專(zhuān)利名稱(chēng)：糖尿病等的治療的制作方法
糖尿病等的治療本申請(qǐng)為申請(qǐng)日為2003年12月5日、申請(qǐng)?zhí)枮?00380105141.X (國(guó) 際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US2003/038689)、發(fā)明名稱(chēng)為"糖尿病等的治療"的發(fā)明 專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本申請(qǐng)要求2002年12月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)No . 60/431351、 2003年6月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)No . 60/476331 和2003年6月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)No . 60/476726的優(yōu)先權(quán)，這些申請(qǐng)的內(nèi)容各自納入本文作參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及葡萄糖的調(diào)節(jié)和體內(nèi)平衡，涉及糖尿病等葡萄糖調(diào)節(jié)受損 傷相關(guān)疾病的治療或預(yù)防。發(fā)明背景糖尿病是-種由于胰島素分泌、胰島素活性或二者發(fā)生缺陷而致的以 高血糖為特征的疾病。I型糖尿病(以前稱(chēng)為胰島素依賴(lài)性糖尿病 (IDDM))是-種朗格漢斯細(xì)胞作用于胰島，破壞了機(jī)體產(chǎn)生胰島素能力而 致的自身免疫性疾病。I型糖尿病占所有糖尿病例的10 % ，影響到美國(guó) 多達(dá)100萬(wàn)人。II型糖尿病(以前稱(chēng)為胰島素非依賴(lài)性糖尿病(NIDDM)) 是-種由于機(jī)體不能產(chǎn)生足夠的胰島素或不能適當(dāng)?shù)乩靡葝u素而致的代 謝性疾病。美國(guó)所有的糖尿病人中大約90 %患II型糖尿病。I型和II型 糖尿病都是由于胰島素分泌、胰島素活性或二者發(fā)生缺陷而致的以高血 糖為特征的代謝性疾病。糖尿病的流行以警報(bào)速度增加。1976-1994年之間美國(guó)成年人中糖尿 病人群從8.9%增加至12.3%。美國(guó)目前大約有1600萬(wàn)(約占人口的6% ) 人患糖尿病，每年新診斷糖尿病人80萬(wàn)人。(Harris等，Diabetes Care ,21 : 518-5241 ， 1998 ; Nathan ; N Engl 2 : J Med . , 347 : 1342 -1349 ， 2002 )。糖尿病在發(fā)生前、發(fā)生期間和發(fā)生后伴有廣泛影響機(jī)體中各種器 官的病癥和供發(fā)??；例如視網(wǎng)膜病變、腎病、神經(jīng)病變等，導(dǎo)致失明、腎 功能衰竭等。糖尿病可能?chē)?yán)重影響生活質(zhì)量，甚至可致死亡。因此該領(lǐng)域 需要治療和預(yù)防糖尿病及其相關(guān)講發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展的有效方法。與糖尿病，通常與II型糖尿病發(fā)生相關(guān)的幾種危險(xiǎn)因素，具體是糖尿 病家族史、某些人種或種族、妊娠性糖尿病史、肥胖，特別是高水平的內(nèi) 臟和腹部脂肪、久坐不動(dòng)的生活類(lèi)型、年齡、高血壓、精神分裂癥等；以 及葡萄糖代謝的改變，包括葡萄糖耐受受損(IGT )或前驅(qū)糖尿病。因此 該領(lǐng)域需要治療和預(yù)防糖尿病相關(guān)危險(xiǎn)因素發(fā)生和發(fā)展的有效方法。糖尿病等疾病與葡萄糖調(diào)節(jié)失控有關(guān)。糖尿病和高血糖可導(dǎo)致產(chǎn)生、 或在反應(yīng)中產(chǎn)生各種疾病和病癥，相關(guān)的疾病和病癥包括動(dòng)脈粥樣硬 化、血管疾病如中風(fēng)等；肥胖癥、心血管疾病如充血性心力衰竭 (CHF )、心肌梗塞(MI )及下游影響等；或與這些疾病和病癥相關(guān)的 危險(xiǎn)因素。因此該領(lǐng)域需要治療和預(yù)防，或最大程度減少發(fā)生糖尿病或高 血糖相關(guān)疾病危險(xiǎn)因素的有效方法。本發(fā)明提供-種藥物治療方法回答了 這一需要，該方法與目前對(duì)于不同疾病和不同疾病的不同方面采用多種治 療方法10不同，而是給予一種能靶向有關(guān)生理過(guò)程的某家族(成員)，并 實(shí)現(xiàn)協(xié)同作用的化合物，即可獲得所需的治療效果。糖尿病的目前治療是控制血液中的葡萄糖水平(如實(shí)現(xiàn)血糖控制)， 以圖再生天然的生理性葡萄糖體內(nèi)平衡。由于生活類(lèi)型的變化，如推薦控 制飲食和增加運(yùn)動(dòng)，因此此方法可能效果有限。這種生活類(lèi)型的變化不可 能防止或戰(zhàn)勝有關(guān)生理因素的發(fā)生，有可能延緩但不能防止該病的進(jìn)展。 此外，病人對(duì)此法缺乏順從性可能限制其效果。常用的治療方法包括用胰島素治療，例如通過(guò)以仔細(xì)設(shè)計(jì)的時(shí)間方 式，常常需要每天一次或甚至一天多次注射需要給予的胰島素。需要注射 胰島素的這種治療可能伴有低血糖癥和高胰島素血癥的危險(xiǎn)。另外這類(lèi)治 療是否成功常因病人缺乏順從性而失效，即不能順從推薦的治療方案而失 敗。其它基于胰島素的治療，如給予胰島素促分沁素(能刺激胰腺分沁胰 島素的化合)，也具有誘生低血糖等的類(lèi)似危險(xiǎn)。這些療法，和現(xiàn)有的療
法，如PPAR-y拮抗劑療法等伴有其它作用，例如糖尿病的和自身的一種危險(xiǎn)因素體重增加。因此需要有效治療或預(yù)防糖尿病、高血糖癥和糖尿 病相關(guān)危險(xiǎn)因素，如體重增加和肥胖的方法和化合物，這些方法和化合物 常?？筛倪M(jìn)給藥的容易性，并不會(huì)伴有其它糖尿病相關(guān)因素，如體重增加 等的發(fā)生或危險(xiǎn)。對(duì)于糖尿病和相關(guān)疾病，需要更接近模擬達(dá)到葡萄糖體 內(nèi)平衡的機(jī)體自身生理機(jī)制的治療方法。當(dāng)然這類(lèi)治療可能需要改進(jìn)給藥 的容易性、提高病人的舒適度以及病人順從性。此外，糖尿病或相關(guān)疾病 的治療需要這種治療不會(huì)有加重或惡化所治疾病的作用。葡萄糖代謝，例如葡萄糖的合成、加工和利用等，是維持正常葡萄糖 平衡和體內(nèi)平衡所必須的。葡萄糖代謝或調(diào)節(jié)的破壞可導(dǎo)致葡萄糖體內(nèi)平 衡的破壞，導(dǎo)致血糖不適當(dāng)?shù)母咚?即高血糖癥)或低水平(即低血糖 癥)。高血糖癥和低血糖癥長(zhǎng)期或嚴(yán)重地影響到生活質(zhì)量，產(chǎn)生神經(jīng)和血 管損傷。因此需要調(diào)節(jié)血糖代謝和體內(nèi)平衡(達(dá)到血糖的控制)，和治療 或預(yù)防與葡萄糖代謝和體內(nèi)平衡改變或受損相關(guān)的疾病和病癥，如糖尿 病、高血糖癥等的有效方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和實(shí)現(xiàn)葡萄糖體內(nèi)平衡的方法和化合物。 也提供使受試者降低血糖水平、降低胰島素耐受、降低糖化血紅素水平和 改善血糖控制的方法。提供治療或預(yù)防糖尿病、高血糖癥和其它血糖水平升高相關(guān)疾病的方法，例如治療10或預(yù)防糖尿病相關(guān)疾病，如成為糖尿 病危險(xiǎn)因素，或與糖尿病同時(shí)發(fā)生或糖尿病所導(dǎo)致的疾病的方法。在各種實(shí)施方案中，所述受試者是細(xì)胞、組織或器官。在其它實(shí)施方 案中，所述受試者是動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。當(dāng)受試者是細(xì)胞 時(shí)，本發(fā)明具體考慮該細(xì)胞可以是分離的細(xì)胞，原核或真核細(xì)胞。當(dāng)受試 者是組織時(shí)，本發(fā)明具體考慮是巧內(nèi)源性組織和體外組織，如培養(yǎng)的組 織。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述受試者是動(dòng)物，具體是哺乳動(dòng)物類(lèi)動(dòng)物， 包括大鼠、家兔、牛、羊、豬、小鼠、馬和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。最優(yōu)選實(shí)施方案 中，所述受試者是人。
本發(fā)明提供調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的方法。
一方面，本發(fā)明方法包括調(diào)節(jié)受試者的糖代謝，系通過(guò)穩(wěn)定受試者的HIFa調(diào)節(jié)其糖代謝。在各方面內(nèi)容 上，HIFa是HIFkx 、 HIF2a或HIF3a。在一優(yōu)選方面，穩(wěn)定HIFa包括 給予受試者有效量的抑制HIF羥化酶活性的化合物。穩(wěn)定HIFa可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已有和已知的方法來(lái)進(jìn)行，可包括采 用能與HIFa相互反應(yīng)，或能修飾HIFa或與HIFa相互反應(yīng)的因子的任何 制劑，如以HIFa為底物的酶。在某些方面，本發(fā)明考慮提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的 HIFa變體，如穩(wěn)定的HIF突變蛋白25等，或編碼這種變體的多核苷酸。 在其它方面，本發(fā)明考慮要穩(wěn)定HIFa，包括給予能穩(wěn)定HIFa的任何制 劑。該制劑可包括多核苷酸，如反義序列；多肽；抗體；其它蛋白質(zhì)；碳 水化合物；脂肪；脂質(zhì)；和有機(jī)及無(wú)機(jī)物質(zhì)，如小分子等。在一優(yōu)選實(shí)施 方案中，本發(fā)明考慮，例如通過(guò)給予受試者能穩(wěn)定HIFa的任何制劑來(lái)穩(wěn) 定該受試者的HIFa，其中所述的制劑是能穩(wěn)定HIFa的化合物，如小分子 化合物。本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)受試者葡萄糖代謝的方法，該方法通過(guò)給予受試者 有效量的本發(fā)明化合物來(lái)調(diào)節(jié)該受試者的葡萄糖代謝。在一優(yōu)選方面，本 發(fā)明的化合物是能抑制HIF羥化酶活性的化合物。在最優(yōu)選的方面，本發(fā) 明的化合物是能抑制HIF脯氨酞羥化酶活性的化合物。在另-優(yōu)選方面， HIF羥化酶選自EGLN1 、 EGLN2禾Q EGLN3 。本發(fā)明還通過(guò)穩(wěn)定受試者的HIFa ，或給予受試者有效量的能調(diào)節(jié)該 受試者葡萄糖代謝過(guò)程的本發(fā)明化合物，提供調(diào)節(jié)受試者葡萄糖代謝過(guò)程 的方法。在各種實(shí)施方案中，所述葡萄糖代謝過(guò)程選自葡萄糖攝取、葡萄 糖轉(zhuǎn)運(yùn)、葡萄糖儲(chǔ)存、葡萄糖加工、葡萄糖利用和葡萄糖合成等。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法通過(guò)穩(wěn)定受試者的HIFa ，或通過(guò) 給予受試者有效量的能改變?cè)撌茉囌咂咸烟钦{(diào)節(jié)因子的表達(dá)的化合物，來(lái) 改變?cè)撌茉囌咂咸烟钦{(diào)節(jié)因子的表達(dá)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法，通過(guò)穩(wěn)定受試者的HIFa ，或 通過(guò)給予受試者有效量的能增加該受試者葡萄糖調(diào)節(jié)因子的表達(dá)的化合 物，來(lái)增加該受試者葡萄糖調(diào)節(jié)因子的表達(dá)。在其它實(shí)施方案中，所述葡 萄糖調(diào)節(jié)因子選自PFK-P、 PFK-L 、烯醇化酶-1 、 GluT-l 、乳酸脫氫
酶、醛縮酶-1、己糖激酶-1 、 IGFBP-1和IGF。在一具體方面，葡萄糖調(diào)節(jié) 因子的增加是持續(xù)性增加。 一方面，該葡萄糖調(diào)節(jié)因子是一種糖酵解因 子。另一方面，該糖酵解因子選自PFK-P 、 PFK-L 、烯醇化酶-1 、乳 酸脫氫酶、醛縮酶-1和已糖激酶-1 。本發(fā)明提供實(shí)現(xiàn)受試者葡萄糖體內(nèi)平衡的方法。 一方面，本發(fā)明的方 法包括實(shí)現(xiàn)受試者葡萄糖體內(nèi)平衡，這是通過(guò)穩(wěn)定受試者的HIFa從而達(dá) 到該受試者的葡萄糖體內(nèi)平衡。另一方面，本發(fā)明的方法包括實(shí)現(xiàn)受試者 葡萄糖體內(nèi)平衡，這是通過(guò)給予受試者有效量的本發(fā)明化合物從而達(dá)到該 受試者的葡萄糖體內(nèi)平衡。本發(fā)明提供降低受試者血糖水平的方法。 一方面，本發(fā)明的方法包括 降低受試者的血糖水平，這是通過(guò)穩(wěn)定受試者的HIFot從而降低該受試者 的血糖體水平。另一方面，本發(fā)明的方法包括降低受試者的糖化血紅素水 平，這是通過(guò)給予受試者有效量的本發(fā)明化合物從而降低該受試者的糖化 血紅素水平。本文涉及治療或預(yù)防具有發(fā)生糖尿病或具有發(fā)生糖尿病危險(xiǎn)受試者的 糖尿病的方法。 一實(shí)施方案中，該方法包括治療或預(yù)防具有發(fā)生糖尿病或 具有發(fā)生糖尿病危險(xiǎn)受試者的糖尿病，這是通過(guò)穩(wěn)定該受試者的HIFa從 而預(yù)防或治療糖尿病。另一方面，本發(fā)明的方法包括治療或預(yù)防受試者的 糖尿病，這是通過(guò)給予受試者有效量的本發(fā)明化合物從而治療或預(yù)防該受 試者的糖尿病。本發(fā)明還提供治療或預(yù)防受試者的血糖水平升高相關(guān)疾病的方法。一 實(shí)施方案，該方法包括治療或預(yù)防受試者的血糖水平升高相關(guān)疾病，這是 通過(guò)穩(wěn)定該受試者的HIFa從而預(yù)防或治療血糖水平升高相關(guān)疾病。另一 方面，本發(fā)明的方法包括治療或預(yù)防受試者的血糖水平升高相關(guān)疾病，這 是通過(guò)給予受試者有效量的本發(fā)明化合物從而治療或預(yù)防該受試者的血糖 增高相關(guān)疾病。