100,000人10至25例(Reido，F(xiàn).X.，等，(1995)Ped.Infect.Dis.J.14，pp.643-657)。傳染病流行期間，腦膜炎球菌病發(fā)生率達(dá)到每1000,000人1000例。在美國(guó)每年有大約2,600例細(xì)菌性腦膜炎，而在發(fā)展中國(guó)家平均是330,000例。病例死亡率范圍在10和20％之間。
病原性腦膜炎球菌被多糖膜包被，多糖膜與生物體外膜表面連接。在莢膜多糖免疫特異性基礎(chǔ)上已經(jīng)鑒定了13種不同的血清組(Frasch，C.E.，等，(1985)Rev.Infect.Dis.7，pp.504-510)。這13種血清組中，五種引起大多數(shù)腦膜炎球菌??；這些包括血清組A，B，C，W135，和Y。血清組A是大多數(shù)傳染病的原因。血清組B，C，和Y引起大多數(shù)傳染病和局部爆發(fā)。
人鼻-口咽粘摸是唯一已知的腦膜炎奈瑟氏球菌天然貯存庫(kù)。菌落化即在粘膜細(xì)胞的外表面也在鼻咽的上皮下組織發(fā)生。腦膜炎球菌的輸移能持續(xù)數(shù)月。腦膜炎球菌的傳播通過(guò)直接接觸或者通過(guò)空氣液滴發(fā)生。作為胞吞作用的結(jié)果，腦膜炎球菌經(jīng)吞噬細(xì)胞空泡通過(guò)粘膜上皮途徑而入侵。宿主對(duì)入侵腦膜炎球菌的抵御依賴于補(bǔ)體介導(dǎo)的溶菌作用。負(fù)責(zé)補(bǔ)體介導(dǎo)的溶菌作用的血清抗體大部分定向抗外莢膜多糖。
有人描述過(guò)以腦膜炎球菌多糖為基礎(chǔ)的疫苗，其激發(fā)抗莢膜多糖的免疫應(yīng)答。這些抗體能進(jìn)行血清組特異性腦膜炎球菌的補(bǔ)體介導(dǎo)的溶菌作用。腦膜炎球菌多糖疫苗被證明對(duì)孩子和成人是有效的(Peltola，H.，等，(1997)New Engl.J.Med 297，pp.686-691和Artenstein，M.S.，等，(1970)New Engl.J.Med.282，pp.417-420)，但是效力對(duì)嬰兒和兒童是有限的(Reingold，A.L.，等，(1985)Lancet 2，pp.114-118)。對(duì)低齡人群的后續(xù)劑量多糖激發(fā)弱的應(yīng)答或者沒(méi)有加強(qiáng)應(yīng)答(Goldschneider，L，等，(1973)J.Infect.Diseases 128.pp.769-776和Gold，R.，等，(1977)J.Infect.Diseases.136，S31-S35)。腦膜炎球菌多糖疫苗激發(fā)的保護(hù)作用的時(shí)間持續(xù)不長(zhǎng)，估計(jì)對(duì)成人和四歲以上的孩子是3-5年之間(Brandt，B.L.和Artenstein，M.S.(1975)J.Infect.Diseases.131，pp.S69-S72，Kyhty，H.，等，(1980)J Infect.Diseases.142，pp.861-868，和Cessey，S.J.，等，(1993)J.Infect.Diseases.167，pp 1212-1216)。對(duì)于1-4歲兒童保護(hù)期短于三年(Reingold，A.L.，等，(1985)Lancet 2，pp.114-118)。
多糖不能與主要組織相容性復(fù)合分子結(jié)合，后者是抗體呈遞和刺激T-輔助淋巴細(xì)胞的先決條件，即，它們是T-細(xì)胞不依賴性抗原。沒(méi)有T-輔助淋巴細(xì)胞的幫助，多糖也能刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體。作為B淋巴細(xì)胞T-不依賴性刺激作用的結(jié)果，接種這些抗原之后沒(méi)有沒(méi)有記憶誘導(dǎo)。多糖抗原對(duì)成人能激發(fā)非常有效的T-不依賴性應(yīng)答，但是這些T-不依賴性應(yīng)答在嬰兒和兒童不成熟免疫系統(tǒng)中是弱的。
通過(guò)多糖與蛋白質(zhì)分子(″載體″或″載體蛋白″)的共價(jià)連接，T-不依賴性多糖抗原能被轉(zhuǎn)化為T-依賴性抗原。對(duì)作為偶聯(lián)的載體蛋白的一部分的肽特異性輔助T細(xì)胞能激活結(jié)合偶聯(lián)疫苗的多糖成分的B細(xì)胞。T-輔助細(xì)胞對(duì)載體蛋白的應(yīng)答用來(lái)增加對(duì)多糖的抗體產(chǎn)生。
已經(jīng)證明血清組B多糖對(duì)人類沒(méi)有免疫原性(Wyle，F(xiàn).A.，等，(1972)J.Infect.Diseases.126，pp.514-522)。這種血清組多糖與蛋白質(zhì)的化學(xué)連接沒(méi)有顯著改變實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的免疫應(yīng)答(Jennings，H.J.和Lugowski，C.(1981)J.Immunol.127，pp.1011-1018)。對(duì)這種血清組多糖沒(méi)有免疫應(yīng)答的原因想必是由血清組B多糖和多唾液酸化宿主糖蛋白例如天然細(xì)胞附著分子之間的結(jié)構(gòu)相似性而來(lái)。
有人描述過(guò)以血清組C多糖為基礎(chǔ)的腦膜炎球菌偶聯(lián)物疫苗。這種一價(jià)疫苗激發(fā)對(duì)相應(yīng)于血清組C腦膜炎奈瑟氏球菌菌株上存在的莢膜多糖的強(qiáng)功能抗體應(yīng)答。這樣的疫苗只能保護(hù)預(yù)防血清組C細(xì)菌引起的疾病。
現(xiàn)有的以腦膜炎球菌多糖為基礎(chǔ)的疫苗對(duì)兒童的應(yīng)用有局限性并且對(duì)成人沒(méi)有提供長(zhǎng)期的保護(hù)作用。已經(jīng)證明對(duì)有腦膜炎球菌感染風(fēng)險(xiǎn)的所有人群包括兒童能激發(fā)長(zhǎng)期保護(hù)作用的唯一腦膜炎球菌疫苗是以來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌單一血清組的多糖為基礎(chǔ)并且不提供抗其他血清組感染的保護(hù)作用。因此，對(duì)于能對(duì)有腦膜炎球菌感染風(fēng)險(xiǎn)的兒童和成人提供抗腦膜炎球菌疾病的廣泛長(zhǎng)期的保護(hù)作用的腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗是存在需求的。本發(fā)明的多價(jià)腦膜炎球菌多糖通過(guò)提供一種疫苗制劑而滿足這種需求，這種疫苗制劑中來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌主要病原性血清組的免疫原多糖通過(guò)與載體蛋白偶聯(lián)已經(jīng)被轉(zhuǎn)化為T-依賴性抗原。
FDA對(duì)腦膜炎球菌多糖疫苗的許可以使用兔崽補(bǔ)體(SBA-BR)進(jìn)行的細(xì)菌實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)是對(duì)接種了許可疫苗的那些兔崽的血樣進(jìn)行的。政府和專家組的數(shù)據(jù)公開(kāi)了目前以這樣的實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)評(píng)價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗的要求和建議，例如，證明接種抗腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A和C的健康成人受試者體內(nèi)細(xì)菌抗體產(chǎn)生的誘導(dǎo)的WHO專家委員會(huì)生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(WHO 1976)；確定分析標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的國(guó)際比較研究中的CDC SBA-BR使用相同的標(biāo)準(zhǔn)參考血清，CDC供體R21654-3430107，那是比較研究中的質(zhì)量控制血清樣品中的一種(Maslanka SE，等，1997.Clin.Diagn.Lab.Immunol.4156-167)；和標(biāo)準(zhǔn)化CDC方法，這是WHO專家委員會(huì)疫苗和生物制品部要求的最佳方法(WHO 1999)。
因?yàn)橐呀?jīng)證明對(duì)腦膜炎球菌疾病的人免疫性與通過(guò)血清殺菌試驗(yàn)(SBA)檢測(cè)的補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌抗體的水平很好關(guān)聯(lián)而得以許可(Goldschneider，I，等，1969，J.Exp.Med.1291307-1326和Goldschneider，I，等.，1969，J.Exp.Med.1291327-1348)。在試驗(yàn)(SBA-H)中使用人補(bǔ)體確定了抗血清組C的1∶4 SBA效價(jià)的替代水平。然而，對(duì)腦膜炎球菌多糖疫苗的許可必要條件的基礎(chǔ)是使用兔崽補(bǔ)體(SBA-BR)作為試驗(yàn)中的補(bǔ)體源的血清殺菌應(yīng)答的誘導(dǎo)作用(世界健康組織，1976，腦膜炎球菌多糖疫苗的必要條件。世界健康組織技術(shù)報(bào)告系列，no.594。世界健康組織，日內(nèi)瓦，瑞士(WHO 1976)。根據(jù)這個(gè)必要條件，當(dāng)試驗(yàn)抵抗下面靶菌株或等價(jià)菌株時(shí)接種2-4周之后，接種了腦膜炎球菌多糖疫苗的至少90％的受試者血清的抗體效價(jià)應(yīng)該顯示高四倍或更多對(duì)于血清組A是A1，對(duì)于血清組C是C11，對(duì)于血清組Y是S-1975，和對(duì)于血清組W-135是S-4383(WHO 1976，WHO1981，Bureau of Biologies，F(xiàn)ood and Drug Administration，1985年7月17日)。The Bureau of Biologies采用WHO建議，根據(jù)這個(gè)必要條件，美國(guó)許可了腦膜炎球菌多糖疫苗，聯(lián)合A和C組，聯(lián)合A，C，Y，和W-135組。為了有利于腦膜炎球菌疫苗誘導(dǎo)的殺細(xì)菌活性的試驗(yàn)間比較，通過(guò)多試驗(yàn)研究確定了使用兔崽補(bǔ)體(SBA-BR)的標(biāo)準(zhǔn)SBA(MaslankaSE，等，1997.Clin.Diagn.Lab.Immunol.4156-167)。
隨著開(kāi)始可獲得腦膜炎球菌偶聯(lián)C疫苗的數(shù)據(jù)，人們開(kāi)始關(guān)心在試驗(yàn)中使用兔補(bǔ)體可以導(dǎo)致假高SBA效價(jià)。澄清并解決與用于人血清腦膜炎球菌血清組A和C特異性抗體的實(shí)驗(yàn)室分析相關(guān)問(wèn)題的1999年3月會(huì)議之后，WHO專家委員會(huì)對(duì)生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)建議，使用兔崽補(bǔ)體的SBA用于測(cè)定對(duì)血清組C的抗體應(yīng)答(世界健康組織，1999，對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A/C疫苗的免疫應(yīng)答評(píng)價(jià)的血清學(xué)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)和驗(yàn)證。日內(nèi)瓦，WHO/V&B/99，19(WHO 1999))。
在避免使用兔崽補(bǔ)體的過(guò)度刺激保護(hù)作用的努力中，WHO建議進(jìn)行一項(xiàng)研究來(lái)校正使用兔崽補(bǔ)體的SBA試驗(yàn)測(cè)定的效價(jià)相對(duì)于使用人補(bǔ)體測(cè)定的SBA效價(jià)的閾值。隨后舉行了會(huì)議并且給出結(jié)果支持一個(gè)一般性結(jié)論，即使用兔崽補(bǔ)體的＜1∶8的SBA效價(jià)與抗血清組C的保護(hù)作用的不存在相關(guān)聯(lián)，并且使用兔崽補(bǔ)體的＞＝1∶128的SBA效價(jià)與使用人補(bǔ)體的1∶4的保護(hù)性SBA效價(jià)很好地相關(guān)聯(lián)。沒(méi)有提供有關(guān)其它腦膜炎球菌血清組，例如A，Y或W-135，或者多糖偶聯(lián)物的校正SBA-BR效價(jià)的信息。
使用兔崽補(bǔ)體的1∶8和1∶64之間的SBA效價(jià)不必需與使用人補(bǔ)體的1∶4的保護(hù)性SBA效價(jià)很好地相關(guān)聯(lián)(Jodar L，等，Biologicals 2002；30323-329)。WHO專家委員會(huì)推薦使用人補(bǔ)體再評(píng)價(jià)1∶8，1∶16，1∶32和1∶64的接種后SBA-BR效價(jià)。解決1∶8，1∶16，1∶32和1∶64的SBA-BR效價(jià)的不確定性的其他方法包括接種之前和接種之后之間的抗體SBA效價(jià)的四倍提高的評(píng)價(jià)。也提供保護(hù)作用關(guān)聯(lián)性的記憶證明，然而專家委員會(huì)認(rèn)識(shí)到對(duì)于這些替代可得到的數(shù)據(jù)或者不恰當(dāng)或者是有限的。
高于1∶8的SBA-BR效價(jià)是人對(duì)于腦膜炎球菌疾病免疫性的一個(gè)較好的標(biāo)記，例如免疫之前至接種之后大約15至大約45天之后SBA-BR效價(jià)提高四倍或更高。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種使用多價(jià)腦膜炎球菌多糖偶聯(lián)物組合物對(duì)人患者接種的方法，其中人患者有1∶16或更高的血清SBA-BR效價(jià)，優(yōu)選地，1∶32或更高，更優(yōu)選地，1∶64或更高，更優(yōu)選地，1∶128或更高。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種使用腦膜炎球菌多糖偶聯(lián)物組合物對(duì)人患者接種的方法，其中人患者免疫之前至接種之后抗體SBA效價(jià)提高四倍或更高。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種給人患者提供抗多血清組腦膜炎奈瑟氏球菌的免疫性的方法，即使用多價(jià)腦膜炎球菌多糖偶聯(lián)物組合物對(duì)人患者接種，其中所述組合物含有選自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A和W-135；Y和W-135；C和Y；C和W-135；A，C和Y；A，C和W-135；C，Y和W-135；A，Y和W-135；以及A，C，Y和W-135的兩種或多種多糖。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種給人患者提供抗多血清組腦膜炎奈瑟氏球菌的免疫性的方法，即使用多價(jià)腦膜炎球菌(純化)多糖偶聯(lián)物組合物對(duì)人患者接種，其中所述多糖經(jīng)衍生化作用而小于100,000道爾頓。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將純化的多糖解聚使得多糖平均大小是大約5,000至大約75,000道爾頓；優(yōu)選地，使得多糖平均大小是大約7,000至大約50,000道爾頓；更優(yōu)選地，使得多糖平均大小是大約8,000至大約35,000道爾頓；更優(yōu)選地，使得多糖平均大小是大約12,000至大約25,000道爾頓。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使組合物中多糖平均大小是大約15,000至大約22,000道爾頓。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種通過(guò)施用腦膜炎球菌多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的免疫組合物而為人提供抗病原性腦膜炎奈瑟氏球菌引起的腦膜炎球菌疾病的免疫性的方法。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，免疫組合物含有兩種或多種蛋白質(zhì)-多糖偶聯(lián)物，其中每種偶聯(lián)物含有與載體蛋白偶聯(lián)的來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫組合物含有兩種或多種不同的蛋白質(zhì)-多糖偶聯(lián)物，其中每種偶聯(lián)物含有與載體蛋白偶聯(lián)的來(lái)自不同血清組腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖。
本發(fā)明提供一種為人提供抗病原性腦膜炎奈瑟氏球菌引起的腦膜炎球菌疾病的免疫性的方法。包括施用含有兩種或多種不同的蛋白質(zhì)-多糖偶聯(lián)物的免疫組合物，其中每種偶聯(lián)物含有與載體蛋白偶聯(lián)的來(lái)自不同血清組腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖。
本發(fā)明提供一種為人提供抗病原性腦膜炎奈瑟氏球菌引起的腦膜炎球菌疾病的免疫性的方法。包括施用腦膜炎球菌多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。本發(fā)明提供由免疫有效量的兩種至四種不同蛋白質(zhì)-多糖偶聯(lián)物組成的多價(jià)腦膜炎球菌疫苗，其中每一種偶聯(lián)物含有與載體蛋白偶聯(lián)的不同莢膜多糖，其中每種莢膜多糖選自來(lái)自血清組A，C，W-135和Y的莢膜多糖。本發(fā)明進(jìn)一步提供誘導(dǎo)對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖的免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)人施用免疫有效量的本發(fā)明的免疫組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，多價(jià)腦膜炎球菌疫苗含有免疫有效量的兩種不同的蛋白質(zhì)-多糖偶聯(lián)物，其中每種偶聯(lián)物含有與載體蛋白偶聯(lián)的不同莢膜多糖，并且其中每種莢膜多糖選自來(lái)自血清組A，C，W-135和Y的莢膜多糖，更優(yōu)選地，含有莢膜多糖A和W-135，A和Y，C和W-135，C和Y，以及W-135和Y的莢膜多糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，多價(jià)腦膜炎球菌疫苗含有免疫有效量的三種不同的蛋白質(zhì)-多糖偶聯(lián)物，其中每種偶聯(lián)物含有與載體蛋白偶聯(lián)的不同莢膜多糖，并且其中每種莢膜多糖選自來(lái)自血清組A，C，W-135和Y，更優(yōu)選地，含有莢膜多糖A，C和W-135，A，C和Y，C，Y和W-135，C，W-135和Y，以及A，W-135和Y。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多價(jià)腦膜炎球菌疫苗含有免疫有效量的四種不同的蛋白質(zhì)-多糖偶聯(lián)物，其中每種偶聯(lián)物含有與載體蛋白偶聯(lián)的不同莢膜多糖，并且其中每種莢膜多糖選自來(lái)自血清組A，C，W-135和Y的莢膜多糖。
本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖的免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)人或動(dòng)物施用免疫有效量的本發(fā)明的免疫組合物。
本發(fā)明提供了由免疫有效量的2-4種不同的蛋白質(zhì)-多糖偶聯(lián)物組成的多價(jià)腦膜炎球菌疫苗，其中每種偶聯(lián)物含有與載體蛋白偶聯(lián)的不同莢膜多糖，并且其中每種莢膜多糖選自來(lái)自血清組A，C，W-135和Y的莢膜多糖。
本發(fā)明提供保護(hù)易感腦膜炎奈瑟氏球菌的人或動(dòng)物的方法，包括對(duì)人或動(dòng)物施用免疫有效量的本發(fā)明疫苗。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供加強(qiáng)第一、第二、第三等劑量腦膜炎球菌疫苗或免疫原組合物之后激發(fā)的應(yīng)答的方法。在一些實(shí)施方案中，第一(或更多)劑量的腦膜炎球菌疫苗或免疫原組合物含有來(lái)自一種或幾種血清組腦膜炎奈瑟氏球菌(血清組A，B，C，Y，W-135，等)的莢膜多糖。在其它一些實(shí)施方案中，第一(或更多)劑量的腦膜炎球菌疫苗或免疫原組合物含有與一種或幾種載體(例如載體蛋白)偶聯(lián)的來(lái)自一種或幾種血清組腦膜炎奈瑟氏球菌(例如，血清組A，B，C，Y，W-135，等)的莢膜多糖。在優(yōu)選實(shí)施方案中，載體蛋白是免疫原性的和/或提供另外的治療或其它利益。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)一次或幾次后來(lái)劑量的含有來(lái)自1，2，3，4，或多種不同血清組腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖的疫苗或免疫原性組合物來(lái)加強(qiáng)一次或幾次劑量腦膜炎球菌疫苗或免疫原組合物之后激發(fā)的受試者(例如人)的第一次應(yīng)答。但是本發(fā)明不限于施用一次或幾次致敏劑量的含有非偶聯(lián)莢膜多糖的疫苗或免疫原組合物，本發(fā)明也不是要受限于施用一次或幾次含有偶聯(lián)莢膜多糖-載體蛋白的疫苗或免疫原性組合物的加強(qiáng)劑量。同樣，本發(fā)明也不是要受限于致敏劑量和加強(qiáng)劑量的時(shí)間間隔。
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圖1-15B說(shuō)明本發(fā)明一些優(yōu)選的實(shí)施方案。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明包括兩種或幾種不同蛋白質(zhì)-多糖偶聯(lián)物的免疫組合物，其中每種偶聯(lián)物包括與載體蛋白偶聯(lián)的莢膜多糖。因此，本發(fā)明包括含有與一種或幾種不同載體蛋白偶聯(lián)的兩種或幾種不同的衍生化莢膜多糖的組合物。
通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)方法能制備莢膜多糖。在本發(fā)明中，從腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A，C，W-135和Y制備的莢膜多糖是優(yōu)選的。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)分開(kāi)的過(guò)程制備這些腦膜炎球菌血清組偶聯(lián)物，并且配制成單一劑量制劑。例如，分別純化腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A，C，W-135和Y的莢膜多糖。
在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，在與載體蛋白偶聯(lián)之前將純化的多糖解聚并激活。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，使用溫和氧化條件將來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A，C，W-135和Y的莢膜多糖部分解聚。
天然腦膜炎球菌多糖是大約500,000至1,500,000道爾頓。本發(fā)明涉及較小大小的腦膜炎球菌多糖。當(dāng)純化天然多糖時(shí)，一定百分比的多糖是較小大小。然而，為了獲得更好的產(chǎn)率，一般優(yōu)選將天然腦膜炎球菌多糖解聚，或者衍生化為優(yōu)選大小范圍，優(yōu)選地小于100,000道爾頓。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，純化的多糖被解聚成大約5,000至大約75,000道爾頓平均多糖大??；優(yōu)選地，解聚成大約7,000至大約50,000道爾頓平均多糖大小；更優(yōu)選地，解聚成大約8,000至大約35,000道爾頓平均多糖大??；甚至更優(yōu)選地，解聚成大約12,000至大約25,000道爾頓平均多糖大小。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物中平均多糖大小是大約15,000至大約22,000道爾頓。
然后接著進(jìn)行活化步驟可以將多糖解聚或部分解聚。所謂″活化″意思是對(duì)多糖進(jìn)行化學(xué)處理，得到能與載體蛋白反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)。優(yōu)選的活化方法涉及在用pH 5.0.+-.0.1的生理鹽水中在15至30℃下用己二酸二酰肼處理大約2小時(shí)。美國(guó)專利No.5,965,714中描述了一種活化方法。
一旦活化，莢膜多糖然后就可以偶聯(lián)一種或幾種載體蛋白。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，各個(gè)莢膜多糖分別與一種載體蛋白物質(zhì)偶聯(lián)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A，C，W-135和Y的莢膜多糖分別與相同載體蛋白物質(zhì)偶聯(lián)。
載體蛋白可以包括細(xì)菌毒素，例如白喉毒素，滅活細(xì)菌毒素，例如白喉類毒素，CRM197，破傷風(fēng)類毒素，百日咳類毒素，大腸桿菌LT，大腸桿菌ST，和來(lái)自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa.)外毒素A。也可以使用細(xì)菌外膜蛋白，例如，外膜復(fù)合體c(OMPC)，膜孔蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白，pneumolysis，肺炎球菌表面蛋白A(PspA)，或者肺炎球菌黏附素蛋白(PsaA)。其它蛋白質(zhì)，例如卵白蛋白，匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)，牛血清白蛋白(BSA)或者結(jié)核菌素(PPD)的純化的蛋白質(zhì)衍生物也可以用作載體蛋白。載體蛋白優(yōu)選無(wú)毒的不是反應(yīng)原性的并且能以足夠量和純度獲得的蛋白質(zhì)。載體蛋白應(yīng)該可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，從白喉棒狀桿菌培養(yǎng)物純化的并且使用甲醛化學(xué)解毒的白喉毒素被用作載體蛋白。另一種可供選擇的載體蛋白是蛋白質(zhì)D，它是流感嗜血桿菌(H.influenza)外膜表面暴露蛋白。
在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，各種衍生化多糖與載體蛋白的平均比例是大約1∶1至大約1∶20(w/w)。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，總的衍生化多糖與載體蛋白的平均比例是大約1∶2至大約1∶10(w/w)，各種衍生化多糖與載體蛋白的更優(yōu)選的平均比例是大約1∶2至大約1∶6(w/w)。在本發(fā)明更優(yōu)選實(shí)施方案中，總的衍生化多糖與載體蛋白的平均比例是大約1∶(4±1)；更優(yōu)選地，1∶(4±0.5)，更優(yōu)選地，1∶(4±0.25)(w/w)。
