專利名稱：治療糖尿病的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及糖尿病的治療或預防，具體涉及多肽或相應核酸分子在治療或預防1型或2型糖尿病，或者延遲其發(fā)病中的應用。
背景將本說明書中引用的所有參考文獻，包括任何專利或專利申請納入本文作參考。不承認任何參考文獻構成現(xiàn)有技術。參考文獻的討論陳述了作者的主張，本申請人保留質詢引用文獻的準確性和針對性的權利。應明確理解，雖然本文提及了許多現(xiàn)有技術公開物，但在澳大利亞或任何其它國家，此參考文獻不能說明任何這些文獻形成了本領域常識的一部分。
糖尿病是影響人類的最常見的嚴重代謝病?？蓪⑵涠x為慢性高血糖癥，即由于相對或絕對缺少胰島素的作用，血液中糖過多。
糖尿病分為兩種主要形式1和2型糖尿病。1型糖尿病也稱為胰島素依賴性糖尿病(IDDM)，它是與產生胰島素的胰腺β-細胞幾乎全部缺失相關的自身免疫病。這種β-細胞缺失導致終身的胰島素依賴性。1型糖尿病可發(fā)生于任何年齡，估計約1％的新生兒在其生命中會患此病。2型糖尿病或非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)指特征為血液中葡萄糖水平高(高血糖癥)和胰島素抗性的一組疾病，發(fā)生于胰腺β細胞功能受損的患者。1型患者中缺少胰島素和2型糖尿病的胰島素抗性導致從血流中吸收的糖減少，因此血液中累積過多糖。這兩種類型的糖尿病都伴隨著壽命預期縮短和重要病癥，如血管病、失明和動脈粥樣硬化。提出了稱為LADA(成年人的潛伏性自身免疫糖尿病)的一種新型糖尿病，以描述診斷有2型糖尿病、也具有1型糖尿病的免疫學證據(因為他們呈抗-Gad抗體陽性)的成年人。
糖尿病是發(fā)達國家最普遍的慢性疾病之一，是死亡的主要原因。除臨床發(fā)病率和死亡率外，糖尿病的經濟成本巨大，僅在美國每年就超過$900億，預計到2010年糖尿病的流行將增加兩倍以上，主要是由于與肥胖相關的2型糖尿病。
非歐裔人群發(fā)生糖尿病的風險顯著增加。不遠的將來，糖尿病在亞洲，包括南亞會非常流行。這些個體在沒有嚴重肥胖的情況下發(fā)生糖尿病，因此胰島素缺陷可能是其疾病的主要成分。此外，在印度發(fā)現(xiàn)了與低胰島素水平相關的兩類糖尿病(涉及營養(yǎng)不良，纖維結石性胰腺糖尿病和蛋白質缺陷型胰腺糖尿病)。
胰島素由胰腺郎格罕氏島的β-細胞產生。在胰腺發(fā)育期間，胰島前體細胞增殖，并最終分化為四種主要胰島細胞類型之一。認為β-細胞的形成具體受各種生長因子、細胞因子和激素作用的調節(jié)。
β-細胞的數量和功能對維持葡萄糖代謝很重要，β-細胞數量和/或功能的嚴重降低導致糖尿病發(fā)病?，F(xiàn)在確定的是，β-細胞質量(mass)是通過損失和從前體細胞新生之間的平衡維持的。當胰島素抗性使胰島素需求顯著提高(例如由于肥胖)時，刺激了β-細胞新生。這導致β-細胞質量的擴大，并維持葡萄糖代謝。如果此代償機制受損，例如在2型糖尿病中，就破壞了葡萄糖代謝。近年來的研究證明，在2型糖尿病的動物模型中，β-細胞新生受損。因此，刺激β-細胞新生的因素應該能有效預防糖尿病發(fā)病，從而代表了可能有用的治療方法。
治療所有形式的糖尿病的主要目的相同，即盡可能地將血糖水平降低接近到正常水平，從而最大程度降低該疾病的短期和長期并發(fā)癥。
糖尿病的長期控制常常包括胰島素治療，不管患者是1型或2型。在健康個體中，胰島素增加骨骼肌攝取的葡萄糖并降低肝臟產生的葡萄糖；然而，在患有2型糖尿病的個體中，胰島素不能起到這種作用。因此，許多2型糖尿病患者不能對胰島素治療產生良好的反應，即使給予高劑量的胰島素。
1型糖尿病的治療必須包括給予取代劑量的胰島素，通常通過胃腸道外途徑給予胰島素。與飲食療法和血糖水平自我監(jiān)測相結合，大部分1型患者可適當地控制血糖。在2型糖尿病中，初始療法是最佳飲食方案、減少體重和進行鍛煉。如果和當這些方法不再提供足夠的代謝控制時，開始藥物療法。通常開給處方的是促進胰島素分泌或通過其它方式降低葡萄糖水平的藥物。降血糖藥，如磺脲或雙胍，是開給這些患者的主要藥物。它們通過直接刺激β-細胞而刺激胰島素產生；因此，這些藥物的有效性依賴胰腺中存留的有功能β-細胞(β-細胞質量)的數量。
磺脲在大部分2型糖尿病中無效；在一項研究中，用磺脲治療的30％新診斷的糖尿病患者在治療的前六年內需要胰島素。近來，據報道高達12％的2型糖尿病患者具有基因變異，即胰島素受體底物-1中的Arg972變異，此變異使他們不能采用這些藥物，因此他們需要胰島素治療。
肽生長因子參與了各種生理和病理過程，包括信號轉導、細胞存活、分化、細胞粘附、細胞遷移、免疫應答、造血作用、炎癥、組織修復、動脈粥樣硬化和癌癥。在幾乎所有這些過程中，肽生長因子通過與跨膜受體酪氨酸激酶(RTK)的胞外結構域相互作用行使其生物學作用。大部分RTK屬于高度同源受體的小類群，它們結合相似配體并通過配體誘導的同源或異源二聚體形成維持受體間相互作用。配體誘導的二聚化發(fā)生后，胞質結構域中的這些受體特異性酪氨酸殘基發(fā)生自身磷酸化。磷酸化的酪氨酸殘基用作具有SH2或磷酸酪氨酸結合(PTB)域的蛋白質(如Shc、Grb2和磷酸肌醇3’-激酶(PI3-激酶)的p85亞基)的高親和?？课稽c。這引起信號轉導途徑如促分裂原活化蛋白激酶途徑的活化，導致復雜的胞內信號級聯(lián)反應，最終產生靶細胞的特定事件。
最徹底研究的RTK亞家族之一是ErbB家族，該家族包括四種已知受體ErbB-1(也稱為表皮生長因子受體(EGFR))、ErbB-2(也稱為HER2或Neu)、ErbB-3和ErbB-4。這些受體廣泛分布于不同組織，并且根據細胞類型和生理條件，用于介導生長抑制或誘導細胞增殖和分化。
許多肽生長因子是ErbB受體家族的配體。這組因子具有高度序列相似性，尤其是共有六-半胱氨酸的36-40個氨基酸殘基的表皮生長因子(EGF)基序。此基序含有CX7CX4CX10CX1CX8C間隔，形成三個分子內二硫鍵(C1-C3、C2-C4、C5-C6)，具有特征性三環(huán)結構，包括C1-C3二硫環(huán)、C2-C4二硫環(huán)和C5-C6二硫環(huán)。
屬于此家族的生長因子肽的EGF-基序似乎都是由含有精確定位的間隔內含子的兩個外顯子編碼的，內含子對應于將前兩個二硫環(huán)(A環(huán)，C1-C3；B環(huán)，C2-C4)與第三個環(huán)(C環(huán)，C5-C6)分開的邊界。這些分子的共同特點是它們是作為較大的跨膜前體合成的，跨膜前體經蛋白水解切割后釋放該生長因子的可溶性生物活性形式。
共有EGF-基序對于結合和活化ErbB受體酪氨酸激酶家族成員很重要。結合ErbB受體的配體誘導受體同源或異源二聚化、自身磷酸化和隨后的下游信號轉導途徑活化，導致各種生理過程，包括細胞增殖、分化、遷移和存活。ErbB家族的哺乳動物配體包括EGF、轉化生長因子-α(TGF-α)、肝素結合的EGF-樣生長因子(HB-EGF)、表皮調節(jié)素(epiregulin)、雙調蛋白、神經-和胸腺-衍生的ErbB激酶激活物(NTAK)、神經調節(jié)蛋白(NRG)亞家族(包括四種基因(NRG1)、NRG2、NRG3和NRG4的產物)和β動物纖維素(BTC)。
起初從小鼠胰腺β-細胞癌(胰島瘤)細胞系的條件培養(yǎng)基中純化出BTC，它是對成纖維細胞、視網膜色素上皮細胞和平滑肌細胞具有促分裂活性的32kDa糖蛋白。人BTC克隆自人乳腺癌細胞系MCF-7，牛BTC克隆自牛腎細胞系。
BTC合成為錨定于膜上的前體蛋白，前體蛋白可經蛋白水解切割釋放可溶性成熟生長因子。成熟的BTC結合并活化ErbB1和ErbB-4同源二聚體，此外，還結合并活化所有可能的ErbB異源二聚體，包括高度致癌的異源二聚體ErbB2-ErbB3受體復合物。
許多研究強調，ErbB1受體和配體TGFα，具體是HB-EGF和BTC在胰腺發(fā)育和功能中可能很重要。在整個發(fā)育的胰腺中，ErbB配體的表達豐富。常常死于出生后頭一個星期的ErbB1-/-小鼠普遍顯示出胰腺上皮細胞增殖缺陷，伴隨島細胞延遲分化為產胰島素的β-細胞，以及發(fā)育的胰島內分泌細胞的遷移和結構形成受到破壞。這些缺陷表明，ErbB-1介導的信號轉導對正常β-細胞發(fā)育很重要。ErbB-3-/-小鼠的胰腺發(fā)育也有嚴重缺陷。
許多研究證明，在胰腺發(fā)育和功能中，BTC而非EGF或TGFα可具有獨特的非冗余作用。BTC在胰腺，特別是郎格罕氏島中強烈表達，刺激各種胰腺細胞在體外和體內增殖和分化。由于胰腺的導管細胞表達ErbB-1和ErbB-4，所以認為BTC可結合并活化這些受體以刺激β-細胞新生。
數量大得驚人的膜蛋白進行另路剪接，另路剪接去除編碼跨膜結構域的外顯子序列，產生與膜結合形式功能不同的可溶形式。另路剪接導致的mRNA結構改變可產生在某些組織中、不同的發(fā)育階段和/或在不同的細胞活化狀態(tài)下差異表達的蛋白質變體。當另路剪接的外顯子編碼的蛋白質結構域在功能上對催化活性或結合作用很重要時，得到的蛋白質常常顯示出不同、甚至是對抗性的活性。
我們最近鑒定了一種另路剪接的mRNA轉錄物，它編碼人BTC的新同種型(國際專利申請?zhí)朠CT/AU01/00010，GroPep Limited；Dunbar等，2000)。此同種型稱為BTC-δ4，它缺少編碼BTC基因的外顯子4的147bp，導致產生編碼缺失了EGF結構域的C-環(huán)和跨膜結構域的異常BTC前體的mRNA，而成熟分子的其余部分，包括A環(huán)和B環(huán)以及“鉸鏈”纈氨酸框內融合于截短的C-末端胞質尾。保留疏水信號序列和缺少跨膜結構域說明，BTC-δ4可能是分泌蛋白。PCT/AU01/00010提出，此BTC剪接變體可用于調節(jié)ErbB受體介導的活性，因此可用于治療與ErbB癌基因過度表達相關的疾病，如癌癥。
然后我們證實，此剪接變體是分泌蛋白。然而，我們發(fā)現(xiàn)，BTC-δ4不結合或者活化ErbB1或ErbB4受體，不結合ErbB2或ErbB3同源二聚體；因此我們推論，BTC-δ4不具有功能活性，至少對于ErbB1和ErbB4受體以及ErbB2和ErbB3同源二聚體如此，BTC-δ4丟失的核心EGF基序可能是活性所必需的(Dunbar等，2000)。
報道了缺少EGF結構域的第三個二硫環(huán)的同種型HB-EGF(Loukianov等，1997)。在這種情況下，外顯子III和IV之間94bp插入物引起移碼和成熟前終止，產生保留信號肽、pro-region、肝素-結合域和EGF基序的前兩個保守二硫環(huán)的蛋白，而九個氨基酸的短尾取代了第三個二硫環(huán)、跨膜和胞質域。
美國專利號6,825,159公開了β動物纖維素的變體，列為SEQ ID NO.38，該專利提示，此變體具有完整的β動物纖維素活性和降低的EGF活性。SEQ ID NO.38與本發(fā)明多肽的不同之處在于它包含了所有六個半胱氨酸并且C5-C6環(huán)中無缺陷。
發(fā)明概述盡管BTC-δ4與ErbB受體顯然無法結合，但是我們發(fā)現(xiàn)，BTC-δ4刺激β-細胞分化、增加β-細胞質量、減少β-細胞功能的降低并增加β-細胞的胰島素分泌。作為β-細胞分化刺激物，BTC-δ4比真正的BTC更有效；然而與真正的BTC相比，BTC-δ4沒有細胞生長促進活性或此活性降低。
在第一個方面，本發(fā)明提供了在患有糖尿病或處于患糖尿病風險的對象中治療、預防該疾病或延遲其發(fā)病的方法，該方法包括給予該對象能夠刺激島細胞祖細胞分化為胰腺β細胞的多肽，與真正的BTC相比，該多肽沒有細胞生長促進活性或此活性降低。
在第二個方面，本發(fā)明提供了在患有糖尿病或處于患糖尿病風險的對象中治療、預防該疾病或延遲其發(fā)病的方法，該方法包括給予該對象一種核酸，該核酸編碼能夠刺激島細胞祖細胞分化為胰腺β細胞的多肽，與真正的BTC相比，該多肽沒有細胞生長促進活性或此活性降低。
在第三個方面，本發(fā)明提供了能夠刺激島細胞祖細胞分化為胰腺β細胞的多肽在糖尿病患者中治療、預防該疾病或延遲其發(fā)病的應用，與真正的BTC相比，該多肽沒有細胞生長促進活性或此活性降低。
在第四個方面，本發(fā)明提供了編碼能夠刺激島細胞祖細胞分化為胰腺β細胞的多肽的核酸在患有糖尿病或處于患糖尿病風險的對象中治療、預防該疾病或延遲其發(fā)病的應用，與真正的BTC相比，該多肽沒有細胞生長促進活性或此活性降低。
在第五個方面，本發(fā)明提供了能夠刺激島細胞祖細胞分化為胰腺β細胞的多肽在能在患有糖尿病或處于患糖尿病風險的對象中治療、預防該疾病或延遲其發(fā)病的藥物制備中的應用，與真正的BTC相比，該多肽沒有細胞生長促進活性或此活性降低。
在第六個方面，本發(fā)明提供了編碼能夠刺激島細胞祖細胞分化為胰腺β細胞的多肽的核酸在能在患有糖尿病或處于患糖尿病風險的對象中治療、預防該疾病或延遲其發(fā)病的藥物制備中的應用，與真正的BTC相比，該多肽沒有細胞生長促進活性或此活性降低。
優(yōu)選地，與真正的BTC相比，該多肽活化對象的ErbB1和ErbB4受體的能力顯著降低，刺激島細胞祖細胞向胰腺β細胞分化時沒有刺激其它細胞類型的增殖。優(yōu)選地，與真正的BTC相比，該多肽沒有成纖維細胞生長促進活性或該活性降低。優(yōu)選地，與真正的BTC相比，該多肽沒有上皮細胞生長促進活性或該活性降低。
優(yōu)選地，所述糖尿病是2型糖尿病或1型糖尿病。
在第七個方面，本發(fā)明提供治療、預防糖尿病或延遲其發(fā)病的的組合物，該組合物包含能夠刺激島細胞祖細胞分化為胰腺β細胞的多肽與藥學上可接受的運載體，與真正的BTC相比，該多肽沒有細胞生長促進活性或此活性降低。
在第八個方面，本發(fā)明提供治療、預防糖尿病或延遲其發(fā)病的的組合物，該組合物包含編碼能夠刺激島細胞祖細胞分化為胰腺β細胞的多肽的核酸與藥學上可接受的運載體，與真正的BTC相比，該多肽沒有細胞生長促進活性或此活性降低。
優(yōu)選地，與真正的BTC相比，該多肽沒有刺激細胞類型增殖的能力或此能力降低，與真正的BTC相比，該多肽沒有活化ErbB1或ErbB4受體的能力或此能力降低。優(yōu)選地，與真正的BTC相比，該多肽沒有成纖維細胞生長促進活性或該活性降低。優(yōu)選地，與真正的BTC相比，該多肽沒有上皮細胞生長促進活性或該活性降低。
優(yōu)選地，與真正的BTC相比，該多肽沒有活化ErbB2或ErbB3同源二聚體的能力或該能力降低。
作為治療的副作用，該多肽使對象發(fā)生癌癥的風險可能低于真正BTC處理產生的風險。