在各種實(shí)施方案中，所述疾病選自糖尿病、高血糖癥、 肥胖、糖耐受受損、高血壓、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變、腎病、高脂血癥和 血管疾病。本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防受試者糖尿病相關(guān)疾病的方法。 一實(shí)施方案 中，該方法包括治療或預(yù)防糖尿病相關(guān)疾病，這是通過(guò)穩(wěn)定該受試者的HIFa從而預(yù)防或治療其糖尿病相關(guān)疾病。另一方面，本發(fā)明的方法包括 治療或預(yù)防受試者的糖尿病相關(guān)疾病，這是通過(guò)給予受試者有效量的本發(fā) 明化合物從而治療或預(yù)防該受試者的糖尿病相關(guān)疾病。在各種實(shí)施方案中，所述疾病選自高血壓、肥胖、高血糖癥、葡萄糖耐受受損、高脂血癥、'腎病、神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變、動(dòng)脈粥樣硬化癥和血管疾病。 一實(shí) 施方案中，所述受試者是患糖尿病的受試者。另一實(shí)施方案中，所述受試 者是具有患糖尿病危險(xiǎn)的受試者。本發(fā)明提供降低受試者血液甘油三脂水平的方法。 一方面，本發(fā)明的方法可降低受試者的血液甘油三脂水平，這是通過(guò)穩(wěn)定該受試者的HIFa 從而降低該受試者的血液甘油三脂水平。另一方面，本發(fā)明的方法可降低 受試者的血液甘油三脂水平，這是通過(guò)給予該受試者有效量的本發(fā)明化合 物從而降低該受試者的血液甘油三脂水平。本發(fā)明提供降低受試者胰島素耐受的方法。 一方面，本發(fā)明的方法可 降低受試者的胰島素耐受，這是通過(guò)穩(wěn)定該受試者的HIFa從而降低該受 試者的胰島素耐受。另一方面，本發(fā)明的方法可降低受試者的胰島素耐 受，這是通過(guò)給予該受試者有效量的本發(fā)明化合物從而降低該受試者的胰 島素耐受。本發(fā)明提供提高受試者血糖控制能力的方法。 一方面，本發(fā)明的方法 可利市受試者的血糖控制，這是通過(guò)穩(wěn)定該受試者的HIFa從而提高該受 試者的血糖控制。另一方面，本發(fā)明的方法可提高受試者的血糖控制，這 是通過(guò)給予該受試者有效量的本發(fā)明化合物從而提高該受試者的血糖控 制。還有一方面，所述受試者是患有高血糖癥的受試者。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供含有本發(fā)明化合物的配方或藥物或藥物組合物，以及制造和使用這些配方或藥物或藥物組合物的方法。 附圖簡(jiǎn)述

圖1A和1B顯示用本發(fā)明化合物處理細(xì)胞中誘生的的醛縮酶和葡萄 糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-l(GluT-l )。圖2A 、 2B和2C顯示用本發(fā)明化合物處理動(dòng)物中分別參與腎、肝和 肺中葡萄糖調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)。 圖3A和3B顯示用本發(fā)明化合物處理動(dòng)物的腎和肝中分別編碼GluT-l和IGFBP-1的基因的劑量和溫度反應(yīng)。圖4顯示用本發(fā)明化合物處理的動(dòng)物中血糖水平的降低。圖5A和5B顯示用本發(fā)明化合物治療后，飲食誘導(dǎo)2型糖尿病動(dòng)物模型中糖耐受的提高。圖6顯示用本發(fā)明化合物治療的db/db小鼠中血紅素糖化的降低。 圖7A和7B顯示用本發(fā)明化合物治療動(dòng)物的體重和心臟重量的變化。圖8顯示用本發(fā)明化合物治療動(dòng)物中內(nèi)臟脂肪的減少。圖9A 、 9B和9C顯示用本發(fā)明化合物治療后，飲食誘導(dǎo)肥胖動(dòng)物模型中體重增巧重和腹部脂肪墊重量均得以減少。圖10A和10B顯示用本發(fā)明化合物治療后，編碼了可誘導(dǎo)的-氧化氮合酶(iNos)和腎上腺髓質(zhì)素基因的表達(dá)。圖11顯示用本發(fā)明化合物治療動(dòng)物中的血液甘油三脂水平。圖12A和12B顯示用本發(fā)明化合物處理細(xì)胞中HIF-IQ的穩(wěn)定性。發(fā)明的描述在描述本發(fā)明的組合物和方法之前，須理解本發(fā)明不限于所述的具體 方法學(xué)、程序、細(xì)胞系、試驗(yàn)和試劑，因?yàn)樗鼈兪强梢愿淖兊?。也?yīng)理解 本文所用的術(shù)語(yǔ)目的是描述本發(fā)明的具體實(shí)施方案，不意味著限制本發(fā)明 的范圍，本發(fā)明的范圍由附屬的權(quán)利要求書(shū)所限定。必須指出，如本文和權(quán)利要求書(shū)中所用，單數(shù)形式的"一個(gè)"、"一種" 和"這個(gè)"包括復(fù)數(shù)參比物，除非文中另有說(shuō)明。因此，如本文所述和本領(lǐng) 域技術(shù)人員所知，例如參比某"片段"包括多個(gè)這類(lèi)片段；參比某"化合物" 指參比一個(gè)或多個(gè)化合物和其等價(jià)物。除非另有說(shuō)明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域 任何普通技術(shù)人員所共同理解的相同含義。雖然類(lèi)似于或等價(jià)于本文所述 的任何方法和材料可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝 置和材料。本文所引用的所有出版物其內(nèi)容納入本文作參考，目的是描述 和公開(kāi)這些出版物中報(bào)導(dǎo)的可能與本發(fā)明有關(guān)的方法學(xué)、試劑和工具。本 文中沒(méi)有任何東西構(gòu)成允許本發(fā)明有權(quán)憑借先前發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容倒填日 期。除非另有說(shuō)明，實(shí)施本發(fā)明可采用屬于本領(lǐng)域技術(shù)的化學(xué)、生物化 學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)和藥理學(xué)的常規(guī)方法。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有全面解釋。見(jiàn)例如Gennaro ， A . R主編的雷明頓藥物科 學(xué)(Remington 's Pharmaceutical sciences )， 第 18 版，1990 ， Mack Publishing co . ; Harman ， J . G ， Limird ， L . E禾卩Gilman , A . G .編，治療的 藥理學(xué)基礎(chǔ)(The Pharmacological Basis of Therapeutics )，第10版，2001 ; McGraw-Hill Co ; Colowick ， S等編，Methods in Enzymology， Academic Press ， Inc . ; Weir , D . M禾卩Blacwell , C .C編的實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè) (Handbook of Experimental Immunology )， 第I-IV巻，1986 ， Blackwell Scientific Publications ; Maniatis ， T等編的分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Molecular cloning : A Laboratory Manual )， 第二版，I-III巻，1989 ， Cold Spring Harbor Laboratory Press ; Ansubel ， F . M等編，分子生物學(xué)技術(shù)詳細(xì)實(shí) 驗(yàn)室過(guò)程(Molecular Biology Techniques : An Intensive Laboratory Course ): 1998, Academic Press; Newton ，C.R.，禾卩Graham ， A .編，生物技術(shù)系 歹lj介紹 (Introduction to Biotechniques series )， 第二版，1997 ， SpringerVerlag 。 定義術(shù)語(yǔ)"葡萄糖調(diào)節(jié)"或"葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)"本文用于指細(xì)胞、組織、器 官、器官系統(tǒng)或整個(gè)生物體通過(guò)改變例如葡萄糖代謝特異性加工的增加或 減少，來(lái)維持葡萄糖的體內(nèi)平衡的過(guò)程。葡萄糖代謝或葡萄糖代謝過(guò)程包 括涉及葡萄糖合成、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)、攝取、利用或儲(chǔ)存的過(guò)程，和包括葡萄 糖異生和糖酵解。葡萄糖代謝和調(diào)節(jié)的具體方面包括能促進(jìn)葡萄糖穿過(guò)細(xì) 胞膜及細(xì)胞保留或分泌葡萄糖的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或酶的表達(dá)；參與葡萄糖 利用和形成的酶，如糖酵解酶和葡萄糖異生酶，的表達(dá)和/或活性的改 變；以及體內(nèi)或培養(yǎng)基，包括例如間質(zhì)中(即細(xì)胞外)和細(xì)胞內(nèi)液、血液、 尿液等中葡萄糖分布的改變。術(shù)語(yǔ)"葡萄糖的體內(nèi)平衡"指維持、恢復(fù)或達(dá)到正?；蚪咏５难?水平。血糖的控制也可稱(chēng)為某機(jī)體內(nèi)糖化血紅素水平的正?；?br> 術(shù)語(yǔ)"代謝性疾病"和"代謝性失調(diào)"可互換使用，指與葡萄糖調(diào)節(jié)或血 糖控制受損或改變相關(guān)或惡化相關(guān)的(例如胰島素耐受性)任何疾病。這 類(lèi)疾病包括但不限于糖尿病、高血糖癥、肥胖等。術(shù)語(yǔ)"高血糖癥"本文用于一般指高于正常的血液葡萄糖水平。高血糖 癥可通過(guò)該領(lǐng)域技術(shù)人員已接受和所用的任何方法測(cè)定。目前人的正常血糖水平認(rèn)為在約70-120mg/dl之間，但取決于禁食狀態(tài)而不同。餐前血糖 范圍可在約80-120mg/dl ，而餐后二小時(shí)血糖可在約I80mg/dl或更低。此 外，禁食的個(gè)體正常血糖低于約110mg/dl。血糖水平約126mg/dl或更高 者通過(guò)認(rèn)為是高血糖癥，血糖高于約200mg/dl者一般視為糖尿病。術(shù)語(yǔ)"肥胖"指體內(nèi)脂肪過(guò)多。肥胖可通過(guò)該領(lǐng)域技術(shù)人員己接受和所 用的任何方法測(cè)定。目前己接受的肥胖衡量方法是體重指數(shù)(BMI)，為 體重的公斤數(shù)與身高的公尺數(shù)平方相比的測(cè)量值。通常20歲以上成人的 BMI在18.5-24.9之間認(rèn)為正常；10 BMI在25.0-29.9之間認(rèn)為過(guò)重； BMI超過(guò)30.0認(rèn)為是肥胖，BMI在40或超過(guò)40認(rèn)為是病態(tài)肥胖(見(jiàn)例 如Gallagher等(2000 ) Am J ClinNurt 72 : 694-701 )。這些BMI范圍依 據(jù)體重對(duì)疾病危險(xiǎn)性的增加作用而定。與過(guò)重和肥胖有關(guān)的一些常見(jiàn)疾病 包括心血管疾病、高血壓、骨關(guān)節(jié)炎、癌癥和糖尿病。雖然BMI與機(jī)體 脂肪有關(guān)，但BMI與確切的機(jī)體脂肪之間的關(guān)系隨年齡和性別而不同。 例如具有相同BMI的女性機(jī)體巧脂肪百分率可能比男性更高。肥胖的另一種衡量方法是機(jī)體脂肪百分率.現(xiàn)有的各種間接衡量楊體 脂肪的方法包括皮膚折皺測(cè)定、水密度測(cè)定、生物電阻分析(BIA )、 雙能量X-線吸收測(cè)定、機(jī)體總鉀測(cè)定和體內(nèi)氮活化測(cè)定。水密度測(cè)定，或 水(中)靜態(tài)測(cè)定(HW)通過(guò)測(cè)定受試者在水中和空氣中重量之間的差異 來(lái)測(cè)定機(jī)體總體積。類(lèi)似的，空氣置換體積描記圖(AP)通過(guò)測(cè)定將受試 者放在-空氣體積固定的室中時(shí)引起的室體積減少，來(lái)測(cè)定機(jī)體總體積。 然后用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的預(yù)測(cè)公式計(jì)算出機(jī)體總密度和組成。BIA以小電流通過(guò) 二電極間引起的電壓下降來(lái)估計(jì)電阻或電流阻抗。機(jī)體水和電解質(zhì)組成的 -種指標(biāo)，電阻的水平，可用于從開(kāi)發(fā)的回歸公式估計(jì)瘦肉組織含量和機(jī) 體的水體積。假設(shè)痩肉組織的含水組分時(shí)，可用其它的回歸公式估計(jì)機(jī)體 瘦肉量和脂肪量。女性體脂的百分率通常約17-27% ，雖然高達(dá)31%認(rèn)為