莢膜多糖與載體蛋白偶聯(lián)之后，可以利用多種多樣的技術(shù)純化多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物(富集多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的量)。純化步驟的一個(gè)目的是從多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物去除沒(méi)有結(jié)合的多糖。純化的一種方法涉及在硫酸銨存在下超濾，描述于美國(guó)專利No.6,146,902。或者，通過(guò)多種技術(shù)能從沒(méi)有反應(yīng)的蛋白質(zhì)和多糖純化出偶聯(lián)物，其中包括，大小排阻色譜法，密度梯度離心法，疏水作用色譜法或者分級(jí)分離法。參見(jiàn)，例如，P.W.Anderson，等(1986)。J.Immunol.1371181-1186。還可參見(jiàn)H.J.Jennings和C.Lugowski(1981)J.Immunol.1271011-1018。
多糖和載體蛋白偶聯(lián)之后，通過(guò)將各種衍生化多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物混合來(lái)制備本發(fā)明的免疫組合物。本發(fā)明的免疫組合物含有與一種或幾種載體蛋白偶聯(lián)的兩種或幾種不同莢膜多糖。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案是含有分別與白喉毒素或類毒素偶聯(lián)的來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌的血清組A和C的衍生化莢膜多糖的二價(jià)免疫組合物。更優(yōu)選地，本發(fā)明是含有分別與白喉毒素或類毒素偶聯(lián)的來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌的血清組A，C，W-135和Y的莢膜多糖的四價(jià)免疫組合物。
本發(fā)明部分涉及多成分衍生化多糖偶聯(lián)物，其中各種衍生化多糖在每劑量中存在大約0.5至大約15微克。因此，組合物可以含有1微克至60微克的總的衍生化多糖微克。在優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物中各種衍生化多糖的相對(duì)量在±50％之內(nèi)；更優(yōu)選地，±30％之內(nèi)；更優(yōu)選地，±20％之內(nèi)，大約相等。
載體蛋白的制備和使用，和各種有效的偶聯(lián)方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員利用本發(fā)明的教導(dǎo)以及一般文獻(xiàn)中容易獲得的信息能制備本發(fā)明的偶聯(lián)物。從下面的一個(gè)專利或所有專利也能得到指導(dǎo)，這些專利的教導(dǎo)全文在此引作參考美國(guó)專利Nos.4,356,170；4,619,828；5,153,312；5,422,427和5,445,817。
或者，通過(guò)將兩種或幾種腦膜炎奈瑟氏球菌血清組一起培養(yǎng)并共純化，解聚，活化并與多糖偶聯(lián)，或者通過(guò)分別培養(yǎng)純化腦膜炎奈瑟氏球菌血清組，并在解聚，活化并與多糖偶聯(lián)步驟之前或之后混合兩種或幾種純化多糖，可以制備免疫組合物。
從不同腦膜炎球菌血清組分別制備多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，然后混合偶聯(lián)物，來(lái)制備本發(fā)明的免疫組合物。本發(fā)明的免疫組合物可以用作疫苗。應(yīng)用本領(lǐng)域公知的方法能制備本發(fā)明的疫苗制劑。本發(fā)明的疫苗組合物還可以含有一種或幾種輔助劑。輔助劑包括，例如但不限于，鋁輔助劑(例如，鋁鹽，例如氫氧化鋁，磷酸鋁，硫酸鋁或者其混合物)，弗氏佐劑(完全或不完全)，BAY，DC-chol，pcpp，單磷酸脂質(zhì)A，CpG，QS-21，霍亂毒素和甲?；琢虬滨ｋ摹⒁?jiàn)，例如，Vaccine Design，the Subunitand Adjuvant Approach，1995(M.F.Powell和M.J.Newman，編著，Plenum Press，N.Y.)。輔助劑優(yōu)選是鋁輔助劑，例如氫氧化鋁或磷酸鋁。
可選擇的輔助劑包括水包油乳狀液制劑，例如PCT公開(kāi).No.WO90/14837中公開(kāi)的MF59，SAF，含有10％角鯊?fù)椋?.4％Tween 80，5％pluronic-保護(hù)聚合物L(fēng)121，和thr-MDP，RibiTM輔助劑體系(RAS)，(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)含有2％角鯊烯，0.2％Tween 80，和一種或幾種選自單磷酸脂A(MPL)，海藻糖二霉菌酸(TDM)的細(xì)菌細(xì)胞壁成分，和細(xì)胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選MPL+CWS(DetoxTM)；皂甙輔助劑，例如可以使用StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，Mass.)或者從其得到的顆粒，例如ISCOMs(免疫刺激復(fù)合體)；細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素(例如，IL-I，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-12，等)，干擾素(例如，γ干擾素)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，腫瘤壞死因子(TNF)。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)-多糖有大約0.05至大約2的平均糖基化比例(多糖與蛋白質(zhì)之比)；更優(yōu)選地，大約0.08至大約1.25的平均比例；更優(yōu)選地，大約0.1至大約0.9的平均比例。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)-多糖偶聯(lián)物有大約0.2至大約0.8的平均糖基化比例多糖與蛋白質(zhì)之比；更優(yōu)選地，大約0.2至大約0.6的平均比例，在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，大約0.3至大約0.5的平均比例。
如下所證明的，根據(jù)本發(fā)明的疫苗和免疫組合物對(duì)各種不同動(dòng)物模型激發(fā)T-依賴-樣免疫應(yīng)答，而多糖疫苗激發(fā)T-不依賴-樣免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的組合物還是研究對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌抗原的T-依賴-樣免疫應(yīng)答中涉及的生物學(xué)途徑和過(guò)程的研究工具。
根據(jù)藥學(xué)和獸醫(yī)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)能確定對(duì)人或動(dòng)物施用的本發(fā)明疫苗的量和給藥方案，考慮的因素如特定抗原，輔助劑(如果存在)具體動(dòng)物或患者的年齡，性別，體重，物種和癥狀，和給藥途徑。在本發(fā)明中，提供抗腦膜炎奈瑟氏球菌接種有效劑量的多糖-蛋白質(zhì)載體的量可以在每千克體重大約0.02微克至大約5微克之間。本發(fā)明優(yōu)選的組合物和方法中，劑量在每千克體重大約0.1微克至大約3微克之間。例如，如果感染后歷時(shí)較短，則因?yàn)榧?xì)菌增殖所用時(shí)間較短而使得有效劑量要求較少抗體。在類似方法中，有效劑量取決于診斷時(shí)細(xì)菌負(fù)載量。治療性應(yīng)用應(yīng)該考慮經(jīng)一段時(shí)間施用多次注射。
本發(fā)明的多價(jià)偶聯(lián)物可以給藥一次或者一系列給藥(即，用″加強(qiáng)劑量″或″幾次加強(qiáng)劑量″)。例如，一名兒童可能在生命早期接受一次劑量，然后10年之后給予一次加強(qiáng)劑量，這是目前要求的預(yù)防兒童期疾病的其它疫苗。
加強(qiáng)劑量會(huì)從致敏的B-細(xì)胞產(chǎn)生抗體，即記憶性應(yīng)答。也就是說(shuō)，與許可的多糖疫苗相比，多價(jià)偶聯(lián)物疫苗對(duì)相對(duì)年輕人群激發(fā)高的第一次(即，一次施用疫苗之后)功能抗體應(yīng)答，并且能激發(fā)記憶性應(yīng)答(即，加強(qiáng)劑量之后)，證明本發(fā)明的多價(jià)偶聯(lián)物疫苗激發(fā)的保護(hù)性免疫應(yīng)答有效期長(zhǎng)。
本發(fā)明的組合物包括孔口用液體制劑，例如，口服，鼻用，肛門，陰道，經(jīng)口，胃內(nèi)，粘膜(例如，經(jīng)舌，牙槽，齒齦，嗅覺(jué)或呼吸膜)等。給藥，例如混懸劑，糖漿或酏劑；和用于腸胃外，皮下，真皮內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥(例如，注射給藥)的制劑，例如無(wú)菌混懸劑或乳狀液。靜脈內(nèi)和腸胃外給藥是優(yōu)選的。這樣的組合物可以與合適的載體，稀釋劑，或賦形劑混合，例如無(wú)菌水，生理鹽水，葡萄糖等。也可以凍干組合物。組合物可以含有輔助物質(zhì)，例如濕潤(rùn)劑或乳化劑，pH緩沖劑，凝膠化或黏度增強(qiáng)添加劑，防腐劑，矯味劑，顏料，等，取決于期望的給藥途徑和制劑?？梢圆殚啒?biāo)準(zhǔn)教科書，例如″REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCE″，17增刊，1985，這里引作參考，不用特殊實(shí)驗(yàn)就可以來(lái)制備合適的制劑。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選給藥途徑是肌內(nèi)或皮下，肌內(nèi)途徑是優(yōu)選的。通過(guò)注射或者通過(guò)送遞裝置可以給藥。
方便地將本發(fā)明的組合物制成液體制劑，例如，等滲水溶液，混懸劑，乳狀液或可以緩沖至選擇的pH的粘組合物。如果消化道吸收是優(yōu)選的，本發(fā)明的組合物可以是″固體″形式的藥丸，片劑，膠囊等，包括緩釋的或者裝填有液體的″固體″制劑，裝填有液體的″固體″制劑例如明膠覆蓋的液體，從而明膠溶解于胃中送遞給腸。如果期望鼻或呼吸(黏膜)給藥，組合物可以是擠出型噴霧分配器，泵出分配器或氣溶膠分配器形式并通過(guò)它們分配。氣溶膠通常利用碳?xì)浠衔飦?lái)加壓。泵出分配器優(yōu)選分配計(jì)量的劑量或者有特定顆粒大小的劑量。
液體制劑一般比凝膠，其它粘稠組合物，和固體組合物更容易制備。另外，液體組合物在某種程度上更方便給藥，特別是通過(guò)注射或口服，對(duì)動(dòng)物，兒童，特別是小孩，以及對(duì)吞咽藥丸，片劑，膠囊等困難，或者多次給藥困難的情況下。另一方面，粘稠組合物能在合適的粘度范圍內(nèi)配制，以提供與黏膜的更長(zhǎng)時(shí)間的接觸，例如在胃黏膜或鼻黏膜內(nèi)層。
在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，疫苗組合物配制成無(wú)菌液體，無(wú)熱原，磷酸鹽緩沖生理鹽水，有或沒(méi)有防腐劑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，每劑量組合物含有大約0.3至大約1.0毫克磷酸鈉和大約3.5至大約6.0毫克氯化鈉和多至1.5毫升水。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，每劑量組合物含有大約0.6±0.2毫克磷酸鈉和4.4±0.2毫克氯化鈉和多至0.5±0.2毫升水。
顯然，對(duì)合適的載體和其它添加劑的選擇取決于精確的給藥途徑和特定劑型的性質(zhì)，例如，液體劑型(例如，無(wú)論組合物配制成溶液，混懸液，凝膠或另一種液體形式)，或固體劑型(例如，無(wú)論組合物配制成藥丸，片劑，膠囊，香囊劑(caplet)，隨時(shí)間釋放的劑型或裝填液體的劑型)。
溶液，混懸液和凝膠除了活性成分外一般含有主要量的水(優(yōu)選純化水)。也可以存在少量的其它成分，例如pH調(diào)節(jié)劑(例如，堿，例如NaOH)，乳化劑或分散劑，緩沖劑，防腐劑，濕潤(rùn)劑，凝膠劑(例如甲基纖維素)，顏料和/或調(diào)味劑。組合物可以是等滲的，即其可以有和血液和淚液相同的滲透壓。
使用酒石酸鈉，聚乙二醇或其它無(wú)機(jī)或有機(jī)溶質(zhì)可以實(shí)現(xiàn)期望的本發(fā)明組合物的等滲性。在一個(gè)實(shí)施方案中，從磷酸鈉或氯化鈉，或者它們的混合物獲得優(yōu)選的組合物的等滲性。對(duì)于含有鈉離子的緩沖劑，氯化鈉是特別優(yōu)選的。
使用藥學(xué)可接受增稠劑可以將組合物粘度保持在選擇水平。甲基纖維素是優(yōu)選的，因?yàn)樗菀撰@得并且經(jīng)濟(jì)并且容易操作。其它合適的增稠劑包括，例如，黃耆膠，羧甲基纖維素，羥丙基纖維素，木炭等。增稠劑優(yōu)選的濃度取決于選擇的試劑。重點(diǎn)是使用實(shí)現(xiàn)選擇的粘度的量。一般通過(guò)加入這樣的增稠劑從溶液制備粘稠組合物。
為了提高組合物貨架保存期，可以使用藥學(xué)可接受防腐劑。芐醇是合適的，但是也可以使用各種各樣的防腐劑，包括，例如，對(duì)羥基苯甲酸酯，乙基汞硫代水楊酸鈉，氯丁醇，或也可以使用benzalkoniumchloride。防腐劑合適的濃度是以總重量為基礎(chǔ)0.02％至2％，但是也可以根據(jù)選擇的試劑而變化。
本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到必須選擇與腦膜炎奈瑟氏球菌多糖-蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)物是化學(xué)惰性的組合物成分。
參照下面本發(fā)明概念幾個(gè)詳細(xì)優(yōu)選實(shí)施方案中給出的下面的詳細(xì)描述的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
下面的縮寫和商標(biāo)是ACIP，免疫實(shí)施咨詢委員會(huì)；AE，副作用；CetavalonTM，溴化十六烷基三甲銨，CTAB；CFR，聯(lián)邦規(guī)則代碼；CRF，報(bào)告表例；DTP，白喉破傷風(fēng)百日咳；ELISA，酶聯(lián)免疫吸收測(cè)定；FDA，食品和藥物管理部(Food and Drug Administration)；GCP，好的臨床實(shí)踐；GMC，幾何平均濃度；GMT，幾何平均效價(jià)；IgG，免疫球蛋白G；IgG1，免疫球蛋白G亞類1；IgG2，免疫球蛋白G亞類2；IgM，免疫球蛋白M；ICH，國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議；IND，調(diào)查新藥；IRB，InstitutionalReview Board；MenA/C-Dt二價(jià)(A和C)腦膜炎球菌多糖白喉偶聯(lián)物疫苗；MenPS，腦膜炎球菌組特異性多糖；mL，毫升；MenomuneTM，許可的腦膜炎球菌A，C Y和W-135多糖疫苗；OD，光密度；PBS，磷酸鹽緩沖鹽水；SAE，嚴(yán)重副作用；SBA，血清殺菌活性；SBA-BR，使用兔崽補(bǔ)體進(jìn)行的血清殺菌活性測(cè)定；SBA-HC，使用人補(bǔ)體進(jìn)行的血清殺菌活性測(cè)定；SIDS，新生兒突然死亡綜合征；TetraMenD，四價(jià)(A，C，Y，和W-135)腦膜炎球菌多糖白喉偶聯(lián)物疫苗；Td，破傷風(fēng)和白喉疫苗；UAE，意外的副作用；URI，后期呼吸感染；μg，微克。
實(shí)施例實(shí)施例1腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A，C，W-135，和Y純化莢膜多糖粉末的制備粗糊狀物制備分別地，將腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A，C，W-135，和Y濕冷凍種子培養(yǎng)物解凍并且借助液體Watson Scherp培養(yǎng)基回收并且接種在含有Mueller Hinton瓊脂培養(yǎng)基的Blake瓶中。Blake瓶在35至37℃下CO2中溫育15-19小時(shí)。溫育期之后，移開(kāi)從Blake瓶中生長(zhǎng)的培養(yǎng)物并加給含有Watson Scherp培養(yǎng)基的4L燒瓶。燒瓶在平板搖動(dòng)器上在35至37℃下溫育3-7小時(shí)。將4L燒瓶中的內(nèi)含物轉(zhuǎn)移給含有Watson Scherp培養(yǎng)基的發(fā)酵器。發(fā)酵器在35至37℃下溫育7-12小時(shí)，用補(bǔ)充原料和止泡劑來(lái)控制溶解的氧內(nèi)含物和pH。溫育期之后，將發(fā)酵器中的內(nèi)含物轉(zhuǎn)移給500L罐，加入CetavlonTM，將原料混合1小時(shí)。將Cetavlon處理的培養(yǎng)物以，每小時(shí)大約30-70升的流速以大約15,000-17,000xg離心。利用第二次CetavlonTM沉淀法從上清液沉淀出粗多糖。將CetavlonTM加給上清液，原料在室溫下混合至少1小時(shí)。將材料在1至5℃下貯藏8-12小時(shí)。以每分鐘300至400ml的流速以大約45,000-50,000xg離心收集沉淀的多糖。將收集的糊狀物在-60℃或更低溫度下貯藏，直到進(jìn)一步處理。
純化的多糖粉末制劑將滅活的糊狀物解凍并且轉(zhuǎn)移給混合器。糊狀物與0.9M氯化鈣混合得到均勻的懸浮液。該懸浮液以大約10,000xg離心15分鐘。第一次萃取時(shí)將上清液傾析通過(guò)一個(gè)沒(méi)有皮棉的墊倒入容器。將第二容積的0.9M氯化鈣加給糊狀物并混合，得到均勻懸浮液。如上將懸浮液離心，上清液與第一次萃取的上清液混合。共進(jìn)行四次萃取，合并上清液。使用10-30kDa MWCO螺旋超濾設(shè)備將合并的萃取液超濾濃縮。
向濃縮液中加入氯化鎂，使用氫氧化鈉將pH調(diào)至7.2-7.5。向濃縮液中加入DNA酶和RNA酶，混合下在25-28℃下溫育4小時(shí)。加入乙醇達(dá)到濃度30-50％。以10,000xg離心2小時(shí)去除沉淀的核酸和蛋白質(zhì)?；厥丈锨逡海ㄟ^(guò)加入乙醇達(dá)到80％并在1-5℃下靜置過(guò)夜而沉淀出多糖。將醇虹吸出，沉淀出的多糖以10,000xg離心5分鐘。用醇洗滌沉淀出的多糖。多糖用丙酮洗滌，以10,000xg離心15-20分鐘。真空干燥多糖。將最初的多糖粉末溶解于乙酸鈉溶液。加入氯化鎂，使用氫氧化鈉溶液將pH調(diào)至7.2-7.5。向溶液中加入DNA酶和RNA酶，混合下在25-28℃下溫育4小時(shí)去除殘余核酸。與這些酶溫育之后，想多糖-酶混合物加入等體積的乙酸鈉-苯酚溶液，并且置于1-5℃下平搖動(dòng)器上大約30分鐘?；旌衔镆?0,000xg離心15-20分鐘?；厥丈厦娴暮畬硬⒈４?。向含水層加入等體積的乙酸鈉-苯酚溶液，并且如上萃取。共進(jìn)行四次萃取從多糖溶液去除蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素。用注射用水將合并的含水萃取液稀釋至10倍，并且用10倍體積的注射用水滲濾。向滲濾的多糖加入氯化鈣。通過(guò)加入乙醇達(dá)80％在1-5℃下沉淀過(guò)夜沉淀出多糖?；厥沾忌锨逡?，以10,000xg離心15分鐘收集多糖。純化的多糖用乙醇洗滌兩次，用丙酮洗滌一次。真空下在干燥器中干燥洗滌過(guò)的粉末。干燥過(guò)的粉末在-30℃或更低溫度下貯存直到加工成偶聯(lián)物。
實(shí)施例2腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A，C，W135，和Y純化的莢膜多糖粉末的解聚作用這項(xiàng)制備中使用的材料包括來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A，C，W135，和Y(根據(jù)實(shí)施例1制備的)的純化的莢膜多糖粉末，無(wú)菌50mM乙酸鈉緩沖液，pH 6.0，無(wú)菌1N鹽酸，無(wú)菌1N氫氧化鈉，30％過(guò)氧化氫，無(wú)菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)。
在分開(kāi)的反應(yīng)中將各血清組多糖解聚。將不銹鋼罐裝滿最多60g純化的莢膜多糖粉末。向多糖加入無(wú)菌50mM乙酸鈉緩沖液，pH 6.0，使得濃度是每升2.5g多糖。讓多糖溶液在1-5℃下混合12-24小時(shí)形成溶液。反應(yīng)罐與熱交換器裝置連接。加入另外的50mM乙酸鈉緩沖液，pH 6.0，將多糖稀釋至每升1.25g的反應(yīng)濃度。將多糖溶液加熱至55℃±0.1。向反應(yīng)混合物加入等份的30％過(guò)氧化氫，得到1％過(guò)氧化氫的反應(yīng)濃度。
根據(jù)多糖分子大小隨時(shí)間的變化監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程。每15-20分鐘，從反應(yīng)混合物取出等份并且注入HPSEC柱，測(cè)定多糖的分子大小。當(dāng)多糖的分子大小達(dá)到目標(biāo)分子大小時(shí)，關(guān)掉加熱裝置，通過(guò)冰水浴循環(huán)將多糖溶液快速冷卻至5℃。通過(guò)將反應(yīng)罐與裝有3000MWCO再生纖維素柱的超濾裝置連接，將解聚多糖溶液濃縮至每升15克。用10體積的無(wú)菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)將濃縮解聚多糖溶液滲濾。在下一步過(guò)程之前將解聚多糖在1-5℃下保存。
通過(guò)以商品名″Ultahydrogel.TM.250″出售的用葡聚糖分子大小標(biāo)準(zhǔn)校正并多角激光散射的凝膠過(guò)濾色譜柱過(guò)柱測(cè)定解聚多糖的分子大小。應(yīng)用Bartlet，G.R.J.(1959)Journal of Biological Chemistry，234，pp-466-468的方法，通過(guò)血清組A的磷含量，或者應(yīng)用Svennerholm，L.(1955)Biochimica Biophysica Acta 24，pp604-611的方法，通過(guò)血清組C，W135和Y的唾液酸含量，來(lái)測(cè)定多糖的量。通過(guò)Hesterin，S.(1949)Journal of Biological Chemistry 180，p249的方法測(cè)定O-乙酰基含量。通過(guò)Park，J.T.和Johnson，M.J.(1949 Journal of BiologicalChemistry 181，pp149-151的方法測(cè)定還原性。通過(guò)蛋白質(zhì).sup.1H和.sup.13C NMR測(cè)定解聚多糖的結(jié)構(gòu)完整性。通過(guò)測(cè)定LAL(內(nèi)毒素)含量和殘存過(guò)氧化氫含量來(lái)測(cè)定解聚多糖的純度。
實(shí)施例3腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A，C，W135，和Y解聚多糖的衍生化作用這項(xiàng)制備中使用的材料包括來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌的過(guò)氧化氫解聚莢膜多糖血清組A，C，W-135，和Y(根據(jù)實(shí)施例2制備的)，己二酸二酰肼，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDAC)只適用于血清組A，氰基硼氫化鈉，無(wú)菌1N鹽酸，無(wú)菌1N氫氧化鈉，無(wú)菌1M氯化鈉，和無(wú)菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)。
各種血清組多糖在分開(kāi)的反應(yīng)中衍生化。向不銹鋼罐加入純化的解聚多糖，用無(wú)菌0.85％生理鹽水稀釋，達(dá)到每升6g多糖的最終反應(yīng)濃度。為了實(shí)現(xiàn)每升1g的反應(yīng)濃度，向該溶液加入一份溶解于無(wú)菌0.85％生理鹽水的濃縮己二酸二酰肼。為了實(shí)現(xiàn)每升1g的反應(yīng)濃度，僅對(duì)血清組A，加入一份作為溶解于無(wú)菌0.85％生理鹽水的濃縮EDAC。室溫下(15-30℃)使用無(wú)菌1N鹽酸，無(wú)菌1N氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至5.0±0.1，并且將這個(gè)pH保持2小時(shí)。2小時(shí)之后，向該反應(yīng)混合物加入一份溶解于0.85％生理鹽水的濃縮氰基硼氫化鈉，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)濃度每升2g。保持pH 5.5±0.5下室溫下(15-30℃)將反應(yīng)攪拌44小時(shí)±4小時(shí)。這個(gè)反應(yīng)期后，將pH調(diào)節(jié)至6.0±0.1，并且通過(guò)將反應(yīng)罐與裝有3000MWCO再生纖維素柱的超濾裝置連接，將衍生化多糖濃縮至每升12克多糖。濃縮的衍生化多糖用30體積的1M氯化鈉滲濾后用10體積的0.15氯化鈉滲濾。將罐從超濾裝置上解下來(lái)并且在1-5℃下保存7天。將罐從裝有3000MWCO再生纖維素柱的超濾裝置上解下來(lái)，用30體積的1M氯化鈉滲濾后用10體積的0.15氯化鈉滲濾。
利用和對(duì)解聚多糖使用的相同的方法測(cè)定衍生化多糖的分子大小，多糖的量，和O-乙?；俊Ｍㄟ^(guò)Snyder，S.L。和Sobocinski，P.Z.(1975)Analytical Biochemistry 64，pp282-288的2，4，6-三硝基苯磺酸方法測(cè)定酰肼含量。通過(guò)質(zhì)子1H和13C NMR測(cè)定衍生化多糖的結(jié)構(gòu)完整性。通過(guò)測(cè)定沒(méi)有結(jié)合的酰肼含量，LAL(內(nèi)毒素)含量，和殘留的氰基硼氫化物含量來(lái)測(cè)定衍生化多糖的純度。