優(yōu)選地，該多肽與EGF家族的成員基本同源。更優(yōu)選地，該多肽與表皮生長因子、轉化生長因子-α、肝素結合的EGF樣生長因子、表皮調節(jié)素、雙調蛋白、神經-和胸腺-衍生的ErbB激酶激活物(NTAK)、神經調節(jié)蛋白亞家族成員(NRG1、NRG2、NRG3和NRG4)或β動物纖維素(BTC)基本同源。更優(yōu)選地，該多肽與BTC-δ4基本同源。最優(yōu)選地，該多肽是BTC-δ4。BTC-δ4多肽的氨基酸序列如圖4(SEQ ID NO11-15)所示。
該多肽可以是(a)BTC的剪接變體，其中沒有C5-C6二硫環(huán)，而編碼真正BTC的基因中通常存在此二硫環(huán)；或
(b)序列與(a)分子基本同源的多肽，或(c)(a)分子的類似物、片段、突變體、衍生物或等位基因變體。
該多肽可以是(a)BTC的剪接變體，其中沒有C5-C6二硫環(huán)，此二硫環(huán)通常由編碼真正BTC的基因中存在的核酸序列編碼，編碼真正BTC多肽分子的核酸序列的其余部分，包括A環(huán)和B環(huán)以及“鉸鏈”纈氨酸框內融合于編碼截短的C-末端胞質尾的核酸序列；(b)序列與(a)分子基本同源的多肽；或(c)(a)的片段、類似物、變體或衍生物。
優(yōu)選地，該多肽能夠用作β-細胞分化因子、增加β-細胞質量、減少β-細胞功能的降低和/或增加β-細胞的胰島素分泌。
所述片段、類似物、變體或衍生物可具有以下特征(a)一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基，優(yōu)選保守氨基酸殘基取代；所述取代的氨基酸殘基可以是或不是遺傳密碼編碼的殘基；(b)一個或多個氨基酸殘基包括取代基；(c)成熟多肽融合于另一種化合物，以增加該多肽的半衰期；或(d)融合于成熟多肽的其它氨基酸。
作為治療的副作用，該多肽使對象發(fā)生癌癥的風險可能低于BTC治療產生的風險。
優(yōu)選地，對象具有以下糖尿病風險因素中的一項或多項葡萄糖耐受受損、代謝綜合征、1型或2型糖尿病家族史、肥胖、多囊卵巢綜合征、高血壓或高膽固醇。
應該明確理解，本發(fā)明的范圍內包括應用肽生長因子的EGF家族的其它成員的變異形式，其能夠用作體外和/或體內的β-細胞分化因子、在體外和/或體內增加β-細胞質量、減少β-細胞功能的降低和/或在體外和/或體內增加β-細胞胰島素分泌，本文將其稱為“類似的生長因子變體”。在這些變體形式中，通常存在于真正多肽中的氨基酸殘基缺失，其缺失方式類似于BTC-δ4中的缺失。優(yōu)選地，沒有通常存在于真正分子中的C5-C6二硫環(huán)，類似于BTC-δ4中的缺失。選自EGF家族的合適的真正多肽包括表皮生長因子、轉化生長因子-α、肝素結合的EGF樣生長因子、表皮調節(jié)素、雙調蛋白、神經-和胸腺-衍生的ErbB激酶激活物(NTAK)和神經調節(jié)蛋白亞家族成員(NRG1、NRG2、NRG3和NRG4)。預計這些變異形式的作用方式類似于本發(fā)明BTC-δ4多肽，條件是它們具有上述功能特征。
應理解，一旦知曉了本文所述多肽的氨基酸序列，就可通過本領域熟知的化學方法如固相多肽合成或重組方法合成BTC-δ4和其它生長因子的類似變體。
優(yōu)選地，該多肽分子具有人類來源的氨基酸序列。然而，本發(fā)明也包括應用非人哺乳動物的BTC-δ4；本發(fā)明BTC-δ4多核苷酸不難用作以本領域常規(guī)方法分離其它哺乳動物細胞的相應多核苷酸的探針。
因此，本發(fā)明多肽可以是重組多肽、分離的天然產生多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。
本發(fā)明方法可用于治療2型糖尿病，以及預防2型糖尿病或延遲其發(fā)病。而且，由于1型糖尿病的特征是β細胞的缺失和β細胞功能的完全喪失，本發(fā)明也可用于治療1型糖尿病，或者預防1型糖尿病或延遲其發(fā)病。
任選地，本發(fā)明多肽可與免疫抑制劑一起給藥。合適的免疫抑制劑包括皮質類固醇、TNF-α抗體如英利昔單抗(Remicade)和可溶性TNF-α受體如依坦西普(Enbrel)。在1型糖尿病或LADA(任何新β細胞仍然受免疫攻擊，除非抑制免疫攻擊)中可優(yōu)選這種聯(lián)合療法。
可以想像，與采用真正BTC相比，本發(fā)明方法使致癌風險降低。我們發(fā)現(xiàn)，BTC-δ4不能活化ErbB1和ErbB4受體，因此防止了ErbB-刺激的細胞增殖，從而降低或避免了成為治療副作用的癌癥風險。
特別考慮到，本發(fā)明方法和組合物適合用于人類糖尿病的醫(yī)學治療，它們也可用于獸醫(yī)治療，包括治療伙伴動物如犬和貓，以及家畜如馬、牛和綿羊，或動物園動物如非人靈長動物、貓科動物、犬科動物、?？苿游锖陀刑泐悇游铩?br> 通常以藥物組合物的形式給予本發(fā)明多肽。制備藥物組合物的方法和藥物運載體是本領域熟知的，如《雷明頓藥物科學》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第20版，Williams和Wilkins，美國賓夕法尼亞州等教科書所述。
運載體或稀釋劑和其它賦形劑將取決于給藥途徑，本領域技術人員能夠為各具體情況確定最合適的劑型。
可通過任何合適途徑給予本發(fā)明化合物和組合物，本領域技術人員能夠為所治療的病癥確定最合適的途徑和劑量。劑量由主治醫(yī)生或獸醫(yī)確定，取決于所治療病癥的特性和狀態(tài)、所治療對象的年齡和健康狀況、給藥途徑以及可能已經給予的在先治療。
附圖簡要說明

圖1A顯示了用RT-PCR檢測MCF-7細胞(泳道1)和人乳房皮膚成纖維細胞(泳道2)中的真正的人BTC和剪接變體人BTC-δ4。泳道3是無cDNA模板的對照。圖1B顯示用包含編碼人BTC氨基酸D32-Y111的多核苷酸的cDNA探針進行的相應Southern印跡。
圖2A比較了真正人BTC與剪接變體人BTC-δ4的部分核苷酸和推斷出的氨基酸序列(以一字母氨基酸編碼表示)。將圖1A中獲自MCF-7 cDNA的RT-PCR產物克隆入pBluescript II SK，并測序插入物。顯示了147bp缺失點(用朝下的箭頭表示)周圍的序列。圖2B顯示了BTC-δ4 cDNA的完整核苷酸序列和推斷出的氨基酸序列。
圖3在假擬比對中比較了真正人BTC和剪接變體人BTC-δ4的完整氨基酸序列。BTC-δ4序列中的水平虛線表示與真正hBTC序列相比丟失氨基酸的位點。下面的示意圖顯示了與BTC-δ4相比真正人BTC的全局結構。
圖4顯示了BTC-δ4多肽的氨基酸序列(BTC-δ41-129、BTC-δ41-94、BTC-δ432-94、BTC-δ432-129、BTC-δ432-111和BTC-δ495-129)。
圖5說明用于BTC和BTC-δ4的重組表達和純化的構建物。圖5A是分別用于BTC和BTC-δ4的構建物的示意圖。圖5B顯示了用C4柱的分析RP-HPLC評價各BTC或BTC-δ4制劑純度的結果。
圖6顯示出BTC-δ4是分泌蛋白。A用BTC-FLAG、BTC-δ4-FLAG或空載體(pcDNA3.1)瞬時轉染COS-7細胞。轉染72小時后，收集培養(yǎng)基并制備細胞裂解物。用抗-FLAG M2抗體的Western印跡分析培養(yǎng)基和細胞裂解物。B如上所述轉染COS-7細胞，用抗-FLAG M2抗體的ELISA分析培養(yǎng)基或非滲透性固定細胞。需要注意，用抗-BTC胞外域抗體(R&D Systems)也能獲得相似的Western印跡和ELISA結果(數據未顯示)。
圖7顯示出BTC而非BTC-δ4刺激了Balb/c 3T3成纖維細胞增殖，也顯示出BTC而非BTC-δ4在放射性受體試驗中結合ErbB1和ErbB4。Balb/c 3T3成纖維細胞與單獨的濃度增加的BTC或BTC-δ4(A)或在固定濃度的BTC存在下與濃度增加的BTC-δ4(B)一起孵育。在濃度增加的BTC或BTC-δ4存在下[125I]-標記的BTC與表達ErbB1的AG2804細胞(C、D)或ErbB4轉染的CHO細胞(E、F)競爭性結合。
圖8顯示出BTC而非BTC-δ4分別誘導了AG2804和CHO-ErbB4細胞中的ErbB1和ErbB4受體酪氨酸磷酸化。未處理(-)或處理(10nmol/l BTC，10nmol/l BTC-δ4或10nmol/l BTC+10nmol/l BTC-δ4)的裂解物。用抗-ErbB1(AG2804)或抗-ErbB4(CHO-ErbB4)抗體使細胞免疫沉淀(IP)，然后用抗-磷酸化酪氨酸抗體(αPY)進行印跡和檢測。也洗提印跡并用抗-ErbB1或抗-ErbB4抗體再檢測。
圖9顯示出BTC和BTC-δ4誘導AR42J細胞分化。AR42J-B20細胞與2 nM活化素A以及1nM BTC(圖A和C)或BTC-δ4(圖B和D)一起孵育48小時，然后固定并用抗-胰島素抗體(箭頭“1”)和DAPI(箭頭“2”)染色，DAPI染核。在活化素A和BTC-δ4處理的細胞中，許多細胞表達胰島素，但核被片段化(箭頭“3”)或丟失。放大倍數，圖A和B×100；圖C和D×400。
圖10顯示出BTC而非BTC-δ4改善了活化素-誘導的AR42J細胞凋亡。用2nM活化素A以及1nM BTC(A)或BTC-δ4(B)處理AR42J-B20細胞48小時。用箭頭表示TUNEL-陽性細胞。
圖11顯示出將BTC-δ4給予STZ-處理的大鼠降低血漿葡萄糖濃度并提高葡萄糖耐受。A在第0天(一日齡的新生動物)注射STZ(85μg/g)，從第0天開始每天注射BTC或BTC-δ4(3pmol/g)，并測定血漿葡萄糖濃度，共計5天。值是平均值±S.E.○，STZ組(n＝5)；●，STZ/BTC-δ4組(n＝5)；△，STZ/BTC組(n＝5)；*對STZ組的P＜0.05。B在2月齡的大鼠上進行葡萄糖耐受測試。左圖，血漿葡萄糖濃度的改變。右圖，血漿胰島素濃度的改變。值是平均值±SE。○，STZ組(n＝5)；●，STZ/BTC-δ4組(n＝5)；△，STZ/BTC組(n＝5)，(---)正常SD大鼠(n＝3)。*對STZ組的P＜0.05，**對STZ組的P＜0.01。
圖12顯示出在圖11所述研究的第4天測定的PDX-1陽性導管細胞(A)和島樣細胞簇(ICC)(B)的數量。(A)PDX-1-陽性導管細胞(箭頭“1”)PDX-1(箭頭“2”)細胞角蛋白。(B)ICC(箭頭“3”)細胞角蛋白(箭頭“4”)胰島素(箭頭“5”)DAPI。STZ用鹽水處理STZ-注射的大鼠。*對STZ的p＜0.05。**對STZ的p＜0.01。放大倍數，A×400；B×100。
發(fā)明詳述除非另有說明，本文所用的所有科技術語與本發(fā)明所屬領域普通技術人員所理解的含義相同。雖然可采用與本文所屬內容相似或等效的任何材料和方法來實施或測試本發(fā)明，但描述了優(yōu)選的材料和方法。
定義本文所用單數形式“一個”、“一種”和“這種”包括相應的復數含義，除非文中明確指出不是如此。因此，例如，提到“一種酶”包括多種這樣的酶，提到“一種氨基酸”指一種或多種氨基酸。
在本發(fā)明說明書和所附權利要求書中，除了由于表達語言或必需含義文中另有要求，術語“包含”用于包括性描述，即說明存在所屬特征，但不排除本發(fā)明各種實施方式中存在或加入了其它特征。
本文所用術語″對象″指患有需要用藥學活性物質治療的糖尿病的任何動物。對象可以是人，或者可以是家畜或伙伴動物。雖然具體考慮了本發(fā)明化合物適合用于人類的醫(yī)學治療，但其也可用于獸醫(yī)治療，包括治療伙伴動物如犬和貓，以及家畜如馬、牛和綿羊，或動物園動物如非人靈長動物、貓科動物、犬科動物、?？苿游锖陀刑泐悇游?。
本文所用術語“治療有效量”指能有效產生所需治療反應，如預防或治療易于通過給予藥學活性物質治療的疾病的本發(fā)明化合物的用量。
當然，具體的“治療有效量”因各種因素而變化，如所治療的具體疾病、對象的身體狀況和臨床史、所治療動物的類型、治療時間、并行治療(如果有)的特性以及所用具體制劑和化合物或其衍生物的結構。
治療組合物中的多肽濃度不重要，但應該是能有效治療糖尿病或者預防或延遲其發(fā)病的含量。在采用BTC-δ4多肽的所有方法中，本文所用術語″有效量″指足以以95％置信水平引起統(tǒng)計學顯著性反應(即僅由于概率引起的作用的p＜0.05)的量?？赏ㄟ^經驗，根據體外細胞對該多肽或含有該多肽的制劑的反應和實驗動物對該多肽或含有該多肽的制劑的反應來測定多肽用量。多肽用量應該足以在體內引發(fā)β-細胞分化、體內β-細胞質量增加、體內β-細胞功能下降減少和/或體內β-細胞胰島素分泌增加。平均來看，體重約75kg的患者的日劑量至少為0.001mg/kg，優(yōu)選0.01mg/kg，至約20mg/kg，優(yōu)選1mg/kg體重。
本文所用″藥物運載體″是用于將BTC-δ4和/或其它藥學活性物質遞送給對象的藥學上可接受的溶劑、懸浮劑、賦形劑或運載體。運載體可以是液體或固體，根據計劃給藥方式選擇。
本文所用術語“糖尿病”包括1型糖尿病和2型糖尿病，1型糖尿病也稱為胰島素-依賴性糖尿病(IDMM)，2型糖尿病也稱為非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)。
本發(fā)明的剪接變體稱為BTC-δ4，本文將編碼BTC-δ4的多核苷酸稱為BTC-δ4多核苷酸。提到BTC時所用術語“真正的”指178個氨基酸的全長或成熟的可溶性BTC蛋白。
術語“基本同源的序列”指功能上等效于本文所述的特定BTC-δ4序列的多肽，特別公開的多肽序列中包括取代、缺失或插入。
提到本發(fā)明多肽時術語“片段”、“類似物”、“變體”和“衍生物”指保留了與此多肽基本相同的生物功能或活性的分子。因此，類似物包括前蛋白(proprotein)，它可通過切割前蛋白部分產生有活性的成熟多肽而活化。
術語“片段”應明確理解為包括全長序列的任意大小的部分或結構域，只要該片段有功能活性。術語″序列的片段″或″序列的一部分″指所述原始序列的截短序列。截短序列(核酸或多肽序列)的長度可以不同，最小尺寸為足以提供至少具有與所述原始序列相當的功能和/或活性的序列的尺寸，而最大尺寸并不重要。在一些實施方式中，最大尺寸通常基本上不大于提供原始序列的所需活性和/或功能所需的尺寸。截短的氨基酸序列的長度一般至少約為5個氨基酸。然而更一般地，該序列的長度至少約為50個氨基酸，優(yōu)選至少約為60、80、100、120、150、200或220個氨基酸。片段序列可側接其它氨基酸，或可根據本領域技術人員已知方法進行修飾。修飾的蛋白質必須保留天然蛋白質的至少一種生物學活性。該片段可用于氧化或還原形式，或者與偶聯(lián)或保護基團聯(lián)用。例如，可將它們偶聯(lián)于運載體分子。