也可接受。男性體脂百分率-般應(yīng)為了0-20% ，雖然高達(dá)25%認(rèn)為也可接受。術(shù)語(yǔ)"HIFa"指缺氧可誘導(dǎo)因子蛋白的a亞基。HIFa可以是人或其它哺 乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，或其片段，包括人HIF-la( Genbank登錄號(hào) No .Q16665 ) 、 HIF-2a(Genbank登錄號(hào)No . AAB41495 )和HIF-3a (Genbank登錄號(hào)No . AAD22668 ):小鼠HIF-la(Genbank登錄號(hào)No . Q61221 ) 、 HIF-2a ( Genbank登錄號(hào)No . BAA20130和AAB41496 )和 HIF-3a( Genbank登錄號(hào)No , AAC72734 );大鼠HIF-kx (Genbank登錄號(hào) No.CAA70701 ) 、 HIF -2a( Genbank登錄號(hào)No . CAB96612 )和 HIF-3a( Genbank登錄號(hào)No .CAB96611 );和牛HIF-la( Genbank登錄號(hào) No.BAA78675 )。 HIFa也可以是任何非哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)或其片段，包括 非洲爪蟾laevis的HIF-la( Genbank登錄號(hào)No . CAB96628 )、黑腹果蠅 HIF-la ( Genbank登錄號(hào)No . JC4851 )和雞HIF-la (Genbank 5登錄號(hào) No BAA34234 ) 。 HIFa的基因序列也可用常規(guī)克隆技術(shù)獲得，例如用上 述HIFa基因序列的全部或一部分作為探針來(lái)發(fā)現(xiàn)其它物種中的HIFa基因序列。HIFa的片段包含人HIF-la的氨基酸401-603區(qū)域(Huang等，同 上)、氨基酸531 -575區(qū)域(Jiang等，J Bio Chem . 272 : 19253-260 ， 1997 )、氨基酸556-575區(qū)域(Tanimoto等，同上)、氨基酸557-571區(qū) 域(Srinivas等，Biochem Biophys Res 10 Commun . 260 : 557-561 , 1999 )、氨基酸556 -575區(qū)域(Ivan和Kaelin , Science . 292 : 464-468 , 2001 )。另外，HIFa片段包括含有至少一個(gè)LXXLAP基序的任何片段， 如見(jiàn)于HIFa天然序列中的L397TLLAP和L別EMLAP。此外，HIFa的片段 包括保留了 HIFa的至少一種特征性功能和結(jié)構(gòu)的任何片段。例如，用于 實(shí)施例14篩選試驗(yàn)的HIF膚可含有DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (SEQ ID No : 5 )。術(shù)語(yǔ)"HIF羥化酶"指能羥化HIFa蛋白質(zhì)，特別是HIFa亞基中的氨基酸殘基的任何酶。所述殘基優(yōu)選脯氨酸和域天冬酞胺殘基。術(shù)語(yǔ)"HIF天冬酞胺基羥化酶"指能羥化HIF蛋白中任何天冬酞胺殘基的任何酶，優(yōu)選被HIF天冬酞基羥化酶羥化的天冬酞胺殘基包括例如 HIF-loi的N803殘基或其它HIFa同工型中的同源性天冬酞胺殘。HIF天 冬酞胺基羥化酶包括抑制HIF因子20(FIH )、負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)HIFa反式激活 的HIF天冬酞基羥化酶(Genbank登錄號(hào)NoAA127308 ; Mahon等.Gene Dev . 15 : 2675 -2686 ， 2001 ; Lando等.Science295 : 858 -861 , 2002 ;和 Lando等.Gene Dev 16 : 1446 -1471 ， 2002 。也參見(jiàn)Elkins等.J Bio Chem C200644200 ， 2002 )。術(shù)語(yǔ)"HIF脯氨酞羥化酶"和"HIF PH "指能羥化HIF蛋白中脯氨酸殘 基的任何25酶。優(yōu)選被HIFPH羥化的脯氨酸殘基包括基序LXXLAP中 的脯氨酸，如人HIF-la天然序列中L397TLLAP和L559EMLAP的脯氨酸。 HIF PH包括Taylor ( Gene 275 : 125 -132 , 2001 )所述的禾口 Aravind及 Koonin ( Genome BiolZ : REsEARCH0007 ， 2001 ) 、 Epstein等(Cell. 107 : 43 -54 ，2001 )和Bmick及McKnight ( Science 294 : 1337 -1340 , 2001 ) 所特征鑒定的Egl-Nine(EGLN)基因家族成員。HIF PH酶的例子包括人 SM-20 ( EGLN1 ) ( Genbank登錄號(hào)No . AAG33965 ; Dupuy等。Genomics 69 : 348-54 , 2000 ) , EGLN2同工型l( Genbank登錄號(hào)No . CAC42510 ; Taylor ，同上)，EGLN1 ( Genbank登錄號(hào)No—060025 )和EGLN3 (Genbank登錄號(hào)No,CAC42515 ; Taylor ，同上)；小鼠EGLN1H (Genbank登錄號(hào)No . CAC42511) 、 EGLN2 ( Genbank登錄號(hào)No . CAC42511 )和EGLN3(SM-20)( Genbank登錄號(hào)No . CAC42517 )和大 鼠SM-20 (Genbank登錄號(hào)No . AAA19321 )。此外，HIF PH可包括秀麗 隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegan ) EGL-9 (Genbank ，登錄號(hào)No , AAD56365 )和黑腹果蠅(Drosophila melanogaster ) CG1114基因產(chǎn)物 (Genbank登錄號(hào)No . AAF52050 ) 。 HIF PH也包括上述全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的 任何活性片段。本文所用的"樣品"可產(chǎn)生自任何來(lái)源，例如體液、分沁物、組織、細(xì) 胞或培養(yǎng)的細(xì)胞，包括但不限于唾液、血液、尿液、血清、血漿、玻璃 體液、滑膜液、腦脊液、羊水和器官組織(如活檢組織)；從細(xì)胞分離的 染色體、細(xì)胞器或其它膜；基因組DNA 、 cDNA 、 RNA 、 mRNA等； 和清除的細(xì)胞或組織，或這類(lèi)細(xì)胞或組織的印染物或印制品。樣品可產(chǎn)生 自任何來(lái)源，如人體功非人哺乳動(dòng)物受試者。也考慮樣品來(lái)自任何患病動(dòng)
物模型。樣品可以是液體或可以固定或結(jié)合于一基質(zhì)。樣品可以是適合于 測(cè)定與代謝調(diào)節(jié)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)存在與否，或測(cè)定脂肪和葡萄糖水 平的任何物質(zhì)。獲得這類(lèi)樣品的方法是該領(lǐng)域技術(shù)水平之內(nèi)的事。"受試者"如本文所用可包括分離的原核或真核細(xì)胞，或培養(yǎng)的組織。 優(yōu)選項(xiàng)所述受試者包括動(dòng)物、特別是哺乳動(dòng)物，其包括大鼠、家兔、牛、 羊、豬、馬和靈長(zhǎng)動(dòng)物，特別是人。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供治療或預(yù)防糖尿病、高血糖癥和與葡萄糖代謝和/或體內(nèi) 穩(wěn)定改變或受損相關(guān)的其它疾病的方法和化合物。也提供用于治療、預(yù)防 和延緩與糖尿病和與葡萄糖代謝和/或體內(nèi)穩(wěn)定改變或受損相關(guān)的其它疾 病的發(fā)生和/或發(fā)展的方法和化合物，因?yàn)檫@些方法和化合物或調(diào)節(jié)葡萄 糖代謝和實(shí)現(xiàn)葡萄糖的體內(nèi)穩(wěn)定。本發(fā)明涉及到以下發(fā)現(xiàn)，即穩(wěn)定缺氧可誘導(dǎo)因子的a亞基(HIFcO可 導(dǎo)致降低血糖水平。本發(fā)明還涉及以下發(fā)現(xiàn)，即穩(wěn)定HIFa可調(diào)節(jié)葡萄糖 代謝。此外，本發(fā)明還涉及以下發(fā)現(xiàn)，即本發(fā)明的化合物可用來(lái)降低血糖 水平、調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和實(shí)現(xiàn)葡萄糖體內(nèi)平衡。缺氧可誘導(dǎo)因子(HIF)是一種參與多和生物途徑活動(dòng)的生理因子。 HIFa在正常的氧環(huán)境下降解。在缺氧或低氧條件下，HIFa穩(wěn)定而發(fā)揮一 些下游作用。最近確定羥化fflFa亞基中的特定殘基可使HIFa定向降解， 從而防止了在正常氧環(huán)境下形成穩(wěn)定的HIF復(fù)合物，確定了這種羥化是由 于某些HIF羥化酶活化所致(見(jiàn)例如Ivan和Kaelin . science 292 : 464-468 , 2001 : Jaakkola等，science 292 : 468 -472 ,2001 ; Epstein等，，cell 107 : 43 -54 , 2001 ; Bmick和McKnight Sciene 294 : 1337 -1340 , 2001 )。這些 HIF羥化酶屬于2-酮戊二酸雙加氧酶家族。這些酶是氧依賴(lài)性的，在低氧 或缺氧條，件下，HIFa殘基的羥化受到抑制。已描述了可治療性穩(wěn)定 HIFa和通過(guò)抑制HIFa羥化來(lái)穩(wěn)定HIFa (見(jiàn)國(guó)際出版物W003 / 0 49686 ，其內(nèi)容納入本文作參考)。方法 一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)穩(wěn)定受試者的缺氧可誘導(dǎo)因子的a亞基 (HIFa)來(lái)降低血糖水平或調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的方法。另一方面，該方法通 過(guò)抑制受試者的HIFa羥化來(lái)降低血糖水平或調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。在-優(yōu)選項(xiàng) 方面，本發(fā)明的方法包括通過(guò)抑制受試者的HIF羥化酶活性來(lái)降低血糖水 平或調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的方法。在最優(yōu)選項(xiàng)方面，該方法包括通過(guò)抑制HIF 脯氨酸羥化酶的活性來(lái)降低血糖水平或調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。穩(wěn)定HIFa可用該領(lǐng)域技術(shù)人員已有的和知道的方法之-實(shí)施，可能包 括采用能巧與HIFa相互反應(yīng)或結(jié)合或修飾HIFa的任何制劑，或能與 HIFa相互反應(yīng)的因子，包括例如，以HIFa作為底物的酶。在某些方面， 本發(fā)明提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的HIFa變體，如穩(wěn)定的HIF突變蛋白等，或編碼某 變體的多核苷酸(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No . 6,562,799禾B 6,124,131和 6,432,927)。在其它方面，本發(fā)明考慮穩(wěn)定HIFa包括給予能穩(wěn)定HIFa的 制劑。該制劑可由多核苷酸組成，如反義序列(見(jiàn)國(guó)際出版物WO2003 /0 45440 );多肽；抗體；其它蛋白質(zhì)；碳水化合物；脂肪；脂質(zhì)；和有機(jī) 及無(wú)機(jī)物質(zhì)，如小分子等。在一優(yōu)選項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明通過(guò)給予受試 者能穩(wěn)定HIFa的制劑來(lái)穩(wěn)定HIFa，其中所述制劑是一種化合物，例如能 穩(wěn)定HIFa的小分子化合物等。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括通過(guò)抑制至少一種選自2-酮戊 二酸雙加氧酶家族的酶活性來(lái)穩(wěn)定HIFa。在一優(yōu)選項(xiàng)實(shí)施方案中，所述 酶是HIF羥化酶，如EGLN-1 、 EGLN-2 、 EGLN-3 (見(jiàn)Taylor . Gene 275 : 125 -132 , 2001 ; Epstein等，Cell 107 : 43-54 ，2001 ; Bruick禾卩McKnight Sciene 294 : 1337 -1340 , 2001 )。然而特別考慮所述酶選自2 -酮戊二酸雙 加氧酶家族的酶，包括例如原膠元賴(lài)氨酰羥化酶、原膠元脯氨酰3-羥化 酶、原膠元脯氨酰4-羥化酶a(I)和a(II)、胸腺嘧啶7-羥化酶、天冬酰胺卩-羥化酶、s-N-三甲基賴(lài)氨酸羥化酶和Y-丁酸甜菜堿羥化酶等。(見(jiàn)例如 Majamaa等。Biochem J . 229 : 127-133 , 1985 ; Myllyharju和Kivirikko . EMBO J . 16 : 1173 -1150 ， 1997 ; Thornburg等.32 : 14023 -14033 , 1993和 Jia等.Proc Natl Acad Sci USA 91 : 7227 -7231 ， 1 994 )。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括通過(guò)抑制HIFa的某些殘基，如脯 氨酰殘基、天冬氨酰殘基等的羥化來(lái)降低血糖水平或調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。在