實(shí)施例4載體蛋白的制備粗白喉類毒素蛋白質(zhì)的制備重新組成凍干的菌種培養(yǎng)物并且溫育16-18小時(shí)。將一份培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移給含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基的0.5-升燒瓶，培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器上在34.5-36.5℃下培養(yǎng)7-9小時(shí)。將一份培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移給含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基的4-升燒瓶，培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器上在34.5-36.5℃下培養(yǎng)14-22小時(shí)。使用4-升燒瓶中的培養(yǎng)物接種含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基的發(fā)酵罐。發(fā)酵罐在34.5-36.5℃下培養(yǎng)70-144小時(shí)。發(fā)酵罐中的內(nèi)含物通過(guò)深過(guò)濾器過(guò)濾到收集容器中。加入一等份37％甲醛溶液，達(dá)到0.2％的濃度。將pH調(diào)節(jié)至7.4-7.6。收集物通過(guò)0.2微米過(guò)濾芯過(guò)濾到滅菌20升瓶中。瓶子在34.5-36.5℃下保溫7天。向各個(gè)20升瓶中加入一等份37％甲醛溶液，達(dá)到0.4％的濃度。將混合物pH調(diào)節(jié)至7.4-7.6。瓶子在在搖動(dòng)器上34.5-36.5℃下保溫7天。向各個(gè)20升瓶中加入一等份37％甲醛溶液，達(dá)到0.5％的濃度。將混合物pH調(diào)節(jié)至7.4-7.6。瓶子在34.5-36.5℃下保溫8周。對(duì)粗類毒素測(cè)定解毒作用。在試驗(yàn)期間瓶子在1-5℃下保存。
粗白喉類毒素蛋白質(zhì)的純化讓粗類毒素溫?zé)嶂潦覝?，并且?0升瓶中的內(nèi)含物合并到純化罐中。將類毒素的pH調(diào)節(jié)至7.2-7.4，并且向粗類毒素加入木炭并混合2分鐘。讓木炭類毒素混合物靜置1小時(shí)，然后通過(guò)深過(guò)濾芯過(guò)濾到第二純化罐中。向?yàn)V液中加入固體硫酸銨實(shí)現(xiàn)70％飽和。將pH調(diào)節(jié)至6.8-7.2，讓溶液靜置16小時(shí)。過(guò)濾收集沉淀的蛋白質(zhì)并用70％的飽和硫酸銨溶液，pH 7.0洗滌。將沉淀物溶解于無(wú)菌蒸餾水，并將蛋白質(zhì)溶液過(guò)濾到不銹鋼收集容器中。將pH調(diào)節(jié)至6.8-7.2，加入硫酸銨至40％飽和。將溶液pH調(diào)節(jié)至7.0-7.2，讓溶液靜置16小時(shí)。過(guò)濾去除沉淀物并棄除。向?yàn)V液中加入硫酸銨至60％飽和，將pH調(diào)節(jié)至7.0-7.2，讓混合物靜置16小時(shí)，過(guò)濾收集沉淀的蛋白質(zhì)。將沉淀物溶解于無(wú)菌蒸餾水，過(guò)濾去除沒(méi)有溶解的蛋白質(zhì)，用0.85％生理鹽水滲濾。
純化的白喉類毒素蛋白質(zhì)的濃縮和滅菌過(guò)濾使用10,000 MWCO再生纖維素過(guò)濾柱將蛋白質(zhì)溶液濃縮至每升15g并用10體積的0.85％生理鹽水滲濾。通過(guò)0.2微米膜過(guò)濾將濃縮蛋白質(zhì)溶液滅菌。在加工成偶聯(lián)物之前將蛋白質(zhì)溶液在1-5℃下貯存。
通過(guò)Lowry，O.H.等(1951)Journal of Biological Chemistry 193，p265-275的方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)無(wú)菌，LAL(內(nèi)毒素)含量，和殘留的甲醛含量來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的純度。
實(shí)施例5腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A，C，W-135，和Y多糖與白喉類毒素蛋白質(zhì)的一價(jià)偶聯(lián)物的制備該項(xiàng)制備中使用的材料包括來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A，C，W-135，和Y的己二酸衍生化多糖(根據(jù)實(shí)施例3制備)，無(wú)菌白喉類毒素蛋白質(zhì)(根據(jù)實(shí)施例4制備)，EDAC，硫酸銨，無(wú)菌1N鹽酸，無(wú)菌1N氫氧化鈉，和無(wú)菌生理鹽水(0.85％)。
在分開(kāi)的反應(yīng)中制備各種血清組多糖偶聯(lián)物。所有四種偶聯(lián)物都根據(jù)下面的方法制備。以每升700-1000微摩爾反應(yīng)酰肼的反應(yīng)濃度向不銹鋼罐中加入純化己二酸衍生化多糖和以每升3.8-4.0克蛋白質(zhì)的反應(yīng)濃度加入純化白喉類毒素蛋白質(zhì)。使用生理鹽水0.85％將起始物稀釋至目標(biāo)反應(yīng)濃度并將pH調(diào)節(jié)至 5.0±0.1。向多糖蛋白質(zhì)混合物加入一份EDAC，使反應(yīng)濃度達(dá)到每升2.28-2.4克。15-30℃下將反應(yīng)pH保持在5.0±0.1反應(yīng)2小時(shí)。2小時(shí)之后，使用無(wú)菌1N氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至7.0±0.1，反應(yīng)在1-5℃下保存16-20小時(shí)。
讓反應(yīng)混合物溫?zé)嶂?5-30℃，并且將反應(yīng)容器與裝備有30,000MWCO再生纖維素芯的超濾裝置連接。加入固體硫酸銨至60％飽和(對(duì)于血清組A，W-135和Y)和50％飽和(對(duì)于血清組C)。偶聯(lián)反應(yīng)混合物用20體積的60％飽和硫酸銨溶液(對(duì)于血清組A，W-135和Y)和50％飽和硫酸銨溶液(對(duì)于血清組C)滲濾，接著用20體積的0.85％生理鹽水滲濾。將經(jīng)滲濾的偶聯(lián)物首先通過(guò)含有1.2微米和0.45微米過(guò)濾器的過(guò)濾囊過(guò)濾，然后提高含有0.22微米過(guò)濾器的第二過(guò)濾囊過(guò)濾。
根據(jù)對(duì)解聚和衍生化多糖使用的相同的方法測(cè)定多糖和O-乙?；鶅?nèi)含物的量。通過(guò)Lowry方法測(cè)定蛋白質(zhì)的量。通過(guò)以商標(biāo)″TSK6000PW″出售的使用DNA作為空白體積標(biāo)記，ATP用作總體積標(biāo)記，和牛甲狀腺球蛋白用作參照標(biāo)記的凝膠過(guò)濾色譜柱，測(cè)定偶聯(lián)物的分子大小。另外，通過(guò)多角激光散射測(cè)定TKS6000PW柱洗脫出來(lái)的偶聯(lián)物的分子大小。應(yīng)用雙-夾層ELISA方法通過(guò)與抗-多糖血清組特異性抗體結(jié)合測(cè)定偶聯(lián)物的抗原特征。通過(guò)疏水性相互作用色譜柱洗脫測(cè)定沒(méi)有結(jié)合的(沒(méi)有偶聯(lián)的)多糖的量，用毛細(xì)電泳法測(cè)定沒(méi)有偶聯(lián)的蛋白質(zhì)，測(cè)定無(wú)菌性，LAL(內(nèi)毒素)含量，殘留EDAC含量，和殘留的銨離子含量，來(lái)測(cè)定偶聯(lián)物的純度。
實(shí)施例6多價(jià)腦膜炎球菌A，C，W-135，和Y多糖白喉類毒素偶聯(lián)物疫苗制劑該項(xiàng)制備中使用的材料包括根據(jù)實(shí)施例5制備的血清組A，C，W-135，和Y多糖-白喉類毒素偶聯(lián)物，無(wú)菌100mM磷酸鈉緩沖生理鹽水(0.85％氯化鈉)。
向不銹鋼批量生產(chǎn)罐中的生理鹽水(0.85％)加入一份無(wú)菌100-500mM磷酸鈉緩沖生理鹽水，得到10mM磷酸鈉最終疫苗濃度。向含有10mM無(wú)菌磷酸鈉緩沖生理鹽水的批量生產(chǎn)罐加入兩種至四種無(wú)菌一價(jià)腦膜炎球菌多糖-白喉類毒素偶聯(lián)物各一份，得到每毫升緩沖液8微克各種血清組多糖的最終濃度。將配制的四價(jià)偶聯(lián)物混合并通過(guò)0.2微米過(guò)濾器過(guò)濾到第二個(gè)批量生產(chǎn)罐中。
應(yīng)用高pH陰離子-交換色譜法用脈沖電流測(cè)定，通過(guò)糖成分分析測(cè)定多價(jià)制劑中存在的各種血清組多糖的量。用Lowry的方法測(cè)定蛋白質(zhì)的量。利用與pH計(jì)量器連接的組合電極測(cè)定疫苗的pH。利用雙-夾層ELISA方法通過(guò)與抗-多糖血清組特異性抗體來(lái)測(cè)定多價(jià)偶聯(lián)物疫苗的抗原性特征。對(duì)多價(jià)偶聯(lián)物疫苗的免疫原性測(cè)定疫苗中存在的各種偶聯(lián)物對(duì)動(dòng)物模型激發(fā)原發(fā)的和加強(qiáng)的抗-多糖IgG免疫應(yīng)答的能力。通過(guò)使用高pH陰離子-交換色譜法用脈沖電流測(cè)定沒(méi)有結(jié)合的(沒(méi)有偶聯(lián)的)多糖的量，無(wú)菌性，LAL(內(nèi)毒素)含量，熱源量，和一般安全性，來(lái)測(cè)定多價(jià)偶聯(lián)物疫苗的純度。
實(shí)施例7氫氧化鋁輔助的多價(jià)腦膜炎球菌多糖白喉類毒素偶聯(lián)物的制備吸附到氫氧化鋁上的偶聯(lián)物的制備該項(xiàng)制備中使用的材料包括根據(jù)實(shí)施例5制備的血清組A，C，W-135，和Y多糖-白喉類毒素偶聯(lián)物，無(wú)菌100mM磷酸鈉緩沖生理鹽水(0.85％氯化鈉)，和生理鹽水(0.85％氯化鈉)中的無(wú)菌氫氧化鋁。
向含有生理鹽水的批量生產(chǎn)罐中的加入一份各無(wú)菌一價(jià)腦膜炎球菌多糖-白喉類毒素偶聯(lián)物，得到每毫升緩沖液8微克各血清組多糖的最終濃度。向多價(jià)偶聯(lián)物疫苗加入一份生理鹽水(0.85％氯化鈉)中的無(wú)菌氫氧化鋁，達(dá)到每毫升疫苗0.44mg鋁離子的最終濃度。
實(shí)施例8磷酸鋁-輔助的偶聯(lián)物的制備該項(xiàng)制備中使用的材料包括根據(jù)實(shí)施例5制備的血清組A，C，W-135，和Y多糖-白喉類毒素偶聯(lián)物，無(wú)菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)，和生理鹽水(0.85％氯化鈉)中的磷酸鋁。
向含有生理鹽水的批量生產(chǎn)罐中的加入一份無(wú)菌一價(jià)腦膜炎球菌多糖-白喉類毒素偶聯(lián)物的一種，得到每毫升緩沖液8微克血清組多糖的最終濃度。向多價(jià)偶聯(lián)物疫苗加入一份生理鹽水(0.85％氯化鈉)中的無(wú)菌氫氧化鋁，達(dá)到每毫升疫苗0.44mg鋁離子的最終濃度。
實(shí)施例9人臨床研究中使用的材料和方法的一般性描述四價(jià)衍生偶聯(lián)物疫苗的免疫原性在多種不同臨床程序中對(duì)偶聯(lián)物疫苗研究它對(duì)人激發(fā)免疫應(yīng)答的能力。下面的研究總結(jié)了結(jié)果。除非另有說(shuō)明，在下面各項(xiàng)研究中使用的材料和方法是TetraMenDTetraMenD疫苗含有血清組A，C，Y，和W-135的四種腦膜炎球菌莢膜多糖，它們與48微克白喉類毒素蛋白。在無(wú)菌無(wú)熱源磷酸鹽緩沖生理鹽水中配制疫苗制劑，沒(méi)有防腐劑。制劑含有0.6mg磷酸鈉，4.4mg氯化鈉和至多0.5mL水。
Menomune_Menomune_在美國(guó)和其他地方得到授權(quán)對(duì)兩歲和更大的人群使用。Menomune_是凍干制劑，每劑量疫苗含有各種A，C，Y和W-135多糖50微克作為抗原，用硫汞撒防腐的等滲氯化鈉稀釋劑重新構(gòu)成，并且以0.5mL劑量皮下給藥。每0.5mL劑量疫苗含有2.5mg至5mg乳糖作為穩(wěn)定劑。皮下使用的Menomune_-A/C/Y/W-135，腦膜炎球菌多糖疫苗，混合A，C，Y，和W-135，是來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌組-特異性多糖抗原A組，C組，Y組，和W-135組的凍干制劑。稀釋劑是無(wú)菌無(wú)熱源蒸餾水。根據(jù)標(biāo)簽指示用稀釋劑重新構(gòu)成凍干產(chǎn)品之后，每0.5mL劑量在等滲氯化鈉溶液中配制成含有50微克來(lái)自各種血清組A，C，Y，和W-135的″分離產(chǎn)物″。
Tetanus and Diphtheria Toxoids Adsorbed for Adult Use_(后來(lái)被指定為Td)是含有調(diào)控pH的磷酸鈉緩沖液的等滲氯化鈉溶液中明礬沉淀類毒素?zé)o菌懸浮液。該疫苗用于肌內(nèi)注射。經(jīng)化驗(yàn)，每0.5mL劑量配制成含有5Lf破傷風(fēng)類毒素，2Lf白喉類毒素和不多于0.28mg的鋁。在豚鼠效能試驗(yàn)中破傷風(fēng)和白喉類毒素分別誘導(dǎo)每毫升至少2單位和0.5單位的抗毒素。第一次試驗(yàn)中，使用一英寸25標(biāo)準(zhǔn)度量針頭通過(guò)肌內(nèi)注射對(duì)所有參與者施用Td，注射到左臂三角肌。每0.5mL劑量含有5Lf的破傷風(fēng)類毒素和2Lf的白喉類毒素。
血清樣品在基線后指定的天數(shù)取血樣。例如，如果方案指定三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，D0，D28和6個(gè)月，則在接種前第0天(基線)，接種后第28天(評(píng)價(jià)初期免疫應(yīng)答)，和接種后第6個(gè)月(評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答的長(zhǎng)期性)取血樣。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)每個(gè)受試者采集大約5毫升的全血。在采集的4小時(shí)內(nèi)將全血離心。取出血清并保存在-20℃?！?8天′血樣在第0天注射之后至少28天但不到57天時(shí)獲取?！?個(gè)月″血樣在第0天注射之后6個(gè)月加或減28天時(shí)獲取。這樣，第28天血清代表D0后第28天至第56天之間取出的血清；6個(gè)月血清代表D0后第149天至第217天之間取出的血清。
分析技術(shù)本項(xiàng)研究使用多種標(biāo)準(zhǔn)免疫試驗(yàn)。下面的描述總結(jié)了這里使用的方法。然而，其它相似方法，包括這里給出的那些方法的變化形式，是本領(lǐng)域公知的并且可以使用。
使用兔崽補(bǔ)體(SBA-BR)通過(guò)血清殺細(xì)菌試驗(yàn)的抗-腦膜炎球菌抗體測(cè)定應(yīng)用血清殺細(xì)菌試驗(yàn)測(cè)定抗-腦膜炎球菌抗體抗血清組A，C，Y，和W-135的功能抗體活性。在無(wú)菌96-孔微升板中制備兩倍稀釋的試驗(yàn)血清。向血清稀釋液中加入血清組特異性腦膜炎球菌和兔崽補(bǔ)體并溫育。溫育期過(guò)后，向血清/補(bǔ)體/細(xì)菌混合物加入瓊脂覆蓋培養(yǎng)基，使變硬，然后在37℃5％CO2下溫育過(guò)夜。計(jì)數(shù)孔中存在的細(xì)菌菌落。通過(guò)與補(bǔ)體對(duì)照孔平均值相比得到＞50％殺傷的血清稀釋度倒數(shù)測(cè)定終點(diǎn)效價(jià)。使用兔補(bǔ)體的該項(xiàng)試驗(yàn)測(cè)定的限度是效價(jià)8。
IgG抗-腦膜炎球菌抗體測(cè)定利用間接ELISA測(cè)定抗-腦膜炎球菌抗體抗血清組A，C，Y，和W-135的IgG抗體活性。這道程序包括使血清中的抗體與通過(guò)甲基化人血清白蛋白與塑料微量滴定孔吸附的過(guò)量腦膜炎球菌組特異性多糖(MenPs)抗原反應(yīng)。通過(guò)與過(guò)氧化物酶-標(biāo)記的小鼠抗-人IgG特異性單克隆抗體反應(yīng)測(cè)定結(jié)合的抗體的量。接著的使用過(guò)氧化物酶底物的反應(yīng)產(chǎn)生可分光光度法測(cè)定的產(chǎn)色產(chǎn)物。得到的光密度(OD)相應(yīng)于血清中與微量滴定板上腦膜炎球菌多糖結(jié)合的IgG抗體的量。然后，應(yīng)用4-參數(shù)邏輯曲線方法，用分配值，通過(guò)與參考值(Lot CDC 1992或等價(jià)物)的比較，計(jì)算IgG抗體的量。
IgM抗-腦膜炎球菌抗體測(cè)定利用間接ELISA測(cè)定抗-腦膜炎球菌抗體抗血清組A，C，Y，和W-135的IgG抗體活性。這道程序包括使血清中的抗體與通過(guò)甲基化人血清白蛋白與塑料微量滴定孔吸附的過(guò)量MenPs抗原反應(yīng)。通過(guò)與過(guò)氧化物酶-標(biāo)記的小鼠抗-人IgM特異性單克隆抗體反應(yīng)測(cè)定結(jié)合的抗體的量。接著的使用過(guò)氧化物酶底物的反應(yīng)產(chǎn)生可分光光度法測(cè)定的產(chǎn)色產(chǎn)物。得到的光密度(OD)相應(yīng)于血清中與微量滴定板上腦膜炎球菌多糖結(jié)合的IgM抗體的量。然后，應(yīng)用4-參數(shù)邏輯曲線，用分配值，通過(guò)與參考值(Lot CDC 1992或等價(jià)物)的比較，計(jì)算IgM抗體的量。
高抗體親抗原性抗-腦膜炎球菌IgG抗體測(cè)定利用改進(jìn)的ELISA，在Aventis Pasteur Inc.測(cè)定抗-腦膜炎球菌抗體抗血清組A，C，Y，和W-135的高抗體親抗原性IgG抗體活性。該項(xiàng)試驗(yàn)?zāi)壳霸贏ventis Pasteur Inc.的開(kāi)發(fā)下，并且在臨床抽樣分析之前定性分析。簡(jiǎn)要地說(shuō)，96孔微量滴定板包被MenPs抗原。抽吸并清洗包被板之后，使用含有75mM硫代氰酸銨的磷酸緩沖鹽水(PBS)血清稀釋緩沖液，在平板中直接制備臨床血清系列稀釋液，并溫育過(guò)夜。通過(guò)與過(guò)氧化物酶-標(biāo)記的小鼠抗-人IgG特異性單克隆抗體反應(yīng)來(lái)測(cè)定結(jié)合的抗體的量。接著的使用過(guò)氧化物酶底物的反應(yīng)產(chǎn)生可分光光度法測(cè)定的產(chǎn)色產(chǎn)物。得到的OD相應(yīng)于血清中與微量滴定板上腦膜炎球菌多糖結(jié)合的高抗體親抗原性IgG抗體的量。然后，應(yīng)用4-參數(shù)邏輯曲線，通過(guò)與參考值(Lot CDC 1992或等價(jià)物)的比較，計(jì)算高抗體親抗原性IgG抗體的量。
IgG1和IgG2亞組腦膜炎球菌抗體測(cè)定利用ELISA測(cè)定抗-腦膜炎球菌抗體抗血清組A，C，Y，和W-135的IgG1和IgG2亞組抗體分布。血清系列稀釋液中存在的抗體與吸附于微量滴定板孔的MenPs抗原反應(yīng)。使用抗-人IgG1 Fc或IgG2 Fc特異性試劑測(cè)定結(jié)合的抗體的量。接著的使用酶底物的反應(yīng)產(chǎn)生可分光光度法測(cè)定的產(chǎn)色產(chǎn)物。得到的OD相應(yīng)于血清中與微量滴定板上腦膜炎球菌多糖結(jié)合的IgG1和IgG2抗體的量。以血清樣品中IgG1∶IgG2之比，或者，如果可獲得合適的參考物，則以樣品中IgG1或IgG2的濃度，報(bào)道抗體的量。
通過(guò)VERO細(xì)胞的代謝抑制的抗-白喉抗體測(cè)定通過(guò)試驗(yàn)血清保護(hù)VERO細(xì)胞不受白喉毒素攻擊的能力測(cè)定抗-白喉抗體應(yīng)答。使用無(wú)菌96-孔微量滴定板，用白喉毒素攻擊開(kāi)始是1∶4稀釋度后來(lái)是兩倍稀釋度的試驗(yàn)血清并溫育。然后加入VERO細(xì)胞，用無(wú)菌礦物油密封各孔并溫育6-8天。通過(guò)觀察從細(xì)胞代謝副產(chǎn)品得到的培養(yǎng)基的pH指示劑的顏色變化來(lái)測(cè)定抗體水平。通過(guò)與校正的WHO參考血清相比較以國(guó)際單位/毫升為單位報(bào)道結(jié)果，并通過(guò)攻擊劑量白喉毒素存在下讓細(xì)胞代謝的最高血清稀釋度來(lái)測(cè)定。通過(guò)參考血清的最小可檢測(cè)抗毒素水平，和試驗(yàn)血清的起始稀釋度，來(lái)測(cè)定檢測(cè)的低限，并且一般是0.005IU/mL。
通過(guò)Elisa的抗-破傷風(fēng)抗體的測(cè)定通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)定抗-破傷風(fēng)抗體水平。該方法包括使試驗(yàn)血清中的抗體和與塑料微量滴定孔吸附的破傷風(fēng)類毒素反應(yīng)。通過(guò)與堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗-人IgG-特異性抗體反應(yīng)測(cè)定結(jié)合的抗體的量。接著的使用堿性磷酸酶底物的反應(yīng)產(chǎn)生可分光光度法測(cè)定的產(chǎn)色產(chǎn)物。得到的OD(光密度)相應(yīng)于血清稀釋液中與抗原包被微量滴定板結(jié)合的抗體的量。應(yīng)用平行線分析方法，用指定單位量，通過(guò)與國(guó)際人參照值(WHO Lot TE-3)的比較，計(jì)算抗體濃度。以每毫升國(guó)際單位(IU/mL)報(bào)道結(jié)果。抗-破傷風(fēng)IgG ELISA定量測(cè)定的最小水平是0.01IU/mL，對(duì)該值低于該水平的樣品報(bào)道為＜0.01IU/mL。
如這里使用的，″副作用″，″嚴(yán)重副作用″，和″意想不到的副作用″是疫苗工業(yè)常規(guī)理解的術(shù)語(yǔ)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)臨床實(shí)踐總結(jié)和分析了安全性數(shù)據(jù)，包括對(duì)臨床研究期間接受疫苗的所有受試者進(jìn)行評(píng)價(jià)。一般情況下，理解各術(shù)語(yǔ)具有下面的意義。
副作用(AE)定義為″使用了藥物產(chǎn)物的患者或臨床研究受試者出現(xiàn)的任何有麻煩的醫(yī)療事件，其不必然與這種治療有因果相關(guān)性。因此，副作用可以是任何不利的和非故意的征兆(包括異常實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn))，癥狀，或與藥產(chǎn)品(研究對(duì)象)使用暫時(shí)相關(guān)的疾病，不管是否涉及藥產(chǎn)品(研究對(duì)象)″(ICH指南，GCP(E6)§1.2)。
嚴(yán)重副作用(SAE)是″導(dǎo)致下面任何結(jié)果的任何劑量下發(fā)生的任何不利藥物體驗(yàn)死亡，威脅生命的不利藥物體驗(yàn)，住院病人住院或者住院期延長(zhǎng)，持久的或明顯殘疾/機(jī)能不全，或者先天畸形/出生缺陷。當(dāng)以適當(dāng)?shù)尼t(yī)學(xué)鑒定為基礎(chǔ)時(shí)，可能不導(dǎo)致死亡，威脅生命，或者要求住院的重要醫(yī)療事件可以被認(rèn)為是嚴(yán)重藥物副作用，它們可能危害患者或受試者并且可能要求醫(yī)療或手術(shù)干預(yù)來(lái)防止該定義中列出的事件中的一項(xiàng)。這樣的醫(yī)療事件的例子包括要求在急診室或者在家中加強(qiáng)治療的過(guò)敏性支氣管痙攣，不導(dǎo)致住院的血液惡液質(zhì)或驚厥，或者產(chǎn)生藥物依賴性或藥物濫用″(21 CFR Ch.I，§312.32(a))。
意料之外的副作用(UAE)是″任何不利藥物體驗(yàn)，其特殊性和嚴(yán)重性與當(dāng)前審查手冊(cè)不相一致；或者，如果審查手冊(cè)不是必須的或者可得的，其特殊性和嚴(yán)重性與一般研究計(jì)劃中或者在當(dāng)前申請(qǐng)中描述的風(fēng)險(xiǎn)信息不相吻合，如修改的″(21 CFR Ch.I，§312.32(a))。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)臨床實(shí)踐進(jìn)行的研究，以及研究中患者登記或排除的標(biāo)準(zhǔn)是患者包含標(biāo)準(zhǔn)1.根據(jù)醫(yī)療史和身體檢查確定參加者是健康的。
2.在接種時(shí)參加者至少11歲但是還不到19歲。
3.父母/監(jiān)護(hù)人或參與者簽署了相關(guān)Institutional Review Board(IRB)核準(zhǔn)資料內(nèi)容表。
4.參加者簽署了相關(guān)Institutional Review Board(IRB)核準(zhǔn)協(xié)議。
患者排除標(biāo)準(zhǔn)
1.嚴(yán)重慢性疾病(即心臟病，腎病，神經(jīng)病，代謝病，風(fēng)濕病，等)。
2.已知或懷疑免疫功能損傷。
3.在參與期間在最后72小時(shí)內(nèi)沒(méi)有發(fā)燒或者口腔溫度≥38℃(100.4_)的急性內(nèi)科病。
4.有記載的入侵式腦膜炎球菌病史或者先前腦膜炎球菌接種。
5.在后三個(gè)月施用免疫球蛋白，其他血產(chǎn)品，或者在研究疫苗六周內(nèi)口服或注射皮質(zhì)類固醇或施用其他免疫調(diào)節(jié)療法。只要在登記之前兩周內(nèi)沒(méi)有接受多于一個(gè)療程，則正在接受持續(xù)時(shí)間少于7天的口服類固醇治療方案的個(gè)體就可以在試驗(yàn)中登記。
6.在接種之前72小時(shí)內(nèi)抗生素治療。
7.登記之前28天內(nèi)接受任何疫苗，或者在登記之后28天內(nèi)預(yù)定接受任何疫苗，除了研究記錄另外的接種情況。
8.對(duì)任何疫苗成分有懷疑的或已知過(guò)敏癥。
9.不能完成整個(gè)研究期或者不能參加預(yù)定訪問(wèn)或者不能遵守研究程序。
10.在另一個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)中登記了。
11.在研究人員看來(lái)會(huì)給參加者帶來(lái)健康風(fēng)險(xiǎn)或者干擾疫苗評(píng)價(jià)的任何癥狀。
12.在接種時(shí)有陽(yáng)性或不明確妊娠試驗(yàn)的女性。
實(shí)施例10研究A-劑量研究研究A是對(duì)三個(gè)年齡組的參加者施用三個(gè)劑量水平的TetraMenD疫苗的不盲開(kāi)放標(biāo)記的劑量調(diào)整試驗(yàn)。在I階段登記了90名健康成人(年齡在18至55歲)并且接受一次注射TetraMenD疫苗。在II階段登記了30名孩子(年齡在12至22個(gè)月)并且接受單一劑量水平的TetraMenD疫苗注射兩次。在III階段登記了90名嬰兒(年齡在6至12周)并且接受單一劑量水平的TetraMenD疫苗注射三次。
I階段對(duì)18至55歲成人的劑量研究該項(xiàng)臨床試驗(yàn)是對(duì)三個(gè)年齡組的參加者施用三個(gè)劑量水平的TetraMenD疫苗的不盲開(kāi)放標(biāo)記的劑量調(diào)整試驗(yàn)。在I階段90名健康成人(年齡在18至55歲)接受了一次注射的TetraMenD疫苗。
對(duì)于成人參加者，在施用TetraMenD之前在基線(第0天)和在施用TetraMenD之后28天獲得血清學(xué)分析用血清樣品。對(duì)所有獲得的樣品分析抗腦膜炎球菌多糖血清組A，C，Y，和W-135的SBA，并且通過(guò)ELISA分析抗這些相同血清組的IgG抗體。下面總結(jié)對(duì)于所有血清組的SBA和IgG ELISA觀察結(jié)果。
一個(gè)關(guān)鍵的免疫原性終點(diǎn)是自基線增長(zhǎng)4倍的參加者的比例。為了測(cè)定基線SBA效價(jià)對(duì)SBA增長(zhǎng)4倍的比例有什么樣的影響，對(duì)對(duì)各特定抗原的基線效價(jià)小于1∶64的成人，和對(duì)各特定抗原的基線效價(jià)至少1∶64的成人進(jìn)行小組分析。
TetraMenD的安全曲線可與Menomune_的相比較。下表總結(jié)了該項(xiàng)研究的結(jié)果。
表A-1I階段(成人)-基線(第0天)SBA效價(jià)隨TetraMenD劑量水平的分布