蛋白質“變體”包括圖4所示蛋白的同系物和含有能使該蛋白二級結構保持不變的保守取代的蛋白質。這種保守取代的例子包括疏水性、大小和電荷與原始的氨基酸殘基基本相同的氨基酸殘基。這種取代通常是蛋白質化學領域的技術人員熟知的。例如，保守取代包括脯氨酸取代甘氨酸，反之亦然；丙氨酸或纈氨酸取代甘氨酸，反之亦然；異亮氨酸取代亮氨酸，反之亦然；組氨酸取代賴氨酸，反之亦然；絲氨酸取代天冬酰胺，反之亦然；蘇氨酸取代半胱氨酸，反之亦然；絲氨酸或丙氨酸取代蘇氨酸，反之亦然；谷氨酰胺取代天冬酰胺，反之亦然；色氨酸取代酪氨酸，反之亦然；精氨酸取代谷氨酸，反之亦然。
術語蛋白質“衍生物”包括用20種天然產生氨基酸的天然產生或合成的氨基酸同系物取代了一個或數個氨基酸殘基的蛋白質。這種同系物的例子是4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、3-甲基組氨酸、高絲氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥基脯氨酸、甲狀腺素、γ-氨基丁酸、高絲氨酸、瓜氨酸等。
本文所用天然氨基酸殘基是蛋白質中常見的20種氨基酸殘基(即丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨酸和纈氨酸)，并且包括這些氨基酸的D形和L形。
本文所用合成氨基酸殘基包括在蛋白質中發(fā)現(xiàn)的、天然情況下發(fā)現(xiàn)的或合成產生的任何其它氨基酸殘基的D形和L形。合成氨基酸殘基包括但不限于β-丙氨酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥基脯氨酸、甲狀腺素、γ-氨基丁酸、高絲氨酸、瓜氨酸等。
在表示值的范圍時，應明確理解，此范圍包括該范圍的上下限以及上下限之間的所有值。
應明確理解，本發(fā)明不限于本文所述的具體材料和方法，因為它們可以改變。也應理解，本文使用術語的目的僅僅是描述具體實施方式
，不旨在限制本發(fā)明范圍，本發(fā)明范圍僅受所附權利要求書的限制。
除非另有說明，本發(fā)明采用本領域技術人員能夠使用的常規(guī)的化學、蛋白質化學、分子生物學和酶學技術。這些技術是本領域工作人員熟知的，并且在文獻中有詳細解釋。參見例如，Coligan、Dunn、Ploegh、Speicher和Wingfield《蛋白質科學中的現(xiàn)有技術》(Current protocols in Protein Science)(1999)第I卷和第II卷(JohnWiley和Sons Inc.)；Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis《分子克隆實驗室手冊》(MolecularCloningA Laboratory Manual)(2001)；Shuler，M.L.《生物過程工程基本概念》(Bioprocess EngineeringBasic Concepts)(第二版，Prentice-Hall International，1991)；Glazer，A.N.、DeLange，R.J.和Sigman，D.S.《蛋白質的化學修飾》(ChemicalModification of Proteins)(North Holland Publishing Company，阿姆斯特丹，1975)；Graves，D.J.、Martin，B.L.和Wang，J.H.《蛋白質的共翻譯和翻譯后修飾化學原理和生物效應》(Co-and post-translational modification of proteinschemical principles和biological effects)(Oxford University Press，1994)Lundblad，R.L.(1995)《蛋白質修飾技術》(Techniques in protein modification).CRC Press，Inc.美國佛羅里達州伯克萊屯；和Goding，J.W《單克隆抗體原理和實踐》(Monoclonal antibodiesprinciplesand practice)(Academic Press，紐約第三版。1996)。
本發(fā)明方法可包括(a)在給予第二種藥學活性物質之前、一起或之后給予BTC-δ4，以治療糖尿??；或(b)聯(lián)合給予BTC-δ4和第二種藥學活性物質，以治療糖尿病。
本文所用縮寫如下bp 堿基對BTC β動物纖維素CM 培養(yǎng)基DMEMDulbecco基礎必需培養(yǎng)基EGF 表皮生長因子
EIA 酶免疫試驗ELISA 酶聯(lián)免疫吸附實驗IDMM 胰島素依賴性糖尿病IGT 葡萄糖耐受受損LADA 成年人的潛伏性自身免疫糖尿病NIDMM 非胰島素依賴性糖尿病PCR 聚合酶鏈反應PP胰多肽PBS 磷酸鹽-緩沖鹽水RT-PCR逆轉錄酶PCRSD標準差SDS-PAGE 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳STZ 鏈脲霉素前驅糖尿病也稱為葡萄糖耐受受損(IGT)，影響著約四千一百萬美國人，它是2型糖尿病和心血管病的前兆。美國糖尿病協(xié)會(ADA)將前驅糖尿病定義為血糖水平高于正常值，但未高至診斷為2型糖尿病的水平的疾病。除了減少體重和增加鍛煉活動以外，正進行臨床試驗來檢測在前驅糖尿病進展為慢性疾病之前含有吡啶甲酸鉻的營養(yǎng)補充物的功效。
可能引起糖尿病或可能與糖尿病綜合征相關的基礎病癥包括代謝綜合征(高血壓、肥胖/超重和高膽固醇)、血色素沉著、慢性胰腺炎、多囊卵巢綜合征(PCOS)、類癌瘤綜合征、胰腺手術或外傷、垂體活性過高、腎上腺活性過高、胰功能不全、肢端肥大癥、庫欣氏綜合征、囊腫性纖維化、腺癌、生長抑制素瘤、醛甾酮瘤-誘導的低鉀血、嗜鉻細胞瘤、原發(fā)性醛固酮癥、沃爾弗臘姆綜合征、短妖精貌綜合征、Rabson-Mendenhall綜合征、僵人綜合征、自身免疫性淋巴增殖綜合征；高催乳素血癥；甲狀腺功能亢進；POEMS或Crow-Fukase綜合征(多神經病、器官巨大癥、內分泌病、M蛋白質和皮膚改變)；催乳素瘤；Kearns-Sayre綜合征；煙酸過量和2型多發(fā)性內分泌缺陷綜合征。
具體說，2型糖尿病的風險因素包括一種或多種IGT、2型糖尿病家族史、肥胖、高血壓、高膽固醇和久坐的生活方式。已知某些種族，具體是非洲人、西班牙人和墨西哥裔美國人、澳大利亞原住民和太平洋島國居民中2型糖尿病的發(fā)病率較高。也包括妊娠相關因素，因為之前有妊娠性糖尿病、流產、死產或分娩大嬰兒或有先天缺陷的嬰兒的病史都會伴有2型糖尿病發(fā)病率升高。
近來有報道稱，與沒有疾病的個體相比，1型糖尿病患者中稱為小泛素相關性修飾物(SUMO-4)的基因突變似乎更頻繁，在一些家族中此基因與1型糖尿病有關(Guo等，2004；Bohren等，2004)。
本領域熟知診斷糖尿病的方法。一般用兩種測試診斷人的糖尿病(1)禁食的血糖水平診斷糖尿病的“黃金標準”是禁食過夜(午夜后不攝入食物)后血糖水平高。至少兩次測定的值高于140mg/dl則可診斷為糖尿病。正常對象的禁食糖水平為70-110mg/dl。
口服葡萄糖耐受測試(OGTT)可在醫(yī)生辦公室或實驗室進行口服葡萄糖耐受測試。在葡萄糖刺激后3小時中測定5次血糖水平。對象在禁食狀態(tài)(除水外沒有其它的食物或飲料攝入至少10小時，但不長于16小時)開始測試。取初始血液樣品，然后給對象高葡萄糖的飲料(75克葡萄糖；妊娠婦女是100克)。然后在喝下高葡萄糖飲料后30分鐘、1小時、2小時和3小時再取血液樣品。在非糖尿病人中，葡萄糖刺激后血液中的葡萄糖水平升高，但其后迅速回到正常水平。在糖尿病患者中，葡萄糖刺激后葡萄糖水平升高到正常值以上，而回復到正常水平則要慢得多。
ErbB家族的哺乳動物配體包括EGF(Savage等，1972)、轉化生長因子-α(TGF-α)(Marquardt等，1984)、肝素結合的EGF樣生長因子(HB-EGF)(Higashiyama等，1991)、表皮調節(jié)素(Toyoda等，1995)、雙調蛋白(Shoyab等，1989)、神經-和胸腺-衍生的ErbB激酶激活物(NTAK)(Higashiyama等，1997)、神經調節(jié)蛋白(NRG)亞家族和β動物纖維素(BTC)(Shing等，1993)，其中神經調節(jié)蛋白(NRG)亞家族包括四種基因的產物(NRG1)(Marchionni等，1993)、NRG2(Chang等，1997；Carraway等，1997)、NRG3(Zhang等，1997)和NRG4(Harari等，1999)。
BTC-δ4多肽和其變體總地如PCT/AU01/00010所述，將其全部內容納入本文作參考。本領域可廣泛獲得產生多肽的合適方法。優(yōu)選采用重組DNA技術。
例如，BTC-δ4多核苷酸序列分離自MCF-7細胞。它含有編碼129個氨基酸的多肽的開放閱讀框。該多核苷酸序列與人BTC相同，除了開放閱讀框中缺失了147bp(編碼49個氨基酸)，導致缺少C5-C6二硫環(huán)，該二硫環(huán)通常存在于EGF結構域中(參見圖2B和3)。它的產生是人BTC基因外顯子之一的mRNA另路剪接(外顯子跳過)的結果。
BTC-δ4多核苷酸可獲自表達BTC-δ4編碼的mRNA的各種細胞來源。本發(fā)明人鑒定了BTC-δ4多核苷酸的許多合適的人細胞來源，包括但不限于腎、肝、胰和各種乳腺癌細胞系如MCF-7。
例如，編碼BTC-δ4多肽的多核苷酸可獲自從細胞來源分離和純化的RNA克隆的cDNA?？捎帽绢I域熟知的技術制備克隆的cDNA文庫，可用與BTC基因任何部分基本互補的核苷酸探針篩選該文庫中的BTC-δ4編碼的DNA。也可利用各種PCR克隆技術獲得本發(fā)明的BTC-δ4多核苷酸。
因此，可利用寡核苷酸引物用PCR獲得編碼本發(fā)明BTC-δ4多肽的多核苷酸，所述引物包含編碼BTC基因一部分的多核苷酸序列。該引物優(yōu)選包含最末端的5′和3′編碼區(qū)。該寡核苷酸引物更優(yōu)選具有以下序列，或與以下序列基本同源的序列5′GAGCGGGGTTGATGGACCGG 3′(SEQ ID NO1)5′TTAAGCAATATTTGTCTCTTC 3′(SEQ ID NO2)用本發(fā)明載體，如克隆載體或表達載體轉化或轉染宿主細胞。本領域技術人員可以同樣良好地利用各種表達載體/宿主系統(tǒng)來重組表達BTC-δ4多肽。這種系統(tǒng)包括但不限于微生物如用包含所需BTC-δ4多核苷酸編碼序列的重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表達載體轉化的細菌；用包含所需BTC-δ4多核苷酸編碼序列的重組酵母表達載體轉化的酵母；用包含所需BTC-δ4多核苷酸編碼序列的重組病毒表達載體(如桿狀病毒)轉染的昆蟲細胞系統(tǒng)；或用包含所需BTC-δ4多核苷酸編碼序列的合適的哺乳動物表達載體轉染的動物細胞系統(tǒng)。
可用各種方法將合適的DNA序列插入載體。通常，用本領域技術人員熟知的方法將DNA序列插入合適的限制性核酸內切酶位點。
插入表達載體的DNA序列操作性連接于表達控制序列(啟動子)，以指導mRNA合成。根據所用的宿主/載體系統(tǒng)，可采用任何合適的轉錄/翻譯元件。例如，用原核細胞如大腸桿菌(E.coli)克隆時，可采用trc或T7啟動子；用哺乳動物表達系統(tǒng)克隆時，可采用分離自哺乳動物細胞基因組的啟動子(如小鼠金屬硫蛋白啟動子)或分離自這些細胞中生長的病毒的啟動子(如人巨細胞病毒立即早期(CMV)啟動子)。也可利用重組DNA或合成技術產生的啟動子轉錄插入序列。表達載體也含有用于啟動翻譯的核糖體結合位點和轉錄終止子。也需要特異性啟動信號來有效翻譯插入的編碼序列。這些信號包括ATG啟動密碼子和相鄰序列。在將整個BTC-δ4編碼序列(包括其自身的啟動密碼子和相鄰序列)插入合適的表達載體的情況下，不需要額外的翻譯控制信號。然而，在僅插入一部分BTC-δ4編碼序列的情況下，必須提供外源性翻譯控制信號，包括ATG啟動密碼子。
而且，啟動密碼子必須與BTC-δ4編碼序列的閱讀框同相，以保證整個插入物的翻譯。這些異源翻譯控制信號和啟動密碼子可以是各種來源的，包括天然和合成來源?？赏ㄟ^包含轉錄衰減序列、增強子元件等提高表達效率。
此外，表達載體優(yōu)選包含一個或多個可選擇標記基因，以提供用于選擇轉化或轉染的宿主細胞的表型特征，如真核細胞的新霉素(G418)抗性，或原核細胞如大腸桿菌的氨芐青霉素抗性。
可用含有本發(fā)明DNA分子的載體，以及合適的啟動子或控制序列轉化或轉染合適的宿主，使該宿主表達該蛋白。
合適宿主的代表性例子包括但不限于細菌細胞，如大腸桿菌；昆蟲細胞如果蠅(Drosophila)和Sf9；以及動物細胞如CHO、COS或293細胞。
可以常規(guī)方式用宿主細胞中的構建物產生重組序列編碼的基因產物?；蛘?，可用常規(guī)的肽合成儀以合成方法產生本發(fā)明多肽。
可用各種方法從重組細胞培養(yǎng)物中回收和純化上述各種不同載體/宿主表達系統(tǒng)產生的本發(fā)明多肽，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用色譜、親和色譜、羥基磷灰石色譜和反相高效液相色譜(HPLC)。如果需要，在完成所需多肽構型中可采用蛋白質再折疊步驟。
該多肽可以是純化產物、分離自組織或細胞來源、化學合成步驟的產物、或通過重組技術用原核或真核宿主產生的產物。根據重組產生步驟中所用的宿主，本發(fā)明多肽可以是糖基化或非糖基化的。
可獲得使本領域技術人員能夠鑒定用于本發(fā)明的、序列與BTC-δ4或BTC-δ4的類似物、片段、突變體、衍生物或等位基因變體基本同源的多肽的方法，例如，通過評價該多肽在體外誘導胰細胞系分化的能力，或評價降低糖尿病動物模型的糖尿病癥狀嚴重程度的能力。
用于本發(fā)明的BTC-δ4的類似物、片段、突變體、衍生物或等位基因變體優(yōu)選具有以下體外生物學特性(1)采用實施例5所述方法時，該多肽不取代人肺成纖維細胞(AG2804)的ErbB1或ErbB4受體上放射性標記的成熟BTC。
(2)采用實施例5所述方法時，該多肽不誘導人肺成纖維細胞(AG2804)的ErbB1或ErbB4受體的酪氨酸磷酸化。
(3)采用實施例6所述方法時，該多肽就像真正的BTC那樣，與活化素A一起刺激AR42J-B20細胞分化，但與真正的成熟BTC相比，該多肽促進細胞存活的能力差得多。
可用含有常規(guī)無毒的藥學上可接受的運載體、佐劑和載體的劑量單位劑型以口服、直腸、胃腸道外或吸入途徑給予本發(fā)明化合物。本文所用術語胃腸道外包括皮下、靜脈內、肌肉內、胸內、顱內、注射或輸注技術。