一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述殘基是脯氨酸殘基。在具體實(shí)施方案中，所述殘基是HIF-la中的Ps64殘基或其它HIFa同工型中的同源脯氨酸，或HIF-la 中的P4Q2殘基或其它HIFa同工型中的同源脯氨酸等。在其它實(shí)施方案中， 本發(fā)明方法可包括抑制HIFa的天冬酰胺殘基，如HIF-la的N柳殘基或其 它HIFa同工型中的同源天冬酞胺殘基的羥化。 化合物一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)給予受試者本發(fā)明的化合物來(lái)降低血糖水 平或調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的方法。本發(fā)明的化合物可以是能抑制或調(diào)節(jié)2-酮戊 二酸雙加氧酶活性的任何化合物。2-酮戊二酸雙加氧酶包括但不限于羥化酶?？闪u化靶底物殘基的羥化酶包括例如脯氨酰、賴(lài)氨酰、天冬氨酰(天冬酰胺)羥化酶等。羥化酶有時(shí)可通過(guò)底物來(lái)描述，如HIF羥化酶、 原膠元羥化酶等；和/或通過(guò)底物中的耙殘基來(lái)描述，如脯氨酰羥化酶、 賴(lài)氨酰羥化酶等或通過(guò)二者來(lái)描述，如HIF脯氨酰羥化酶、原膠元脯氨 酰羥化酶等。代表性的2-酮戊二酸雙加氧酶包括但不限于HIF羥化酶，包 括HIF脯氨酰羥化酶，如EGLNI 、 EGLN2和EGLN3、 HIF天冬酰胺羥 化酶，如HIF抑制因子(FIH)等；原膠元羥化酶如原膠元賴(lài)氨酰羥化酶、 原膠元脯氨酰羥化酶如原膠元脯氨酰3-羥化酶、原膠元脯氨酰4-羥化酶a(1) 和a(II)等；胸腺嘧啶7-羥化酶；天冬酰胺卩-羥化酶；s-三甲基賴(lài)氨酸羥化 酶；Y-丁酸甜菜堿羥化酶等。雖然酶活性20可包括與任何2-酮戊二酸雙 加氧酶相關(guān)的活性，但特別考慮能羥化底物中的氨基酸殘基。雖然特別包 括羥化底物中的脯氨酸和/或天冬氨酸殘基，但也考慮羥化其它氨基酸。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物是能抑制羥化酶活性的化合物。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物是能抑制HIF羥化酶的化合物。在不 同實(shí)施方案中，所述活性是由于HIF脯氨酰羥化酶，例如EGLN1、 EGLN2或EGLN3等所致。在其它實(shí)施方案中，所述活性是由于HIF天冬 酰胺羥化酶，例如但限于FIH所致。一方面，顯示對(duì)一種或多種2-酮戊二酸雙加氧酶有抑制活性的本發(fā)明 化合物，也可能顯示對(duì)一種或多種其它2-酮戊二酸雙加氧酶有抑制活性， 如能抑制HIF羥化酶活性的某化合物也可能抑制膠元脯氨酰羥化酶；能抑 制HIF脯氨酰羥化酶的某化合物也可能抑制HIF天冬酰胺羥化酶的活性。 一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)給予受試者本發(fā)明的化合物來(lái)降低血糖水平或調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的方法。本發(fā)明的化合物是能抑制HIF羥化酶活性的 小分子化合物。本發(fā)明的優(yōu)選化合物是能抑制HIF脯氨酰羥化酶活性的化 合物。可直接或間接抑制，可以是競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性抑制等。特別提供本 發(fā)明的化合物和鑒定本發(fā)明其它化合物的方法。在正常情況下，葡萄糖是機(jī)體供應(yīng)外周組織的主要能源。腦和其它神 經(jīng)組織在正常情況下需要葡萄糖作為唯一的能源，即使在應(yīng)激狀態(tài)下，如 長(zhǎng)期禁食時(shí)，需要大量的葡萄糖。肝臟是通過(guò)分解儲(chǔ)存的糖原或從前體物 質(zhì)如乳酸、丙酮酸、甘油和氨基酸合成來(lái)產(chǎn)生葡萄糖，調(diào)節(jié)血糖水平，防 止禁食時(shí)血糖水平下降的主要器官。維持葡萄糖的體內(nèi)穩(wěn)定，如葡萄糖的 內(nèi)部平衡，需要在肝臟有葡萄糖產(chǎn)生和外周葡萄糖的攝取及利用之間保持 平衡。血糖的體內(nèi)穩(wěn)定，葡萄糖內(nèi)部平衡的維持受到諸多生化因素的密切控 制和影響，包含各種生理過(guò)程。為達(dá)到葡萄糖的體內(nèi)平衡，機(jī)體從幾個(gè)水 平上調(diào)節(jié)葡萄糖，包括葡萄糖的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存、加工、合成、利用等。因此葡萄糖的體內(nèi)平衡受諸多因素的影響，包括例如外在因素如生 理需要、食物攝入等；和內(nèi)在因素如胰島素、糖原的循環(huán)水平等。葡萄糖水平升高葡萄糖正常調(diào)節(jié)的破壞可導(dǎo)致血糖水平變化，即與正常血糖水平相比 升高或降低。例如，慢性血糖水平升高是高血糖癥、糖尿病等的特征，可 對(duì)機(jī)體的各種器官、組織和系統(tǒng)產(chǎn)生多種不良作用。糖尿病、高血糖癥或 血糖水平升高與許多疾病和病癥相關(guān)，包括動(dòng)脈粥樣硬化加速、慢性心臟 病增加、心肌梗塞、中風(fēng)、微血管病變、血管損傷、導(dǎo)致手臂和腿部循環(huán) 減少的外周血管疾病、大血管拼發(fā)癥、眼科疾病如糖尿病性視網(wǎng)膜病妾、黃斑退變、白內(nèi)障等；腎病包括糖尿病性腎病、腎損傷等；神經(jīng)損傷和其 它神經(jīng)病變包括糖尿病神經(jīng)病變、外周神經(jīng)病變、自主性神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)的 損傷等、高胰島素血癥、高脂血癥、胰島素耐受、葡萄糖代謝損傷、葡萄 糖耐受損傷、皮膚和結(jié)締組織疾病、足部創(chuàng)傷和潰瘍、糖尿病酮酸中毒
可通過(guò)測(cè)定循環(huán)葡萄糖水平或測(cè)定血液/血漿葡萄糖水平來(lái)鑒定葡萄 糖調(diào)節(jié)的變化或受損，和是否存在或有發(fā)生糖尿病、高血糖癥等疾病的危 險(xiǎn)。最常通過(guò)禁食時(shí)的血糖測(cè)定、隨機(jī)血糖測(cè)定或口服葡萄糖耐受試驗(yàn)來(lái) 測(cè)定血糖水平。通過(guò)禁食時(shí)血糖試驗(yàn)來(lái)測(cè)定血糖水平。在此種分析中，反映禁食狀態(tài) 時(shí)(即不吃水以外的食物或液體)血糖水平的測(cè)量數(shù)值通常保持在約70mg/dL-110mg/dL之間。如果禁食狀態(tài)時(shí)血糖水平升高超過(guò)此典型示 范，例如到126mg/dL水平或更高，可作出糖尿病診斷。在一實(shí)施方案 中，本發(fā)明提供能將禁食狀態(tài)時(shí)血糖水平保持在或達(dá)到正常禁食狀態(tài)時(shí)血 糖水平，艮卩70mg/dL-110mg/dL之間的化合物和方法。在另一實(shí)施方案 中，本發(fā)明提供能將禁食狀態(tài)時(shí)的低血糖水平(即低于正常禁食狀態(tài)時(shí)的 血糖水平)升高或恢復(fù)到70mg/dL-110mg/dL之間的化合物和方法。在另一 實(shí)施方案中，本發(fā)明提供能將禁食狀態(tài)時(shí)升高的血糖水平(即血糖水平高 于禁食狀態(tài)正常水平)降低(減少)或恢復(fù)到約126mg/dL以下，和約 70mg/dL，更優(yōu)選約120-7Omg/dL ，最優(yōu)選約U0-70mg/dL的化合物和方 法。另一種血糖水平的測(cè)定方法是隨機(jī)血糖試驗(yàn)。以這種方式測(cè)定的血糖水平 通常顯示的值在低至中等100秒(mg/dL)。約180mg/dL或更高的隨機(jī) 血糖水平是高血糖癥，約180mg/dL或更高水平表明存在發(fā)生血糖調(diào)節(jié)受 損相關(guān)疾病如糖尿病的危險(xiǎn)。因此， 一方面，本發(fā)明提供的方法和化合物 能使隨機(jī)血糖試驗(yàn)測(cè)定的血糖水平維持或達(dá)到正常水平，即低至中等100 秒(mg/dL)。另一方面本發(fā)明的方法和化合物可用于使隨機(jī)血糖試驗(yàn)測(cè)定 的降低到正常水平以下的血糖水平恢復(fù)達(dá)到正常水平，即低至中等100秒 (mg/dL)。還有一方面，本發(fā)明的方法和化合物可用于降低/減少高于正 常的，即高于低至中等100秒(mg/dL)的血糖水平。在各種方面，該方 法和化合物能將升高的血糖水平降低至約200-100 mg/dL水平面，更優(yōu)選 至180-100 mg/dL水平，最優(yōu)選至150-100 mg/dL水平。也可用口服葡萄糖耐受試驗(yàn)來(lái)鑒定受試者是否患有或有患葡萄糖調(diào)節(jié) 損傷、高血糖癥、糖尿病的危險(xiǎn)。在此試驗(yàn)中，讓個(gè)體喝-杯糖水液禁食 過(guò)夜，幾小時(shí)后測(cè)定血糖水平。具有正常葡萄糖耐受/調(diào)節(jié)的人，如無(wú)糖 尿病等者，在喝下糖水后測(cè)定的血糖水平升高然后迅速下降。喝糖水后二小時(shí)讀取的正常血糖水平低于約140 mg/dL，在0時(shí)和2小時(shí)之間讀取的所 有值都低于200 mg/dL。如果在口服葡萄糖耐受試驗(yàn)中測(cè)定的血糖水平在 約140-199 mg/dL范圍內(nèi)， 一般診斷為葡萄糖耐受受損。如果測(cè)定的血糖 水平約為20Omg/dL或更高， 一般診斷為糖尿病。本發(fā)明的方法和化合物 可用于在口服葡萄糖耐受試驗(yàn)后保持、恢復(fù)或達(dá)到正常血糖水平。 葡萄糖調(diào)節(jié)因子的表達(dá)一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供能提高產(chǎn)物參與細(xì)胞葡萄糖攝取和利用的 基因的表達(dá)的化合物和方法。這種基因包括但不限于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白， 如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GluT) -1和GluT-3;葡萄糖酵解酶如醛縮酶-A、烯醇 化酶-1、己糖激酶-1、已酮激酶-2、果糖磷酸激酶-L和果糖磷酸激酶-P。 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子及其利用的治療性上調(diào)將有效降低胰島素的耐受、降低血糖 水平，從而在代謝疾病病人，如2型糖尿病、高血糖癥、葡萄糖控制受 損、葡萄糖耐受受損等的病人中產(chǎn)生有利的作用。一方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防高血糖癥的化合物和方法。這種化合 物和方法適合治療或預(yù)防高血糖癥相關(guān)疾病，如由于葡萄糖釋放增加、葡 萄糖利用減少和/或葡萄糖攝取受損所致的血糖水平升高。這些疾病還與 胰島素耐受、葡萄糖耐受受損、2型糖尿病和/或肥胖相關(guān)。一方面，本發(fā)明的方法提供了活化能調(diào)節(jié)葡萄糖和葡萄糖代謝(包括 全身加工和利用)水平和活性的基因表達(dá)文庫(kù)的工具。該方法能補(bǔ)償機(jī)體 調(diào)節(jié)這種加工天然機(jī)制的缺陷(例如不能產(chǎn)生胰島素可對(duì)其反應(yīng))。本發(fā) 明提供的方法可治療與葡萄糖控制受損相關(guān)的代謝性疾病或病癥。這些疾 病包括但不限于葡萄糖耐受受損(IGT)或前糖尿病、糖尿病、高血糖癥 等。本發(fā)明特別考慮選擇性設(shè)計(jì)被特定器官攝入時(shí)可被激活的前藥化合 物。例如，由于肝臟能產(chǎn)生參與脂肪體內(nèi)平衡的許多蛋白質(zhì)，本發(fā)明考慮 在本發(fā)明的方法中選擇性地靶向肝臟。選擇性上調(diào)肝臟中的一些基因，如 醛縮酶基因，可采用能被肝特異性酶從無(wú)活性轉(zhuǎn)變成活性的化合物來(lái)實(shí) 現(xiàn)。例如，對(duì)某活性化合物起作用的羧酸可相應(yīng)的醇代替。肝中的醇脫氫 酶(ADH)活性可將這類(lèi)化合物轉(zhuǎn)變成活性形式。因?yàn)槠渌鞴偃鄙貯DH
活性，該化合物只能在肝內(nèi)被選擇性激活。類(lèi)似的，可使本發(fā)明方法中所 用的化合物靶向其它器官，如脂肪組織、腎、骨骼肌、心臟等。 胰島素胰島素是調(diào)節(jié)機(jī)體大多數(shù)細(xì)胞代謝平衡，刺激葡萄糖攝取的關(guān)鍵性激 素。當(dāng)存在胰島素時(shí)，大多數(shù)細(xì)胞采用葡萄糖作為它們的代謝燃料，脂肪 細(xì)胞利用葡萄糖合成脂肪，肝細(xì)胞將葡萄糖轉(zhuǎn)變成糖原和脂肪。血胰島素 升高隨后立即血糖升高，幾種與葡萄糖攝取相關(guān)的活動(dòng)刺激了胰島素分 泌。血糖水平隨后降低時(shí)，胰島素釋放迅速減少，葡萄糖進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)以 外的細(xì)胞受到抑制。不供應(yīng)葡萄糖時(shí)細(xì)胞利用糖原和脂肪作為代謝燃料。 肝臟和脂肪細(xì)胞開(kāi)始分解儲(chǔ)存的糖原和脂肪。結(jié)果肝臟向血液提供葡萄糖 而不是從血液攝取葡萄糖，肝臟和脂肪組織都向血液提供脂肪酸。因此， 胰島素水平低時(shí)降低了胰島素敏感組織的葡萄糖攝取，促進(jìn)了肝臟中的葡 糖異生和糖原分解(糖元破壞)，減少了糖原合成，并促進(jìn)了儲(chǔ)存糖原和 脂肪的代謝。機(jī)體不能產(chǎn)生胰島素，或?qū)σ葝u素?zé)o反應(yīng)，例如對(duì)胰島素敏感性降 低，即胰島素耐受等可導(dǎo)致各種疾病，包括糖尿病和高血糖癥。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受損原因與胰島素耐受有關(guān)。本發(fā)明的方法可降低胰島素 耐受以恢復(fù)受損的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)或提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。本發(fā)明提供降低或減少胰島素耐受的方法。在某些方面，通過(guò)穩(wěn)定HIF(x來(lái)降低胰島素耐受。在 其它方面，提供了通過(guò)抑制HIFPH活性而降低胰島素耐受的方法。胰島素敏感性提高與胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-l(IGFBP-l)的高血漿 水平正相關(guān)。IGFBP-1血漿水平也與青少年的體重指數(shù)負(fù)相關(guān)(Travers 等，J Clin Endocrinol Metab . 83 : 1935 -1939 ， 1998 )。此外，低IGFBP-1 水平與2型糖尿病心血管危險(xiǎn)增加相關(guān)(Gibson等.J Clin Endocrinol Metab 81 : 860-563 ，1996 )。因此，在恢復(fù)或維持胰島素敏感性，即治療 胰島素耐受中，需要提高IGFBP-1的水平。此外，影響果糖磷酸-l-激酶(PFK)的基因缺陷可導(dǎo)致胰島素耐受和2 型糖尿病。因?yàn)镻FK是糖酵解級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的速度限制性酶，糖酵解級(jí)聯(lián)反 應(yīng)中此酶活性的降低通常與胰島素耐受和2型糖尿病明顯相關(guān)。因此，提