表A-1I階段(成人)-基線(第0天)SBA效價(jià)隨TetraMenD劑量水平的分布

表A-2I階段(成人)-注射后第28天SBA效價(jià)隨TetraMenD劑量水平的分布(每份記錄總數(shù))

表A-2I階段(成人)-注射后第28天SBA效價(jià)隨TetraMenD劑量水平的分布(每份記錄總數(shù))

表A-3I階段(成人)-在基線和注射后第28天實(shí)現(xiàn)的SBA閾值隨TetraMenD劑量水平的比例(每份記錄總數(shù))

N每個(gè)時(shí)間點(diǎn)可評(píng)價(jià)參加者的人數(shù)(第0天；第28天)
表A-4I階段(成人)-在基線和注射后第28天的SBA和IgG ELISA結(jié)果隨TetraMenD劑量水平的變化(每份記錄總數(shù))

表A-4I階段(成人)-在基線和注射后第28天的SBA和IgG ELISA結(jié)果隨TetraMenD劑量水平的變化(每份記錄總數(shù))

第0天接種之前獲取的基線血樣。
第28天接種之后28天獲取的血樣。
升高％≥4-倍與第0天相比，第28天GMT升高≥4-倍的成人的百分比。
N可評(píng)價(jià)的參加者的人數(shù)。
*對(duì)SBA數(shù)據(jù)計(jì)算GMTs；對(duì)IgG ELISA數(shù)據(jù)計(jì)算GMCs。
表A-5代表GMT隨劑量，患者年齡和血清組的變化。
表A-5 GMT隨劑量，患者年齡和血清組的變化



II階段 對(duì)12至22個(gè)月齡幼兒的劑量研究該項(xiàng)臨床試驗(yàn)是對(duì)三個(gè)年齡組的參加者施用三個(gè)劑量水平的TetraMenD疫苗的不盲開(kāi)放標(biāo)記的劑量調(diào)整試驗(yàn)。在II階段，30名健康孩子(年齡在12至22個(gè)月)接受了單一劑量的TetraMenD疫苗注射兩次。
對(duì)于幼兒參加者，在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲取血清分析用血清樣品TetraMenD注射#1之前基線時(shí)(第0天)，登記之后第60天(注射#1之后60天以及注射#2之前立即)，和登記之后第90天(注射#2之后30天)。對(duì)所有獲得的樣品分析抗腦膜炎球菌多糖血清組A，C，Y，和W-135的SBA，并且通過(guò)ELISA分析抗這些相同血清組的IgG抗體。下面總結(jié)對(duì)于所有血清組的SBA和IgG ELISA觀察結(jié)果。下表中總結(jié)了結(jié)果。
表A-6II階段(幼兒)-基線(第0天)時(shí)SBA效價(jià)隨TetraMenD劑量水平的分布(每份記錄總數(shù))

表A-6II階段(幼兒)-基線(第0天)時(shí)SBA效價(jià)隨TetraMenD劑量水平的分布(每份記錄總數(shù))

表A-7II階段(幼兒)-注射#1之后60天(第60天)時(shí)SBA效價(jià)隨TetraMenD劑量水平的分布(每份記錄總數(shù))

表A-7II階段(幼兒)-注射#1之后60天(第60天)時(shí)SBA效價(jià)隨TetraMenD劑量水平的分布(每份記錄總數(shù))

表A-8II階段(幼兒)-注射#2之后30天(第90天)時(shí)SBA效價(jià)隨TetraMenD劑量水平的分布(每份記錄總數(shù))

表A-8II階段(幼兒)-注射#2之后30天(第90天)時(shí)SBA效價(jià)隨TetraMenD劑量水平的分布(每份記錄總數(shù))

表A-9II階段(幼兒)-基線時(shí)，注射#1之后60天，和注射#2之后30天時(shí)獲得的SBA閾值隨TetraMenD劑量水平的比例(每份記錄總數(shù))

表A-9II階段(幼兒)-基線時(shí)，注射#1之后60天，和注射#2之后30天時(shí)獲得的SBA閾值隨TetraMenD劑量水平的比例(每份記錄總數(shù))

表A-10II階段(幼兒)-基線時(shí)，注射#1之后60天，和注射#2之后30天時(shí)幼兒SBA和IgG ELISA結(jié)果隨TetraMenD劑量水平的變化(每份記錄總數(shù))

表A-10II階段(幼兒)-基線時(shí)，注射#1之后60天，和注射#2之后30天時(shí)幼兒SBA和IgG ELISA結(jié)果隨TetraMenD劑量水平的變化(每份記錄總數(shù))

表A-10II階段(幼兒)-基線時(shí)，注射#1之后60天，和注射#2之后30天時(shí)幼兒SBA和IgG ELISA結(jié)果隨TetraMenD劑量水平的變化(每份記錄總數(shù))

第0天注射#1之前獲取的基線血樣。
第60天注射#1之后60天和注射#2之前獲取的血樣。
第90天注射#2之后30天獲取的血樣。
升高％≥4-倍注射#1之后，與第0天相比，第60天GMT升高≥4-倍的幼兒的百分比；注射#2之后，與第0天相比，第90天GMT升高≥4-倍的幼兒的百分比。
N可評(píng)價(jià)的參加者的人數(shù)。
*對(duì)SBA數(shù)據(jù)計(jì)算GMTs；對(duì)IgG ELISA數(shù)據(jù)計(jì)算GMCs。
表A-11總結(jié)GMT隨劑量，患者年齡和血清組的變化。
表A-11 GMT隨患者年齡和血青組的變化的總結(jié)


III階段 對(duì)嬰兒的劑量研究該項(xiàng)臨床試驗(yàn)是對(duì)三個(gè)年齡組的參加者施用三個(gè)劑量水平的TetraMenD疫苗的不盲開(kāi)放標(biāo)記的劑量調(diào)整試驗(yàn)。在III階段，30名健康嬰兒(年齡在6至12周)接受了單一劑量的TetraMenD疫苗注射三次。
嬰兒參加者在2月齡(注射#1)，4月齡(注射#2)，和6月齡(注射#3)時(shí)接受TetraMenD注射。對(duì)所有獲得的樣品分析抗腦膜炎球菌多糖血清組A，C，Y，和W-135的SBA，并且通過(guò)ELISA分析抗這些相同血清組的IgG抗體。下面總結(jié)對(duì)于所有血清組的SBA和IgG ELISA觀察結(jié)果。下表中總結(jié)了結(jié)果。
表A-13III階段(嬰兒)-7月齡(第三次給藥之后一個(gè)月)SBA效價(jià)隨TetraMenD劑量水平的分布(每份記錄總數(shù))

表A-13III階段(嬰兒)-7月齡(第三次給藥之后一個(gè)月)SBA效價(jià)隨TetraMenD劑量水平的分布(每份記錄總數(shù))

表A-14III階段(嬰兒)-6月齡(第三次給藥之前)和7月齡(第三次給藥之后)獲得的SBA閾值隨TetraMenD劑量水平的比例(每份記錄總數(shù))

N各時(shí)間點(diǎn)(6月齡；7月齡)可評(píng)價(jià)的參加者數(shù)目表A-15III階段(嬰兒)-6月齡(第三次給藥之前)和7月齡(第三次給藥之后)嬰兒SBA和IgG ELISA結(jié)果隨TetraMenD劑量水平的變化(每份記錄總數(shù))

表A-15III階段(嬰兒)-6月齡(第三次給藥之前)和7月齡(第三次給藥之后)嬰兒SBA和IgG ELISA結(jié)果隨TetraMenD劑量水平的變化(每份記錄總數(shù))

表A-15III階段(嬰兒)-6月齡(第三次給藥之前)和7月齡(第三次給藥之后)嬰兒SBA和IgG ELISA結(jié)果隨TetraMenD劑量水平的變化(每份記錄總數(shù))

N可評(píng)價(jià)參加者數(shù)*對(duì)SBA數(shù)據(jù)計(jì)算GMTs；對(duì)IgG ELISA數(shù)據(jù)計(jì)算GMCs。
表A-16代表GMT隨患者年齡和血清組的總結(jié)。
表A-16 GMT隨患者年齡和血清組變化的總結(jié)


對(duì)嬰兒和TetraMenD伴隨施用的兒科疫苗就每次當(dāng)前ACIP推薦和現(xiàn)場(chǎng)實(shí)際情況，現(xiàn)在嬰兒接受日常兒科疫苗。在該項(xiàng)研究中，嬰兒接受TetraMenD和兒科疫苗。在2，4，和6月齡給與DTacP(Tripedia_)和Hib(ActHIB_)?？梢越o與IPV或OPV；第一次和第二次注射TetraMenD(2和4月齡)時(shí)施用IPV。每次現(xiàn)場(chǎng)實(shí)施中給與乙肝疫苗；給一些2月齡參加者施用乙肝疫苗，但是對(duì)4月齡或6月齡的參加者不施用。在進(jìn)行該項(xiàng)試驗(yàn)的嬰兒期期間，RotaShield_被許可并且獲得ACIP推薦用于常規(guī)使用。在該項(xiàng)試驗(yàn)期間，一名參加者在4月齡和6月齡接受了RotaShield_。
在6月齡和7月齡評(píng)價(jià)對(duì)常規(guī)施用的兒科疫苗抗原的抗體應(yīng)答。在不同的表中總結(jié)了結(jié)果。
參加該項(xiàng)試驗(yàn)的嬰兒在2，4，和6月齡接受了DTacP和PRP疫苗；第三次注射疫苗之后一個(gè)月取7-月齡血樣。對(duì)于這些疫苗抗原的每一種(白喉，破傷風(fēng)，百日咳FHA，百日咳PT，和PRP)，觀察到的抗體水平證明3個(gè)TetraMenD劑量組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(所有p-值＞0.05)。(參見(jiàn)表A-17)。
在該項(xiàng)試驗(yàn)中，在2月和4月齡給與IPV。第二次注射IPV之后一個(gè)月取7-月齡血樣。對(duì)于1型脊髓灰質(zhì)炎和2型脊髓灰質(zhì)炎，觀察的GMTs，比例為NA≥1∶4，和比例為NA≥1∶8，證明3個(gè)TetraMenD劑量組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(所有p-值＞0.05)。證明所有3個(gè)TetraMenD劑量組的至少95.0％有抗1型脊髓灰質(zhì)炎和2型脊髓灰質(zhì)炎的保護(hù)作用，比例為NA≥1∶8。對(duì)于3型脊髓灰質(zhì)炎，1微克，4微克，和10微克組中的GMTs分別是562.7，164.0，和113.3。三個(gè)類型GMTs各組之間的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的(p＝0.001，ANOVA)。然而，所有三個(gè)TetraMenD劑量組證明有抗脊髓灰質(zhì)炎的保護(hù)作用，比例為NA≥1∶8(分別是100.0％[22/22]，100.0％[21/21]，和94.1％[16/17])。這些比例沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＝0.283，F(xiàn)isher′s精確試驗(yàn))。此外，對(duì)于三個(gè)脊髓灰質(zhì)炎血清型觀察到的GMTs很好地落在該項(xiàng)試驗(yàn)中使用的IPV接種方案2和4月齡兩個(gè)IPV劑量的公布范圍內(nèi)。
最近一次乙肝疫苗接種之后至少5個(gè)月取7月齡血。通過(guò)GMT和比例≥10mIU/mL觀察到的乙肝表面抗體的水平不證明三個(gè)TetraMenD劑量組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(兩者p-值≥0.649)。特別地，該項(xiàng)試驗(yàn)中沒(méi)有嬰兒在6個(gè)月回訪時(shí)接受乙肝疫苗，6個(gè)月是這種疫苗第三劑量最早建議年齡。這可以解釋為什么乙肝表面抗體效價(jià)≥10mIU/mL的7月齡嬰兒比例與初始劑量疫苗之后可檢測(cè)抗體的公開(kāi)范圍相一致，但是低于預(yù)示的完成三個(gè)接種系之后的保護(hù)性抗體水平。該項(xiàng)研究的結(jié)果總結(jié)在下面的表中。
表A-17III階段(嬰兒)-7月齡伴隨疫苗的免疫原性隨TetraMenD劑量水平的變化(每份記錄總數(shù))

表A-17III階段(嬰兒)-7月齡伴隨疫苗的免疫原性隨TetraMenD劑量水平的變化(每份記錄總數(shù))

表A-17III階段(嬰兒)-7月齡伴隨疫苗的免疫原性隨TetraMenD劑量水平的變化(每份記錄總數(shù))

*利用F-試驗(yàn)進(jìn)行GMT比較。利用Fisher′s精確試驗(yàn)進(jìn)行百分比比較。
_p-值＜0.05實(shí)施例11 研究B對(duì)2至10齡孩子進(jìn)行1-6個(gè)月研究這是對(duì)2和10齡之間的健康孩子的隨機(jī)的活動(dòng)受到控制的研究，將單劑量的TetraMenD與單劑量的Menomune相比較。在D0，接種之前，D28和D0之后6個(gè)月采取血樣。TetraMenD的總的安全性與Menomune相比是可比較的。該項(xiàng)研究的結(jié)果總結(jié)在下面的表中。
SBA-BR抗體效價(jià)的分布表B-1給出每個(gè)血清組的基線，D28和6個(gè)月SBA-BR抗體效價(jià)的頻率分布。
表B-1D0，D28和接種之后6個(gè)月SBA-BR抗體效價(jià)的分布(每份記錄總數(shù))

表B-1D0，D28和接種之后6個(gè)月SBA-BR抗體效價(jià)的分布(每份記錄總數(shù))

表B-1D0，D28和接種之后6個(gè)月SBA-BR抗體效價(jià)的分布(每份記錄總數(shù))

表B-1D0，D28和接種之后6個(gè)月SBA-BR抗體效價(jià)的分布(每份記錄總數(shù))

表B-1D0，D28和接種之后6個(gè)月SBA-BR抗體效價(jià)的分布(每份記錄總數(shù))

表B-1D0，D28和接種之后6個(gè)月SBA-BR抗體效價(jià)的分布(每份記錄總數(shù))

表B-1D0，D28和接種之后6個(gè)月SBA-BR抗體效價(jià)的分布(每份記錄總數(shù))

表B-1D0，D28和接種之后6個(gè)月SBA-BR抗體效價(jià)的分布(每份記錄總數(shù))

表B-1D0，D28和接種之后6個(gè)月SBA-BR抗體效價(jià)的分布(每份記錄總數(shù))

表B-2對(duì)于TetraMenD的幾何平均效價(jià)(GMT)隨受試者年齡和血清組的變化的總結(jié)。
表B-2對(duì)于TetraMenD的GMT隨受試者年齡和血清組的變化的總結(jié)


表B-3顯示對(duì)于血清組A，C，Y，和W-135自基線至D28 SBA-BR效價(jià)提高≥4倍的參加者的數(shù)目和比例。對(duì)于每個(gè)血清組，TetraMenD組中的這些百分比高于Menomune_組。比例差別對(duì)于血清組A，C，Y，和W-135分別是-0.0397，-0.0452，-0.1092和-0.0562。
表B-3對(duì)于每份記錄總數(shù)的初級(jí)假設(shè)試驗(yàn)總結(jié)

n自基線效價(jià)提高≥4倍的參加者人數(shù)。
N使用過(guò)的人數(shù)中的參加者數(shù)目PI和Pm分別對(duì)于TetraMenD和Menomune_，SBA接種之后效價(jià)提高≥4倍的參加者比例。
接種之后D28 SBA抗體效價(jià)≥32的參加者比例總結(jié)在表B-3中。
表B-3接種之后第28天SBA-BR抗體效價(jià)≥32的參加者的百分比和數(shù)目(每份記錄總數(shù))