本發(fā)明也提供了合適的局部、口服、氣霧劑和胃腸道外藥物劑型，用于本發(fā)明治療的新方法?？诜o予的本發(fā)明化合物可以是片劑、水性或油性懸浮劑、錠劑、藥片、粉末劑、顆粒劑、乳劑、膠囊、糖漿或酏劑?？诜媒M合物可含有選自下組的一種或多種物質甜味劑、調味劑、著色劑和防腐劑，目的是產生藥學上精致和美味的制劑。片劑含有活性成分，混有無毒的藥學上可接受的賦形劑，該賦形劑適用于生產片劑。
這些賦形劑可以是(例如)惰性稀釋劑，如碳酸鈣、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；成粒劑和崩解劑，如玉米淀粉或藻酸；粘合劑，如淀粉、明膠或阿拉伯樹膠；或潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。片劑可以是不包衣的，或者可以是用已知技術包衣的，以延遲在胃腸道中的崩解和吸收，從而在較長時間內提供緩釋作用。例如，可采用延時物質如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。也可用美國專利號4,256,108；4,160,452和4,265,874所述技術進行包衣，以形成用于控釋的等滲治療片劑。
可在胃腸道外通過注射或逐步灌注單獨或一起給予用于本發(fā)明方法的BTC-δ4以及藥學活性物質。給藥可以是靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、腔內或透皮給藥。在體外研究中，可將藥物加入或溶解于合適的生物學可接受的緩沖液并加入細胞或組織。
胃腸道外給藥的制劑包括無菌水性或非水性溶液、懸液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油和可注射的有機酯如油酸乙酯。水性運載體包括水、醇溶液/水溶液、乳劑或懸液，包括鹽水和緩沖培養(yǎng)基。胃腸道外載體包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉，乳酸化的林格氏靜脈內載體包括液體和營養(yǎng)補充物、電解質補充物，如基于林格氏右旋糖的補充物等。也可以存在防腐劑和其它添加劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、生長因子和惰性氣體等。
通常，本文所用術語″治療″等指影響對象、組織或細胞以獲得所需藥理和/或生理作用。該作用可以是預防性的，即完全或部分預防疾病或者其病征或癥狀，和/或可以是治療性的，即部分或完全治愈疾病。本文所用術語″治療″覆蓋了脊椎動物、哺乳動物，特別是人的疾病的任何治療或預防，包括預防可能傾向于發(fā)生疾病但仍未診斷患有此病的對象發(fā)生該疾??；抑制該疾病，即阻滯其發(fā)展；或者緩解或改善該疾病的效應，即引起疾病效應減退。
本發(fā)明包括用于改善疾病的各種藥物組合物的應用。通過將BTC-δ4，其類似物、衍生物或鹽以及一種或多種藥學活性物質或BTC-δ4和一種或多種藥學活性物質的組合合并為適合用運載體、賦形劑和添加劑或輔劑給予對象的形式，來制備本發(fā)明一種實施方式的藥物組合物。
常用的運載體或輔劑包括碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露醇和其它糖、滑石粉、牛乳蛋白質、明膠、淀粉、維生素、纖維素和其衍生物、動物和植物油、聚乙二醇和溶劑，如無菌水、醇、甘油和多元醇。靜脈內載體包括液體和營養(yǎng)補充物。防腐劑包括抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體。其它藥學上可接受的運載體包括水溶液、無毒賦形劑包括鹽、防腐劑、緩沖液等，如《《雷明頓藥物科學》(Remington′sPharmaceutical Sciences)，第20版，Williams和Wilkins(2000)和《英國國家藥典》(TheBritish National Formulary) 第43版，(British Medical Association and RoyalPharmaceutical Society of Great Britain，2002；http://bnf.rhn.net)所述，將其內容納入本文作參考。根據本領域常規(guī)技術調整藥物組合物的各種組分的pH和準確濃度。參見Goodman和Gilman的《治療的藥理基礎》(The Pharmacological Basis forTherapeutics)(第7版，1985)。
優(yōu)選以劑量單位的形式制備和給予藥物組合物。固體劑量單位包括片劑、膠囊和栓劑。在對象治療中，根據化合物活性、給藥方式、疾病的特性和嚴重程度、對象的年齡和體重，可采用不同的日劑量。然而在某些情況下，較高或較低的日劑量可能是合適的?？赏ㄟ^單次給予單個劑量單位或幾個較小劑量單位的形式，也可通過以特定間隔多次給予分開的劑量來給予日劑量。
可局部或全身給予治療有效劑量的本發(fā)明藥物組合物。當然，達到此目的的有效用量取決于疾病的嚴重程度以及對象的體重和總體狀況。一般地，體外所用劑量可為藥物組合物原位給藥的用量提供有用指導，可用動物模型確定治療細胞毒性副作用的有效劑量。例如，Langer，Science，2491527，(1990)中描述了各種考慮?？诜┬涂梢允怯裁髂z膠囊的形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑，如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合。它們也可以是軟明膠膠囊的形式，其中活性成分與水或油性介質，如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。
水性懸液通常含有活性物質，混有適合生產水性懸液的賦形劑。這種賦形劑可以是懸浮劑，如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃芪樹膠和阿拉伯樹膠；分散劑或濕潤劑，可以是(a)天然產生的磷脂如卵磷脂；(b)烯化氧與脂肪酸的縮合產物，例如，聚氧乙烯硬脂酸酯；(c)環(huán)氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合產物，例如，十七碳乙烯氧基十六烷醇；(d)環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產物，如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或(e)環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產物，如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。
藥物組合物可以是無菌可注射水性或油性懸液的形式。可根據已知方法用合適的分散劑或濕潤劑以及如上所述的懸浮劑配制此懸液。無菌注射劑也可以是無毒的胃腸道外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸液，如1，3-丁二醇的溶液?？刹捎玫目山邮艿妮d體和溶劑是水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的不揮發(fā)性油通常用作溶劑或懸浮介質。因此，可采用任何無刺激性不揮發(fā)性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸可用于制備注射劑。
也可以在脂質體遞送系統(tǒng)的形式，如小單層囊泡、大單層囊泡和多層囊泡中給予本發(fā)明化合物?？捎筛鞣N磷脂，如膽固醇、十八烷胺硬脂胺或磷脂酰膽堿形成脂質體。
BTC-δ4的劑量水平通常約在每千克體重0.5mg-20mg的數量級，優(yōu)選的劑量范圍是每千克體重每天約0.5mg-10mg(每患者每天約0.5g-3g)?？膳c運載體材料組合以產生單一劑量的活性成分的用量將因所治療宿主和具體的給藥方式而改變。例如，用于人口服給藥的制劑可含有約5mg-1g活性化合物與合適和方便量的運載體材料，運載體材料可約占總組合物的5-95％。劑量單位形式通常含有約5mg-500mg的活性成分。
然而應理解，用于具體患者的特定劑量水平取決于各種因素，包括所用特定化合物的活性、年齡、體重、健康狀況、性別、飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄率、藥物組合和進行治療的具體疾病的嚴重程度。
此外，本發(fā)明多肽可與其它化合物組合，以提供操作性組合。旨在包括藥學活性物質的任何化學相容性組合，只要該組合不消除BTC-δ4的活性。
測定BTC-δ4功效的體外模型AR42J-B20細胞的分化胰AR42J細胞衍生自化學誘導的胰腫瘤，表達外分泌和神經內分泌的特性(Rosewicz等，1992)。用活化素A處理后，AR42J-B20細胞停止生長，其形態(tài)顯著改變(神經突延伸)。此外，活化素-處理的細胞表達編碼GLUT2、ATP-敏感性K+通道和胰多肽(PP)的mRNA。因此，活化素A將AR42J細胞轉變?yōu)閮确置诩毎?br> 用BTC-δ4和活化素A處理這些細胞能將它們進一步轉化為產生胰島素的細胞?？稍诳挂葝u素抗體染色細胞后用免疫熒光法測定響應于BTC-δ4而產生的胰島素。或者，可用AR42J克隆AR1898-0192定量測定AR42J細胞向胰島素分泌細胞的轉化。此克隆含有分泌型堿性磷酸酶(SEAP)基因，它位于大鼠胰島素II基因啟動子下游。用BTC-δ4刺激這些細胞導致堿性磷酸酶的合成和分泌入培養(yǎng)基，可用酶學方法測定。
永生化的上皮細胞系胰前體細胞系分離自攜帶溫度敏感型SV40 T抗原的轉基因小鼠(“永生化小鼠(immortomice)”)的胰導管(Sharma等，2001)。當在33℃培養(yǎng)這些小鼠的細胞時，表達SV40 T抗原，細胞變成條件性永生化細胞；然而在37℃，T抗原表達被關閉，細胞適當地分化。因此，這些細胞在33℃培養(yǎng)時不顯示出島/神經內分泌顆粒，不能表達島標記。然而，在37℃培養(yǎng)約2周后，約50％的細胞死亡時，其余細胞開始分化為顯示出原始的島樣胰島素和胰高血糖素顆粒的細胞。移植到裸小鼠的腎囊下時，在兩種溫度下培養(yǎng)的細胞都發(fā)展出導管樣和島樣表型。
將此細胞系用于快速靈敏的試驗(與上述試驗相似)，以測定胰島素表達和β-細胞分化。在這種情況下，用大鼠胰島素1啟動子驅動綠色熒光蛋白(GFP)受體的表達。這種細胞系提供了非常靈敏的方法，通過測定活細胞中的GFP熒光鑒定β-細胞分化因子如BTC-δ4，所述β-細胞分化因子刺激β-細胞特異性基因如胰島素的表達。
2型糖尿病的體內模型除鏈脲霉素(STZ)模型(參見實施例7)以外，2型糖尿病的許多其它動物模型均可用于測試BTC-δ4的體內活性。這些模型包括手術如大鼠的胰切除術產生的2型糖尿病模型(Bonner-Weir等，1983)和基于選擇性飼喂的遺傳模型。遺傳模型包括Goto-Kakizaki(GK)大鼠、自發(fā)性糖尿病Torii(SDT)大鼠、Otsuka-Long-Evans-Tokushima肥胖(OLETF)大鼠、db/db小鼠和NOD/Ltj小鼠。
Goto-Kakizaki(GK)大鼠顯示出與人糖尿病所見相似的代謝、激素和血管疾病。不像2型糖尿病的許多其它嚙齒類模型，GK大鼠并不肥胖。Goto-Kakizaki大鼠的特征包括禁食高血糖癥，在體內和分離的胰細胞中響應于葡萄糖的胰島素分泌受損，以及肝和外周的胰島素抗性。文獻中已經描述了晚期并發(fā)癥如視網膜病、微血管病、神經病和腎病。
在自發(fā)性糖尿病Torii(SDT)大鼠模型中，14周齡后雄性大鼠自發(fā)地發(fā)生葡萄糖不耐受，同時胰島素分泌受損；20周齡后發(fā)生伴有顯著高血糖癥和顯著低胰島素血癥的糖尿病。糖尿病Long-Evans大鼠的特征是18周齡后發(fā)生中度肥胖和晚期發(fā)病的高血糖癥，以及與慢性糖尿病相關的并發(fā)癥。雖然通過遺傳分析鑒定了多個基因座，但這些大鼠中引起糖尿病的原因似乎是胰島素抗性和胰島素分泌受損的組合，類似人類的2型糖尿病。Otsuka-Long-Evans-Tokushima肥胖(OLETF)大鼠衍生自胰島素抗性和胰島素分泌受損的自發(fā)組合，類似人類的2型糖尿病。在這些大鼠中，胰島素敏感性隨衰老而降低，即與周齡匹配的對照Long-Evans Tokushima Otsuka(LETO)大鼠相比，在6周齡時正常，而在12周齡時降低40％，18周齡后降低80％。胰島素分泌在40周齡時受損(14)，對島β-細胞的脂毒性(lipotoxicity)可能參與了甘油三酯過高的OLETF大鼠的島功能障礙發(fā)病。此外，與LETO大鼠相比，OLETF大鼠的胰β-細胞的再生能力降低(17)。因為糖尿病的慢性進行性形式，OLETF大鼠適用于研究前驅糖尿病期間的病理生理學改變。
db/db小鼠的瘦激素(leptin)受體基因中攜帶點突變，出生后8-10周自發(fā)性發(fā)生血糖水平升高和胰β細胞耗減。約4周齡時這些小鼠也變得顯著肥胖。
NOD/Ltj小鼠的特征是胰島炎，胰島的白細胞浸潤。約為12周齡的雌性，胰臟的胰島素含量顯著降低，雄性再過數周發(fā)生這種現(xiàn)象。糖尿病發(fā)病的標志是中度糖尿和未禁食的血漿葡萄糖高于250mg/dl。糖尿病NOD/Ltj小鼠的胰島素分泌過少且血糖過多，這表明胰島β細胞被選擇性破壞。NOD/LtJ小鼠對IDDM的易感性是多基因性的，環(huán)境，包括飼養(yǎng)條件、健康狀況和飲食對外顯率具有強烈的影響。NOD/LtJ雌性比雄性的應用更廣泛，因為IDDM癥狀的發(fā)生更早且發(fā)病率更高(30周齡時90-100％)。30-40周齡時NOD/LtJ雄性發(fā)生IDDM的頻率是40-60％。雄性小鼠可用于某些應用，包括藥物研究、IDDM的″加速轉移″和一些體外研究。NOD小鼠的糖尿病易感性的主要組分是獨特的MHC單倍型(H2g7＝Kd、Aad、Abg7、Enull、Db)。NOD小鼠也展現(xiàn)多種異常的免疫表型，包括抗原遞呈細胞免疫調節(jié)功能缺陷、T淋巴細胞庫的調節(jié)缺陷、NK細胞功能缺陷、巨噬細胞產生細胞因子的缺陷(Fan等，2004)和傷口愈合受損。它們也缺少α溶血補體組分C5。NOD/LtJ小鼠的聽力也嚴重受損。已將引起免疫缺陷的各種突變、細胞因子基因靶向突變和影響免疫功能的轉基因回交到NOD/Lt近交株背景中。
本領域技術人員可獲得的測試本發(fā)明推定多肽以用于本發(fā)明的其它合適方法包括采用上述2型糖尿病的體內模型、測試β-細胞再生、改善葡萄糖不耐受和改進血糖(禁食血清葡萄糖)的控制、當血糖水平升高時刺激胰島素分泌和抑制胰高血糖素分泌，低血糖和測定β-細胞功能標志的改善如靜脈內葡萄糖耐受測試、精氨酸刺激和高血糖鉗。這些試驗也可應用于人類臨床試驗。