高PFK和其它糖酵解因子，如醛縮酶、烯醇化酶、己糖激酶等的水平是恢 復(fù)或維持胰島素敏感性，如降低胰島素耐受所需要的。本發(fā)明的化合物顯示能提高IGFBP-1、 PFK和其它糖酵解酶的表達(dá)(見(jiàn) 實(shí)施例4 )。因此，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供協(xié)同表達(dá)某些基因(其 產(chǎn)物如IGFBP-1、 PFK等，參與葡萄糖加工和利用)的方法和化合物。在 另一實(shí)施方案中，本發(fā)明通過(guò)協(xié)同表達(dá)式這類(lèi)基因，提供能提高胰島素敏 感性，如降低胰島素耐受等的方法和化合物。 一方面，該方法包括例如穩(wěn) 定受試者的HIFa。本發(fā)明還通過(guò)給予受試者本發(fā)明的化合物，如能抑制 HIF羥化酶活性的制劑，來(lái)提供增加胰島素敏感性的方法。糖化血紅素糖尿病控制和供發(fā)癥試驗(yàn)(DCCT)的結(jié)果證明血糖控制的改進(jìn)減少了 供發(fā)癥，包括非增殖性和增殖性視網(wǎng)膜病變(降低47%)、微白蛋白血癥 (降低39%)、臨床腎病(降低54% )和神經(jīng)病變(降低60。/。)(DCCT 研究小組，NEnglJMed 329 :977 -986， 1993 )。此外，英國(guó)糖尿病預(yù)后 研究(UKPDs)證明血糖控制與微血管供發(fā)癥減少相關(guān)，嚴(yán)格的血壓控制 顯著減少了大血管和小血管講發(fā)癥(UKPDS小組，Lancet 352 : 837 -853 , 1998 )。糖化血紅素(也稱(chēng)為糖血紅蛋白、糖基化血紅素、HbAlc或HbAl)可 通過(guò)使各種糖分子(最常用葡萄糖)結(jié)合血紅素分子而形成，其形成的速 率與血糖濃度成正比。糖化血紅素水平的測(cè)定提供了前2-3個(gè)月的平均血 糖濃度的精確指數(shù)。臨床上糖化血紅素水平提供了對(duì)糖尿病病人血糖控制 的評(píng)估手段。正常(非糖尿病)的糖化血紅素水平范圍是4-6%。在糖尿病 個(gè)體的研究中，DCCT發(fā)現(xiàn)與具有較高水平HbAlc的糖尿病個(gè)體相比，將 HbAlc水平降低或維持到7.2%可導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變減少76%、神經(jīng)病變減 少60%、腎病減少50%、心血管疾病減少35%。本發(fā)明提供降低糖化血紅素水平的化合物和方法。 一實(shí)施方案中，采 用本發(fā)明方法和化合物來(lái)維持、恢復(fù)或使糖化血紅素水平達(dá)到約4 -6%。 在另-實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和化合物可降低糖化血紅素水平低于約9 %，更優(yōu)選低于約8%，最優(yōu)選低于約7%。糖尿病和肥胖 肥胖是一種危險(xiǎn)因素，有時(shí)是糖尿病的一種惡性副作用。肥胖的特征 是脂肪積蓄過(guò)量，具體是內(nèi)臟或中樞脂肪水平過(guò)高。因此治療或預(yù)防肥胖 可最大程度減少發(fā)生糖尿病的危險(xiǎn)，事實(shí)上對(duì)糖尿病病人或診斷有糖尿病 風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體常開(kāi)出減輕體重的處方。本發(fā)明的化合物在體內(nèi)研究中己顯示能防止或減慢體重的增加(見(jiàn)實(shí) 施例9和10)。因此， 一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)減少或預(yù)防肥胖來(lái)治療或預(yù)防糖尿病的方法。 一方面，該方法包括例如穩(wěn)定受試者的HIFa。本 發(fā)明還提供了通過(guò)給予受試者本發(fā)巧明的化合物，如能抑制HIF羥化酶活 性的制劑，來(lái)治療或預(yù)防該受試者肥胖的方法。如上所述，糖尿病與多種 疾病和病癥相關(guān)。例如。心血管疾病(CVD)是2型糖尿病病人死亡的主 要原因。2型糖尿病病人比非糖尿病病人死于CVD高2-6倍。這些病人顯 著數(shù)量死于慢性心臟病(CHD)。高脂血癥在2型糖尿病病人中常見(jiàn)并引 起CHD。 2型糖尿病病人的常見(jiàn)脂質(zhì)分布為，與非糖尿病個(gè)體相比甘油三 脂較高而HDL膽固醇較低。類(lèi)似的甘油三脂和HDL膽固醇異常見(jiàn)于肥胖 (特別是具有內(nèi)臟脂肪增加的個(gè)體)、高血壓和胰島素耐受(如代謝綜合 征)的非糖尿病個(gè)體。甘油三脂水平升高已表明是心血管疾病的-種危險(xiǎn)因 素。升高的甘油三脂是代謝綜合征的-種重要成分。 糖尿病和高血壓高血壓，或血壓升高是糖尿病的-種危險(xiǎn)因素。此外，高血壓及其相 關(guān)疾病的作用可伴隨產(chǎn)生糖尿病或?qū)е绿悄虿?。因此，治療或預(yù)防高血壓 可盡量減少糖尿病或發(fā)生糖尿病的危險(xiǎn)，強(qiáng)調(diào)糖尿病這方面的治療方法應(yīng) 是有價(jià)值的。本發(fā)明提供這樣-種方法。具體說(shuō)，本發(fā)明的方法和化合物可用于治 療糖尿病相關(guān)的高血壓。例如，本發(fā)明的化合物可提高血壓調(diào)節(jié)因子如腎 上腺髓質(zhì)激素和一氧化氮合成酶的表達(dá)(見(jiàn)料施例12 )。因此， 一方面， 本發(fā)明通過(guò)降低或預(yù)防高血壓，提供治療或預(yù)防糖尿病的方法。 一方面， 該方法包括例如穩(wěn)定受試者的HIFct。本發(fā)明還提供了通過(guò)給予受試者本 發(fā)明的化合物，如能抑制HIF羥化酶活性的制劑，來(lái)治療或預(yù)防該受試者 高血壓的方法。協(xié)同治療方法
糖尿病與多種有害的同時(shí)發(fā)生或發(fā)展、重疊的和/或相繼發(fā)生的疾病 相關(guān)。例如，高血壓、血管和循環(huán)損傷、肥胖可導(dǎo)致糖尿病發(fā)生發(fā)展危險(xiǎn) 性的增加。因此，可同時(shí)降低這類(lèi)危險(xiǎn)因素和癥狀的治療方法是有價(jià)值 的。
本發(fā)明提供這類(lèi)方法。具本說(shuō)，本發(fā)明的方法和化合物可用于實(shí)現(xiàn)多 種效應(yīng)。例如如上所述，肥胖是糖尿病發(fā)生的一種危險(xiǎn)因素。此外，肥胖 可因糖尿病，例如由于特殊的治療方法而發(fā)生。具體說(shuō)，胰島素介導(dǎo)了脂 質(zhì)攝入脂肪組織，加重了肥胖，進(jìn)而加重了胰島素耐受。本發(fā)明因此一方 面提供治療或預(yù)防肥胖和以協(xié)同方式提高胰島素敏感性，來(lái)治療或預(yù)防糖 尿病的方法。
本發(fā)明的化合物能降低血糖水平(見(jiàn)實(shí)施例6)、減少內(nèi)臟和腹部脂肪(見(jiàn)實(shí)施例9 )、提高糖化酶的表達(dá)從而提高胰島素敏感性(見(jiàn)實(shí)施例4) 和提高血壓調(diào)節(jié)因子的表達(dá)(見(jiàn)實(shí)施例12)，因而能調(diào)節(jié)機(jī)體的血管張力， 維持正常血壓水平或?qū)寡軓埩Φ淖兓?，如高血壓的作用等。因此一?面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防糖尿病的方法，該方法包括穩(wěn)定受試者的 HIFct。來(lái)降低血糖水平面和減少內(nèi)臟脂肪。另一方法還包括提高胰島素敏 感性來(lái)治療或預(yù)防受試者的糖尿病。另一方法還包括提高血壓調(diào)節(jié)因子的 表達(dá)來(lái)治療或預(yù)防受試者的糖尿病。 代謝性疾病本發(fā)明提供能調(diào)節(jié)代謝活動(dòng)的化合物，和利用該化合物治療代謝失調(diào)相關(guān)疾病或病癥的方法。這類(lèi)疾病包括但不限于糖尿病、高血糖癥和肥 胖。
一方面，本發(fā)明提供利用所述化合物預(yù)防或治療糖尿病的方法，該方法包括給予需要的病人治療有效量的該化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，單 獨(dú)給予或與藥學(xué)上可接受的賦形劑一起給予。
一實(shí)施方案中，根據(jù)預(yù)測(cè)的情況，如葡萄糖體內(nèi)平衡受損、葡萄糖耐受受損、高血糖癥、糖尿病或肥 胖等情況給予該化合物。
另一方面，本發(fā)明提供利用該化合物治療高血糖癥的方法，該方法包 括給予需要的病人治療有效量的該化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，單獨(dú)給 予或與藥學(xué)上可接受的賦形劑一起給予。 一實(shí)施方案中，給予診斷為伴有 發(fā)生高血糖癥相關(guān)疾病如糖尿病的病人該化合物?？膳c各種其它治療方法聯(lián)合給予該化合物。 一實(shí)施方案中，該化合物 與外源性胰島素如合成的人胰島素聯(lián)用。葡萄糖調(diào)節(jié)本發(fā)明的方法和化合物能提高烯醇化酶的表達(dá)。這些結(jié)果表明本發(fā)明 的方法和化合物可用于調(diào)節(jié)參與糖酵解的基因的表達(dá)。也提供了通過(guò)提高 糖羚化調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的方法和化合物。本發(fā)明提供提高GluT-l表達(dá)的方法和化合物。 一方面，本發(fā)明的方法 能調(diào)節(jié)參與葡萄糖攝取的因子的表達(dá)。本發(fā)明的方法和化合物提供了增加 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞的治療方法。治療性上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子將有效降低胰 島素耐受，提高胰島素敏感性，降低血糖水平，從而對(duì)高血糖癥或糖尿病 病人產(chǎn)生有利作用。本發(fā)明的方法和化合物能提高腎、肝和肺中的葡萄糖調(diào)節(jié)因子，包括 磷酸果糖激酶-P、磷酸果糖激酶-L、醛縮酶-1、 GluT-l、乳酸脫氫酶、烯 醇化酶-l和已糖激酶-1的表達(dá)。 一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可協(xié)同調(diào)節(jié) 其產(chǎn)物參與葡萄糖攝取和利用的基因的表達(dá)，從而可調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。治 療性上調(diào)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用將降低胰島素耐受，提高胰島素敏感性，降 低血糖水平，從而提供了治療高血糖癥或糖尿病的方法。利用本發(fā)明的方法和化合物可提高腎和肝中編碼胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié) 合蛋白-l(IGFBP-l)基因的表達(dá)。IGFBP-1血漿高水平與胰島素敏感性提高 正相關(guān)。因此本發(fā)明的方法和化合物可用于提高胰島素敏感性和增加葡萄 糖轉(zhuǎn)運(yùn)，從而調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。治療性提高胰島素敏感性和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)將 降低血糖水平，從而提供了治療高血糖癥或糖尿病的方法。本發(fā)明提供的方法和化合物能提高細(xì)胞的葡萄糖攝取。本發(fā)明的方法 和化合物在胰島素存在下可提高葡萄糖攝取，表明本發(fā)明的方法和化合物 可提高細(xì)胞的胰島素敏感性，導(dǎo)致葡萄糖攝取的增加和葡萄糖調(diào)節(jié)的改 變。治療性提高胰島素敏感性和葡萄糖攝取可用于治療患胰島素敏感性降 低或胰耐受的全體，從而提供了治療高血糖癥或糖尿病的方法。
本發(fā)明的方法和化合物也可用于提高胰島素激發(fā)的葡萄糖攝入組織。 本發(fā)明的方法和化合物可用于提高組織的葡萄糖攝入，提高其對(duì)胰島素的 敏感性。葡萄糖攝入增加對(duì)血糖水平升高的個(gè)體，如高血糖癥或糖尿病個(gè) 體，或?qū)崿F(xiàn)或維持葡萄糖體內(nèi)平衡有缺陷的個(gè)體，提供了降低其血糖水平 的方法。因此，本發(fā)明的方法和化合物可通過(guò)提高胰敏感性、提高葡萄糖 攝入和降低血糖水平來(lái)治療高血糖癥和糖尿病。用本發(fā)明的化合物治療動(dòng)物顯示血糖水平呈劑量依賴(lài)性降低。通過(guò)改 變?cè)摶衔锏膭┝靠蓪⒀撬奖３衷谒杷?。因此一方面，本發(fā)明的 方法和化合物可用于調(diào)節(jié)血糖水平。另一方面，本發(fā)明的方法和化合物可 用于降低血糖水平。因此本發(fā)明的方法和化合物可用于治療性降低血糖水 平。通過(guò)降低血糖水平，本發(fā)明提供了治療高血糖癥和糖尿病的方法。給 予本發(fā)明的化合物改進(jìn)了飲食誘導(dǎo)肥胖和葡萄糖耐受受損動(dòng)物模型中的葡 萄糖從循環(huán)中的廓清。提高葡萄糖廓清降低了血糖水平。因此一方面，本 發(fā)明的方法通過(guò)提高葡萄糖廓清或降低血糖水平可用于調(diào)節(jié)葡萄糖耐受受 損個(gè)體的葡萄糖代謝。治療性提高葡萄糖廓清和降低血糖水平可用于治療 病人，包括糖尿病病人或有發(fā)生糖尿病危險(xiǎn)的病人。糖尿病的治療本發(fā)明的方法和化合物能降低糖尿病動(dòng)物模型的血糖水平。此外，本 發(fā)明的方法和化合物能恢復(fù)和實(shí)現(xiàn)糖尿病和葡萄糖耐受受損動(dòng)物模型的葡 萄糖體內(nèi)平衡。糖化血紅素水平反映了糖尿病病人或高血糖癥個(gè)體中的血糖控制和葡萄糖體內(nèi)平衡的維持。降低糖化血紅素水平表明本發(fā)明的方法 和化合物可用于改變個(gè)體的葡萄糖調(diào)節(jié)，從而恢復(fù)、達(dá)到或維持葡萄糖體 內(nèi)平衡。因此，本發(fā)明的方法和化合物通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，和恢復(fù)、達(dá) 到或維持葡萄糖體內(nèi)平衡，可用于治療高血糖癥和糖尿病。用本發(fā)明的化合物和方法治療動(dòng)物降低了糖尿病動(dòng)物模型中糖化血紅 素的積累。糖化血紅素水平反應(yīng)了糖尿病患者或高血糖癥患者對(duì)血糖水平 的控制和葡萄糖體內(nèi)平衡的維持。糖化血紅素的水平降低說(shuō)明本發(fā)明的化 合物和方法可用于改變個(gè)體的葡萄糖調(diào)節(jié)，從而恢復(fù)、實(shí)現(xiàn)或維持葡萄糖 體內(nèi)平衡。因此，本發(fā)明的化合物可方法可通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖代謝并恢復(fù)、 實(shí)現(xiàn)或維持葡萄糖體內(nèi)平衡來(lái)治療高血糖癥和肥胖。