*％n/N。
_n接種之后D28效價(jià)≥32的參加者的數(shù)目。
_N該組D28時(shí)有有效血樣的參加者的總數(shù)目。
接種之后D28 SBA抗體效價(jià)≥128的參加者比例總結(jié)在表B-4中。
表B-4接種之后第28天SBA-BR抗體效價(jià)≥128的參加者的百分比和數(shù)目(每份記錄總數(shù))

表B-4接種之后第28天SBA-BR抗體效價(jià)≥128的參加者的百分比和數(shù)目(每份記錄總數(shù))

*％n/N。
_n接種之后D28效價(jià)≥32的參加者的數(shù)目。
_N該組D28時(shí)有有效血樣的參加者的總數(shù)目。
SBA-BR抗體效價(jià)提高至少四倍的參加者比例表B-5顯示D28和第6個(gè)月SBA-BR抗體效價(jià)自基線提高≥4倍的參加者比例。接受TetraMenD之后第28天至56天，大多數(shù)參加者表現(xiàn)出對(duì)疫苗中包含的各個(gè)血清組SBA-BR抗體效價(jià)提高≥4倍。
表B-5D28和6個(gè)月中SBA-BR抗體效價(jià)自基線提高≥4倍的參加者的百分比和數(shù)目(每份記錄總數(shù))

表B-5D28和6個(gè)月中SBA-BR抗體效價(jià)自基線提高≥4倍的參加者的百分比和數(shù)目(每份記錄總數(shù))

*％n/N。
_n接種之后D28效價(jià)≥4的參加者的數(shù)目。
_N使用過(guò)的人數(shù)中的參加者總數(shù)目。
D0時(shí)效價(jià)檢測(cè)不到(＜8)而在D28天中SBA-BR抗體效價(jià)實(shí)現(xiàn)提高≥4倍的參加者的比例在兩個(gè)治療組和所有疫苗血清組，在基線時(shí)檢測(cè)不到(＜8)SBA-BR效價(jià)的大多數(shù)患者在D28天中實(shí)現(xiàn)SBA效價(jià)提高≥4倍。(表B-6)D 0時(shí)SBA效價(jià)＜8但是到D28時(shí)自基線提高≥4倍的參加者比例范圍在TetraMenD組中是86.21％至98.57％；在Menomune_組中是75.00％至94.64％。
表B-6D0時(shí)效價(jià)檢測(cè)不到(＜8)而在D28天中SBA-BR抗體效價(jià)實(shí)現(xiàn)提高≥4倍的參加者的數(shù)目和比例

*n＝各血清組中D0時(shí)效價(jià)＜8而D28時(shí)效價(jià)≥32的參加者數(shù)目N＝各血清組中D0時(shí)效價(jià)＜8的參加者數(shù)目_對(duì)于百分比是精確95％置信區(qū)間SBA-BR抗體GMTs和平均提高倍數(shù)表B-7顯示基線時(shí)，接種之后D28和6個(gè)月時(shí)的SBA GMTs以及SBA GMTs提高倍數(shù)。
表B-7基線時(shí)，接種之后D28和6個(gè)月時(shí)的SBA-BR血清學(xué)結(jié)果(每份記錄總數(shù))

表B-7基線時(shí)，接種之后D28和6個(gè)月時(shí)的SBA-BR血清學(xué)結(jié)果(每份記錄總數(shù))

表B-7基線時(shí)，接種之后D28和6個(gè)月時(shí)的SBA-BR血清學(xué)結(jié)果(每份記錄總數(shù))

*效價(jià)或提高倍數(shù)，其中提高倍數(shù)＝D28時(shí)效價(jià)/D0時(shí)效價(jià)_N計(jì)算中使用的參加者的總數(shù)目。
血清組A，C，W-135，和Y的ELISA IgG表B-8給出基線時(shí)，接種之后D28和6個(gè)月時(shí)的IgG GMCs以及IgG GMCs的提高倍數(shù)。
表B-8基線時(shí)，接種之后D28和6個(gè)月時(shí)的IgG血清學(xué)結(jié)果(每份記錄總數(shù))

表B-8基線時(shí)，接種之后D28和6個(gè)月時(shí)的IgG血清學(xué)結(jié)果(每份記錄總數(shù))

*效價(jià)或提高倍數(shù)，其中提高倍數(shù)＝D28時(shí)效價(jià)/D0時(shí)效價(jià)_N計(jì)算中使用的參加者的總數(shù)目。
接受所研究的疫苗TetraMenD之后第28天至56天，大多數(shù)參加者表現(xiàn)出對(duì)疫苗中包含的各個(gè)血清組SBA-BR抗體效價(jià)提高≥4倍?？偟膩?lái)說(shuō)，77％的TetraMenD受試者對(duì)所有血清組抗體效價(jià)提高四倍。與對(duì)于血清組C或W-135相比，對(duì)于血清組Y觀察到更高的接種前的抗體水平。這可能與這樣的事實(shí)相關(guān)，即在該年齡段自然接觸血清組Y可能比先前想象的更常見(jiàn)。更高的循環(huán)抗體水平反映近期天然接觸，并且可能減小表現(xiàn)出4倍或更高抗體應(yīng)答的疫苗受體的比例。這清楚地表明是當(dāng)與其他血清組相比血清組Y應(yīng)答的情況。與對(duì)于血清組C是73.4％，對(duì)于血清組A是87.7％，對(duì)于血清組W-135是91.0％相比，血清組Y提高四倍是56.6％。對(duì)于血清組A也觀察到高的接種前抗體水平。這可能是間歇性地與幾種天然存在的交叉反應(yīng)抗原接觸過(guò)長(zhǎng)時(shí)間引起的結(jié)果。
為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)預(yù)先存在的效價(jià)的影響和研究血清轉(zhuǎn)化的比例(由當(dāng)對(duì)于任何血清組的接種之前效價(jià)＜1∶8時(shí)實(shí)現(xiàn)抗體效價(jià)提高4倍的疫苗接受者的比例確定)，對(duì)對(duì)疫苗中含有的4種血清組中的任一種有＜1∶8的接種之前抗體效價(jià)的參加者進(jìn)行另一項(xiàng)分析。使用兔崽為補(bǔ)體來(lái)源通過(guò)SBA分析測(cè)得的＜1∶8的效價(jià)被認(rèn)為代表不可檢測(cè)水平的循環(huán)抗體。當(dāng)使用這項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)參加者時(shí)，發(fā)現(xiàn)用TetraMenD接種之后，對(duì)于血清組A血清轉(zhuǎn)化比例是98.6％，對(duì)于血清組C是87.9％，對(duì)于血清組W-135是96.0％，和對(duì)于血清組Y是86.2％。
以對(duì)新兵的觀察為基礎(chǔ)，Goldschneider提出使用人補(bǔ)體來(lái)源進(jìn)行SBA分析得到的≥1∶4的最小效價(jià)與抵抗血清組C入侵疾病的保護(hù)作用相關(guān)。然而，由于該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)需要標(biāo)準(zhǔn)化以及沒(méi)有可靠人補(bǔ)體來(lái)源，建議將兔崽補(bǔ)體當(dāng)作可替代來(lái)源。腦膜炎球菌顯示對(duì)兔崽補(bǔ)體比對(duì)人補(bǔ)體更靈敏，產(chǎn)生更高的測(cè)定的抗體效價(jià)。有幾個(gè)人曾提出使用兔崽補(bǔ)體測(cè)定的效價(jià)≥1∶128，預(yù)示有保護(hù)作用，而效價(jià)＜1∶8則預(yù)示至少對(duì)于血清組C靈敏。雖然當(dāng)評(píng)價(jià)多糖疫苗時(shí)這個(gè)水平是適當(dāng)?shù)?，但是它不適用于偶聯(lián)物疫苗。Borrow提出，在證明接種之后SBA效價(jià)在8和64之間的接受一價(jià)C偶聯(lián)物疫苗的受試者中，施用減小劑量(10微克)的腦膜炎球菌多糖疫苗幾個(gè)月后證明有記憶性應(yīng)答表明，這些個(gè)體也是受到保護(hù)的，實(shí)現(xiàn)抗體水平≥1∶128。表中給出了接受對(duì)于每一種血清組SBA-BR效價(jià)≥1∶128的TetraMenD疫苗的受試者的結(jié)果。當(dāng)對(duì)疫苗中包含的各種血清組適用這些標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，總的來(lái)說(shuō)，接受TetraMenD的參加者的96.2％實(shí)現(xiàn)了接種后SBA-BR效價(jià)≥1∶32，并且90.5％實(shí)現(xiàn)效價(jià)≥1∶128。也使用一小組來(lái)自該項(xiàng)臨床研究的血清來(lái)評(píng)價(jià)利用兔崽補(bǔ)體和人補(bǔ)體的SBA試驗(yàn)之間的關(guān)系，并且在接下來(lái)的研究中提供了結(jié)果。
與接受TetraMenD的組相比，Menomune_組對(duì)于血清組C，Y，和W-135有高得多的總的IgG應(yīng)答。然而，對(duì)于血清組A，C，Y，和W-135，接種之后的SBA GMT水平要比TetraMenD組高得多。
表B-9提供了不同血清組GMC對(duì)GMT效價(jià)的比較。
表B-9不同血清組的IgG GMC對(duì)SBA GMT效價(jià)的比較

偶聯(lián)物產(chǎn)生的較低水平的IgG產(chǎn)生比多糖疫苗更高水平的殺細(xì)菌活性的發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈提示，對(duì)偶聯(lián)物疫苗的抗體應(yīng)答的品質(zhì)和親和性都優(yōu)于沒(méi)有偶聯(lián)的多糖疫苗產(chǎn)生的。高親和性抗體與功能活性和記憶性應(yīng)答有關(guān)。在幾項(xiàng)公開(kāi)的研究中也觀察到了這種效果。這些數(shù)據(jù)證明，TetraMenD在2至10歲齡孩子中是高免疫原性的，對(duì)四種血清組中的每一個(gè)，對(duì)TetraMenD觀察到的GMTs優(yōu)于對(duì)Menomune_觀察到的，實(shí)現(xiàn)的效價(jià)預(yù)示有保護(hù)作用。最后，發(fā)現(xiàn)TetraMenD對(duì)疫苗中包含的每一種血清組產(chǎn)生較高親和性抗體響應(yīng)。
在試驗(yàn)期間的四個(gè)時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)安全性報(bào)道了立即反應(yīng)(接種的30分鐘內(nèi))，接種之后頭7天內(nèi)激發(fā)的局部和全身反應(yīng)，接種之后和持續(xù)AEs(自D0至D28)間28天內(nèi)所有的副作用，和D0至接種之后6個(gè)月間嚴(yán)重的副作用。
對(duì)于所有參加者，兩個(gè)處理組都報(bào)道大多數(shù)局部激發(fā)反應(yīng)是輕度的并且在接種三天內(nèi)消散。各個(gè)處理組的局部反應(yīng)的頻率相近。在接受TetraMenD的組中，據(jù)報(bào)道58.8％至少有一個(gè)局部反應(yīng)，而接受Menomune_的組，報(bào)道58.3％是相同的。另外，對(duì)青少年肌內(nèi)施用的一價(jià)C CRM197偶聯(lián)物疫苗的經(jīng)驗(yàn)表明，該項(xiàng)研究中，局部反應(yīng)比例與對(duì)于TetraMenD觀察到的非常類似。
大多數(shù)報(bào)道的Aes不是嚴(yán)重的，可逆的，和與接種不相關(guān)的。在這項(xiàng)研究中沒(méi)有新開(kāi)始的支氣管哮喘，糖尿病或自身免疫疾病的報(bào)道。
實(shí)施例12研究C對(duì)11-18齡孩子的一個(gè)月研究研究C是對(duì)11-18齡健康孩子的隨機(jī)的活動(dòng)受控的研究，是DO的單劑量TetraMenD對(duì)單劑量Menomune_。在DO，在接種之前和D28取血清并分析，并且根據(jù)結(jié)論中描述的對(duì)來(lái)自患者的一小組血清進(jìn)一步評(píng)價(jià)。
對(duì)于所有參加者，據(jù)報(bào)道兩個(gè)處理組的大多數(shù)局部激發(fā)反應(yīng)是輕度的并且在接種2天內(nèi)消散。各個(gè)處理組的局部反應(yīng)的頻率相近。與接受Menomune_的組(34.7％)相比，接受TetraMenD的組中局部反應(yīng)頻率更常見(jiàn)(72.4％)。這個(gè)結(jié)果可能是由于偶聯(lián)物疫苗的性質(zhì)(白喉載體蛋白質(zhì))而不是給藥途徑(肌內(nèi))。該項(xiàng)研究的結(jié)果總結(jié)在下面的表中。
表C-1說(shuō)明基線和D28對(duì)于各血清組SBA-BR抗體效價(jià)頻率分布。
表C-1D0和接種之后D28 SBA-BR抗體效價(jià)分布(每份記錄總數(shù))

表C-1D0和接種之后D28 SBA-BR抗體效價(jià)分布(每份記錄總數(shù))

表C-1D0和接種之后D28 SBA-BR抗體效價(jià)分布(每份記錄總數(shù))

表C-1D0和接種之后D28 SBA-BR抗體效價(jià)分布(每份記錄總數(shù))

表C-2總結(jié)了使用TetraMenD的受試者年齡和血清組的GMT水平。
表C-2使用TetraMenD的受試者年齡和血清組的GMT水平總結(jié)


表C-3顯示對(duì)于血清組A，C，Y，和W-135，自基線至D28 SBA-BR效價(jià)提高≥4倍的參加者的數(shù)目和百分比。對(duì)于每個(gè)血清組，TetraMenD組的這些百分比比Menomune_組的高。
表C-3自基線至D28 SBA-BR效價(jià)提高≥4倍的參加者的數(shù)目和百分比

SBA-BR抗體效價(jià)≥32的頻率表4總結(jié)了接種之后D28時(shí)SBA抗體效價(jià)≥32的參加者的比例。
表C-4接種之后D28時(shí)SBA抗體效價(jià)≥32的參加者的百分比和數(shù)目(每份記錄總數(shù))

*％n/N。
_n接種之后D28效價(jià)≥4的參加者的數(shù)目。
_N該組D28時(shí)有效血樣的參加者總數(shù)目。
SBA-BR抗體效價(jià)≥128的頻率表5總結(jié)了接種之后D28時(shí)SBA抗體效價(jià)≥128的參加者的比例。
表C-5接種之后D28時(shí)SBA抗體效價(jià)≥128的參加者的百分比和數(shù)目(每份記錄總數(shù))

*％n/N表示為百分比。
_n接種之后D28效價(jià)≥128的參加者的數(shù)目。
_N該組D28時(shí)有效血樣的參加者總數(shù)目。
SBA抗體效價(jià)提高≥4倍的參加者百分比表C-6顯示D28 SBA抗體效價(jià)自基線提高≥4倍的參加者的比例。
表C-6D28 SBA抗體效價(jià)自基線提高≥4倍的參加者的百分比和數(shù)目

*％n/N表示為百分比。
_n自基線效價(jià)提高≥4倍的參加者的數(shù)目。
_N使用的人數(shù)中參加者的總數(shù)目。
D0時(shí)檢測(cè)不到效價(jià)(＜8)而在D28中SBA-BR抗體效價(jià)實(shí)現(xiàn)提高≥4倍的參加者百分比在兩個(gè)處理組中并且對(duì)于所有疫苗血清組，基線時(shí)檢測(cè)不到SBA效價(jià)(＜8)的大多數(shù)參加者在D28天中實(shí)現(xiàn)SBA效價(jià)實(shí)現(xiàn)提高≥4倍。D0時(shí)SBA效價(jià)＜8而自基線至D28提高≥4倍的參加者的比例范圍是98.17％至100.0％(表C-7)。
表C-7D0時(shí)檢測(cè)不到效價(jià)(＜8)而在D28中SBA-BR抗體效價(jià)實(shí)現(xiàn)提高≥4倍的參加者的數(shù)目和百分比

*n＝各血清組中D0時(shí)效價(jià)＜8而D28時(shí)效價(jià)≥32的參加者的數(shù)目N＝各血清組中D0時(shí)效價(jià)＜8的參加者的數(shù)目_百分比是精確95％置信區(qū)間
SBA-BR抗體GMTs和平均倍數(shù)提高表C-8顯示基線時(shí)和接種之后D28天的SBA GMTs以及SBAGMTs提高倍數(shù)。
表C-8基線時(shí)和接種之后D28天的SBA血清學(xué)結(jié)果(每份記錄總數(shù))

*效價(jià)或提高倍數(shù)，其中提高倍數(shù)＝D28效價(jià)/D0效價(jià)_N計(jì)算中使用的參加者的總數(shù)目。
血清組A，C，W-135，和Y的ELISA IgG表C-9顯示基線時(shí)和接種之后D28天的IgG GMCs(微克/毫升)和IgG GMCs提高倍數(shù)。
表C-9基線時(shí)和接種之后D28天的IgG血清學(xué)結(jié)果(每份記錄總數(shù))

*效價(jià)或提高倍數(shù)，其中提高倍數(shù)＝D28效價(jià)/D0效價(jià)_N計(jì)算中使用的參加者的總數(shù)目。
血清組A，C，W-135，和Y的ELISA IgM表C-10顯示基線時(shí)和接種之后D28天的IgM GMCs和IgM GMCs提高倍數(shù)。
表C-10基線時(shí)和接種之后D28天的IgM血清學(xué)結(jié)果(每份記錄總數(shù))IgM

表C-10顯示基線時(shí)和接種之后D28天的IgM GMCs和IgM GMCs提高倍數(shù)。
表C-10基線時(shí)和接種之后D28天的IgM血清學(xué)結(jié)果(每份記錄總數(shù))IgM

*效價(jià)或提高倍數(shù)，其中提高倍數(shù)＝D28效價(jià)/D0效價(jià)_N計(jì)算中使用的參加者的總數(shù)目。
接受所研究的疫苗TetraMenD之后第28天至56天，大多數(shù)參加者表現(xiàn)出對(duì)疫苗中包含的各個(gè)血清組SBA-BR抗體效價(jià)提高≥4倍?？偟膩?lái)說(shuō)，90.7％的TetraMenD受試者對(duì)所有血清組抗體效價(jià)提高四倍。與對(duì)于血清組C或W-135相比，對(duì)于血清組Y觀察到更高的接種前的抗體水平。這可能與這樣的事實(shí)相關(guān)，即目前血清組Y是在美國(guó)該年齡段與入侵性腦膜炎球菌相關(guān)的最常見(jiàn)的血清組，并且與該血清組自然接觸可能更常見(jiàn)。更高的循環(huán)抗體水平反映近期天然接觸，并且可能減小表現(xiàn)出4倍或更高抗體應(yīng)答的疫苗受體的比例。這清楚地表明是當(dāng)與其他血清組相比血清組Y應(yīng)答的情況。與對(duì)于血清組C是91.7％，對(duì)于血清組W-135是96.7％相比，血清組Y提高四倍是81.8％。對(duì)于血清組A也觀察到高的接種前抗體水平。這可能是間歇性地與幾種天然存在的交叉反應(yīng)抗原接觸過(guò)長(zhǎng)時(shí)間引起的結(jié)果。
為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)預(yù)先存在的效價(jià)的影響和研究血清轉(zhuǎn)化的比例(由當(dāng)對(duì)于任何血清組的接種之前效價(jià)＜1∶8時(shí)實(shí)現(xiàn)抗體效價(jià)提高4倍的疫苗接受者的比例確定)，對(duì)對(duì)疫苗中含有的4種血清組中的任一種有＜1∶8的接種之前抗體效價(jià)的參加者進(jìn)行另一項(xiàng)分析。使用兔崽為補(bǔ)體來(lái)源通過(guò)SBA分析測(cè)得的＜1∶8的效價(jià)被認(rèn)為代表不可檢測(cè)水平的循環(huán)抗體。當(dāng)使用這項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)參加者時(shí)，發(fā)現(xiàn)用TetraMenD接種之后，對(duì)于血清組A血清轉(zhuǎn)化比例是100％，對(duì)于血清組C是98.1％，對(duì)于血清組W-135是98.1％，和對(duì)于血清組Y是98.3％。
如前面另一項(xiàng)研究中討論的，以對(duì)新兵的觀察為基礎(chǔ)，Goldschneider提出使用人補(bǔ)體來(lái)源進(jìn)行SBA分析得到的≥1∶4的最小效價(jià)與抵抗血清組C入侵疾病的保護(hù)作用相關(guān)。然而，由于該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)需要標(biāo)準(zhǔn)化以及沒(méi)有可靠人補(bǔ)體來(lái)源，建議將兔崽補(bǔ)體當(dāng)作可替代來(lái)源。腦膜炎球菌顯示對(duì)兔崽補(bǔ)體比對(duì)人補(bǔ)體更靈敏，產(chǎn)生更高的測(cè)定的抗體效價(jià)。有幾個(gè)人曾提出使用兔補(bǔ)體測(cè)定的效價(jià)≥1∶128，預(yù)示有保護(hù)作用，而效價(jià)＜1∶8則預(yù)示至少對(duì)于血清組C靈敏。雖然當(dāng)評(píng)價(jià)多糖疫苗時(shí)這個(gè)水平是適當(dāng)?shù)模撬贿m用于偶聯(lián)物疫苗。Borrow提出，在證明接種之后SBA效價(jià)在8和64之間的接受一價(jià)C偶聯(lián)物疫苗的受試者中，施用減小劑量(10微克)的腦膜炎球菌多糖疫苗幾個(gè)月后證明有記憶性應(yīng)答表明，這些個(gè)體也是受到保護(hù)的，實(shí)現(xiàn)抗體水平≥1∶128。表中給出了接受TetraMenD疫苗對(duì)于每一種血清組SBA-BR效價(jià)≥1∶128的受試者的結(jié)果。當(dāng)對(duì)疫苗中包含的各種血清組適用這些標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，總的來(lái)說(shuō)，接受TetraMenD的參加者的99.2％實(shí)現(xiàn)了接種后SBA-BR效價(jià)≥1∶128。
利用標(biāo)準(zhǔn)ELISA分析，在小組參加者中評(píng)價(jià)IgG和IgM應(yīng)答。TetraMenD受試者中，接種之后對(duì)于各個(gè)血清組IgG抗體的平均水平＞2微克。在兩個(gè)處理組中，對(duì)于各個(gè)血清組的IgM應(yīng)答非常類似。與接受TetraMenD的組相比，接受Menomune_組中，對(duì)于血清組C，Y，和W-135，IgG應(yīng)答一般更高。但是對(duì)于血清組C，Y，和W-135，接種之后SBA GMT水平在各個(gè)處理組是非常類似的，表C-11。
表C-11對(duì)總的殺細(xì)菌活性的IgG和IgM的相對(duì)分布