下面將通過參照以下非限制性實施例和附圖的方式詳細描述本發(fā)明。
實施例1用RT-PCR檢測BTC-δ4并克隆入pBluescript II SK用Rneasy小抽試劑盒按照廠商說明書(Qiagen，Clifton Hill，Vic.，Australia)分離70-80％匯合的MCF-7細胞和人乳房皮膚成纖維細胞的總RNA。由乳房復位術中獲得的一塊皮膚制備正常的人乳房皮膚成纖維細胞。用補充有10％胎牛血清和青霉素-鏈霉素硫酸鹽的DMEM將該皮膚作為外植體培養(yǎng)5天，直到成纖維細胞長成單層。然后，按照廠商說明書用Superscript II酶、寡聚dT引物(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)將總RNA(2μg)逆轉錄為cDNA。用PCR以正義引物和反義引物擴增對應于人BTC-β的cDNA。
正義引物為(5′CTCGTCGACGAGCGGGGTTGATGGACCGG-3′)(SEQ ID NO3)反義引物為(5′CTCCTGCAGTTAAGCAATATTTGTCTCTTC-3′)(SEQ ID NO4)。
下面劃線的核苷酸對應于SalI(正義引物)和PstI(反義引物)限制性位點。用50μl60mM Tris-SO4、18mM(NH4)2SO4、1.5mM MgSO4(pH9.1)、0.2mM dNTP、200ng各引物、1U eLONGase(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)和1μl cDNA進行PCR。一開始在94℃孵育3分鐘后，進行35個下述循環(huán)94℃ 1分鐘，50℃ 1分鐘，68℃ 1分鐘，最后在68℃延伸4分鐘。用2％瓊脂糖凝膠分離416bp BTC-δ4 PCR產物，用溴乙錠染色后在紫外燈下觀察。PCR標記(Promega，Madison，WI)用作分子大小標準，結果見圖1A。電泳后，通過0.4M NaOH將凝膠Southern轉移到帶正電的尼龍膜(Roche，Castle Hill，NSW，Australia)上。在預雜交緩沖液(5×SSC，5×Denhardt，0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)和50μg/ml鮭精DNA)中55℃孵育該印跡2小時，在含有用Gigaprime試劑盒(Geneworks，Adelaide，Australia)以隨機引物法產生的32P-dCTP-標記的人BTC cDNA探針(D32-Y111)的相同緩沖液中雜交16小時。用2×SSC，0.1％SDS室溫下洗滌5分鐘兩次，然后用0.5×SSC，0.1％SDS在55℃再洗滌15分鐘兩次。然后在-80℃用該印跡曝光Kodak XAR X-線膠片，結果見圖1B。
通過以下方法克隆并測序BTC和BTC-δ4 PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳分離產物，用Concert試劑盒(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)進行凝膠抽提后，回收片段。然后用SalI和PstI消化純化的PCR產物，并亞克隆入SalI/PstI-消化的pBluescript IISK(Strategene，La Jolla，CA)，產生pBlue-BTC和pBlue-BTC-δ4，并引入大腸桿菌JM109。擴增重組質粒并用雙脫氧核苷酸鏈末端法測序，測序采用含有M13 T7和T3啟動子引物的Thermosequenase循環(huán)測序試劑盒(Amersham-Pharmacia Biotech，澳大利亞悉尼)。在兩個方向上測序PCR產物，以驗證序列；對兩個獨立克隆進行兩次測序，結果見圖2A和B。
實施例2用大腸桿菌表達和純化重組BTC和BTC-δ4為了表征BTC-δ4的生物學活性，我們將相應的cDNA(Asp32-Ala129；無信號肽)克隆入pET-32a表達載體，在大腸桿菌BL21trxB(DE3)中將該蛋白表達為硫氧還蛋白融合物。此菌株的硫氧還蛋白還原酶缺陷，能夠在胞質中形成二硫鍵。所用構建物的示意圖見圖5A。在細菌表達載體pET3.2a中BTC(Asp32-Tyr111)或全長BTC-δ4(Asp32-Ala129，減去疏水信號肽Met1-Ala31)的成熟形式表達為硫氧還蛋白融合蛋白。將pET3.2a-BTC和pET3.2a-BTC-δ4構建物轉化入大腸桿菌菌株BL21(DE3)，IPTG誘導后表達蛋白。誘導后，收集細胞并裂解，用Ni-NTA瓊脂糖和RP-HPLC純化BTC或BTC-δ4。表達后，裂解細胞，用Ni-NTA瓊脂糖純化融合蛋白。用腸激酶切割純化的硫氧還蛋白融合蛋白，以釋放BTC-δ4，用反相HPLC純化BTC-δ4至均一。
通過PCR以pBlue-BTC-δ4(Dunbar等，2000)為模板用以下引物組擴增BTC-δ432-129的開放閱讀框序列5′-CGTCCATGGCTGATGGGAATTCCACCAGAAGT-3′(SEQ ID NO5)(正義)和5′-CGTCTCGAGTCATTAAGCAATATTTGTCTCTTC-3′(SEQ ID NO6)(反義)。將NcoI和XhoI識別位點(下劃線)分別連接于正義和反義引物。也用pET系統(tǒng)表達并純化BTC的氨基酸32-111(BTC32-111)，作為陽性對照，如上所述(Seno等，1996)，或用質粒pET32a產生為硫氧還蛋白融合蛋白。在此構建物中，通過PCR以pBlue-BTC-δ4(Dunbar和Goddard，2000)為模板用以下引物組擴增BTC32-111的ORF序列5′-CGTCCATGGCTGATGGGAATTCCACCAGAAGT-3′(SEQID NO7)(正義)和5′CGTCTCGAGTCAGTAAAACAAGTCAACTGT-3′(SEQ ID NO8)(反義)。也將NcoI和XhoI識別位點(下劃線)分別連接于正義和反義引物。擴增后，用NcoI/XhoI消化PCR產物，并克隆入NcoI/XhoI消化的pET32a載體，如上所述。用大腸桿菌JM109維持得到的質粒pETBTC-δ432-129和pETBTC32-111，轉化入大腸桿菌BL21trxB(DE3)細胞進行表達。為了在BL21trxB(DE3)細胞中表達BTC或BTC-δ4，將單菌落接種到50ml培養(yǎng)物中，用LB培養(yǎng)基(補充有50μg/ml氨芐青霉素和15μg/ml卡那霉素)37℃培養(yǎng)過夜，不斷振蕩。然后，用10ml此過夜培養(yǎng)物接種200ml新鮮的LB培養(yǎng)基。在37℃培養(yǎng)細胞至OD600nm為0.4-0.5，然后用IPTG(1mmol/l)誘導，3小時后離心沉淀(4000rpm，4℃，10分鐘)，純化前貯存于-80℃。
為了純化表達為融合蛋白的BTC或BTC-δ4，在冰上融化冷凍的細胞沉淀，重懸于含有溶菌酶(100μg/ml)的18ml BugBuster蛋白質抽提試劑，室溫下溫和振蕩孵育10分鐘。孵育后，超聲處理(3×5秒脈沖)細胞裂解物以降低粘度，離心使其澄清(20分鐘，16000rpm，10分鐘)。離心后，將澄清的細胞裂解物調整到10mmol/l咪唑中，與6ml Ni-NTA瓊脂糖一起孵育，在50mmol/lNaH2PO4、0.3mol/l NaCl、10mmol/l咪唑(pH8.0)中4℃預平衡1小時，溫和振蕩。孵育后，離心樹脂(5分鐘，15000rpm，4℃)，去除上清，通過懸浮于50mmol/l NaH2PO4、0.3mol/l NaCl、40mmol/l咪唑(pH8.0)洗滌樹脂。連續(xù)進行三次上述洗滌后，通過在12ml 50mmol/l NaH2PO4、0.3mol/l NaCl、250mmol/l咪唑(pH8.0)中孵育樹脂15分鐘洗脫蛋白質。得到的上清中含有BTC或BTC-δ4，然后更換幾次腸激酶切割緩沖液(50mmol/l Tris-Cl，1mmol/lCaCl2，0.1％吐溫-20，pH7.4)透析此上清過夜(Spectra/Por，3.5kDa MWCO，SpectrumLaboratories)。為了去除BTC或BTC-δ4的硫氧還蛋白融合伴侶，加入腸激酶，使終濃度為0.1單位/20μg蛋白質，并在37℃溫和混合地孵育過夜。通過上述Ni-NTA瓊脂糖親和色譜進一步分離BTC或BTC-δ4與硫氧還蛋白融合伴侶。在這種情況下，在樹脂上捕獲切割的硫氧還蛋白融合伴侶，BTC或BTC-δ4富集于流過組分中。用反相HPLC進一步純化流過組分中存在的BTC或BTC-δ4。簡要說，用0.1％TFA1∶4(v/v)地稀釋Ni-NTA瓊脂糖流過組分，將其施加于C4 Prep-Pak反相HPLC柱(25mm×100 mm；300，15μm；Millipore-Waters)，流速為10ml/分鐘。用0.1％TFA洗滌該柱，直到OD214nm回到基線，然后用150分鐘在0.08％TFA的存在下以8-80％梯度(v/v)的乙腈洗脫該柱，流速為10ml/分鐘。收集20ml組分，用SDS-PAGE和山羊抗人BTC胞外域(Asp32-Tyr111)抗體的Western印跡分析各等分(50μl)，以鑒定含有純BTC或BTC-δ4的組分。集合含有BTC或BTC-δ4的組分，用分析RP-HPLC、電子噴霧離子化質譜和SDS-PAGE分析純度。用40分鐘通過Brownlee aquapore C4RP-HPLC柱(2.1×100mm)(Alltech)以8-80％線性梯度(v/v)的乙腈和0.08％TFA進行分析RP-HPLC，流速為0.5ml/分鐘。結果見圖5B。
電子噴霧離子化質譜測定的重組BTC和BTC-δ4的分子質量分別為9211.35±0.29Da和11450.26±0.23Da，與9249和11452Da的計算理論質量(數據未顯示)一致。SDS-PAGE和銀染后，獲得約為9kDa和11.5kDa的單一條帶，它們對應于還原或非還原條件下檢測到的BTC和BTC-δ4。通過N-末端序列分析(5個循環(huán))進一步驗證了BTC和BTC-δ4的純度，該分析給出預計的N-末端序列，純度約＞95％。
或者，將BTC-δ432-129(含有起始甲硫氨酸殘基)克隆入表達載體pET3b，重組蛋白溶解，從包含體再折疊，用陽離子交換柱和凝膠過濾柱色譜純化，如前所述(Maeda等，2002)。本研究中制備的所有重組蛋白都被凍干并儲存于-80℃待用。
實施例3構建用于哺乳動物表達的BTC-δ4表達質粒將全長BTC-δ4(1-129)克隆入載體pcDNA3.1(Invitrogen)，產生用于哺乳動物產生BTC-β(如下所述)的表達載體。簡要說，用ApaI和BamHI消化實施例1的pBlue-BTC-δ4，瓊脂糖凝膠電泳后純化釋放的插入物。然后將消化和純化的插入物克隆入ApaI/BamHI-消化的pcDNA3.1中，轉化到大腸桿菌TOP10細胞(Invitrogen)中后鑒定重組克隆。為了產生“Flag-標記的”pcDNA3.1-BTC-δ4構建物(其中Flag表位DYKDDDDK插入氨基酸S35-T36之間，如圖3所示)，將pBlue-BTC-δ4用作PCR模板，采用以下引物5′-CTCGGGAATTCC TCCTGAA-3′(SEQ ID NO9)(正義；下劃線的核苷酸對應于EcoRI限制性位點；雙下劃線的核苷酸編碼FLAG表位標簽)和5′-CTCCTGCAGTTAAGCAATATTTGTCTCTTC-3′(SEO ID NO10)(反義；下劃線的核苷酸對應于PstI限制性位點)。純化得到的PCR產物，用EcoRI和PstI消化并克隆入EcoRI/Pst1-消化的pBlue-BTC-δ4中。然后，用ApaI/BamH1消化得到的Flag-標記的pBlue-BTC-δ4構建物，并克隆入ApaI/BamH1-消化的pcDNA3.1，產生pcDNA3.1-FLAG-BTC-δ4。
實施例4在COS-7細胞中表達和分析BTC和BTC-δ4 FLAG-標記的構建物正如EGF家族的其它成員，BTC合成為跨膜-錨定的前體蛋白(pro-BTC)，它經蛋白質水解切割后可產生含EGF-基序(Asp32-Tyr111)的可溶性BTC。保留了疏水性信號肽和不存在跨膜結構域說明，BTC-δ4可能是分泌蛋白。為了檢驗此推論，工程改造BTC或BTC-δ4的完整開放閱讀框，以在氨基酸Ser35和Thr36之間額外摻入了FLAG表位，用于如實施例3所述的后續(xù)檢測，將此開放閱讀框克隆入表達載體pcDNA3.1，瞬時轉染COS-7細胞后監(jiān)測分泌。轉染72小時后，收集培養(yǎng)物上清和細胞裂解物，并用ELISA和Western印跡分析分泌的和與細胞相連的BTC-FLAG和BTC-δ4-FLAG的存在。
在pcDNA3.1-FLAG-BTC-δ4和pcDNA3.1-FLAG-BTC的瞬時轉染中，用DMEM/10％FBS將COS-7細胞接種到12孔板中，密度為2×105細胞/孔。孵育過夜后，用Lipofectamine 2000和Optimem-1培養(yǎng)基(均來自Invitrogen)按照生產商說明書以2μg構建物DNA轉染細胞。12小時后，洗滌細胞兩次，補充新鮮的Optimem-1培養(yǎng)基。轉染72小時后，收集培養(yǎng)基(CM)，制備細胞裂解物。通過離心使CM澄清，用抗FLAG-M2抗體(Sigma)的ELISA或Western印跡分析培養(yǎng)基中BTC或BTC-δ4的存在。用抗FLAG-M2抗體的Western印跡分析細胞裂解物中存在的BTC或BTC-δ4。去除CM后用PBS洗滌細胞兩次，然后用SDS-PAGE的樣品緩沖液直接裂解細胞并加熱到95℃5分鐘，從而制備細胞裂解物。
在CM的ELISA分析中，將90μl CM與10μl 10×包被緩沖液(0.15mol/l Na2CO3，0.35mol/l NaHCO3，pH9.3)混合，加入96孔免疫吸附板中。板在4℃包被過夜，然后用PBS/0.1％吐溫(PBS-T)中的2％BSA封閉。用PBS-T洗板4次，然后與PBS-T(2.5μg/ml)稀釋的抗-FLAG抗體一起在37℃孵育1小時。孵育后，如上所述洗板，與PBS-T稀釋的HRP-偶聯(lián)的綿羊抗-小鼠抗體(1∶2000)一起孵育(HRP-偶聯(lián)的綿羊抗-小鼠抗體來自Silenus Laboratories)。然后用PBS-T洗板4次，用鄰苯二胺(OPD)底物發(fā)色，用2mol/l H2SO4終止。在490nm讀出吸光度。結果表示為三次重復測定的平均值±標準差(SD)。為了用ELISA分析細胞表面上BTC或BTC-δ4的存在，去除CM，用PBS洗滌細胞3次。然后用4％多聚甲醛固定細胞，用抗-FLAG M2抗體染色，如上所述。