用本發(fā)明化合物治療的動(dòng)物顯示其體重增加呈劑量依賴(lài)性延緩。特別 地，用該化合物治療的動(dòng)物觀察到內(nèi)臟脂肪墊呈劑量依賴(lài)性減少。因此， 本發(fā)明的方法和化合物可用于減少脂肪儲(chǔ)存和減少內(nèi)臟脂肪。肥胖，特別 是伴有內(nèi)臟、腹部或中樞脂肪過(guò)量的肥胖，與高血糖癥和糖尿病相關(guān)。具 體說(shuō)，伴有胰島素敏感性降低、胰島素耐受提高等的肥胖將導(dǎo)致高血糖癥 和發(fā)生糖尿病。 一方面，本發(fā)明的方法和化合物通過(guò)減少內(nèi)臟的脂肪可減 少發(fā)生高血糖癥或糖尿病的危險(xiǎn)。另一方面，本發(fā)明的方法和化合物通過(guò) 減少肥胖可降低發(fā)生高血糖癥或糖尿病的危險(xiǎn)。藥物制劑和給藥途徑如該領(lǐng)域所熟知，本發(fā)明的組合物可直接輸送或放在含賦形劑的藥物 組合物中輸送。本發(fā)明的治療方法可包括給予患有代謝性疾病，具體是葡 萄糖調(diào)節(jié)相關(guān)疾病，如糖尿病、高血糖癥等，或有患這類(lèi)疾病危險(xiǎn)的受試 者，治療有效量的本發(fā)明化合物。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述受試者是哺 乳動(dòng)物，在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述受試者是人?；衔锘蛩幬锏挠行Я?，如劑量，不難用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定，可通過(guò)有效 有和常規(guī)的途徑和適當(dāng)?shù)闹苿┙o藥。該領(lǐng)域己有各種制劑和藥物輸送系統(tǒng)(見(jiàn)Gonnaro主編，2000，雷明頓藥物科學(xué)(Remington's Pharmaceutical Sciences )，同上和Hardman ， Limbird與Gilman編的治療的藥理學(xué)基礎(chǔ) (The Pharmacological Basis of Therapetics),同上)。合適的給藥途徑可包括，例如口服、直腸、局部、鼻內(nèi)、肺內(nèi)、眼 內(nèi)、腸道內(nèi)和腸胃道外給藥。主要的腸胃道外給藥途徑包括靜脈內(nèi)、肌肉 內(nèi)和皮下給藥。第二種給藥途徑包括腹膜內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、心內(nèi)、腦 池內(nèi)、皮內(nèi)、病灶內(nèi)、眼內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、尿道內(nèi)和心室內(nèi)給藥。應(yīng) 優(yōu)選要治療的指征與藥物的物理、化學(xué)和生物學(xué)性能，表明制劑類(lèi)型和所 用的給藥途徑，以及是否局部或全身輸送。本發(fā)明化合物的藥物劑量形式可提供的有一次性釋放、控釋、緩釋或 靶向藥物輸送系統(tǒng)。常用的劑量形式包括例如，溶液、懸浮液、(小)乳 液、軟膏、凝膠和貼片、脂質(zhì)體、片劑、糖衣丸、軟或硬膠囊、錠劑、卵 狀小體(ovule)、植入物、無(wú)定形或結(jié)晶粉末、氣溶膠和凍干制劑。取決 于使用的給藥途徑，可能需要特殊裝置來(lái)施加或給予藥物，例如，注射器
和針頭、吸入器、泵、注射筆、施加器或?qū)Ｓ闷俊Ｋ幬飫┝啃问匠０?物、賦形劑和容器/密封系統(tǒng)?？稍诒景l(fā)明的化合物中加入一種或多種稱(chēng) 為無(wú)活性成分的賦形劑，以改善或有利于制造、穩(wěn)定性、藥物的給藥和安 全性，可提供一種實(shí)現(xiàn)藥物所需釋放方式的工具。因此，加入該藥物中的 賦形劑的類(lèi)型取決于多種因素，例如藥物的理化性能、給藥途徑和制造方 法。藥學(xué)上可接受的賦形劑該領(lǐng)域己具有，包括各種藥典中所列出的那些(見(jiàn)USP、 JP、 EP禾卩BP、 FDAweb頁(yè)(www.fda.gov)，惰性成分指南 (Inactive Ingredient Guide) 1996 ， 和藥物添加劑手冊(cè)(Handbook ofPharmaceutical Additives),Ash 編；Synapse Information Resources Inc.2002)?？捎迷擃I(lǐng)域熟知的任何方法制備本發(fā)明化合物的藥物劑量形式，如常 規(guī)的混合法、過(guò)篩、溶解、融化、制粒、糖衣丸制備、制片、懸浮、擠 壓、噴霧干燥、研磨、乳化、(納米/微米)包裹、陷夾或凍干加工。如 上所述本發(fā)明的組合物可包含一種或多種生理上可接受的無(wú)活性成分，以 有利于將活性分子加工到具有藥物用途的制品中。適當(dāng)?shù)闹苿┤Q于所需的給藥途徑。對(duì)于靜脈注射，例如，該組合物 可配制成水溶液，如果需要，可采用生理相容性緩沖劑，包括例如，磷 酸、組氨酸或檸檬酸來(lái)調(diào)節(jié)制劑的pH ，和采用張力調(diào)節(jié)劑如氯化鈉或葡 萄糖。對(duì)于經(jīng)粘膜或鼻內(nèi)給藥，優(yōu)選半固體、液體制劑或貼片，可含滲透 增強(qiáng)劑，這類(lèi)滲透增強(qiáng)劑是該領(lǐng)域通常知道的。對(duì)于口服給藥，可將該化 合物配制成液體或固體劑量形式，和一次性釋放或控釋/緩釋制劑。適合 受試者口服的劑量形式包括片劑、丸藥、糖丸、硬和軟殼膠囊、液體、凝 膠、糖漿、糖水、懸浮液和乳液。該化合物也可配制在直腸組合物中，如 錠劑或保留灌腸劑中，如含有常規(guī)錠劑基質(zhì)如可可油或其它甘油基質(zhì)的灌 腸劑中?？刹捎觅x形劑，包括填充劑、崩解劑、粘合劑(干的或濕的)、溶解 延緩劑、潤(rùn)滑劑、促滑劑、防粘劑、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、增濕劑、抗氧化 劑、防腐劑、著色劑和芳香劑。這些賦形劑可來(lái)源于合成的或天然的。這 類(lèi)賦形劑的例子包括纖維素衍生物、檸檬酸、磷酸二鈣、明膠、碳酸鎂、 月桂酸硫酸鎂/鈉、甘露醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、硅酸鹽、二氧
化硅、苯甲酸鈉、山梨醇、淀粉、硬脂酸及其鹽、糖(即葡萄糖、蔗糖、 乳糖等)、滑石粉、西黃耆膠粘漿、植物油(加氫的)和蠟。乙醇和水可 作為制粒輔助劑。在某些情況下，可能需要用掩蔽氣味的膜、抗胃酸膜、 或釋放延巧緩膜來(lái)包裹片劑。常常聯(lián)用天然和合成的聚合物與著色劑、 糖、有機(jī)溶劑和水來(lái)包裹片劑，產(chǎn)生糖丸。當(dāng)包裹藥片、藥粉、懸浮液或 溶液優(yōu)選用膠囊時(shí)，可以相容的硬或軟殼膠囊來(lái)輸送。在一實(shí)施方案中，可局部，例如通過(guò)皮膚貼片、半固體開(kāi)液體制劑， 如凝膠、(小)浮劑、軟膏、溶液、(納米/微米)懸浮液、或泡沫制劑 給予本發(fā)明的化合物?？刹捎美?，滲透促進(jìn)劑；適當(dāng)選擇和組合親脂 性、親水性和兩性賦形劑，包括水、有機(jī)溶劑、蠟、油、合成的和天然的聚合物、表面活性劑、促乳化劑，通過(guò)調(diào)節(jié)pH 、采用促混合劑，來(lái)調(diào)節(jié)藥物對(duì)皮膚和其下組織的滲透?？刹捎闷渌夹g(shù)，如離子電滲療法，來(lái)調(diào) 節(jié)本發(fā)明化合物對(duì)皮膚的滲透。優(yōu)選透皮或局部給藥，例如在需要最低限 度全身接觸的情況下局部輸送藥物。對(duì)于吸入給藥或鼻內(nèi)給藥，本發(fā)明的化合物可以溶液、懸液、乳液或 加壓包裝的半固體氣溶膠形式或采用螺旋槳推進(jìn)的噴霧器，如甲烷和乙 烷、二氧化碳或任何其它合適的氣體產(chǎn)生的鹵化碳常規(guī)輸送。對(duì)于局部施 加氣溶膠，可采用丁烷、異丁烷和戊烷類(lèi)碳?xì)浠衔铩＞图訅簹馊苣z而 言，可通過(guò)提供-輸送確定量氣溶膠的閥門(mén)來(lái)確定適當(dāng)?shù)膭┝繂挝??？膳?制用于吸入器或吹入器中的膠囊和明膠栓。這些膠囊或栓通常含有化合物 的混合粉末和適合的粉末基質(zhì)，如乳糖和淀粉。通常以單位劑量形式，如在安瓿、注射器、注射筆或多劑量容器(常 含有防腐劑)中，提供配制的用于胃腸道外注射的除菌組合物。此組合物 可采取懸液、溶液或油性或水性乳液形式，可含有配制試劑，如緩沖劑、 強(qiáng)化劑、粘性增強(qiáng)劑、表面活性劑、懸而未決浮和分散劑、抗氧化劑、生 物相容性聚合物、螯合劑和防腐劑。取決于注射部位，到家載體可含水、 合成的油或植物油和/或有機(jī)促溶劑。某些情況下，如凍干產(chǎn)品或濃縮產(chǎn) 品時(shí)，可在給藥之前重建或稀釋胃腸道外給藥制劑?？商峁┍景l(fā)明化合物 控釋或緩釋的儲(chǔ)存制劑，可包含納米/微米級(jí)顆?；蚣{米/微米級(jí)或非微 化晶體的可注射懸浮液。聚合物，除該領(lǐng)域熟知的那些外，如聚(乳酸)
聚(羥乙酸)，或其共聚物或用作控釋/緩釋基質(zhì)?？梢灾踩胛锖托枰?割的泵形式提供其它儲(chǔ)存輸送系統(tǒng)。本領(lǐng)域熟知適合靜脈注射本發(fā)明分子的載體，其包括能形成離子化化 合物的含堿如氫氧化鈉的和作為增強(qiáng)劑的蔗糖或氯化鈉的堿性溶液，例 如，含磷酸或組氨酸的緩沖液?？杉尤牍踩軇?，如聚乙二醇。這些水系統(tǒng) 能有效溶解本發(fā)明的化合物，對(duì)全身給藥只產(chǎn)生低毒性。溶液系統(tǒng)的各組 分比例可相當(dāng)不同而不破壞其溶解性和毒性特征。另外，諸組分的身分可 以改變。例如，可采用低毒的表面活性劑，如聚山15梨醋或波洛沙姆， 可加入聚乙二醇或其它共溶劑、生物相容性聚合物如聚乙烯吡咯垸酮，其 它糖和聚醇來(lái)代替葡萄糖。對(duì)于目前治療方法所用的組合物，起初可用本領(lǐng)域熟知的各種技術(shù)估 計(jì)治療有效劑量。動(dòng)物研究所用的最初劑量可根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)確定的有 效濃度而定。適合人用的劑量范圍可用動(dòng)物研究和細(xì)胞培養(yǎng)所獲得的數(shù)據(jù) 確定。本發(fā)明的化合物或藥物的治療有效量或劑量，指該化合物或藥物可導(dǎo) 致受試者的癥狀緩解或生存延長(zhǎng)的量或劑量。這類(lèi)分子的毒性和治療效果 可通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)程序來(lái)確定，例如，通過(guò)測(cè)定LD50 (導(dǎo)致50%群體死亡的劑量)和ED50 (50 %群體治療有效的 劑量)來(lái)確定。毒性和療效的劑量比值是治療指數(shù)，可用LD50/ED50比值 表示。優(yōu)選顯示高治療指數(shù)的制劑。有效量或治療有效量是所述化合物或藥物組合物能誘導(dǎo)研究者、獸 醫(yī)、醫(yī)生或其它臨床人員所認(rèn)為的組織、系統(tǒng)、動(dòng)物或人產(chǎn)生生物學(xué)或醫(yī) 反應(yīng)的量，例如能調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、降低升高的或增加的血糖水平、治療 或預(yù)防葡萄糖代謝改變相關(guān)疾病如糖尿病的量。優(yōu)選項(xiàng)的劑量應(yīng)落在包括ED50并有極小或沒(méi)有毒性的循環(huán)濃度范圍 內(nèi)。劑量可在此范圍內(nèi)根據(jù)所用的劑量形式和/或給藥途徑而變化。應(yīng)按 照本領(lǐng)域己知方法根據(jù)受試者狀況的特征選擇精確的制劑、給藥途徑、劑 量和劑量間隔?？蓚€(gè)別調(diào)整劑量和間隔以提供能充分獲得所需效果，如調(diào)節(jié)葡萄糖代 謝、降低血糖水平等的血漿水平的活性成分，即盡量減少有效濃度
(MEC)。各化合物的MEC不同但可從例如體外資料和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)估計(jì)。 需要獲得MEC的劑量取決于個(gè)體的特征和給藥途徑。就局部給藥或選擇 性攝入而言，藥物的有效局部濃度可能與血漿濃度無(wú)關(guān)。可根據(jù)多種因素，包括待治療受試者的性別、年齡和體重、疾病的嚴(yán) 重程度、給藥方式和醫(yī)生的判斷確定給予的制劑或組合物的量。如果需要，本發(fā)明的組合物可以裝在含一個(gè)或多個(gè)單位劑量形式(含 有活性成分)的填裝或分散裝置中。例如，這種填裝或裝置可包括金屬或 塑料泊，如起泡填裝物或玻璃和橡皮塞如小瓶中。該填裝或分散裝置可裝 有給藥說(shuō)明書(shū)。也可制備用相容性藥學(xué)載體配制的含本發(fā)明化合物的組合 物，裝其放在適當(dāng)?shù)娜萜髦校N上治療某種標(biāo)明疾病的標(biāo)簽?；衔锛捌浜Y選方法本發(fā)明的化合物是能抑制羥化酶活性的化合物，具體說(shuō)，其中的羥化 酶活性是2-酮戊二酸雙加氧酶活性。更優(yōu)選羥化酶活性是HIF羥化酶的活 性。最優(yōu)選羥化酶活性是HIF脯氨酞羥化酶的活性。本發(fā)明的方法是依靠穩(wěn)定HIFa以實(shí)現(xiàn)受試者的特殊效果的方法。通 過(guò)給予受試者能穩(wěn)定HIFa以實(shí)現(xiàn)受試者的特殊效果的化合物來(lái)完成本發(fā) 明的方法。最優(yōu)選通過(guò)給予本發(fā)明的化合物來(lái)實(shí)施該方法。本發(fā)明的化合物示范性地用于本發(fā)明與穩(wěn)定HIFa有關(guān)的方法中。具 體說(shuō)，本發(fā)明提供能抑制羥化酶活性和/或HIFa羥化、穩(wěn)定HIFcx等的化 合物，和篩選及鑒定其它化合物的方法。本發(fā)明的化合物包括能抑制羥化 酶活性的化合物，其中優(yōu)選的羥化活性是2-酮戊二酸雙加氧酶的活性。更 優(yōu)選羥化酶活性是HIF羥化酶的活性。HIF羥化酶可羥化HIF蛋白，優(yōu) 選HIFa亞基中的任何氨基酸，包括例如，脯氨酸或25天冬氨酸殘基等。 在-特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述羥化酶活性是HIF脯氨酰羥化酶和/或 HIF天冬酰胺羥化酶的活性。本領(lǐng)域知道2 —酮戊二酸雙加氧酶的抑制劑。例如，己鑒定到前膠原 脯氨酰4-羥化酶的幾種小分子抑制齊U(見(jiàn)Majamaa等，Eur J Biochem 138 : 239 -245 , 1954 ; Majamaa等，Biochem J 229 : 127 -133 , 1985 ; Kivirikko和 Myllyharju , Matrix Biol 16 : 357 -368 ， 30 1998 ; Bickel等，Hepatology 28 : 404 -411 , 1998 ; Friedman等，Proc Natl Acad Sci USA 97 : 4736-4741 ，2000 ; Franklin等，Biochem J 353 : 333 -338 , 2001 ;所有文獻(xiàn)的內(nèi)容都 納入本文作參考)。也己鑒定到HIF羥化酶的小分子抑制劑(見(jiàn)國(guó)際公開(kāi) 號(hào)WO 02/07498l，WO 03/049686和WO 03/080566,所有文獻(xiàn)的內(nèi)容納入本 文作參考)。本發(fā)明特別考慮采用能用本領(lǐng)域已知方法鑒定的這些和其它 的化合物。2-酮戊二酸雙加氧酶家族中的所有酶對(duì)于它們的羥化酶活性都需要 氧、Fe2+、 2-酮戊二酸和抗壞血酸(見(jiàn)Majamaa等，Biochem J 229 : 127 -133 , 1985 : Myllyharju和Kivirikko EMBO J 16 : 1173-1180， 1997; Thomburg等，32 : 14023 -14033 ， 1993 ;和Jia等，Pro Natl Acad Sci USA 91 : 7227-7231 )。因此，本發(fā)明的化合物包括但不限于鐵螯合 劑、2-酮戊二酸模擬物和修飾的氨基酸如脯氨酸或天冬氨酸同類(lèi)物。