*GMC單位是微克/毫升偶聯(lián)物產(chǎn)生的較低水平的IgG產(chǎn)生和多糖疫苗相似水平的殺細(xì)菌活性的發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈提示，對(duì)偶聯(lián)物疫苗的抗體應(yīng)答的品質(zhì)和親和性都優(yōu)于多糖產(chǎn)生的。高親和性抗體與功能活性和記憶性應(yīng)答有關(guān)。在幾項(xiàng)公開(kāi)的研究中也觀察到了這種效果。
這些數(shù)據(jù)證明，TetraMenD在青少年人群中是高免疫原性的。對(duì)于兩種疫苗，對(duì)于四種血清組中的每一個(gè)，GMTs本質(zhì)上相等，實(shí)現(xiàn)的效價(jià)預(yù)示保護(hù)作用，表明TetraMenD對(duì)于疫苗中含有的各種血清組產(chǎn)生更高的親和性抗體應(yīng)答。
研究D研究D是對(duì)年齡18-55歲健康成人的隨機(jī)的活動(dòng)受控的研究，是DO的單劑量TetraMenD對(duì)單劑量Menomune_。在DO，在接種之前和D28取血清并分析。
一般來(lái)說(shuō)，TetraMenD的安全性曲線與Menomune可相比，具體地，對(duì)于激發(fā)的局部反應(yīng)(D0-7)，激發(fā)的全身反應(yīng)(D0-)，沒(méi)有激發(fā)的副作用(D0-28)，沒(méi)有激發(fā)的顯著副作用和SAEs(D29-6個(gè)月)，嚴(yán)重副作用(D0-6個(gè)月)報(bào)道的百分比全都在對(duì)于Menomune報(bào)道的百分比的2-3％內(nèi)。下面的表中提供了研究的結(jié)果。
SBA-BR抗體效價(jià)的分布表D-1給出基線和D28時(shí)對(duì)于各個(gè)血清組的SBA-BR效價(jià)的頻率分布。
表D-1D0和接種之后D28時(shí)SBA-BR效價(jià)的分布

表D-1D0和接種之后D28時(shí)SBA-BR效價(jià)的分布

表D-2提供了使用TetraMenD的受試者年齡和血清組的幾何平均效價(jià)(GMT)的總結(jié)。
表D-2使用TetraMenD的受試者年齡和血清組的GMT的總結(jié)


表D-3說(shuō)明對(duì)于血清組A，C，Y，和W-135，SBA-BR效價(jià)自基線至D28提高≥4倍的參加者的數(shù)目和百分比。TetraMenD組中，對(duì)于血清組A的數(shù)目和百分比，1028/1278(80.4％)；C，1131/1278(88.5％)；Y，941/1278(73.6％)；和W-135，1142/1278(89.4％)，可與Menomune_組相比，對(duì)于血清組A，929/1099(84.5％)；C，985/1099(89.6％)；Y，872/1099(79.3％)；和W-135，1036/1099(94.3％)。
表D-3對(duì)于血清組*SBA-BR效價(jià)自基線提高≥4倍的參加者的數(shù)目和百分比

*試驗(yàn)無(wú)效假設(shè)H0PMenomune_-PTetraMenD≥O.10對(duì)HaPMenomune_-PTetraMenD＜0.10_n/Nn＝自基線效價(jià)提高≥4倍的參加者數(shù)目/N＝每份記錄總數(shù)中參加者的總數(shù)目。
_PTetraMenDTetraMenD組SBA-BR接種后效價(jià)自基線提高≥4倍的參加者百分比§PMenomune_Menomune_組SBA-BR接種后效價(jià)自基線提高≥4倍的參加者百分比。
SBA-BR抗體效價(jià)≥32的頻率表D-4中總結(jié)了接種后D28 SBA-BR抗體效價(jià)≥32的參加者比例。
表D-4接種后D28 SBA-BR抗體效價(jià)≥32的參加者的百分比和數(shù)目(每份記錄總數(shù))

*％＝n/N_n＝接種后D28效價(jià)≥32的參加者數(shù)目/N＝該組中D28時(shí)有效血樣的參加者的總數(shù)目。
SBA-BR抗體效價(jià)≥128的頻率表D-5中總結(jié)了接種后D28 SBA-BR抗體效價(jià)≥128的參加者比例。
表D-5接種后D28 SBA抗體效價(jià)≥128的參加者的百分比和數(shù)目(每份記錄總數(shù))

*％＝n/N_n＝接種后D28效價(jià)≥128的參加者數(shù)目_N＝該組中D28時(shí)有效血樣的參加者的總數(shù)目。
表D-6對(duì)基線協(xié)方差調(diào)節(jié)的GMTs治療效果的分析D0至D28的效價(jià)差異的反應(yīng)(每份記錄總數(shù))*


*治療效果的反對(duì)數(shù)計(jì)算為治療效果的二次方(Menomune_-TetraMenD)2SBA-BR抗體效價(jià)提高至少4倍的參加者的比例表D-7顯示自基線至D28 SBA抗體效價(jià)提高≥4倍的參加者的比例。
表D-7D28時(shí)SBA抗體效價(jià)自基線提高≥4倍的參加者的數(shù)目和百分比

*％＝n/N_n＝自基線效價(jià)提高≥4倍的參加者數(shù)目_N＝各血清組中抽取血樣的參加者的數(shù)目。
D0時(shí)檢測(cè)不到效價(jià)(＜8)而在D28中SBA-BR抗體效價(jià)實(shí)現(xiàn)提高≥4倍的參加者的比例表D-8顯示D0時(shí)檢測(cè)不到效價(jià)(＜8)而在D28中SBA-BR抗體效價(jià)實(shí)現(xiàn)提高≥4倍的參加者的比例。在兩個(gè)處理組中和對(duì)所有的疫苗血清組，在基線時(shí)檢測(cè)不到SBA效價(jià)(＜8)的大多數(shù)參加者在D28中SBA效價(jià)實(shí)現(xiàn)提高≥4倍。在TetraMenD組中，D0時(shí)SBA效價(jià)＜8而在D28自基線提高≥4倍的參加者的比例范圍是90.7％至100.0％，在Menomune_組是96.9％至99.3％。
表D-8D0時(shí)檢測(cè)不到效價(jià)(＜8)而在D28中SBA-BR抗體效價(jià)實(shí)現(xiàn)提高≥4倍的參加者的比例

*％＝n/N_n＝各血清組中D0時(shí)效價(jià)＜1∶8而D28效價(jià)≥1∶32的參加者數(shù)目_N＝各血清組中D0時(shí)效價(jià)＜1∶8的參加者的數(shù)目。
表D-9給出基線時(shí)和接種之后D28的SBA GMTs以及SBAGMTs提高倍數(shù)。
表D-9對(duì)血清組的抗體效價(jià)(GMT)的幾何平均和GMT提高倍數(shù)的總結(jié)(每份記錄總數(shù))

*效價(jià)或提高倍數(shù)，其中提高倍數(shù)＝D28效價(jià)/D0效價(jià)。
_N各血清組中抽血的參加者數(shù)目。注一名參加者沒(méi)有第二個(gè)血樣。
_根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分布大約值計(jì)算的GMT的95％CI。
接受所研究的疫苗TetraMenD之后第28天至56天，大多數(shù)參加者表現(xiàn)出對(duì)疫苗中包含的各個(gè)血清組SBA-BR抗體效價(jià)提高≥4倍。對(duì)于血清組A，C，Y，和W-135，實(shí)現(xiàn)抗體效價(jià)提高倍的TetraMenD受試者百分比分別是80.4％，88.5％，73.6％，和89.4％。與對(duì)于血清組C或W-135相比，對(duì)于血清組Y觀察到更高的接種前的抗體水平。這可能與這樣的事實(shí)相關(guān)，即目前血清組Y是在美國(guó)該年齡段與入侵性腦膜炎球菌相關(guān)的最常見(jiàn)的血清組，并且與該血清組自然接觸可能更常見(jiàn)。更高的循環(huán)抗體水平反映近期天然接觸，并且可能減小表現(xiàn)出4倍或更高抗體應(yīng)答的疫苗受體的比例。這清楚地表明是當(dāng)與其他血清組相比血清組Y應(yīng)答的情況。與對(duì)于血清組C是88.5％，對(duì)于血清組W-135是89.4％相比，血清組Y提高四倍是73.6％。對(duì)于血清組A也觀察到高的接種前抗體水平。這可能是間歇性地與幾種天然存在的交叉反應(yīng)抗原接觸過(guò)長(zhǎng)時(shí)間引起的結(jié)果。
為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)預(yù)先存在的效價(jià)的影響和研究血清轉(zhuǎn)化的比例(由當(dāng)對(duì)于任何血清組的接種之前效價(jià)＜1∶8時(shí)實(shí)現(xiàn)抗體效價(jià)提高4倍的疫苗接受者的比例確定)，對(duì)對(duì)疫苗中含有的4種血清組中的任一種有＜1∶8的接種之前抗體效價(jià)的參加者進(jìn)行另一項(xiàng)分析。使用兔崽為補(bǔ)體來(lái)源通過(guò)SBA分析測(cè)得的＜1∶8的效價(jià)被認(rèn)為代表檢測(cè)不到水平的循環(huán)抗體。當(dāng)使用這項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)參加者時(shí)，發(fā)現(xiàn)用TetraMenD接種之后，對(duì)于血清組A血清轉(zhuǎn)化比例是100％，對(duì)于血清組C是99.4％，對(duì)于血清組W-135是96.5％，和對(duì)于血清組Y是90.7％。
如上文在另一項(xiàng)研究中討論的，以對(duì)新兵的觀察為基礎(chǔ)，Goldschneider提出使用人補(bǔ)體來(lái)源進(jìn)行SBA分析得到的≥1∶4的最小效價(jià)與抵抗血清組C入侵疾病的保護(hù)作用相關(guān)。建議將兔崽補(bǔ)體當(dāng)作可替代來(lái)源。腦膜炎球菌顯示對(duì)兔崽補(bǔ)體比對(duì)人補(bǔ)體更靈敏，產(chǎn)生更高的測(cè)定的抗體效價(jià)。有幾個(gè)人曾提出使用兔崽補(bǔ)體測(cè)定的效價(jià)≥1∶128，預(yù)示有保護(hù)作用，而效價(jià)＜1∶8則預(yù)示至少對(duì)于血清組C靈敏。雖然當(dāng)評(píng)價(jià)多糖疫苗時(shí)這個(gè)水平是適當(dāng)?shù)?，但是它不適用于偶聯(lián)物疫苗。Borrow提出，在證明接種之后SBA效價(jià)在8和64之間的接受一價(jià)C偶聯(lián)物疫苗的受試者中，施用減小劑量(10微克)的腦膜炎球菌多糖疫苗幾個(gè)月后證明有記憶性應(yīng)答表明，這些個(gè)體也是受到保護(hù)的，實(shí)現(xiàn)抗體水平≥1∶128。當(dāng)對(duì)疫苗中包含的各種血清組適用這些標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，實(shí)現(xiàn)接種之后SBA-BR效價(jià)≥1∶128的接受TetraMenD的參加者百分比對(duì)于血清組A，C，Y，和W-135分別是99.8％，98.7％，96.9％，和97.1％。
實(shí)施例13 研究E 對(duì)10-18歲孩子的Td加強(qiáng)研究在該項(xiàng)研究中，根據(jù)測(cè)定它們各自破傷風(fēng)和白喉效價(jià)中有可接受的反應(yīng)的參加者的比例，將接受了試驗(yàn)四價(jià)腦膜炎球菌白喉偶聯(lián)物疫苗TetraMenD，同時(shí)接受Td的組中的破傷風(fēng)和白喉類毒素(Td)加強(qiáng)反應(yīng)與接受Td作為安慰劑的組的反應(yīng)相比較?？山邮艿姆磻?yīng)定義為，接種之后28天，有預(yù)定低接種前效價(jià)的參加者自基線提高至少4倍，有預(yù)定高接種前效價(jià)的參加者自基線提高至少2倍。
根據(jù)對(duì)于各個(gè)血清組效價(jià)提高至少4倍的參加者的比例所測(cè)定的，將與Td共同施用的TetraMenD中對(duì)于血清組A，C，Y，和W-135的抗體應(yīng)答與施用Td疫苗之后施用28天TetraMenD的反應(yīng)相比。
這是一項(xiàng)隨機(jī)的改進(jìn)的雙盲的活動(dòng)受控多中心試驗(yàn)，總計(jì)1024名參加者隨機(jī)分成兩組A和B。

選擇11-17歲年齡范圍的孩子作為正常接受Td疫苗作為日常孩童時(shí)期免疫日程的一部分的那些個(gè)體。另外，這個(gè)年齡段被鑒定為有發(fā)生入侵性腦膜炎球菌疾病的高風(fēng)險(xiǎn)，并且最可能是一旦許可就接種腦膜炎球菌偶聯(lián)物疫苗的候選人。為了適當(dāng)?shù)卦u(píng)價(jià)安全性，利用使用安慰劑的改進(jìn)的雙盲設(shè)計(jì)。對(duì)于第一次病訪，接種護(hù)士不知情并根據(jù)方案在各個(gè)臂上施用疫苗；TetraMenD(IM)或安慰劑種在右臂，Td在左臂。第一次病訪，各個(gè)處理組在左臂接受疫苗。評(píng)價(jià)的護(hù)士在不知情下監(jiān)測(cè)局部和全身反應(yīng)和副反應(yīng)。
選擇11-17歲年齡范圍的孩子作為正常接受Td疫苗作為日常孩童時(shí)期免疫日程的一部分的那些個(gè)體。另外，這個(gè)年齡段被鑒定為有發(fā)生入侵性腦膜炎球菌疾病的高風(fēng)險(xiǎn)，并且最可能是一旦許可就接種腦膜炎球菌偶聯(lián)物疫苗的候選人。
在接種之前D0(基線)和接種1之后D28獲得用于血清學(xué)試驗(yàn)的血樣(至少5毫升全血)。病訪2之后28天對(duì)參加者取第三個(gè)血樣。在這些時(shí)間點(diǎn)，對(duì)血清測(cè)定腦膜炎球菌血清組A，C，Y，和W-135，抗-白喉抗體和抗-破傷風(fēng)抗體。
為了評(píng)價(jià)TetraMenD受者的抗體功能，使用兔崽補(bǔ)體(SBA-BR)對(duì)所有可獲得的樣品測(cè)定抗各個(gè)疫苗血清組的SBA。一個(gè)免疫學(xué)終點(diǎn)是SBA-BR效價(jià)提高≥4倍的各處理組中參加者比例。以試驗(yàn)血清保護(hù)非洲綠猴腎細(xì)胞株系細(xì)胞抵抗白喉毒素進(jìn)攻的能力來(lái)測(cè)量抗-白喉抗體水平。以間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)來(lái)測(cè)定抗-破傷風(fēng)抗體水平。
該項(xiàng)研究將接受一個(gè)劑量的TetraMenD的研究C較早研究的參加者的GMTs測(cè)定的對(duì)于血清組A，C，Y，和W-135的TetraMenD的抗體應(yīng)答和與Td同時(shí)施用TetraMenD的和Td接種之后28天施用TetraMenD的參加者的反應(yīng)相比較。
在接種之前基線(D0)和接種之后D28(窗口+28天)和6個(gè)月獲得用于血清學(xué)分析的血清樣品。在接種之前和接種之后28天測(cè)定抗破傷風(fēng)類毒素和白喉類毒素(Td)疫苗的抗體效價(jià)。
對(duì)在接種之前和接種之后28天獲得的所有血清樣品測(cè)定對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A，C，Y，和W-135的SBA-BR抗體效價(jià)?？傊?，A組和B組的安全性曲線是可相比的。該項(xiàng)研究的結(jié)果總結(jié)在下表中。
表E-1總結(jié)GMT水平隨受試者年齡和血清組的變化。
1)表E-1GMT水平隨受試者年齡和血清組的變化的總結(jié)

表E-2顯示D28破傷風(fēng)和白喉抗體提高至少4倍或2倍的參加者的數(shù)目和比例。
表E-2D28破傷風(fēng)和白喉抗體提高至少4倍或2倍的參加者的數(shù)目和比例

對(duì)于血清組A，C，Y，和W-135的破傷風(fēng)和白喉抗體效價(jià)和SBA抗體效價(jià)表E-2顯示D28破傷風(fēng)和白喉抗體提高至少4倍或2倍的參加者的數(shù)目和比例。比例的差異對(duì)于破傷風(fēng)和白喉分別是2.78和-2.73。
表E-2破傷風(fēng)和白喉接種之后D28天破傷風(fēng)和白喉抗體應(yīng)答提高至少4倍或2倍的參加者的總數(shù)目和比例，初步假設(shè)1(每份記錄總數(shù))

表E-2破傷風(fēng)和白喉接種之后D28天破傷風(fēng)和白喉抗體應(yīng)答提高至少4倍或2倍的參加者的總數(shù)目和比例，第一種假設(shè)(每份記錄總數(shù))

表E-3D28天對(duì)血清組A，C，Y，和W-135的抗體效價(jià)提高至少4倍的參加者的數(shù)目和比例。
表E-3TetraMenD接種之后D28天SBA-BR效價(jià)提高≥4倍的參加者的數(shù)目和比例，初步假設(shè)2(每份記錄總數(shù))

表E-4顯示基線時(shí)有高白喉和破傷風(fēng)效價(jià)的參加者的數(shù)目和D28天效價(jià)提高2倍的參加者的數(shù)目和比例。
表E-4基線時(shí)有高白喉和破傷風(fēng)預(yù)先效價(jià)的參加者的數(shù)目(％)和D28天效價(jià)提高2倍的參加者的數(shù)目和比例(每份記錄總數(shù))

表E-5顯示基線時(shí)有低白喉和破傷風(fēng)效價(jià)的參加者的數(shù)目和D28天效價(jià)提高4倍的參加者的數(shù)目和比例。
表E-5基線時(shí)有低白喉和破傷風(fēng)預(yù)先效價(jià)的參加者的數(shù)目(％)和D28天效價(jià)提高4倍的參加者的數(shù)目和比例(每份記錄總數(shù))

表E-6給出與TetraMenD或安慰劑一起給與的破傷風(fēng)和白喉接種之后D28破傷風(fēng)和白喉抗體效價(jià)≥1.0IU/ml的參加者的數(shù)目和比例。
表E-6破傷風(fēng)和白喉接種之后D28天破傷風(fēng)和白喉抗體效價(jià)≥1.0IU/ml的參加者的數(shù)目和比例(每份記錄總數(shù))

表E-7給出破傷風(fēng)和白喉接種(與TetraMenD或安慰劑一起給與)之后D28天破傷風(fēng)和白喉幾何平均抗體效價(jià)(GMTs)。
表E-7破傷風(fēng)和白喉接種之后D28天破傷風(fēng)和白喉幾何平均抗體效價(jià)(GMTs)的比較(每份記錄總數(shù))[1]

表E-8說(shuō)明TetraMenD接種之后D28天對(duì)血清組A，C，Y，和W-135的SBA-BR幾何平均抗體效價(jià)(GMTs)。對(duì)血清組A，C，Y，和W-135的GMT比分別是0.92，0.42，0.39，和0.32。
表E-8TetraMenD接種之后D28天SBA-BR幾何平均抗體效價(jià)(GMTs)的比較(每份記錄總數(shù))[1]

表E-9顯示Td+TetraMenD，安慰劑組和研究MTA02所得相應(yīng)結(jié)果中，TetraMenD接種之后D28天對(duì)血清組A，C，Y，和W-135的SBA-BR幾何平均抗體效價(jià)(GMTs)。對(duì)血清組A，C，Y，和W-135的GMT比分別是0.48，0.38，0.34，和0.39。
表E-9Td+TetraMenD組，安慰劑組與研究C所得相應(yīng)結(jié)果的，TetraMenD接種之后D28天SBA-BR幾何平均抗體效價(jià)(GMTs)的比較(每份記錄總數(shù))

表E-10顯示Td+安慰劑，TetraMenD組和研究MTA02所得相應(yīng)結(jié)果中，TetraMenD接種之后D28天對(duì)血清組A，C，Y，和W-135的SBA-BR幾何平均抗體效價(jià)(GMTs)。對(duì)血清組A，C，Y，和W-135的GMT比分別是0.53，0.90，0.99，和1.05。
表E-10B組和研究C所得相應(yīng)結(jié)果的，TetraMenD接種之后D28天SBA-BR幾何平均抗體效價(jià)(GMTs)的比較，觀察的假設(shè)(每份記錄總數(shù))[1]

表E-11顯示每份記錄總數(shù)TetraMenD接種之后D0和D28天SBA-BR抗體效價(jià)隨血清組的分布(SBA-BR效價(jià)＜8至1024)。
表E-12顯示每份記錄總數(shù)TetraMenD接種之后D0和D28天SBA-BR抗體效價(jià)隨血清組的分布(SBA-BR效價(jià)2048至524288)。
表E-11TetraMenD接種之后D0和D28天SBA-BR抗體效價(jià)隨血清組的分布(每份記錄總數(shù))(SBA-BR效價(jià)＜8至1024)

表E-11TetraMenD接種之后D0和D28天SBA-BR抗體效價(jià)隨血清組的分布(每份記錄總數(shù))(SBA-BR效價(jià)＜8至1024)

表E-12TetraMenD接種之后D0和D28天SBA-BR抗體效價(jià)隨血清組的分布(每份記錄總數(shù))(SBA-BR效價(jià)2048至524288)

表E-12TetraMenD接種之后D0和D28天SBA-BR抗體效價(jià)隨血清組的分布(每份記錄總數(shù))(SBA-BR效價(jià)2048至524288)

表E13抗體效價(jià)的總結(jié)破傷風(fēng)和白喉效價(jià)的分布(每份記錄總數(shù))[1]

對(duì)健康的10-17歲青少年進(jìn)行相關(guān)研究來(lái)評(píng)價(jià)與許可的Td疫苗伴隨施用的MCV-4疫苗的安全性和免疫原性。簡(jiǎn)要地說(shuō)，在多中心隨機(jī)試驗(yàn)中，健康的10-17歲青少年(平均年齡12.9歲)接受了TetraMenD(MCV-4)+Td，或者是同時(shí)的(n＝509)，或者隔一個(gè)月分別探訪(n＝512)。在接種之后第8天和28天收集對(duì)分開(kāi)地和同時(shí)地給與的兩種疫苗的安全性評(píng)價(jià)。以對(duì)白喉和破傷風(fēng)的抗體效價(jià)，和對(duì)腦膜炎球菌血清組的血清殺細(xì)菌活性(SBA)來(lái)評(píng)價(jià)接種之前和接種之后4周的免疫應(yīng)答。單獨(dú)施用Td的受試者的安全性狀況與接受Td+TetraMenD的受試者相類似。伴隨施用Td+TetraMenD不干擾對(duì)破傷風(fēng)或白喉類毒素的免疫應(yīng)答。下面表E-14總結(jié)了對(duì)四種血清組的SBA應(yīng)答。
表E-14對(duì)四種血清組的SBA應(yīng)答