在用抗-FLAG M2抗體進行的Western印跡分析中，用SDS-PAGE(10-20％Tris-Tricine凝膠)分辨CM或細胞裂解物。然后將蛋白質轉移到硝酸纖維素(Hybond-Cextra；Amersham)上，用小鼠抗-FLAG M2抗體(2.5μg/ml)、隨后用HRP-偶聯(lián)的綿羊抗-小鼠抗體(1∶10000)檢測膜。用Supersignal West Dura Extended Duration Substrate(Pierce)觀察HRP-標記的蛋白質。
圖6中小結了結果。如圖6A和B所示，用Western印跡(～14kDa)或酶免疫測定(EIA)明確檢測到培養(yǎng)物上清中的BTC-δ4-FLAG，細胞裂解物中或細胞表面上存在的非常少(圖6A和B)。相反，BTC-FLAG主要存在于細胞裂解物中(～20kDa)和細胞表面上(圖6A和B)。因此，不像膜-錨定的pro-BTC是細胞表面胞外域切割后分泌的，BTC-δ4缺少跨膜結構域，似乎是表達后直接分泌的。
實施例5BTC-δ4的ErbB-受體結合和促分裂活性為了研究BTC-δ4的生物學活性，我們起初測試了它刺激表達ErbB1的Balb/c3T3小鼠成纖維細胞增殖的能力。如前所述(Dunbar等，1999)測定BTC和BTC-δ4對Balb/c 3T3成纖維細胞的的促分裂活性。Balb/c 3T3細胞獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。
結果見圖7A和7B。不出所料，BTC以劑量依賴方式刺激Balb/c 3T3增殖。相反，BTC-δ4不刺激細胞增殖，即使?jié)舛雀哌_100nmol/l。此外，在該細胞系中BTC-δ4不拮抗BTC的作用。
通過測定BTC或BTC-δ4競爭性取代ErbB1或ErbB4受體上的[125I]-標記的重組人BTC的能力確定BTC和BTC-δ4與ErbB受體的結合親和力，所述ErbB1或ErbB4受體分別存在于AG2804成纖維細胞(Dunbar等，1999)或ErbB4穩(wěn)定轉染的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(CHO-ErbB4細胞；(Tzahar等，1996)，以色列魏茨曼學院的YosefYarden教授友情饋贈)上。為了完成此測定，在24-孔板中用DMEM/10％FBS將AG2804或CHO-ErbB4細胞培養(yǎng)至70-80％匯合。(人肺成纖維細胞。然后用結合緩沖液(100mmol/l Hepes，(pH7.6)，120mmol/l NaCl，5mmol/l KCl，1.2mmol/l MgSO4，8mmol/l葡萄糖，0.1％BSA)洗滌細胞兩次，然后與[125I]-rhBTC(10000-15000cpm，用氯胺-T以Na[125I]標記，至比活性約為20μCi/μg)和濃度升高的未標記BTC或BTC-δ4(AG2804細胞是0-100nmol/l，CHO-ErbB4細胞是0-10nmol/l)一起在結合緩沖液中4℃孵育18小時。然后用冰冷的Hank’s緩沖鹽溶液洗滌標記的細胞三次，并用1ml 0.5mol/l NaOH/0.1％(v/v)Triton X-100裂解30分鐘。隨后用γ-計數器(Wallac1470)測定細胞裂解物的放射性。在未標記配體過量100倍的情況下進行該生物試驗測定非特異性結合。非特異性結合一般約為總結合的5％。
我們也比較了BTC和BTC-δ4刺激ErbB1或ErbB4的酪氨酸磷酸化的能力。在10cm培養(yǎng)皿中將過度表達ErbB1受體的細胞系AG2804或過度表達ErbB4受體的CHO細胞(CHO-ErbB4細胞；以色列魏茨曼學院的Yosef Yarden教授友情饋贈)培養(yǎng)至匯合，然后用無血清培養(yǎng)基孵育12-14小時，然后用10nmol/l BTC、BTC-δ4或二者的組合在室溫下刺激細胞10分鐘。刺激后，用PBS洗滌細胞兩次，隨后用裂解緩沖液(0.5ml)(50mmol/l Tris-Cl pH7.4，150mmol/l NaCl，1％脫氧膽酸，1％ TritonX-100，0.1％SDS，5mmol/l原釩酸鈉，10mmol/l氟化鈉，1mmol/l EGTA和完全蛋白酶抑制劑TM)裂解。通過離心(15000g 4℃離心20分鐘)使細胞裂解物澄清，分別通過將裂解物與1μg兔多克隆抗-ErbB1抗體(1005)(Santa Cruz)或兔多克隆抗-ErbB4抗體一起在4℃溫和振蕩孵育2小時免疫沉淀ErbB1或ErbB4。
孵育后，加入蛋白-G瓊脂糖，再在4℃孵育該混合物1小時。離心收集免疫復合物，用裂解緩沖液洗滌三次并在SDS-PAGE樣品緩沖液中加熱(3分鐘，95℃)。用SDS-PAGE或10-20％Tricine凝膠分離蛋白質，轉移到硝酸纖維素濾膜(Hybond C，Amersham)上。首先用抗-磷酸化酪氨酸單克隆抗體(PY20)探測膜，然后用HRP-偶聯(lián)的綿羊抗-小鼠抗體探測。用酶-聯(lián)化學發(fā)光(ECL)(Amersham)觀察HRP-標記蛋白。為了驗證上樣量相等，洗提印跡，用兔多克隆抗-ErbB1或兔多克隆抗-ErbB4抗體和HRP-偶聯(lián)的兔抗-綿羊抗體再探測?？?ErbB1(1005)、抗-ErbB4(C-18)和抗-磷酸化酪氨酸(PY20)抗體購自Santa Cruz，HRP-偶聯(lián)的兔抗-綿羊抗體購自Zymed Laboratories。
圖7C-7F和圖8中小結了結果。我們發(fā)現(xiàn)，BTC而非BTC-δ4可以取代人肺成纖維細胞(AG2804)上存在的ErbB1受體的[125I]-BTC(圖7C和D)，并誘導ErbB1受體自身磷酸化(圖8)。類似地，BTC而非BTC-δ4競爭結合ErbB4受體(圖7E和F)并誘導ErbB4受體酪氨酸磷酸化(圖8)。這些結果表明，與BTC相反，BTC-δ4沒有顯示出與ErbB1或ErbB4的親和力。而且，BTC-δ4不活化ErbB1或ErbB4。
這些結果完全出乎意料。因為這意味著BTC-δ4不刺激細胞增殖，我們的發(fā)現(xiàn)提示，BTC-δ4比真正BTC的癌癥誘導風險低。而且，似乎BTC-δ4通過一種仍未鑒定的受體發(fā)揮其作用，而不是通過ErbB1或ErbB4受體?？捎帽疚乃龇椒ǎ蛴肂IAcore試驗繼續(xù)進行進一步研究。
實施例6測定AR42J細胞的分化和凋亡已知天然BTC能刺激胰β-細胞分化(Mashima等，1996；Watada等，1996；Yamamoto等，2000；Li等，2001；Li L等，2003；Li等，2004)，有一些證據提示，這種作用可能通過獨特的非ErbB細胞表面受體發(fā)生(Ishiyama等，1998)。
為了檢測BTC-δ4對胰β-細胞分化的影響(如通過評價對胰島素表達的誘導)，我們采用了模式細胞系AR42J-B20，它是AR42J的亞克隆，是一種分泌淀粉酶的胰腫瘤細胞系。在這些細胞中，BTC與活化素A協(xié)同作用，將它們轉變?yōu)橐葝u素分泌細胞(Mashima等，1996)。因此，活化素A將分泌淀粉酶的AR42J-B20轉變?yōu)楫a生胰多肽(PP)的內分泌細胞?；罨谹也誘導這些細胞凋亡，在沒有存活因子時，許多活化素-處理的細胞在轉變?yōu)楫a生PP的細胞后通過凋亡而死亡(Furukawa等，1999)。
BTC在AR42J-B20細胞中發(fā)揮兩種作用首先，它抑制活化素A誘導的凋亡，其次，它將它們轉變?yōu)楫a生胰島素的細胞(Mashima等，1996；Furukawa等，1999)。用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)AR42J-B20細胞，如前所述(Mashima等，1996)。
為了評價向產生胰島素的細胞的分化，將細胞與2nmol活化素A和1nmol BTC或BTC-δ4一起孵育48小時。然后固定細胞，用抗-胰島素抗體染色，如前所述(Mashima等，1996)，計數胰島素-陽性細胞。用DAPI染核。
用末端脫氧核苷酸轉移酶(TUNEL)技術(Wako Pure Chemicals，Osaka，Japan)評價凋亡。用3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)評價活細胞數量的改變(Carmichael等，1987)。
如圖9A所示，彩色印刷時，AR42J-B20細胞響應于活化素A和BTC的組合分化為產生胰島素的細胞。定量來看，48小時后78±6.5％的細胞(平均值±S.E.，n＝4)變成胰島素陽性?；罨谹和BTC處理的細胞具有延長的過程并表達免疫反應性胰島素，如彩色印刷時的圖9C所示。用活化素A和BTC-δ4的組合處理的細胞也變成胰島素陽性；48小時后72±4.5％(n＝4)的細胞變成胰島素陽性，如彩色印刷時的圖9B所示。
與活化素A和BTC處理的細胞相比，活化素A和BTC-δ4處理的細胞的形態(tài)非常不同。一些胰島素陽性細胞顯示出延長的過程，但大部分看上去保持圓形。這些細胞的細胞核是皺縮的，在一些情況下呈片段化或不存在，如彩色印刷時的圖9B和D所示，這是細胞通過凋亡死亡的特征。與凋亡現(xiàn)象一致，用活化素A和BTC-δ4處理的許多細胞是TUNEL-陽性，而僅有一小部分用活化素A和BTC處理的細胞變?yōu)門UNEL-陽性，如圖10所示。
為了再次確認BTC-δ4對AR42J-B20細胞存活的影響，我們測定了活化素A和BTC或BTC-δ4處理后活細胞數的改變。48小時后，用活化素A和BTC處理的培養(yǎng)物中的活細胞數為接種的細胞數的78.8±4.2％。相比較，用活化素A和BTC-δ4處理的培養(yǎng)物中的活細胞數明顯較低(21.8±3.2％)(P＜0.005)?？傊?，在刺激AR42J-B20細胞分化方面BTC-δ4與BTC同樣有效；然而，BTC-δ4在促進這些細胞存活方面的功效要小得多。
實施例7將BTC-δ4給予STZ-處理的大鼠能降低血漿葡萄糖濃度并改善葡萄糖耐受。
為了研究BTC-δ4的體內β-細胞分化活性，我們將BTC-δ4給予STZ-處理的新生大鼠。試驗方案由Gunma大學的動物護理委員會批準。用新鮮溶解于0.05mmol/l檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.5)的85μg/g鏈脲霉素(STZ)腹膜內(ip)注射一日齡的Sprague-Dawley(SD)大鼠。將幼崽留在母親身邊直到4周齡。在STZ注射1天后(第1天)用Accu-Chek Active(Roche Diagnostics，德國)測試所有新生動物的血糖。只有當第一天血糖濃度在200和350mg/dl之間時，才將該動物包括在該研究中。第一天血糖＞350mg/dl的動物發(fā)生嚴重的糖尿病，在第2天或第3天這些動物的血糖濃度＞600mg/dl。
將3pmol/g BTC-δ4、BTC或鹽水每天注射給STZ-處理的新生大鼠，從第0天起共計5天。在第一周每天測定禁食血糖濃度和體重，然后每周測定一次，共測定8周。STZ處理后2個月，禁食14小時后進行ip葡萄糖耐受測試(2g/kg體重)。
在第4天和第8周，以每100g體重1ml溴脫氧尿苷(BrdU)標記試劑ip注射動物(細胞增殖試劑盒，Amersham Pharmacia Biotech，英國)，3小時后處死。切除胰臟，稱重，并分為兩份。用4％多聚甲醛/PBS固定一份脾臟節(jié)段(4℃過夜)，加工后用于石蠟包埋。在各新生動物胰臟上以100μm的間隔連續(xù)切4個切片，成年動物的間隔是300μm，進行免疫染色和組織化學。在冷酸-乙醇中勻漿第二部分，在70℃水浴中加熱5分鐘，離心，將上清儲存于-20℃，然后測定胰島素。通過如前所述時間分辨的免疫熒光試驗(Mashima等，1996)測定胰島素。
如前所述(Li等，2001；Li等，2003)進行免疫組化。第一抗體的來源和稀釋如下豚鼠抗-豬胰島素，1∶1000(Gunma大學的Matozaki博士提供)；兔抗-PDX-1，1∶3000；單克隆小鼠抗-BrdU，1∶100(Amersham)；用于廣譜篩選的兔抗-牛細胞角蛋白(Ckwss)，1∶1000(DAKO)。第二抗體的來源和稀釋如下山羊Alexa Flour 568偶聯(lián)的抗-豚鼠IgG，1∶1000；山羊Alexa Flour 488偶聯(lián)的抗-豚鼠IgG，1∶500；山羊Alexa Flour 568偶聯(lián)的抗-小鼠IgG，1∶1000；山羊Alexa Flour 488偶聯(lián)的抗-小鼠IgG，1∶500；山羊Alexa Flour 568偶聯(lián)的抗-兔IgG，1∶1000；山羊Alexa Flour 488偶聯(lián)的抗-兔IgG，1∶500(Molecular Probes Inc.，俄勒岡尤金)。
通過裝有PXL 1400冷卻-電荷耦合器件照相機系統(tǒng)(Photometrics，美國亞利桑那州圖森)的AX70落射熒光顯微鏡(Olympus，日本東京)用圖像分析軟件(NIH圖像)在胰島素-染色的切片上對β-細胞質量進行定量，所述照相機系統(tǒng)是用IP Lab Spectrum軟件(Signal Analysis，弗吉尼亞維也納)操作的。在一個切片(來自各包埋塊的不同連續(xù)切片的三個切片)上至少隨機測定40個視野(放大倍數×200)下的胰島素-陽性細胞區(qū)域。如其它地方所述(Li L、Seno M、Yamada H、Kojima I，在90％胰切除的大鼠中β動物纖維素能促進β-細胞再生(Promotion of β-cell regeneration by betacellulin inninety percent pancreatectomized rats)，Endocrinology 1425379-5385，2001；Li L，Seno M，Yamada H，Kojima I在鏈脲霉素-處理的小鼠中β動物纖維素通過促進島內前體細胞轉化為β-細胞提高葡萄糖代謝(Betacellulin improves glucose metabolismby promoting conversion of Intraislet precursor cells to β-cells in streptozotocin-treatedmice)，Am J Physiol 285E577-E583，2003)。為了定量β-細胞新生，我們測定了島樣細胞簇(ICC)的數量(寬度小于5個細胞)。測定用抗胰島素抗體染色的切片中ICC和島的數量，測定這些切片的面積。就每個動物而言至少分析5個切片。結果表示為平均值±SE，見表1以及圖11和12(圖12彩色印刷時)。在兩組之間的比較中，采用不成對t-檢驗。
表1.