該項(xiàng)研究表明，共同施用Td和TetraMenD是安全的并且所試驗(yàn)的受試者是耐受的。伴隨施用TetraMenD+Td不會(huì)負(fù)面影響對(duì)破傷風(fēng)或白喉類毒素的免疫應(yīng)答。當(dāng)MCV-4與Td共同施用時(shí)，對(duì)血清組C，Y，和W135多糖的免疫應(yīng)答被加強(qiáng)。在該項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答是另人驚奇的和出人意料的。
實(shí)施例14使用兔崽補(bǔ)體和使用人補(bǔ)體的對(duì)于腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C，W-135和Y的血清殺細(xì)菌試驗(yàn)的比較在該項(xiàng)研究中使用一組來(lái)自III階段研究A的血清樣品，來(lái)比較血清組C，W-135的SBA-BR效價(jià)和SBA-HC效價(jià)獲得的結(jié)果。在該項(xiàng)試驗(yàn)中登記的受試者至少2歲但是還不到11歲，并且隨機(jī)分為兩個(gè)接種組。在基線(接種之前)和接種之后D28天從每名受試者采集大約5毫升全血。在采集后4小時(shí)之內(nèi)將來(lái)自受試者的血樣離心。從血清去除凝塊，轉(zhuǎn)移到貼標(biāo)簽的冷凍管中并保存在-20℃或更低溫度的有溫度監(jiān)測(cè)的冰箱中。該項(xiàng)報(bào)告中分析所使用的所有的樣品來(lái)自在臨床研究中登記的第一個(gè)受試者的一對(duì)血清，并且血清體積足以完成所有計(jì)劃的試驗(yàn)。所有的樣品來(lái)自2歲和3歲的受試者，只有一名4歲。有意治療錄中有兩名受試者。一名來(lái)自TetraMenD疫苗組(D24天時(shí)采集接種之后D28樣品)，一名來(lái)自Menomune_疫苗組(D9天時(shí)采集接種之后D28樣品)。
對(duì)兔崽補(bǔ)體(Pel-Freez_，Clinical Systems LLC，Brown Deer，WI，產(chǎn)品代碼31038)預(yù)先篩選在各血清組特異性分析中的適應(yīng)性。適應(yīng)性標(biāo)準(zhǔn)包括符合使用預(yù)先定量兔補(bǔ)體的確定一組血清樣品(2倍稀釋度之內(nèi))的SBA-BR試驗(yàn)結(jié)果。還使用了匯集參照血清和對(duì)照樣品的預(yù)先測(cè)定的效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)。在-70℃或更低溫度下保存2.5ml兔補(bǔ)體等份備用。將等份樣品一次解凍，使用或去除。
通過(guò)ELISA對(duì)登記的受試者的血清篩選抗-腦膜炎球菌多糖IgG和IgM水平并且在功能抗體的SBA-BR中分析，鑒定抗SBA-H中使用的補(bǔ)體的可能的來(lái)源。從選擇人補(bǔ)體源確定的標(biāo)準(zhǔn)如下(1)進(jìn)行SBA-BR分析時(shí)沒(méi)有可檢測(cè)到的抗體，(2)當(dāng)在試驗(yàn)中用作補(bǔ)體源時(shí)沒(méi)有本身固有的殺細(xì)菌活性，(3)使用Dr.Ray Borrow的獨(dú)立外界實(shí)驗(yàn)室中測(cè)得的有先前陰性試驗(yàn)結(jié)果的血清，當(dāng)與一組陰性對(duì)照物一起用作補(bǔ)體源時(shí)有可接受的性能，和(4)使用一組24個(gè)樣品有可接受的再現(xiàn)性。各血清組特異性測(cè)定中使用的外來(lái)補(bǔ)體源來(lái)自不同受試者。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一種補(bǔ)體源對(duì)一個(gè)以上的血清組有效。還有，SBA分析中使用的三個(gè)補(bǔ)體源來(lái)自每個(gè)血清組中的一個(gè)供體。
血清組C來(lái)自幾名受試者的有可接受低ELISA值(對(duì)于IgG和IgM兩者都小于0.5微克/毫升)的血清證明有殺細(xì)菌活性。
血清組Y血清組Y SBA-H的補(bǔ)體源選自在采集方案中登記的受試者。來(lái)自補(bǔ)體源的血清通過(guò)ELISA顯示低水平血清組Y IgG和IgM抗體水平并且在SBA-BR分析中呈陰性。當(dāng)在SBA中使用時(shí)，來(lái)自這個(gè)補(bǔ)體源的血清沒(méi)有顯示固有的殺細(xì)菌活性。
血清組W-135
血清組W-135 SBA-H的補(bǔ)體源選自在采集方案中登記的受試者。來(lái)自補(bǔ)體源的血清通過(guò)ELISA顯示低水平血清組W-135 IgG和IgM抗體水平，并且在SBA-BR分析中呈陰性。當(dāng)在SBA中使用時(shí)，來(lái)自這個(gè)補(bǔ)體源的血清沒(méi)有顯示固有的殺細(xì)菌活性。
血清殺細(xì)菌分析簡(jiǎn)要地說(shuō)，從Centers for Disease Control，Atlanta，GA(CDC)獲得腦膜炎球菌血清組C，Y，和W-135菌株。制備細(xì)菌的靶菌株用于剛解凍的接種多個(gè)血清組C，Y和W-135小瓶的試驗(yàn)中。每個(gè)小瓶被用來(lái)劃線培養(yǎng)在37℃±0.5℃在5％CO2中保溫過(guò)夜的Thayer Martin板。第二天，用消毒勺收集分離的菌落并且用來(lái)接種已經(jīng)溫?zé)嶂潦覝氐男迈rThayer Martin板的整個(gè)表面。平板在37℃±0.5℃在5％CO2中培養(yǎng)4小時(shí)，獲得一淺層的會(huì)合的細(xì)菌，用消毒勺收集并懸浮于Dulbecco′s PBS+0.1％葡萄糖緩沖液中，測(cè)定光密度(在600nm的吸光度)。在Dulbecco′s PBS+0.1％.葡萄糖緩沖液中制備有規(guī)定濃度細(xì)菌的分析溶液，保持在環(huán)境溫度，并且在制備的30分鐘之內(nèi)使用。
將試驗(yàn)樣品在56℃下加熱處理30分鐘使內(nèi)源補(bǔ)體滅活。向96-孔微量滴定板的所有的孔加入Dulbecco′s PBS+0.1％葡萄糖緩沖液，然后在板上以兩倍系列稀釋度調(diào)配試驗(yàn)血清樣品，留最后兩列孔為補(bǔ)體和血清對(duì)照物孔。每一個(gè)平板的列包括補(bǔ)體列([列11]-血清/+補(bǔ)體)和血清對(duì)照物列([列12]+血清/-補(bǔ)體)。
將剛解凍的補(bǔ)體與分析濃度的細(xì)菌混合，并且把混合物分配給微量滴定板的所有空，但是不分配給血清對(duì)照物孔。將沒(méi)有加補(bǔ)體的細(xì)菌分配給血清對(duì)照物孔。蓋上板并放到平板搖動(dòng)器上一分鐘，然后轉(zhuǎn)移到37℃±0.5℃在CO2培養(yǎng)箱中。對(duì)于血清組A試驗(yàn)板，培養(yǎng)時(shí)間是90分鐘，對(duì)于血清組C，Y，和W-135試驗(yàn)板，培養(yǎng)時(shí)間是60分鐘。溫育之后，將100微升50℃±1℃的瓊脂糖覆蓋培養(yǎng)基小心地加給所有的孔，避免空氣泡產(chǎn)生。微開(kāi)微量滴定板避免濕氣形成，室溫下培養(yǎng)10分鐘之后，蓋上平板并轉(zhuǎn)移到37℃±0.5℃，5％CO2干燥的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20±4小時(shí)。溫育之后，計(jì)數(shù)每孔細(xì)菌菌落數(shù)目。計(jì)算補(bǔ)體對(duì)照物孔的每孔菌落平均數(shù)目并且除以2，得到T0時(shí)50％存活率。
每種未知血清的殺細(xì)菌效價(jià)表示為與T0時(shí)50％存活率值相比較時(shí)實(shí)現(xiàn)≥50％殺傷的最終血清稀釋度倒數(shù)。SBA-BR樣品的起始稀釋度是1∶8稀釋。對(duì)于SBA-H，起始稀釋度降低至1∶4稀釋度，如最初試驗(yàn)中描述的。
表14-1中提供了這里描述的血清組A分析用SBA-BR程序與標(biāo)準(zhǔn)SBA程序(CDC)以及與根據(jù)Manchester Public Health LaboratoryServices，Meningococcal Reference Unit，Manchester，UK(PHLS)進(jìn)行的SBA程序的比較。
表14-1血清殺細(xì)菌測(cè)定方法比較


從Dr.George Carlone，CDC(CDC donor-R21654-3430107)獲得參照血清，是小瓶中凍干的粉末，使用之前在2℃至8℃下保存。當(dāng)加入時(shí)，用0.5ml無(wú)菌水將小瓶各自再水合并且以100微升操作等份在-80℃至-40℃下保存。當(dāng)在這些條件下重新設(shè)立時(shí)，參照血清的效價(jià)是在對(duì)于血清組A，C，Y，和W-135的標(biāo)準(zhǔn)SBA-BR中1∶256±1兩倍稀釋度。在常規(guī)一套平板的不同平板上用參照血清分析兩次。
從Difco購(gòu)得對(duì)于血清組A，C，Y，和W-135的組特異性兔抗血清，是小瓶中凍干的粉末，使用之前在2℃至8℃下保存。當(dāng)需要時(shí)，用1ml無(wú)菌水將各小瓶再水合并且以50微升等份在-80℃至-40℃下保存，用作SBA中性能對(duì)照樣品。
這里提供的用來(lái)測(cè)定補(bǔ)體-介導(dǎo)的對(duì)臨床血樣中腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C，Y，和W-135多糖殺細(xì)菌活性的使用兔崽補(bǔ)體(SBA-BR)的血清殺細(xì)菌測(cè)定的結(jié)果在精確性，稀釋能力(線性)，特異性和檢測(cè)界限方面完全有效。使用相同一套血樣連續(xù)5天重復(fù)SBA-H試驗(yàn)(對(duì)于血清組C)來(lái)保證試驗(yàn)的精確性。
SBA-BR的靈敏性和特異性的計(jì)算使用1∶4和1∶8的SBA-H基準(zhǔn)效價(jià)，將SBA-BR中獲得的效價(jià)分為真陽(yáng)性(TP)(和假陽(yáng)性[FP])和真陰性(TN)(和假陰性[FN])。以TP/(TP+FN)計(jì)算靈敏性，以TN/(TN+FP)計(jì)算特異性。計(jì)算結(jié)果以百分比表示。
SBA-BR對(duì)SBA-H的SBA效價(jià)分布比較表1和4給出對(duì)于血清組C的接種之前和接種之后D28 SBA效價(jià)，表2和5給出對(duì)于血清組Y的，表3和6給出對(duì)于血清組W-135的。下面部分總結(jié)的是比較從兩個(gè)補(bǔ)體來(lái)源(BR對(duì)H)獲得的結(jié)果的接種之前和接種之后SBA效價(jià)分析。
血清組C SBA效價(jià)分布101個(gè)血清樣品中，根據(jù)SBA-H效價(jià)＜1∶4和SBA-BR效價(jià)＜1∶8確定，63個(gè)是陰性的。接種前樣品中27個(gè)通過(guò)SBA-H分析是陰性的(＜1∶4)但是SBA-BR分析是陽(yáng)性的(＞＝1∶8)。使用SBA-BR而截止效價(jià)＜1∶8的假陽(yáng)性率是30％。較高SBA-BR截止效價(jià)下假陽(yáng)性率降低，1∶128截止效價(jià)時(shí)降低至小于20％，1∶512截止效價(jià)時(shí)降低至小于10％。SBA-H分析陽(yáng)性(＞＝1∶4)的7個(gè)樣品SBA-BR分析是陰性的(＜1∶8)。
在接種之后的血清中，SBA-H分析48個(gè)樣品是陰性的，SBA-BR分析只有11個(gè)是陰性的。在11個(gè)SBA-BR陰性樣品中，3個(gè)是SBA-H陽(yáng)性的。偶聯(lián)物組中51個(gè)接種之后樣品中的17個(gè)(32％)是SBA-H陰性的，但是SBA-BR陽(yáng)性(＞＝1∶8)。對(duì)于多糖組，50個(gè)接種之后樣品中的23個(gè)(46％)是SBA-H陰性的，但是SBA-BR效價(jià)陽(yáng)性(＞＝1∶8)?？紤]接種之后血清的陽(yáng)性反應(yīng)，101個(gè)樣品中的90個(gè)(89％)是SBA-BR陽(yáng)性(＞＝1∶8)，但是101個(gè)中只有53個(gè)(52％)是SBA-H陽(yáng)性的(＞＝1∶4)。當(dāng)比較從兩個(gè)疫苗組獲得的SBA效價(jià)(BR對(duì)H)時(shí)，陽(yáng)性反應(yīng)有顯著差異。偶聯(lián)物組中51個(gè)接種之后樣品，51個(gè)中的33個(gè)(65％)是SBA-H(＞＝1∶4)和SBA-BR(＞＝1∶8)陽(yáng)性的。SBA效價(jià)(BR對(duì)H)之間的協(xié)和將SBA-BR閾值提高至＞＝1∶64或更高。多糖組中的個(gè)接種之后樣品中，50中的17個(gè)(34％)是SBA-H(＞＝1∶4)和SBA-BR(＞＝1∶8)陽(yáng)性的。SBA效價(jià)(BR對(duì)H)之間的吻合將SBA-BR閾值提高至＞＝1∶512或更高。
血清組Y SBA效價(jià)分布和血清組C接種前血清不一樣，根據(jù)SBA-H效價(jià)＜1∶4和SBA-BR效價(jià)＜1∶8確定，血清組Y接種前樣品中只有9個(gè)是陰性的。61個(gè)接種前樣品中52個(gè)是SBA-H陰性的(＜1∶4)但是SBA-BR陽(yáng)性的(＞＝1∶8)。使用SBA-BR而截止效價(jià)＜1∶8的假陽(yáng)性率是85％。較高SBA-BR截止效價(jià)下假陽(yáng)性率降低，1∶256截止效價(jià)時(shí)降低至小于15％，1∶512截止效價(jià)時(shí)降低至小于2％。SBA-H分析陽(yáng)性(＞＝1∶4)的2個(gè)樣品SBA-BR分析是陰性的(＜1∶8)。
沒(méi)有SBA-H效價(jià)＜1∶4且SBA-BR效價(jià)＜1∶8的接種之后血清樣品。19個(gè)樣品是SBA-H陰性(＜1∶4)但SBA-BR陽(yáng)性(＞＝1∶8)。對(duì)于血清組C，假陰性結(jié)果比例沒(méi)有差異。在偶聯(lián)物組中，48個(gè)樣品中的5個(gè)(9％)是SBA-H陰性(＜1∶4)，但是SBA-BR陽(yáng)性。在多糖組中，52個(gè)樣品中的14個(gè)(27％)是SBA-H陰性(＜1∶4)，但是SBA-BR陽(yáng)性。
血清組Y的接種之后血清的陽(yáng)性反應(yīng)的兩個(gè)SBA效價(jià)(BR對(duì)H)之間有好的吻合。對(duì)于整套100個(gè)樣品，所有100個(gè)接種后樣品SBA-BR效價(jià)＞＝1∶8，100個(gè)中的81個(gè)SBA-H效價(jià)＞＝1∶4。對(duì)于血清組C的SBA反應(yīng)，與從多糖組獲得的SBA效價(jià)(BR對(duì)H)相比，偶聯(lián)物組中SBA效價(jià)(BR對(duì)H)之間有更好的關(guān)聯(lián)。偶聯(lián)物組48個(gè)接種后樣品中，43個(gè)(90％)是SBA-H(＞＝1∶4)和SBA-BR(＞＝1∶8)陽(yáng)性。48個(gè)樣品中只有1個(gè)有小于1∶32的SBA-BR效價(jià)，而且那個(gè)樣品是SBA-H陽(yáng)性的(＞＝1∶4)。SBA效價(jià)(BR對(duì)H)之間的吻合不如多糖組的好。52中只有38個(gè)(73％)接種之后SBA-H效價(jià)＞＝1∶4且SBA-BR效價(jià)＞＝1∶8。多糖組接種后血清中SBA效價(jià)(BR對(duì)H)之間的吻合將SBA-BR效價(jià)提高至＞＝1∶128。
血清組W-135 SBA效價(jià)分布對(duì)于血清組W-135，100個(gè)中的54個(gè)(54％)是陰性的，其中SBA-H效價(jià)＜1∶4且SBA-BR效價(jià)＜1∶8。免疫前樣品中，81個(gè)中的27個(gè)是SBA-H陰性(＜1∶4)而SBA-BR陽(yáng)性(＞＝1∶8)。使用SBA-BR而截止效價(jià)＜1∶8的假陽(yáng)性率是33％。較高SBA-BR截止效價(jià)下假陽(yáng)性率降低，1∶128截止效價(jià)時(shí)降低至小于15％，1∶256截止效價(jià)時(shí)降低至小于5％。SBA-H分析陽(yáng)性(＞＝1∶4)的11個(gè)樣品SBA-BR分析是陰性的(＜1∶8)。
三個(gè)接種后樣品SBA-H陰性(＜1∶4)且SBA-BR陰性(＜1∶8)。39個(gè)接種后樣品SBA-H陰性(＜1∶4)但是SBA-BR效價(jià)陽(yáng)性(＞＝1∶8)。在偶聯(lián)物組，47個(gè)樣品中的11個(gè)(23％)SBA-H陰性但是SBA-BR陽(yáng)性。在多糖組，53個(gè)樣品中的28個(gè)(53％)是SBA-H陰性但是SBA-BR陽(yáng)性。
免疫后SBA-BR and SBA-H效價(jià)之間的吻合可與血清組C相比，但是不如血清組Y好。使用血清組C和血清組Y，當(dāng)比較兩個(gè)疫苗組時(shí)，兩個(gè)SBA效價(jià)(BR對(duì)H)之間的吻合有顯著差異。與多糖組相比，偶聯(lián)物組的兩個(gè)SBA效價(jià)(BR對(duì)H)之間的吻合更好一些。在偶聯(lián)物組的免疫后SBA效價(jià)中，47中的36個(gè)(77％)的SBA-H效價(jià)＞＝1∶4，并且都是SBA-BR陽(yáng)性(＞＝1∶8)。偶聯(lián)物組的所有樣品接種后SBA-BR效價(jià)＞＝1∶32。關(guān)于多糖組的接種后效價(jià)，兩個(gè)效價(jià)之間的關(guān)聯(lián)不夠好，53個(gè)中只有22個(gè)(42％)的SBA-H效價(jià)＞＝1∶4并且53個(gè)中的50個(gè)(94％)的SBA-BR效價(jià)＞＝1∶8。
表1.血清組C SBA-H陽(yáng)性和陰性的血清SBA-BR效價(jià)的比較

表2.血清組Y SBA-H陽(yáng)性和陰性的血清SBA-BR效價(jià)的比較

表3.血清組W-135 SBA-H陽(yáng)性和陰性的血清SBA-BR效價(jià)的比較


表4.SBA-BR和SBA-H測(cè)定的血清組C效價(jià)的分布總結(jié)

1樣品總數(shù)是101。
表5.SBA-BR和SBA-H測(cè)定的血清組Y效價(jià)的分布總結(jié)


1樣品總數(shù)是100。
表6.SBA-BR和SBA-H測(cè)定的血清組W-135效價(jià)的分布總結(jié)


1樣品總數(shù)是100。
SBA-BR和SBA-H效價(jià)的靈敏度和特異性比較在進(jìn)行兩組效價(jià)之間靈敏度和特異性評(píng)價(jià)中，將SBA-BR效價(jià)與1∶4和1∶8的SBA-H保護(hù)效價(jià)相比較。在該項(xiàng)分析中使用免疫前和免疫后血清。使用1∶4和1∶8的SBA-H基準(zhǔn)效價(jià)，對(duì)所有三個(gè)血清組計(jì)算特異性和靈敏性并總結(jié)于表7，9和10中。接著對(duì)每一個(gè)血清組討論特異性和靈敏性分析。
對(duì)于血清組C，對(duì)于相對(duì)于1∶4和1∶8 SBA-H效價(jià)的1∶8，1∶16，和1∶32的SBA-BR閾值效價(jià)，靈敏度大于80％。但是，這些SBA-BR效價(jià)的特異性小于60％。1∶64 SBA-BR效價(jià)時(shí)，特異性提高60％，1∶128SBA-BR效價(jià)時(shí)，特異性提高70％。對(duì)于后兩者SBA-BR效價(jià)，特異性開(kāi)始降低。在1∶64的SBA-BR閾值效價(jià)時(shí)，靈敏性在75和78％之間，但是在1∶128 SBA-BR效價(jià)時(shí)，靈敏性降低至62和65％之間。對(duì)于1∶128和1∶256，SBA-BR效價(jià)＞1∶64時(shí)特異性繼續(xù)分別提高至73％至83％的范圍。但是靈敏性從43％降至小于20％。靈敏性和特異性之間有最好平衡的血清組C的SBA-BR效價(jià)落在1∶32和1∶128之間SBA-BR效價(jià)范圍內(nèi)。發(fā)現(xiàn)血清組C的靈敏性和特異性結(jié)果與SantosGF，等，2001.Clin.Diagn.Lab.Immunol.8616-623，以不同組血清樣品和試劑獲得的結(jié)果是十分比得上的(表8)。關(guān)于Santos′s結(jié)果，發(fā)現(xiàn)靈敏性和特異性的最好平衡是SBA-BR效價(jià)在1∶64和1∶128之間，而SBA-H效價(jià)在1∶4和1∶8之間。
表7.血清組C的SBA-H保護(hù)效價(jià)時(shí)SBA-BR的靈敏性和特異性

表8.Santos等2001.Clin.Diagn.Lab.Immunol.8616-623報(bào)道的血清組C的SBA-H保護(hù)效價(jià)時(shí)SBA-BR的靈敏性和特異性

對(duì)于血清組Y，范圍是1∶8至1∶64的SBA-BR閾值效價(jià)靈敏性最高，但是，如所預(yù)期的，在較高SBA-BR閾值效價(jià)時(shí)降低。與血清組C的結(jié)果相比，血清組Y的特異性結(jié)果開(kāi)始低得多，而且沒(méi)有達(dá)到大于50％的水平，直到SBA-BR閾值效價(jià)為1∶128。對(duì)于血清組Y的靈敏性和特異性平衡最好的SBA-BR效價(jià)落在1∶64和1∶256之間的范圍內(nèi)。在1∶256時(shí)，靈敏性降低至大約55％，但是特異性從中間-30％范圍提高至大約82-83％。
表9.血清組Y的SBA-H保護(hù)效價(jià)時(shí)SBA-BR的靈敏性和特異性

對(duì)于血清組W135，靈敏度的值更接近對(duì)于血清組C獲得的值，但是總的模式與所有三個(gè)血清組相同。在SBA-BR閾值效價(jià)為1∶8時(shí)靈敏性開(kāi)始低并在效價(jià)＞＝1∶128時(shí)降低。同樣，在SBA-BR效價(jià)為1∶8時(shí)特異性開(kāi)始低，效價(jià)1∶256時(shí)開(kāi)始達(dá)到穩(wěn)定。根據(jù)對(duì)血清組Y的觀察，對(duì)于血清組W135，靈敏性和特異性之間達(dá)到最佳平衡的SBA-BR落在1∶64和1∶256之間的范圍。
表10.對(duì)于血清組W135的SBA-H保護(hù)效價(jià)時(shí)SBA-BR的靈敏性和特異性

表11總結(jié)的是對(duì)于血清組C，Y，和W135使用兔崽補(bǔ)體或人補(bǔ)體相對(duì)于免疫后SBA-BR效價(jià)的SBA效價(jià)提高4倍的比例。另外對(duì)偶聯(lián)物組，TetraMenD，和多糖組，Menomune_，進(jìn)行該項(xiàng)分析，表11包括兩套分析。比較對(duì)三個(gè)血清組和兩個(gè)疫苗組的殺細(xì)菌反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)4倍提高模式有差異。下面對(duì)每個(gè)血清組和兩個(gè)疫苗組討論反應(yīng)模式。
表11.SBA-BR和SBA-H1測(cè)定的腦膜炎球菌多糖效價(jià)4倍提高的分層比較比例