給予BTC或BTC-δ4的STZ-處理的新生大鼠的特征。
數據是平均值±S.E.(n)。用BTC、BTC-δ4或鹽水處理STZ-處理的新生大鼠，第8周測定各種參數。
*對STZ組的P＜0.05。**對STZ組的P＜0.01。
在STZ-處理的新生大鼠中，血漿葡萄糖濃度顯著增加，在第二天達到峰值(＞400mg/dl)(圖11A)，然后逐漸降低，但2個月后仍然顯著高于對照大鼠(表1)。相反，STZ-處理的大鼠給予BTC-δ4后，在第1天血漿葡萄糖濃度顯著較低，峰值大大降低(圖11A)。隨后血漿葡萄糖濃度也降低，直到2個月后(表1)。與BTC-δ4的作用相比，BTC改善高血糖癥的能力較差(圖11A，表1)。在2月齡時，進行腹膜內(ip)葡萄糖耐受測試。在STZ-處理的大鼠中，對ip葡萄糖-加載產生的葡萄糖反應顯著受損，然而在給予BTC-δ4的STZ-處理的大鼠中，葡萄糖反應顯著改善(圖11B)。BTC-δ4也提高了胰島素反應，但與正常大鼠相比，對ip葡萄糖-加載產生的胰島素反應仍然被延遲。在BTC-處理的大鼠中，提高了葡萄糖耐受，但BTC的作用小于BTC-δ4(圖11B)。而且，在BTC-δ4-處理的大鼠中胰島素含量和β-細胞質量顯著增加(表1)，在第4天對胰組織的組織學分析表明，BTC-δ4顯著增加了PDX-1-陽性導管細胞和ICC的數量(圖12，彩色印刷時)。
本領域技術人員顯然明白，雖然出于闡述和理解的目的詳細描述了本發(fā)明，但可在不背離本說明書所公開的發(fā)明構思范圍的情況下對本文所述的實施方式和方法進行各種修飾和改變。
下面列出了本文引用的參考文獻，將其納入本文作參考。
參考文獻Alroy，I.和Yarden，Y.
胚胎發(fā)生和癌發(fā)生中的ErbB信號轉導網絡通過組合配體-受體相互作用實現(xiàn)的信號多樣化(The ErbB signaling network in embryogenesis and oncogenesissignaldiversification through combinatorial ligand-receptor interactions)。
FEBS Letters 1997 410(1)83-6。
Alimandi M，Wang LM，Bottaro D，Lee CC，Kuo A，F(xiàn)rankel M，F(xiàn)edi P，TangC，Lippman M，Pierce JH.
表皮生長因子和β動物纖維素通過共表達的ErbB2和ErbB3受體介導信號轉導(Epidermal growth factor and betacellulin mediate signal transduction throughco-expressed ErbB2 and ErbB3 receptors)。
EMBO J 1997，165608-5617。
Beerli，R.R.和Hynes，N.E.
ErbB-2是NDF和EGF受體共有的輔助亞基乳腺癌相關因素(ErbB-2 is acommon auxiliary subunit of NDF and EGF receptorsimplications for breast cancer)。
J.Biol.Chem.，1996，2716071-6078。
Bohren KM，Nadkarni V，Song JH，Gabbay KH，Owerbach D.
新型SUMO基因(SUMO-4)中的M55V多態(tài)性區(qū)別地活化熱激轉錄因子并與I型糖尿病的易感性有關(A M55V polymorphism in a novel SUMO gene(SUMO-4)differentially activates heat shock transcription factors and is associated with susceptibilityto type I diabetes mellitus)。
J Biol Chem.2004 27927233-8
Bonner-Weir S，Trent DF，Weir GC。
大鼠的部分胰切除術和隨后的葡萄糖-誘導性胰島素釋放缺陷(Partialpancreatectomy in the rat and subsequent defect in glucose-induced insulin release)。
J Clin.Invest.1983 711544-1553，CarmichaelJ，DeGraff WC，Gazdar AF，Minnam JD，Mitchell JB。
評價基于四唑的半自動比色測定(Evaluation of tetrazolium-based semiautomatedcolorimetric assay)。
Cancer Res 47936-942，1987Carraway KL 3rd，Weber JL，Unger MJ，Ledesma J，Yu N，Gassmann M，Lai C一種新型ErbB3/ErbB4-受體酪氨酸激酶配體-神經調節(jié)蛋白-2(Neuregulin-2，anew ligand of ErtbB 3/ErbB4-receptor tyrosine kinases)Nature 1997 387512-6。
Chang H，Riese DJ 2nd，Gilbert W，Stern DF，McMahan UJ神經調節(jié)蛋白-樣基因編碼的ErbB-家族受體的配體(ErbB-family receptorsencoded by a neuregulin-like gene)。
Nature 1997 387509-12DunbarA，Goddard C。
缺少EGF基序的C環(huán)和跨膜結構域的人β動物纖維素的另路剪接的mRNA轉錄物的鑒定(Identification of an alternatively spliced mRNA transcript of humanbetacellulin lacking the C-loop of the EGF motif and the transmembrane domain)。
Growth Fact 18169-176，2000Dunbar AJ，Priebe IK，Belford DA，Goddard C將β動物纖維素鑒定為牛奶中的主要肽生長因子(Identification of betacellulin asa major peptide growth factor in milk)。
Biochem J 344713-721，1999
Dunbar AJ，Priebe IK，Webb H和Goddard C.
泛-Erbβ配體β動物纖維素的另路剪接同種型的鑒定和組織特異性表達(Identification and tissue-specific expression of an alternatively spliced isoform of thepan-Erbβligand betacellulin)。
第十一屆國際第二信使和磷酸化蛋白質大會，墨爾本，2001Furukawa M，Zhang YQ，Nie L，Shibata H，Kojima I。
MAP激酶和PI3-激酶在HGF誘導的胰AR42J細胞分化中的作用(Role of MAPkinase and PI 3-kinase in differentiation of pancreatic AR42J cells induced by HGF)。
Diabetologia 42450-456，1999Guo D，Li M，Zhang Y，Yang P，Eckenrode S，Hopkins D，Zheng W，PurohitS，Podolsky RH，Muir A，Wang J，Dong Z，Brusko T，Atkinson M，Pozzilli P，ZeidlerA，Raffel LJ，Jacob CO，Park Y，Serrano-Rios M，Larrad MT，Zhang Z，Garchon HJ，Bach JF，Rotter JI，She JX，Wang CY一種新型IkappaBalpha修飾物-SUMO4的功能變體與1型糖尿病有關(Afunctional variant of SUMO4，a new IkappaBalpha modifier，is associated with type 1diabetes)Nat Genet.2004 36(8)837-41Harari D，Tzahar E，Romano J，Shelly M，Pierce JH，Andrews GC，Yarden Y.
神經調節(jié)蛋白-4通過ErbB-4受體酪氨酸激酶起作用的新型生長因子(Neuregulin-4a novel growth factor that acts through the ErbB-4 receptor tyrosinekinase)。
Oncogene 1999 18(17)2681-9。
Harris RC， Chung E，Coffey RJ.
EGF受體配體(EGF receptor ligands).
Exp Cell Res.2003 284(1)2-13。
Higashiyama S，Abraham JA，Miller J，F(xiàn)iddes JC，Klagsbrun M.
巨噬細胞樣細胞分泌的肝素-結合生長因子與EGF有關(Aheparin-binding growthfactor secreted by macrophage-like cells that is related to EGF)。
Science 1991 251936-9Higashiyama S，Horikawa M，Yamada K，Ichino N，Nakano N，Nakagawa T，Miyagawa J，Matsushita N，Nagatsu T，Taniguchi N，Ishiguro H.
與ErbB3和ErbB4相互作用的表皮生長因子家族的新型腦衍生成員(A novelbrain-derived member of the epidermal growth factor family that interacts with ErbB3 andErbB4)。
J Biochem(Tokyo)1997 122(3)675-80。
Ishiyama N，Kanzaki M，Seno M，Yamada H，Kobayashi I，Kojima I.
胰AR42J細胞中β動物纖維素受體的研究(Studies in the betacellulin receptor inpancreatic AR42J cells)。
Diabetologia 41623-628，1998Jones JT，Akita RW，Sliwkowski MX.
egf結構域與ErbB受體的結合特異性和親和力(Binding specificities and affinitiesof egf domains for ErbB receptors)。
FEBS Letters，1999 447227-231Li L，Seno M，Yamada H，Kojima I。
在90％切除胰臟的大鼠中β動物纖維素能促進β-細胞再生(Promotion of β-cellregeneration by betacellulin in ninety percent pancreatectomized rats)。
Endocrinology 1425379-5385，2001Li L，Seno M，Yamada H，Kojima I。
在鏈脲霉素-處理的小鼠中β動物纖維素通過促進島內前體細胞轉化為β-細胞提高葡萄糖代謝(Betacellulin improves glucose metabolism by promoting conversion ofintraislet precursor cells to β-cells in streptozotocin-treated mice)。
Am J Physiol 285E577-E583，2003Li L，Yi Z，Seno M，Kojima I。
活化素A和β動物纖維素對鏈脲霉素-處理的新生大鼠中β細胞再生的影響(Activin A and betacellulineffect on β-cell regeneration in neonatal streptozotocin-treatedrats)。
Diabetes 53608-615，2004Loukianov E，Loukinanova T，Wiedlocha A，Olnes S.
肝素結合EGF樣生長因子的短形式的mRNA表達(Expression of mRNA for ashort form of heparin-binding EGF-like growth factor)。
Gene 1997 19581-86Maeda T，Kitazoe M，Tada H，de Llorens R，Salomon DS，Ueda M，Yamada H，Seno M嗜酸性細胞陽離子性蛋白對哺乳動物細胞的生長抑制(Growth inhibition ofmammalian cells by eosinophil cationic protein)。
Eur J Biochem 2002 269307-3 16Marchionni MA，Goodearl AD，Chen MS，Bermingham-McDonogh O，Kirk C，Hendricks M，Danehy F，Misumi D，Sudhalter J，Kobayashi K等神經膠質生長因子是在神經系統(tǒng)中表達的另路剪接的erbB2配體(Glial growthfactors are alternatively spliced erbB2 ligands expressed in the nervous system)。
Nature 1993 362312-8。
Marquardt H，Hunkapiller MW，Hood LE，Todaro GJ.
1型大鼠轉化生長因子結構和與表皮生長因子有關(Rat transforming growthfactor type 1structure and relation to epidermal growth factor)。
Science 1984 223 1079-82。
Mashima H，Ohnishi H，Wakabayashi K，Miyagawa J，Hanafusa T，Seno M，Yamada H，Kojima I。
β動物纖維素和活化素A共同將淀粉酶分泌型胰AR42J細胞轉化為胰島素分泌細胞(Betacellulin and activin A coordinately convert amylase-secreting pancreatic AR42Jcells into insulin-secreting cells)。
J Clin Invest 9716647-1654，1996；Miettinen PJ，Huotari M，Koivisto T，Ustinov J，Palgi J，Rasilainen S，LehtonenE，Keski-Oja J，Otonkoski T.在沒有EGF受體的小鼠中胰島細胞的遷移受阻和延遲分化(Impaired migration and delayed differentiation of pancreatic islet cells in micelacking EGF-receptors).Development 2000 127(12)2617-27。
Miyagawa J，Hanafusa O，Sasada R，Yamamoto K，Igarashi K，Yamamori K，Seno M，Tada H，Nammo T，Li M，Yamagata K，Nakajima H，Namba M，KuwajimaM，Matsuzawa Y.EGF家族新成員β動物纖維素在正常人胰腺和胰島腫瘤細胞中的免疫組化定位(Immunohistochemical localization of betacellulin，a new member of the EGFfamily，in normal human pancreas and islet tumor cells)。
Endocr J.1999 46(6)755-64。
Pinkas-Kramarski R，Lenferink AE，Bacus SS，Lyass L，van de Poll ML，KlapperLN，Tzahar E，Sela M，van Zoelen EJ，Yarden Y.
致癌性ErbB-2/ErbB-3異源二聚體是表皮生長因子和β動物纖維素的代理受體(The oncogenic ErbB-2/ErbB-3 heterodimer is a surrogate receptor of the epidermalgrowth factor and betacellulin)。
Oncogene 1998，161259-1258。
Plachot C，Movassat J，Portha B.
II型糖尿病的自發(fā)模型-成年Goto-Kakizaki大鼠切除部分胰腺后β細胞再生受損(Impaired beta-cell regeneration after partial pancreatectomy in the adult Goto-Kakizakirat，a spontaneous model of type II diabetes)。
Histochem Cell Biol.2001 116(2)13 1-9。
Riese DJ 2nd，Bermingham Y，van Raaij TM，Buckley S，Plowman GD，Stern DF.
β動物纖維素能活化表皮生長因子受體和erbB-4，并誘導不同于表皮生長因子或神經調節(jié)蛋白-β刺激的細胞反應方式(Betacellulin activates the epidermal growthfactor receptor and erbB-4，and induces cellular response patterns distinct from thosestimulated by epidermal growth factor or neuregulin-beta)。
Oncogene 1996 12345-353Riese DJ，Kim ED，Elenius K，Buckley S，Klagsbrun M，Plowman GD，Stern DF.
表皮生長因子受體將轉化生長因子-α、肝素-結合的表皮生長因子樣因子和雙調蛋白偶聯(lián)于Neu、ErbB-3和ErbB-4(The epidermal growth factor receptor couplestransforming growth factor-alpha，heparin-binding epidermal growth factor-like factor，andamphiregulin to Neu，ErbB-3，and ErbB-4)。
J Biol Chem.1996 271(33)20047-52。
Riese DJ 2nd，Bermingham Y，van Raaij TM，Buckley S，Plowman GD，Stern DF.
β動物纖維素能活化表皮生長因子受體和erbB-4，并誘導不同于表皮生長因子或神經調節(jié)蛋白-β刺激的細胞反應方式(Betacellulin activates the epidermal growthfactor receptor and erbB-4，and induces cellular response patterns distinct from thosestimulated by epidermal growth factor or neuregulin-beta)。
Oncogene 1996 12(2)345-53。
Rosewicz S，Vogt D，Harth N，Grund C，F(xiàn)ranke WW，Ruppert S，Schweitzer E，Riecken EO，Wiedenmann B兩性分泌的胰細胞系AR42J細胞組合了外分泌和神經內分泌特性(Anamphicrine pancreatic cell lineAR42J cells combine exocrine and neuroendocrineproperties)。
Eur.J.Cell Biol 5980-91Sasada R，Ono Y，Taniyama Y，Shing Y，F(xiàn)olkman J，Igarashi K.