1該表給出SBA-BR效價(jià)，疫苗和血清組分層各分析(對(duì)免疫前和免疫后D28天成對(duì)樣品)測(cè)定的SBA效價(jià)提高4倍的比例(和百分比)。
對(duì)于血清組C，與對(duì)于偶聯(lián)物組SBA-BR對(duì)SBA-H之間的提高4倍嚴(yán)密吻合。在這個(gè)疫苗組，顯現(xiàn)出這樣的趨向，即低免疫后效價(jià)時(shí)，例如1∶32-1∶128，SBA-H 4倍提高置后于SBA-BR提高4倍。但是，免疫后SBA-BR效價(jià)＞＝1∶256時(shí)，實(shí)現(xiàn)SBA-H提高4倍的受試者人數(shù)顯示大于實(shí)現(xiàn)SBA-BR提高4倍的受試者人數(shù)。比較兩個(gè)補(bǔ)體源提高倍數(shù)的這種差異是小的，并且可能是由于改變實(shí)現(xiàn)SBA-BR提高4倍的百分比的更高免疫前SBA-BR效價(jià)。對(duì)于多糖組，SBA-BR對(duì)SBA-H之間提高4倍之間的吻合不如它對(duì)于偶聯(lián)物組那么接近。還有，沒(méi)有這樣的顯著趨向，即SBA-H提高4倍在更高免疫后SBA-BR效價(jià)下比對(duì)偶聯(lián)物組發(fā)現(xiàn)的更靈敏。
對(duì)于血清組Y，SBA-H和SBA-BR提高4倍之間的吻合非常接近于兩個(gè)疫苗組。與血清組C免疫后SBA-BR效價(jià)相比，兩個(gè)疫苗組有非常少的免疫后SBA-BR效價(jià)小于1∶32。由于這個(gè)原因，實(shí)現(xiàn)血清組Y SBA-H和SBA-BR提高4倍的受試者比例發(fā)生在比血清組C更高免疫后SBA-BR效價(jià)時(shí)。對(duì)于血清組Y，在與偶聯(lián)物組1∶128的免疫后SBA-BR效價(jià)時(shí)，提高4倍的比例增加至＞＝50％，而對(duì)于血清組C，閾值SBA-BR效價(jià)是偶聯(lián)物組的1∶32。
對(duì)于血清組W135，SBA-H和SBA-BR提高4倍之間的吻合沒(méi)有另兩個(gè)血清組那么接近。根據(jù)對(duì)血清組Y的發(fā)現(xiàn)，對(duì)于任一種疫苗組有小于1∶32的免疫后SBA-BR效價(jià)的受試者人數(shù)是有限的。SBA-BR效價(jià)＞＝1∶256時(shí)發(fā)生SBA效價(jià)(BR對(duì)H)提高4倍之間的吻合。如對(duì)血清組C發(fā)現(xiàn)的，兩個(gè)疫苗組之間提高4倍(BR對(duì)H)的比例有差異，這對(duì)血清組Y則不明顯。與另兩個(gè)血清組多糖疫苗的SBA效價(jià)(BR對(duì)H)提高4倍相比，多糖組中血清組W135 SBA效價(jià)(BR對(duì)H)提高4倍之間的吻合最差。
將使用兔崽補(bǔ)體(SBA-BR)的血清殺細(xì)菌測(cè)定結(jié)果與使用人補(bǔ)體(SBA-H)測(cè)定接種了許可的四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗(Menomune_)或者試驗(yàn)四價(jià)腦膜炎球菌多糖偶聯(lián)物疫苗(TetraMenD)的2-3歲受試者的血清樣品效價(jià)的相應(yīng)SBA相比較。鑒定血清組C，Y，和W135的人補(bǔ)體源并且用來(lái)支持SBA的這種比較。用兩種方法分析這種比較研究的SBA結(jié)果。在一種方法中，將對(duì)于兩個(gè)疫苗組測(cè)定接種前和接種后效價(jià)獲得的SBA-BR和SBA-H數(shù)據(jù)集合用于分析。在第二種方法中，分別分析兩個(gè)疫苗組的接種前和接種后效價(jià)。該項(xiàng)研究的一個(gè)目的是描述與陰性SBA-H血清效價(jià)最好關(guān)聯(lián)的SBA-BR血清效價(jià)。第二個(gè)目的是測(cè)定與使用人補(bǔ)體的陽(yáng)性效價(jià)最佳關(guān)聯(lián)的使用兔崽補(bǔ)體的效價(jià)，在該項(xiàng)分析中作為對(duì)血清組C的保護(hù)作用的相互關(guān)系，并且外推至血清組Y和W135的保護(hù)性殺細(xì)菌效價(jià)。其它實(shí)驗(yàn)公開(kāi)的結(jié)果試圖建立血清組C的SBA-BR的保護(hù)性閾值關(guān)聯(lián)關(guān)系。將該項(xiàng)研究的結(jié)果與公開(kāi)的結(jié)果相比較。最近，對(duì)兩個(gè)補(bǔ)體源比較接種前和接種后測(cè)定的SBA效價(jià)的4倍提高。
只對(duì)于血清組C建立了抗疾病的保護(hù)作用的SBA效價(jià)的關(guān)聯(lián)性。在SBA分析中使用人補(bǔ)體測(cè)定血清組C的保護(hù)作用的SBA關(guān)聯(lián)性。對(duì)于其他血清組，假設(shè)血清組C的保護(hù)作用的SBA-H關(guān)聯(lián)性(SBA效價(jià)1∶4)適用于其他血清組。定義的與血清組C的SBA效價(jià)1∶4關(guān)聯(lián)的SBA-BR效價(jià)在血清組之間可以是不同的。關(guān)于與陰性SBA-H血清效價(jià)最佳吻合的SBA-BR效價(jià)，接種前和接種后血清中SBA-BR效價(jià)＜1∶8與SBA-H效價(jià)＜1∶4可相比。部分以比較血清組C SBA效價(jià)的(BR對(duì)H)WHO/CDC研究結(jié)果為基礎(chǔ)，以及以最近UniversityOutbreak in the United Kingdom發(fā)現(xiàn)的SBA-BR效價(jià)＜1∶4與懷疑血清組C疾病相關(guān)(Jones，G.R.，等，2000.J.Infect.Dis.1811172-1175)為基礎(chǔ)，使用SBA-BR效價(jià)＜1∶8。
以該項(xiàng)研究產(chǎn)生的SBA效價(jià)(BR對(duì)H)為基礎(chǔ)，使用＜1∶8的SBA-BR截止效價(jià)的血清組C的假陽(yáng)性率是30％。使用更高的SBA-BR截止效價(jià)提高假陽(yáng)性率如下＞＝1∶16時(shí)，假陽(yáng)性率降低至26％，＞＝1∶32時(shí)，假陽(yáng)性率降低至24％，＞＝1∶64時(shí)，假陽(yáng)性率降低至22％，＞＝1∶128時(shí)，假陽(yáng)性率降低至18％，＞＝1∶256時(shí)，假陽(yáng)性率降低至14％，和＞＝1∶512時(shí)，假陽(yáng)性率降低至2％。提高SBA-BR截止效價(jià)不會(huì)提高定義的相應(yīng)于SBA-H效價(jià)＜1∶4的陰性效價(jià)的精確度，但是使用較高SBA-BR截止效價(jià)時(shí)區(qū)分陽(yáng)性反應(yīng)和陰性反應(yīng)的靈敏性卻低得多。該項(xiàng)報(bào)告中的數(shù)據(jù)表明，1∶8，1∶16，或1∶32截止效價(jià)時(shí)SBA-BR的靈敏度最高(81-84％)。SBA-BR效價(jià)大于1∶32時(shí)，靈敏度降低至低于80％。但是，1∶8，1∶16，和1∶32截止效價(jià)時(shí)分析的特異性最小，范圍是51至58％。在選擇響應(yīng)于人補(bǔ)體分析中的陰性效價(jià)的截止效價(jià)時(shí)平衡靈敏度，特異性和假陽(yáng)性率。確定1∶32為SBA-BR的截止效價(jià)將導(dǎo)致不必要地扣除真陽(yáng)性應(yīng)答者。該項(xiàng)研究結(jié)果表明SBA-BR效價(jià)＞＝1∶16可能是更合適的截止效價(jià)。以WHO/CDC研究分析(＜1∶8)和U.K.University Outbreak分析(＜1∶4)為基礎(chǔ)，效價(jià)之上最小2倍稀釋據(jù)信是保護(hù)性的。假定殺細(xì)菌抗體保護(hù)作用與血清組C疾病類似并且殺細(xì)菌效價(jià)相應(yīng)于人補(bǔ)體實(shí)驗(yàn)中的陰性效價(jià)，獲得對(duì)血清組W135和Y的分析中保護(hù)性截止效價(jià)的鑒定。對(duì)于血清組Y，與血清組C的30％相比，使用SBA-BR截止效價(jià)＜1∶8的假陽(yáng)性率是十分高的85％。但是，關(guān)于血清組C，SBA-BR截止效價(jià)的提高降低了假陽(yáng)性率。SBA-BR截止效價(jià)是1∶16時(shí)，假陽(yáng)性率降低至84％，1∶32時(shí)，假陽(yáng)性率降低至75％，1∶64時(shí)，假陽(yáng)性率降低至61％，1∶128時(shí)，假陽(yáng)性率降低至38％，1∶256時(shí)，假陽(yáng)性率降低至13％，和1∶512時(shí)，假陽(yáng)性率降低至2％。即使截止效價(jià)＞＝1∶128時(shí)，與血清組C相比，血清組Y的假陽(yáng)性率開(kāi)始高得多，這兩個(gè)血清組分析的假陽(yáng)性率變得完全可比得上。這樣高的截止效價(jià)，hoarer，可以夸大陽(yáng)性反應(yīng)的閾值效價(jià)。根據(jù)靈敏度和特異性分析，SBA-BR截止效價(jià)是1∶8至1∶32時(shí)靈敏度最大，靈敏度范圍是95至98％。但是，對(duì)血清組C，這些SBA-BR效價(jià)下的特異性相當(dāng)?shù)?，范圍?1至18％。次最高SBA-BR效價(jià)，1∶64時(shí)，靈敏度從95％降低至88％，但是特異性急劇升高至35％。血清組Y分析中＜1∶64的截止效價(jià)表現(xiàn)出與人補(bǔ)體分析中的陰性效價(jià)最相當(dāng)。
對(duì)于血清組W135，SBA-BR截止效價(jià)＜1∶8時(shí)假陽(yáng)性率是33％，這類似于血清組C。如對(duì)于較高截止效價(jià)時(shí)血清組C和Y所注意到的，假陽(yáng)性率降至更低水平。SBA-BR截止效價(jià)1∶16時(shí)，假陽(yáng)性率降低至32％，1∶32時(shí)，假陽(yáng)性率降低至28％，1∶64時(shí)，假陽(yáng)性率降低至26％，1∶128時(shí)，假陽(yáng)性率降低至12％，1∶256時(shí)，假陽(yáng)性率降低至4％，和1∶512時(shí)，假陽(yáng)性率最低為0％。SBA-BR效價(jià)范圍是1∶8至1∶64時(shí)靈敏度最高(86％至81％)。特異性，如所預(yù)期的，在該SBA-BR效價(jià)范圍內(nèi)是最低的(46％至52％)。雖然與血清組Y相比，血清組W135的假陽(yáng)性率開(kāi)始低得多，與人補(bǔ)體分析中的陰性效價(jià)最相當(dāng)?shù)慕刂剐r(jià)是＜1∶64。
鑒定了相應(yīng)于人補(bǔ)體分析中的陰性效價(jià)的三個(gè)血清組的效價(jià)，對(duì)這些水平之上的SBA-BR效價(jià)分析了認(rèn)為是陽(yáng)性反應(yīng)的閾值效價(jià)。對(duì)于血清組C，陽(yáng)性反應(yīng)的閾值效價(jià)是＞＝1∶16，對(duì)于血清組Y，陽(yáng)性反應(yīng)的閾值效價(jià)是＞＝1∶64，對(duì)于血清組W135，陽(yáng)性反應(yīng)的閾值效價(jià)是＞＝1∶64。顯示，相對(duì)于1∶4或1∶8的SBA-H效價(jià)和對(duì)于血清組C 1∶4的精確SBA-H效價(jià)的相關(guān)性，血清組C的閾值SBA-BR效價(jià)＞＝1∶128為實(shí)現(xiàn)保護(hù)性效價(jià)提供了好的保證。該閾值效價(jià)與在對(duì)于血清組C的WHO/CDC數(shù)據(jù)組基礎(chǔ)上以及對(duì)Santos數(shù)據(jù)組的分析很好地吻合。在這兩項(xiàng)研究中，效價(jià)＞＝1∶128高度預(yù)示保護(hù)作用，但是SBA-BR效價(jià)小于1∶128也可能是保護(hù)性的。對(duì)于WHO/CDC和Santos數(shù)據(jù)組，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64的SBA-BR效價(jià)被認(rèn)為是兩可的效價(jià)。因?yàn)檫@里對(duì)于血清組C給出的數(shù)據(jù)組SBA-BR效價(jià)小于1∶16被認(rèn)為是陰性的，該項(xiàng)分析的兩可的效價(jià)是1∶16至1∶64，這是另兩項(xiàng)研究的子集。在所有分析中，SBA-BR效價(jià)比得上與20世紀(jì)60年代收集的天然保護(hù)數(shù)據(jù)相關(guān)的SBA-H效價(jià)(1∶4或1∶8)。
最近，為使一價(jià)C偶聯(lián)物的United Kingdom有效數(shù)據(jù)直接與SBA-BR效價(jià)相關(guān)聯(lián)而進(jìn)行了努力(Miller E，等，2002，Vaccine 20S58-S67)。在該項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)SBA-BR效價(jià)＞＝1∶8和＞＝1∶128都與對(duì)接種了一劑量的一價(jià)C偶聯(lián)物的15-17歲受試者采集的有效數(shù)據(jù)很好地相關(guān)聯(lián)。但是，當(dāng)Miller和同事對(duì)學(xué)步齡組(12至30月齡)進(jìn)行相同分析時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)SBA-BR效價(jià)＞＝1∶8與功效之間很好的吻合，但是SBA-BR效價(jià)＞＝1∶128時(shí)吻合不密切。Miller在第13屆International Pathogenic Neisseria Conference，2002年9月1-6日，Oslo，Norway上給出另外的數(shù)據(jù)，預(yù)言接種后一個(gè)月實(shí)現(xiàn)SBA-BR效價(jià)＞＝1∶64的受試者的功效在對(duì)該年齡組觀察的功效的95％置信區(qū)間之外。這些數(shù)據(jù)有助于支持1∶8至1∶64的兩可區(qū)中SBA-BR效價(jià)可以保證保護(hù)作用的想法。根據(jù)對(duì)這項(xiàng)研究的分析，1∶16至1∶64的SBA-BR效價(jià)同樣可以保證抗血清組C的保護(hù)作用。
1∶64的SBA-BR效價(jià)下血清組Y分析只有35％的特異性，但是隨著截止效價(jià)提高至1∶128和1∶256，特異性分別提高至59％和84％。閾值效價(jià)＞＝1∶256在1∶4和1∶8人補(bǔ)體實(shí)驗(yàn)中為保護(hù)作用效價(jià)提供好的保證。但是，對(duì)于血清組Y，1∶128的閾值效價(jià)下靈敏度和特異性平衡更好。對(duì)于血清組Y，1∶64至1∶128的SBA-BR效價(jià)范圍代表效價(jià)的兩可范圍比得上對(duì)于血清組C的1∶16至1∶64的SBA-BR效價(jià)的響應(yīng)范圍，后者與SBA-H效價(jià)相關(guān)聯(lián)。
SBA-BR效價(jià)1∶64下的血清組W-135分析有52％的特異性，但是隨著效價(jià)提高至1∶128和1∶256，特異性分別提高至64和77％。對(duì)于血清組Y，閾值效價(jià)＞＝1∶256在1∶4和1∶8人補(bǔ)體實(shí)驗(yàn)中為保護(hù)作用效價(jià)提供好的保證。和血清組Y一樣，對(duì)于血清組W135，閾值效價(jià)是1∶128時(shí)靈敏度和特異性平衡更好。對(duì)于血清組W135，1∶64至1∶128的SBA-BR效價(jià)的范圍代表效價(jià)的兩可范圍比得上對(duì)于血清組C的1∶16至1∶64的SBA-BR效價(jià)的范圍，后者與該項(xiàng)研究中SBA-H保護(hù)效價(jià)相關(guān)聯(lián)。
對(duì)各血清組計(jì)算殺細(xì)菌效價(jià)4倍提高并且利用兩種分析對(duì)疫苗組分別分析。總的來(lái)說(shuō)，對(duì)于所有三個(gè)血清組在較高免疫后SBA-BR效價(jià)下測(cè)得的SBA效價(jià)(BR和H)提高四倍較高是一個(gè)指征。血清組和疫苗組SBA效價(jià)(BR對(duì)H)四倍提高有差異。對(duì)于血清組C，用人補(bǔ)體的分析中四倍提高顯示比用兔崽補(bǔ)體在低免疫后SBA-BR效價(jià)下的分析中的效價(jià)低。但是在較高免疫后SBA-BR效價(jià)下，效價(jià)提高四倍顯示在用人補(bǔ)體的分析中更高。這種模式似乎提示，低免疫后SBA-BR效價(jià)下，用人補(bǔ)體的分析的靈敏度比用兔崽補(bǔ)體分析的靈敏度低，但是在高免疫后SBA-BR效價(jià)下，正好相反，即，用人補(bǔ)體的分析變得更靈敏。當(dāng)分析多糖疫苗組的樣品時(shí)這種模式不明顯。在這些樣品中，當(dāng)在分析中使用人補(bǔ)體時(shí)，效價(jià)的四倍提高表現(xiàn)得比較低。雖然對(duì)兩種樣品類型之間的這種發(fā)現(xiàn)沒(méi)有解釋，但是它確實(shí)提示用人補(bǔ)體進(jìn)行的分析沒(méi)有用含有低殺細(xì)菌活性效價(jià)的血清樣品的靈敏性。
對(duì)于血清組Y，比較兩個(gè)補(bǔ)體源，SBA效價(jià)四倍提高有好的吻合。與多糖組相比，偶聯(lián)物組SBA效價(jià)四倍提高(BR和H)稍微高一些，但是差異沒(méi)有血清組C那樣大。
對(duì)于血清組W135，在對(duì)于任一種疫苗組的分析中使用人補(bǔ)體或兔崽補(bǔ)體時(shí)SBA效價(jià)四倍提高之間的吻合沒(méi)有與使用另兩種血清組分析的結(jié)果那樣好。SBA-BR效價(jià)四倍提高對(duì)于兩個(gè)疫苗組是非常好的，但是與另兩個(gè)血清組相比，SBA-H四倍提高效價(jià)的比例更低。多糖組的SBA-H四倍提高非常低，并且相對(duì)地比另兩個(gè)血清組的SBA-H效價(jià)的四倍提高低。
使用BR補(bǔ)體的SBA效價(jià)的四倍提高已經(jīng)成為腦膜炎球菌多糖疫苗登記的基準(zhǔn)。最近，為了將SBA-BR效價(jià)四倍提高與United Kingdom(Borrow R，等，2001，Infect.Immun.691568-1573)中一價(jià)C偶聯(lián)物的登記后監(jiān)督數(shù)據(jù)的臨床功效相聯(lián)系已經(jīng)進(jìn)行了努力。以該項(xiàng)分析為基礎(chǔ)，估計(jì)12至30個(gè)月齡范圍內(nèi)學(xué)步幼兒的一價(jià)C偶聯(lián)物的功效在第一次給藥16個(gè)月內(nèi)是88％(69至95％)。對(duì)于該年齡組，一劑量一價(jià)C偶聯(lián)物疫苗后，實(shí)現(xiàn)SBA-BR效價(jià)四倍提高的受試者的比例范圍是89至100％。
這里提供的SBA-BR提供了比得上在血清組C的分析中使用人補(bǔ)體為補(bǔ)體源獲得的值的殺細(xì)菌效價(jià)值。因此，這些SBA-BR效價(jià)與確立對(duì)血清組C腦膜炎球菌疾病的保護(hù)性免疫性的替代品的最初的研究有關(guān)并且支持這里提供的臨床結(jié)果外推有保護(hù)作用，并且血清組C的SBA-BR效價(jià)比得上其他實(shí)驗(yàn)報(bào)道的那些結(jié)果。在測(cè)定對(duì)血清組Y和血清組W-135莢膜多糖的血清特異性反應(yīng)中使用人補(bǔ)體的SBA的性能，類似于血清組C模型，支持測(cè)定對(duì)血清組Y和W-135的殺細(xì)菌效價(jià)的SBA-BR的關(guān)聯(lián)性。
權(quán)利要求
1.一種多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其中偶聯(lián)物包含與一個(gè)或幾個(gè)載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A，C，W-135或Y的莢膜多糖，并且該偶聯(lián)物含有0.5至15微克/毫升的各種莢膜多糖，達(dá)到平均大小小于100,000道爾頓。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中莢膜多糖被衍生化至5,000至75,000道爾頓的平均大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的偶聯(lián)物，其中莢膜多糖被衍生化至7,000至50,000道爾頓的平均大小。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的偶聯(lián)物，其中莢膜多糖被衍生化至8,000至35,000道爾頓的平均大小。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的偶聯(lián)物，其中莢膜多糖被衍生化至12,000至25,000道爾頓的平均大小。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的偶聯(lián)物，其中莢膜多糖被衍生化至15,000至22,000道爾頓的平均大小。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中衍生化多糖與載體蛋白質(zhì)的平均比例是大約1∶1至大約1∶20(w/w)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的偶聯(lián)物，其中衍生化多糖與載體蛋白質(zhì)的平均比例是大約1∶2至大約1∶10(w/w)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的偶聯(lián)物，其中衍生化多糖與載體蛋白質(zhì)的平均比例是大約1∶2至大約1∶6(w/w)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的偶聯(lián)物，其中衍生化多糖與載體蛋白質(zhì)的平均比例是大約1∶(4±1)(w/w)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的偶聯(lián)物，其中衍生化多糖與載體蛋白質(zhì)的平均比例是大約1∶(4±0.5)(w/w)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的偶聯(lián)物，其中衍生化多糖與載體蛋白質(zhì)的平均比例是大約1∶(4±0.25)(w/w)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中載體蛋白質(zhì)包括細(xì)菌毒素或類毒素，或者細(xì)菌外膜蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中載體蛋白質(zhì)包括白喉毒素，白喉類毒素，CRM197，破傷風(fēng)類毒素，百日咳類毒素，大腸桿菌LT，大腸桿菌ST，外毒素A，外膜復(fù)合體c(OMPC)，膜孔蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白，pneumolysis，肺炎球菌表面蛋白A(PspA)，肺炎球菌黏附素蛋白(PsaA)，卵白蛋白，匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)，牛血清白蛋白(BSA)或者結(jié)核菌素(PPD)的純化蛋白質(zhì)衍生物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的偶聯(lián)物，其中載體蛋白質(zhì)包括白喉毒素，白喉類毒素，CRM197，破傷風(fēng)類毒素，外毒素A，或外膜復(fù)合體c(OMPC)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的偶聯(lián)物，其中載體蛋白質(zhì)包括白喉毒素，白喉類毒素，或CRM197。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的偶聯(lián)物，其中載體蛋白質(zhì)包括白喉毒素或白喉類毒素。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的偶聯(lián)物，其中莢膜多糖被衍生化至8,000至35,000道爾頓的平均大小。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的偶聯(lián)物，其中衍生化多糖與載體蛋白質(zhì)的平均比例是大約1∶2至大約1∶10(w/w)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的偶聯(lián)物，其中衍生化多糖與載體蛋白質(zhì)的平均比例是大約1∶(4±1)(w/w)。
全文摘要
本發(fā)明描述衍生化多糖－蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，含有一種或幾種這樣的衍生化多糖－蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的組合物和用它們對(duì)人患者免疫的方法。所述衍生化多糖－蛋白質(zhì)偶聯(lián)物是來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A，C，W－135，和Y的純化莢膜多糖，經(jīng)化學(xué)活化衍生化，并且通過(guò)共價(jià)化學(xué)鍵選擇性地與載體蛋白質(zhì)連接，形成能對(duì)各種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株激發(fā)長(zhǎng)期免疫性的多糖－蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。
文檔編號(hào)A61K39/116GK101048177SQ200580037092
公開(kāi)日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2005年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月30日
發(fā)明者R·P·賴亞爾 申請(qǐng)人:圣諾菲·帕斯圖爾公司