編碼EGF家族的一個新成員-人β動物纖維素的cDNA的克隆和表達(Cloningand expression of cDNA encoding human betacellulin，a new member of the EGFfamily)。
Biochem.Biophys.Res.Commum.1993 1901604-1607。
Savage CR Jr，Cohen S.
表皮生長因子和新型衍生物?？焖俜蛛x步驟以及生物和化學表征(Epidermalgrowth factor and a new derivative.Rapid isolation procedures and biological andchemical characterization)。
J Biol Chem.1972 247(23)7609-11。
Seno M，Tada H，Kosaka M，Sasada R，Igarashi K，Shing Y，F(xiàn)olk，am J，UedaM，Yamada H。
主要在胰腺和小腸中表達的EGF家族的一個新成員-人β動物纖維素的單體形式具有完全活性(Human betacellulin，a member of the EGF family，dominantly expressedin pancreas and small intestine，is fully active in a monomeric form)。
Growth Fact 13181-191，1996Sesti G，Marini MA，Cardellini M，Sciacqua A，F(xiàn)rontoni S，Andreozzi F，IraceC，Lauro D，Gnasso A，F(xiàn)ederici M，Perticone F，Lauro R.
胰島素受體底物-1的Arg972變體與2型糖尿病患者對磺酰脲的二次失效風險增加相關(The Arg972 variant in insulin receptor substrate-1 is associated with an increasedrisk of secondary failure to sulfonylurea in patients with type 2 diabetes)。
Diabetes Care 2004 27(6)1394-8Sharma，A.，Taneja，M.，Rietz，P.，Weitekamp，J.，Bonner-Weir，J。
用于研究β細胞分化的新型胰腺前體細胞系(Novel pancreatic precursor cell linesfor studying beta-cell differentiation)。
Diabetes 2001 50 s42-s43Shing Y，Christofori G，Hanahan D，Ono Y，Sasada R，Igarashi K，F(xiàn)olkman J.
β動物纖維素來自胰腺β細胞腫瘤的促分裂原(Betacellulina mitogen frompancreatic beta cell tumors)。
Science 1993 259(5101)1604-7。
Shoyab M，Plowman GD，McDonald VL，Bradley JG，Todaro GJ.
表皮生長因子家族的一個成員-人雙調蛋白的結構和功能(Structure and functionof human amphiregulina member of the epidermal growth factor family)。
Science.1989 243(4894 Pt 1)1074-6。
Toyoda H，Komurasaki T，Uchida D，Takayama Y，Isobe T，Okuyama T，HanadaK.
表皮調節(jié)素，一種對大鼠原代肝細胞有促分裂活性的新型表皮生長因子(Epiregulin.A novel epidermal growth factor with mitogenic activity for rat primaryhepatocytes)。
J Biol Chem.1995 270(13)7495-500。
Tzahar E，Waterman H，Chen X，Levkowitz G，Karunagaran D，Lavi S，RatzkinBJ，Yarden Y。
受體間相互作用的分級網絡決定了通過Neu分化因子/神經調節(jié)蛋白和表皮生長因子的信號轉導(A hierarchical network of inter-receptor interactions determines signaltransduction by Neu differentiation factor/neuregulin and epidermal growth factor)。
Mol Cell Biol 165276-5287，1996Wang LM，Kuo A，Alimandi M，Veri MC，Lee CC，Kapoor V，Ellmore N，ChenXH，Pierce JH.
ErbB2表達通過ErbB4增加了配體-介導的信號轉導的范圍和效力(ErbB2expression increases the spectrum and potency of ligand-mediated signal transductionthrough ErbB4)。
Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，1998 956809-6814Watada H，Kajimoto Y，Miyagawa J，Hanafusa T，Hamaguchi K，Matsuoka T，Yamamoto K，Matsuzawa Y，Kawamori R，Yamasaki Y.
在β動物纖維素的存在下PDX-1能誘導BTC克隆6細胞的胰島素和葡糖激酶基因表達(PDX-1 induces insulin and glucokinase gene expression in BTC clone 6 cells inthe presence of betacellulin).Diabetes 1996 451826-1831，Watanabe T，Yonemura Y，Yonekura H，Suzuki Y，Miyashita H，Sugiyama K，Moriizumi S，Unno M，Tanaka O，Kondo H等 胰腺β-細胞復制和用Reg蛋白改善手術糖尿病患者(Pancreatic beta-cell replication and amelioration of surgical diabetes byReg protein)。
Proc Natl Acad Sci USA.1994 91(9)3589-92。
Xing Y，Xu O，Lee C.
通過另路剪接去除跨膜錨定結構域而廣泛產生了新型可溶性蛋白質同種型(Widespread production of novel soluble protein isoforms by alternative splicing removalof transmembrane anchoring domains)。
FEBS Letters 2003 555572-578Yamamoto K，Miyagawa J，Waguri M，Sasada R，Igarashi K，Li M，Nammo T，Moriwaki T，Imagawa A，Yamagata K，Nakajima H，Namba M，Tochino Y，HanafusaT，Matsuzawa Y。
在選擇性四氧嘧啶灌注誘導的糖尿病小鼠中重組β動物纖維素能促進β細胞新生并改善葡萄糖耐受(Recombinant betacellulin promotes neogenesis of βcells andameliorates glucose intolerance in mice with diabetes induced by selective alloxanperfusion)。
Diabetes 2000 492021-2027Zhang D，Sliwkowski MX，Mark M，F(xiàn)rantz G，Akita R，Sun Y，Hillan K，CrowleyC，Brush J，Godowski PJ.
神經調節(jié)蛋白-3(NRG3)結合并活化ErbB4的一種新型神經組織富集的蛋白(Neuregulin-3(NRG3)a novel neural tissue-enriched protein that binds and activatesErbB4)。
Proc Natl Acad Sci USA.1997 94(18)9562-7。
序列表<110>谷柔派普有限公司(Gropep Limited)<120>治療糖尿病的方法<130>VSAJHFP20106<160>15<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>合成<400>1gagcggggtt gatggaccgg 20<210>2<211>21<212>DNA<213>合成<400>2ttaagcaata tttgtctctt c21<210>3<211>29<212>DNA<213>合成<400>3ctcgtcgacg agcggggttg atggaccgg29<210>4<211>30<212>DNA<213>合成<400>4ctcctgcagt taagcaatat ttgtctcttc 30<210>5<211>32<212>DNA<213>合成<400>5cgtccatggc tgatgggaat tccaccagaa gt 32<210>6<211>33<212>DNA<213>合成<400>6cgtctcgagt cattaagcaa tatttgtctc ttc 33<210>7<211>32<212>DNA<213>合成
<400>7cgtccatggc tgatgggaat tccaccagaa gt 32<210>8<211>30<212>DNA<213>合成<400>8cgtctcgagt cagtaaaaca agtcaactgt30<210>9<211>51<212>DNA<213>合成<400>9ctcgggaatt ccgactacaa ggacgacgat gacaagacca gaagtcctga a51<210>10<211>30<212>DNA<213>合成<400>10ctcctgcagt taagcaatat ttgtctcttc30<210>11<211>129<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>11Met Asp Arg Ala Ala Arg Cys Ser Gly Ala Ser Ser Leu Pro Leu Leu1 5 10 15Leu Ala Leu Ala Leu Gly Leu Val Ile Leu His Cys Val Val Ala Asp20 25 30Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp35 40 45Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly50 55 60His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly65 70 75 80Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Pro Leu85 90 95Arg Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Lys Glu Glu Glu Met Glu Thr Leu100 105 110Gly Lys Asp Ile Thr Pro Ile Asn Glu Asp Ile Glu Glu Thr Asn Ile115 120 125
Ala<210>12<211>94<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>12Met Asp Arg Ala Ala Arg Cys Ser Gly Ala Ser Ser Leu Pro Leu Leu1 5 10 15Leu Ala Leu Ala Leu Gly Leu Val Ile Leu His Cys Val Val Ala Asp20 25 30Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp35 40 45Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly50 55 60His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly65 70 75 80Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val85 90<210>13<211>63<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>13Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly1 5 10 15Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys20 25 30Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys35 40 45Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val50 55 60<210>14<211>98<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>14Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly1 5 10 15
Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys20 25 30Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys35 40 45Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Pro50 55 60Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Lys Glu Glu Glu Met Glu Thr65 70 75 80Leu Gly Lys Asp Ile Thr Pro Ile Asn Glu Asp Ile Glu Glu Thr Asn85 90 95Ile Ala<210>15<211>35<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>15Pro Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Lys Glu Glu Glu Met Glu1 5 10 15Thr Leu Gly Lys Asp Ile Thr Pro Ile Asn Glu Asp Ile Glu Glu Thr20 25 30Asn Ile Ala3權利要求
1.一種在患有糖尿病或處于患糖尿病風險的對象中治療、預防該疾病或延遲其發(fā)病的方法，所述方法包括給予所述對象多肽，該多肽能夠刺激島細胞祖細胞分化為胰腺β細胞，并且與真正的BTC相比，該多肽沒有細胞生長促進活性或此活性降低。
2.一種在患有糖尿病或處于患糖尿病風險的對象中治療、預防該疾病或延遲其發(fā)病的方法，所述方法包括給予所述對象核酸，該核酸編碼能夠刺激島細胞祖細胞分化為胰腺β細胞的多肽，與真正的BTC相比，所述多肽沒有細胞生長促進活性或此活性降低。
3.能夠刺激島細胞祖細胞分化為胰腺β細胞的多肽在糖尿病患者中治療、預防該疾病或延遲其發(fā)病的應用，其中與真正的BTC相比，所述多肽沒有細胞生長促進活性或此活性降低。
4.編碼能夠刺激島細胞祖細胞分化為胰腺β細胞的多肽的核酸在患有糖尿病或處于患糖尿病風險的對象中治療、預防該疾病或延遲其發(fā)病的應用，其中與真正的BTC相比，所述多肽沒有細胞生長促進活性或此活性降低。
5.能夠刺激島細胞祖細胞分化為胰腺β細胞的多肽在用于在患有糖尿病或處于患糖尿病風險的對象中治療、預防該疾病或延遲其發(fā)病的藥物制備中的應用，其中與真正的BTC相比，所述多肽沒有細胞生長促進活性或此活性降低。
6.編碼能夠刺激島細胞祖細胞分化為胰腺β細胞的多肽的核酸在用于在患有糖尿病或處于患糖尿病風險的對象中治療、預防該疾病或延遲其發(fā)病的藥物制備中的應用，其中與真正的BTC相比，所述多肽沒有細胞生長促進活性或此活性降低。
7.如權利要求1-6中任一項所述的方法或應用，其特征在于，與真正的BTC相比，所述多肽活化所述對象的ErbB1和ErbB4受體的能力顯著降低。
8.如權利要求1-7中任一項所述的方法或應用，其特征在于，刺激島細胞祖細胞向胰腺β細胞分化時沒有刺激其它細胞類型的增殖。
9.如權利要求1-8中任一項所述的方法或應用，其特征在于，所述糖尿病是2型糖尿病。
10.如權利要求1-8中任一項所述的方法或應用，其特征在于，所述糖尿病是1型糖尿病。
11.一種治療、預防糖尿病或延遲其發(fā)病的組合物，其包含能夠刺激島細胞祖細胞分化為胰腺β細胞的多肽和藥學上可接受的運載體，其中與真正的BTC相比，所述多肽沒有細胞生長促進活性或此活性降低。
12.一種治療、預防糖尿病或延遲其發(fā)病的組合物，其包含編碼能夠刺激島細胞祖細胞分化為胰腺β細胞的多肽的核酸和藥學上可接受的運載體，其中與真正的BTC相比，所述多肽沒有細胞生長促進活性或此活性降低。
13.如權利要求1-12中任一項所述的方法、應用或組合物，其特征在于，與真正的BTC相比，所述多肽沒有刺激細胞類型增殖的能力或此能力降低。
14.如權利要求1-13中任一項所述的方法、應用或組合物，其特征在于，與真正的BTC相比，所述多肽沒有活化ErbB1或ErbB4受體的能力或此能力降低。
15.如權利要求1-14中任一項所述的方法、應用或組合物，其特征在于，與真正的BTC相比，所述多肽沒有活化ErbB2或ErbB3同源二聚體的能力或該能力降低。
16.如權利要求1-15中任一項所述的方法、應用或組合物，其特征在于，與用真正BTC治療產生的風險相比，作為治療的副作用而在對象中發(fā)生癌癥的風險降低。
17.如權利要求1-16中任一項所述的方法、應用或組合物，其特征在于，所述多肽與EGF家族成員基本同源。
18.如權利要求17所述的方法、應用或組合物，其特征在于，所述多肽與表皮生長因子、轉化生長因子-α、肝素結合的EGF樣生長因子、表皮調節(jié)素、雙調蛋白、神經和胸腺衍生的ErbB激酶激活物(NTAK)、神經調節(jié)蛋白亞家族成員(NRG1、NRG2、NRG3和NRG4)或β動物纖維素(BTC)基本同源。
19.如權利要求18所述的方法、應用或組合物，其特征在于，所述多肽與BTC-δ4基本同源。
20.如權利要求19所述的方法、應用或組合物，其特征在于，所述多肽是BTC-δ4。
21.如權利要求20所述的方法、應用或組合物，其特征在于，所述BTC-δ4多肽具有圖4所示氨基酸序列(SEQ ID NO11)。
22.如權利要求1-12中任一項所述的方法、應用或組合物，其特征在于，所述多肽是(a)BTC的剪接變體，其中沒有C5-C6二硫環(huán)，而編碼真正BTC的基因中通常存在此二硫環(huán)；或(b)序列與(a)基本同源的多肽，或(c)(a)的類似物、片段、突變體、衍生物或等位基因變體。
23.如權利要求1-12中任一項所述的方法、應用或組合物，其特征在于，所述多肽是(a)BTC的剪接變體，其中沒有C5-C6二硫環(huán)，而編碼真正BTC的基因中通常存在此二硫環(huán)，成熟分子的其余部分，包括A環(huán)和B環(huán)以及“鉸鏈”纈氨酸框內融合于截短的C-末端胞質尾；(b)序列與(a)基本同源的多肽；或(c)(a)的片段、類似物、變體或衍生物。
24.如權利要求1-23中任一項所述的方法、應用或組合物，其特征在于，所述多肽能夠用作β-細胞分化因子、增加β-細胞質量、減少β-細胞功能的降低和/或增加β-細胞的胰島素分泌。
25.如權利要求1-24中任一項所述的方法、應用或組合物，其特征在于，與用BTC治療產生的風險相比，作為治療的副作用而在對象中發(fā)生癌癥的風險降低。
26.如權利要求1-25中任一項所述的方法、應用或組合物，其特征在于，所述對象具有以下糖尿病風險因素中的一項或多項葡萄糖耐受受損、代謝綜合征、1型或2型糖尿病家族史、肥胖、多囊卵巢綜合征、高血壓或高膽固醇。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療或預防糖尿病的方法，該方法包括給予能夠刺激胰島β細胞活性但不結合或激活ErbB1或ErbB4受體的多肽。也提供了診斷糖尿病的方法，即采用該多肽和含有該多肽的組合物。
文檔編號A61P3/10GK101090732SQ200580032419
公開日2007年12月19日 申請日期2005年8月5日 優(yōu)先權日2004年8月6日
發(fā)明者A·J·鄧巴, C·戈達德 申請人:谷柔派普有限公司