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供使用2-酮戊二酸的結(jié)構(gòu)模擬物。這 種化合物可競(jìng)爭(zhēng)性抑制靶子2-酮戊二酸雙加氧酶與2-酮戊二酸的反應(yīng)，并 非競(jìng)爭(zhēng)性其與鐵的反應(yīng)(Majamaa等1954 ，同上；Majamaa等，1985 ， 同上)。特別考慮采用例如Majamaa等，同上；Kiviri硅。和Myllyharju ， Matrix Biol 16 : 357 -368 , 1995 ; Bickd等，Hepatology 28 : 404-411 ， 1998 ; Friedman等，Proc Natl Acad Sci USA 97 : 4736 -4741 ， 2000 ; Franklin , Biochem Soc Trans 19 : 8 12 -815 , 1991 : Franklin等，Biochem J 353 : 333 -338,2001和國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 03/049686中所述的化合物，以上所有文獻(xiàn) 的內(nèi)容納入本文作參考。示范性的化合物包括菲咯啉，其包括但不限于美國(guó)專(zhuān)利5，916，898和 6,200,974;國(guó)際出版物WO 99/21860中所述的那些；雜環(huán)羰基甘氨酸，包 括但不限于美國(guó)專(zhuān)利5，719，164和5,726,305中所述取代的喹啉-2-酞胺及 其酯；美國(guó)專(zhuān)利6,093,730中所述取代的異喹啉-3-酰胺及其酯；歐洲專(zhuān)利 EPO650961和美國(guó)專(zhuān)利5,658,933中所述的3-甲氧基吡啶羰基甘油及其酯； 美國(guó)專(zhuān)利5,620,995和6,020,350中所述的3-羥基吡啶羰基甘油及其酯；美 國(guó)專(zhuān)利5,607,954、 5,610,172和5,620,996中所述的5-亞磺酞氨基羰基吡啶 '羧酸鹽及其酯。這些專(zhuān)利中列出的所有化合物，特別是權(quán)利要求化合物中 和工作實(shí)施例中列出的那些化合物都納入本申請(qǐng)書(shū)中作參考。
因此，本發(fā)明的優(yōu)選化合物包括，例如雜環(huán)酰胺。特別優(yōu)選的雜環(huán)酰 胺包括，例如異喹啉、喹啉、吡啶、噌啉、咔啉等。此外，優(yōu)選化合物的 結(jié)構(gòu)類(lèi)型包括蒽醌、氮雜芴、氮雜菲咯啉、苯并咪唑啉、苯并呋喃、苯并 吡喃、苯并噻吩、兒茶酚、二氫色原酮、(X-二酮、呋喃、N-羥基酰胺、N-羥基脲、咪唑、吲唑、吲哚、異噻二唑、異噻唑、異噁二唑、異噁唑、a-酮酸、a-酮酰胺、a-酮酯、a-酮亞胺、噁二唑、草酰酰胺、噁唑、噁唑 啉、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、吡唑啉、噠嗪、吡啶、喹唑啉、菲咯啉、 四唑、噻二唑、噻唑、噻唑啉、噻吩和三唑。以下用于本發(fā)明實(shí)施例中的示范性化合物表明了本文所述本發(fā)明的方 法[(7-氯-3-羥基-喹啉基-2-羰基)氨基)]-乙酸(化合物八)，[(1-氯-4-羥基-異喹啉基-3-羰基)氨基]-乙酸(化合物B)， [(4-羥基-7-苯氧基-異喹啉基-3-羰基)氨基]-乙酸(化合物C )，4-氧-l，4-二氫-[l,10]菲咯啉基-3-羧酸(化合 物D),[(l-氯-4-羥基-7-甲氧基-異喹啉基-3-羰基)氨基]-乙酸(化合物E)， [(3-羥基-6-異丙氧基-喹啉基-2-羰基)氨基]-乙酸(化合物F), [(3-羥基-卩比啶基-2-羰基)-氨基]-乙酸(化合物G)，和[(7-節(jié)氧基-l-氯-4-羥基-異喹啉基-3-羰基) 氨基]-乙酸甲酯(化合物H)。可采用各種試驗(yàn)和篩選技術(shù)，包括下述的那些，來(lái)鑒定本發(fā)明的化合 物，即能制羥化酶活性的化合物。這些化合物適合用于本發(fā)明方法中。適 合用于本發(fā)明方法中的其它化合物，即能穩(wěn)定HIFa的化合物可由該領(lǐng)域 技術(shù)人員用己有的試驗(yàn)和篩選方法作鑒定。試驗(yàn)通?？商峁┡c反應(yīng)底物的消耗，或與反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)生有關(guān)的可檢 測(cè)信號(hào)。檢測(cè)例如可包括熒光團(tuán)、放射性同位素、酶偶聯(lián)物和本領(lǐng)域熟 知的其它可檢測(cè)標(biāo)記。結(jié)果可以是定量或定性的。標(biāo)記物可有利于反應(yīng)產(chǎn) 物的分離，如生物素或組氨酸尾可通過(guò)沉淀或親和層析使反應(yīng)產(chǎn)物從其它 反應(yīng)成分中純化出來(lái)。本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)化了測(cè)定羥化酶活性的試驗(yàn)。這類(lèi)試驗(yàn)?zāi)苤苯踊蜷g接測(cè)定 羥化酶的活性。例如，某試驗(yàn)?zāi)軠y(cè)定酶底物，如靶蛋白、合成肽模擬物、 或其片段中存在的羥化殘基，如脯氨酸、天冬氨酸等(見(jiàn)Palmerini等，J Chromatogr 339 : 285 -292 ， 1985 )。還原某化合物中存在的羥化脯氨酸或 天冬氨酸表明該化合物能抑制羥化酶活性?；蛘咚鲈囼?yàn)?zāi)軠y(cè)定羥化反應(yīng)
的其它產(chǎn)物，如2-酮戊二酸形成的琥珀酸(見(jiàn)Cunliffe等，BiochemJ240: 617-619 ) 。 Kaule和G麗ler (Anal Biochem 184 : 291 -297 ， 1990 )描述 了一種測(cè)定2-酮戊二酸產(chǎn)生琥珀酸的示范性方法。上述這些方法可用于鑒定能調(diào)節(jié)HIF羥化酶活性的化合物。實(shí)施例 14中描述了示范性方法(見(jiàn)上)。靶蛋白可包括HIFa或其片段，如 HIF(556-575);例如實(shí)施例14中所述試驗(yàn)用的典型底物為 DLDLEMLAPYIPMDDDFQL(SEQ ID NO:5 )。所述酶包括，例如獲自任何 來(lái)源的HIF脯氨酰羥化酶(見(jiàn)GenBank登錄號(hào)No . AAG33965等)、HIF 天冬氨酰羥化酶(見(jiàn)GenBank登錄號(hào)No.AAL27308等)。所述酶可存在 于細(xì)胞粗制裂解液中，或是部分純化形式。例如，在Ivan等(Science 292: 464 -468 , 2001和Proc Natl Acad Sci USA 99 : 13459 -13464 ， 2002 )和 Hirsila等(J Bio Chem 278 : 30772 -30780 , 30 2003 )中描述了直接或間接 測(cè)定HIF羥化酶活性的方法；國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 03/049686中描述了其它方 法。測(cè)定和比較缺少和存在所述化合物時(shí)的酶活性，將鑒定到能抑制 HIFot羥化的化合物。HIFa穩(wěn)定性和/或HIF激活的試驗(yàn)可包括直接測(cè)定樣品中的HIFa (見(jiàn)實(shí)施例14,同上)、通過(guò)測(cè)定與vonHippelLindau蛋白質(zhì)相關(guān)的HIFa 減少(見(jiàn)國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 00/69908)、或HIF應(yīng)答性靶基因或報(bào)導(dǎo)構(gòu)建物的 活化(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,942，434)來(lái)間接測(cè)定HIFa。測(cè)定和比較缺少和存在 所述化合物時(shí)HIF和/或HIF-應(yīng)答性靶蛋白質(zhì)的水平，將鑒定到能穩(wěn)定 HIFa和/或活化HIFa的化合物?？刹捎没?-氧化[l-"C]戊二酸羥化-偶聯(lián)脫羧基試驗(yàn)，鑒定能調(diào)節(jié) HIF特異性脯氨酰羥化酶活性的化合物(見(jiàn)Hirsila等，J Bio Chem 278 : 30772-30780,2003 )。該反應(yīng)25"C在1.0 ml的反應(yīng)體積中進(jìn)行，其中含 10-100微升洗滌劑如Triton-X-lOO、獲自表達(dá)內(nèi)源性HIF脯氨酰羥化酶或 重組HIF脯氨酰羥化酶的裂解細(xì)胞提取液、0.05pM DLDLEMLAPYIPMDDDFQL ( SEQ ID NO : 5 ) 、 0.005, FeS04 0.16jxM 2-氧化[1-4(:]戊二酸、2pM抗壞血酸、60pg過(guò)氧化氫酶、O.l(iM 二硫蘇糖 醇和50pM Tris-鹽酸緩沖液，調(diào)pH到7.8。 37°C進(jìn)行反應(yīng)20分鐘。該反
應(yīng)產(chǎn)生的"C02被捕捉在懸褂于反應(yīng)混合物上方大氣中浸泡堿液的濾紙 上，并在液閃計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。通過(guò)閱讀本文內(nèi)容本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難實(shí)施本發(fā)明的這些和其它 實(shí)施方案。實(shí)施例參見(jiàn)以下目的純粹是說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例將能進(jìn)-步了解木發(fā)明。提 供這些實(shí)施例只是為了說(shuō)明本發(fā)明的權(quán)利要求。本發(fā)明不限于目的是說(shuō)明 本發(fā)明-個(gè)方面的示范性實(shí)施例所述的范圍。功能上相等的任何方法都在 本發(fā)明的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得按照以上描述并參考附圖可對(duì)本發(fā) 明作出本文所述以外的各種修改，這類(lèi)修改都屬于本發(fā)明權(quán)利要求的范 圍。實(shí)施例l:實(shí)驗(yàn)材料通常，用于本發(fā)明方法用的脯氨酰羥化酶抑制劑化合物是采用本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法合成的。用高效液本色譜分析化合物的純 度，室溫避光保存。在制備不同用途的制劑時(shí)，采用PULVERISETTE 7 行星式超微磨(FritshGMBH, Germany )以750rpm使化合物懸浮超粉化 20分鐘以形成均勻大小的顆粒。在使用前立即制備經(jīng)口管飼的超微粉化合物的懸浮液。給藥時(shí)將化合 物懸浮在含0.5X羧甲基纖維素(CMC; Spectrum Chemical Gardena CA), 0.1 %聚山梨酯80 (Mallinckrodt Baker,Inc., Phillipsburg NJ)的水溶液中，用磁 攪拌器或旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)持續(xù)攪拌。計(jì)算懸液的濃度達(dá)到給定體積和所需劑量水 平。另外的方法中，秤重化合物并置于適當(dāng)大小的明膠膠囊中用于口服， 對(duì)照動(dòng)物接受同樣大小的空膠囊；或?qū)⒒衔镫S意溶于代替水的lOOmM 的組氨酸(Mailinckrodt Baker)溶液中。對(duì)于注射給藥，先將化合物與等摩爾量的氫氧化鈉混合于10%的葡萄 糖(Spectmm)或25mM組氨酸加等滲氯化鈉(Mailinckrodt Baker)的水溶 液中。實(shí)施例2 :葡萄糖調(diào)節(jié)因子的體外表達(dá)增加本發(fā)明化合物對(duì)參與葡萄糖調(diào)節(jié)和代tf的蛋白質(zhì)和基因的表達(dá)的作用 如下。將人293A細(xì)胞(腺病毒轉(zhuǎn)化的胎腎上皮細(xì)胞)鋪滿接種在裝有含5% FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基的35mm養(yǎng)皿中，37°C， 10。/。C02條件下培養(yǎng)l天。將培養(yǎng)基換成Opti-Meml ，繼18-24小時(shí)。在 培養(yǎng)基中另入載體對(duì)照或化合物B ，再培養(yǎng)24、 48或72小時(shí)。將平板置 于冰上棄去培養(yǎng)上清液，加入裂解緩沖液-l(LB-l: 10mM Tris pH7.4, lmM EDTA,150mM氯化鈉，0.5%IGEPAL)。刮下收集細(xì)胞裂解物，將其在冰 上培育15分鐘，然后4。C離心3000xg5分鐘分級(jí)。收集代表胞質(zhì)組分的上 清液，用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在還原條件下分離胞質(zhì)蛋 白，每泳道加入等到量的蛋白質(zhì)。在150V下進(jìn)行SDS-PAGE 2小時(shí)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在 4°C 400mA 1.5小時(shí)。用T-TBS洗一次，加入用封閉緩沖液稀釋到工作濃 度的抗醛縮酶抗體。4°C輕搖培育過(guò)夜。用T-TBS洗膜4次，然后與用封 閉緩沖液稀釋的偶聯(lián)第二抗體室溫培育l小時(shí)。用T-TBA洗膜4次，然后 用X-光膠片和ECL SUPERSIGNAL WEST FEMTO或PICO化學(xué)發(fā)光底物 (Pierce Chemical Co. Rockford IL)按照制造商說(shuō)明書(shū)顯影和觀察。如圖1A所示，用化合物B處理24、 48和72小時(shí)的細(xì)胞中醛縮酶的 表達(dá)隨時(shí)間而增加，但用載體對(duì)照處理的細(xì)胞中醛縮酶表達(dá)不見(jiàn)增加。化 合物B處理培養(yǎng)物未顯示p-微管蛋白表達(dá)增加，表明醛縮酶的增加是特異 性的，與蛋白質(zhì)表達(dá)的總體增加無(wú)關(guān)。這些結(jié)果表明本發(fā)明的化合物和方法可用于調(diào)節(jié)參與糖酵解基因的表 達(dá)，并提示用本發(fā)明化合物治療可通過(guò)增強(qiáng)糖酵解而提高葡萄糖的利用率 和代謝。實(shí)施例3 :葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GluT)-l的體外表達(dá)增加 在100mm培養(yǎng)皿中，37°C， 10% C02條件下在含10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)人SSC-25 (鱗狀上皮細(xì)胞癌)或大鼠H9c2 (心室心 肌細(xì)胞)至鋪滿。用PBS洗細(xì)胞2次，與載體對(duì)照、化合物D(10和25)或化合物C(5 、 10和20pM )培育16小時(shí)。將平板置于冰上， 棄去培養(yǎng)上清液，加入裂解緩沖液-l(LB-l : 10mMTrispH7.4，lmMEDTA， 150mM氯化鈉，0.5。/。IGEPAL )。刮下收集細(xì)胞裂解物，冰上培育15分 鐘，然后4°C離心3000xg5分鐘。收集代表胞質(zhì)組分的上清液，用SDS-
聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE )在還原條件下分離胞質(zhì)蛋白，每泳道加 入等到量的蛋白質(zhì)。在150V下進(jìn)行SDS-PAGE2小時(shí)，然后4°C 400mA 1.5小時(shí)或過(guò)夜， 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用T-TBS洗一次，加入用封閉緩沖液稀釋到 工作濃度的抗-GluT-l抗體(Alpha Diagnostics )。 4°C輕搖培育過(guò)夜后， 用T-TBS洗膜4次，然后與用封閉緩沖液稀釋的偶聯(lián)第二抗體室溫培育1 小時(shí)。用T-TBA洗膜4次，然后用X-光膠片和ECLSUPERSIGNALWEST FEMTO或PICO化學(xué)發(fā)光底物(PierceVhemicalCo.RockfordIL )按照制 造商說(shuō)明書(shū)顯影和觀察。圖IB所示資料表明化合物D和化合物C分別提高了 SSC-25和H9c2 細(xì)胞的介導(dǎo)葡萄糖攝入的主要可誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，GluT-1蛋白的水 平。本發(fā)明的化合物和方法能夠提高細(xì)胞的GluT-1表達(dá)提供了研究化合物 對(duì)葡萄糖體外攝取作用的工具。這些結(jié)果顯示本發(fā)明的化合物和方法可用 于提高參與葡萄糖攝入的蛋白質(zhì)的表達(dá)，因而為高血糖癥、糖尿病或葡萄 糖體內(nèi)平衡調(diào)節(jié)有缺陷的其它疾病病人，提供了增強(qiáng)葡萄糖攝入和降低血 糖水平的治療方法。實(shí)施例4 :葡萄糖調(diào)節(jié)因子的體外表達(dá)增加為了確定基因隨時(shí)間推移的誘導(dǎo)方式，從Simonsen.Inc獲得雄性Swiss Webster小鼠(30-32克)24只并用口飼管口服4ml/kg體積的0.5%羧甲 基纖維素(CMC : Sigma-Aldrich , St. Louis Mo) ( Omg / kg /天)或1.25 % 化合物B(25mg/ml0.5。/。CMC)(10Omg/kg)治療。在最后一次服藥后4 、 8 、 16 、 24 、 48和72小時(shí)，用異氟垸麻醉。然后處死小鼠，分離得到 腎、肝、腦、肺和心臟的組織樣品，儲(chǔ)存于-2(TC的RNALATER溶液液 (Ambion)中。為了研究本發(fā)明化合物的劑量反應(yīng)，將12只雄性Swiss Webster小鼠 (30-32克，獲自Simonsen,Inc.,GilroyCA )每天一次用口飼管口服4ml/kg 體積的0.5%羧甲基纖維素(CMC : Sigma-Aldrich ， St丄ouis MO)、化合物D (25mg/ml，用0.5 % CMC配)、或化合物B (7.5和25mg/ml ，用0.5 % CMC 配)(分別30和lOOmg/kg/天)治療4天。在最后一次服藥后4小時(shí)，麻
醉并處死小鼠，分離得到約150mg的肝和每只腎，并儲(chǔ)存在-2(TC的 RNALATER溶液液(Ambion )中。用以下方法分離上述實(shí)驗(yàn)所得組織的RNA :各器官制成50mg的 小方塊，加入875微升RLT緩沖液(RNEARY試劑盒Qiagen Inc.， Valencia CA)，用旋轉(zhuǎn)式POLYTRON勻漿器(Kinematica， Inc., Cincinnati OH)勻 漿化切片20秒。微離心勻漿液3分鐘沉降不溶性物質(zhì)，將上清液轉(zhuǎn)移到一 新試管中，用RNEASY試劑盒(Qiagen)按制造商說(shuō)明書(shū)分離得到RNA 。 該RNA洗脫在80微升水中，用RIBOGREEN試劑(Molecular Probes, Eugene OR )定量。然后用DNA — FREE試劑盒(Ambion Inc., Austin TX) 按制造商說(shuō)明書(shū)除去RNA中的基因組DNA 。測(cè)定260和280吸光值確 定RNA的純度和濃度。或者將組織樣品切成小方塊在TRIZOL試劑(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad CA)中用旋轉(zhuǎn)式POLYTRON勻漿器(Kinematica) 勻漿化。勻漿液置室溫另入0.2體積的氯仿強(qiáng)烈攪拌樣品。室溫培育混合 物幾分鐘，然后4。C 12,000g離心15分鐘。收集水相加入0.5體積的異丙 醇。室溫混合樣品IO分鐘，4°C 12，000g離心10分鐘。棄去上清，沉淀用 75% EtOH洗滌，4°C 7 ， 5,000g離心5分鐘。用DNA-FREE試劑盒 (Ambion Inc., Austin TX)按制造商說(shuō)明書(shū)除去RNA中的基因組DNA 。 測(cè)定260和280吸光值確定RNA的純度和濃度。用0.3M乙酸鈉(pH5.2 )、 50ng/ml糖原和2.5體積的乙醇，-20°C沉 淀RNA—小時(shí)。離心樣品用80%冷乙醇洗滌沉淀，干燥，重懸于水中。 用T7-dT )24第 一 鏈引物(Affymetrix, Inc., Santa Vlara CA )和 SUPERSCRIPT CHOICE系統(tǒng)(Invitrogen)按照制造商說(shuō)明書(shū)合成雙鏈 cDNA 。用等到體積25:14:1的酚氯仿異戊醇和PHASE LOCK GEL 插入物(brinkman， Inc., Westbury NY)抽提最終的cDNA。收集水相用0.5體 積的7.5M乙酸銨和2.5體積的乙醇沉淀cDNA?；蛘?，用GENECHIP樣 品清除模塊(Affymetrix )接制造商說(shuō)明書(shū)純化cDNA 。用BIOARRAY HIGHY正LD RNA轉(zhuǎn)錄標(biāo)記試劑盒(Enzo Diagnostics, Inc., Farmingdale NY )按制造商說(shuō)明書(shū)在體外翻譯反應(yīng)中從cDNA合成生 物素標(biāo)記的cRNA。用GENECfflP樣品清除模塊(Affymetrix)接制造商
說(shuō)明書(shū)純化最后標(biāo)記的產(chǎn)物并片段化。在lx雜交緩沖液(lOOmM MES ，lM[Na+] ,20mM EDTA ,0.01 % Tween 20)中加入5嗎探針，100嗎/ml鯡魚(yú)精子DNA ， 500ng/ml乙?；疊SA ， 0.03nM對(duì)照寡B2 (Affymetrix)和lx GENECHIP真核雜交對(duì)照物 (Affymetrix)，制備雜交混合物。將此雜交混合物依次在99°C和45°C培 育5分鐘，然后離心5分鐘。將鼠基因組U74AV2陣列(MG-U74AV2; Affymetrix)置于室溫，然后與lx雜交液45'C搖動(dòng)預(yù)雜交10分鐘。該緩沖用80微升雜交混合物置換，以60rpm45。C將該陣列與計(jì)量 平衡液雜交16小時(shí)。雜交后用6xSSPE,0.1 %Tween20洗滌陣列一次，然 后洗滌并用R-藻紅蛋白偶聯(lián)的鏈霉親和素(Molecular Probes, Eugene OR)、 生物素化羊抗鏈霉親和素抗體(Vector Laboratories, Burlingame CA)禾口 GENECHIP Fluidics Station 400儀器(Affymetrix)按照制造商的micro—lvl 程序(Affymetrix)染色。用GENEARRAY掃描儀(Affymetrix)和微陣列 組軟件(Affymetrix)分析此陣列。鼠基因組U74AV2陣列(MG-U74AV2 ; Affymetrix )提供了 Mouse UniGene Database build 74 (生物技術(shù)信息國(guó)家中心(National center for Biotechnology Information, Bethesda MD ))中的所有序列(約6000個(gè))， 該序列己經(jīng)功能性特征分析并有約6000個(gè)未注釋的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST) 簇。如圖2A 、 2B和2C所示，編碼參與葡萄糖調(diào)節(jié)酶的基因的表達(dá)，在 用化合物B處理后以協(xié)同方式增加。圖2A 、 2B和2C提供的轉(zhuǎn)錄模式 包括血小板類(lèi)型的磷酸果糖激酶(PFK)-P(A)、肝臟類(lèi)型的PFK-L(B)、烯 醇化酶-l(C)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GluT)-l (D)、乳酸脫氫酶-l(E)、醛縮酶-l(F) 和已糖激酶-l(G)。在時(shí)間曲線中，大多數(shù)mRNA水平在給予化合物后早 期達(dá)到峰值，24-48小時(shí)后回到對(duì)照水平。另外，不同器官之間編碼糖酵 解酶的基因表達(dá)相類(lèi)似，但腎(圖2A)肝(圖2B)和肺(圖2C)在特定 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的增加和增加的時(shí)間上表現(xiàn)不同。這些不同部分與向 各組織提供重要能源，特別在應(yīng)激時(shí)提供能源的糖酵解活動(dòng)程度不同相關(guān)。 這些結(jié)果表明本發(fā)明的化合物可特異性誘導(dǎo)糖酵解作用，這些作用可因組 織而不同。
如圖3A所示，低劑量(30mg/ml)或高劑量(100mg/ml )化合物處 理可導(dǎo)致腎中GluT-l編碼基因表達(dá)的劑量依賴(lài)性改變。此例中GluT-l表 達(dá)的增加提供了通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖來(lái)調(diào)節(jié)血糖水平的機(jī)制。如圖3B 所示，用化合物B處理導(dǎo)致腎和肝中IGFBP-1表達(dá)的幾乎相同的瞬時(shí)誘 導(dǎo)，但一種組織與另一種組織相比表達(dá)水平在量上有所不同。IGFBP-I促 進(jìn)了胰島素樣生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)運(yùn)，提高了 IGFBP-1的循環(huán)水平，以及提高了 胰島素敏感性和葡萄糖的利用效果，這與例如持久的訓(xùn)練有關(guān)(見(jiàn)Marietta 等，Metabolism 52 : 821-826 ， 2003 )。因此，本發(fā)明的化合物可特異性誘 導(dǎo)血糖攝取的直接介導(dǎo)劑，并間接作用于血糖和葡萄糖調(diào)節(jié)的體液調(diào)節(jié)劑。實(shí)施例5 :葡萄糖的攝取增加胰島素耐受使機(jī)體對(duì)胰島素反應(yīng)的能力降低。胰島素耐受或胰島素敏 感性降低，常與高血糖癥、糖尿病和高胰島素血癥相關(guān)連。胰島素耐受降 低或胰島素敏感性增加可通過(guò)以下測(cè)定給予本發(fā)明化合物后葡萄糖的攝入 來(lái)測(cè)定。為了測(cè)定本發(fā)明化合物對(duì)體內(nèi)葡萄糖攝入的影響，給DIO (飲食誘導(dǎo) 的肥胖)大鼠(Charles River)詞喂高脂肪食物4周以誘導(dǎo)肥胖和胰島素耐 受?；蛘?，可采用ZDF大鼠或2型糖尿病的任何其它遺傳動(dòng)物模型。將 動(dòng)物分成治療和對(duì)照組。治療動(dòng)物接受所述化合物10天而其余接受高脂食 物。10天后在全麻下給禁食動(dòng)物作頸靜頸動(dòng)脈和股動(dòng)脈插管。用一種定量 測(cè)定胰島素耐受的參比方法，即高胰島素血-正常血糖維持程序進(jìn)行胰島素 連續(xù)灌注和10%葡萄糖灌注，速度足以將血漿葡萄糖水平維持在基礎(chǔ)濃度。 收取血樣品監(jiān)測(cè)血糖水平并適當(dāng)調(diào)節(jié)葡萄糖灌注速度。在正常血糖穩(wěn)態(tài)條件下，機(jī)體所有組織的葡萄糖灌注速度等于葡萄糖 攝入速度，因此是組織胰島素敏感性的一種衡量指標(biāo)。在此維持程序之前 和穩(wěn)態(tài)時(shí)灌注的[3-3司葡萄糖可估計(jì)基礎(chǔ)的和胰島素激發(fā)的全身葡萄糖流 通量。 一旦達(dá)到穩(wěn)態(tài)葡萄糖水平(約60-75分鐘)，加入作為藥團(tuán)的2-脫氧 -0-[1-14(:]葡萄糖來(lái)估計(jì)各組織中胰島素激發(fā)的葡萄糖攝取。在藥團(tuán)注射后 1 、 3 、 5 、 10 、 20 、 30和45分鐘，測(cè)定血樣的葡萄糖和示蹤物的濃 度。120分鐘安樂(lè)死后收集組織樣品測(cè)定葡萄糖的具體組織攝取。這些方法 對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯然易見(jiàn)的。
用本發(fā)明化合物治療的動(dòng)物，其組織如肌肉和肝臟，通過(guò)對(duì)胰島素敏 感性的提高和對(duì)胰島素耐受的降低而提高了葡萄糖的攝取。給予本發(fā)明的 化合物后葡萄糖攝取的增加，表明本發(fā)明的化合物可用于胰島素耐受的病 人，可胰島素敏感性降低或受損的病人來(lái)治療性降低其胰島素耐受和提高 其胰島素敏感性。因此，本發(fā)明的方法和化合物對(duì)高血糖癥、糖尿病病人 或其它葡萄糖體內(nèi)平衡調(diào)節(jié)缺陷病人，可提高其體內(nèi)葡萄糖攝取和降低其 血糖水平。實(shí)施例6 :血糖水平的劑量依賴(lài)性降低如下研究了給予化合物對(duì)血糖水平的作用。給予從Simonsen， Inc.獲 得的50只雄性Spraque Dawley大鼠(6-7周齡)0.5 % CMC (Sigma-Aldrich)或20 、 60 、 100 、 200mg/kg體重的化合物B ，通過(guò)口 飼管口服每天一次，連續(xù)14天。監(jiān)測(cè)動(dòng)物的體重變化和看得見(jiàn)的毒性和死 亡信號(hào)。第15天，讓動(dòng)物禁食過(guò)夜但可自由飲水，用異氟烷麻醉動(dòng)物，打 開(kāi)腹腔，收集下腔靜脈血液。將約lml的一份樣品收集到含EDTA的試管 中作血液學(xué)分析，將約lml的第二份樣品收集到不抗凝的試管中作血清化 學(xué)分析。血樣分析由IDEXX ( West Sacramento ， CA)進(jìn)行。如圖4所示，兩次分開(kāi)的實(shí)驗(yàn)表明，用本發(fā)明化合物治療的動(dòng)物顯示 了血糖水平的劑量依賴(lài)性降低?；衔飫┝颗c血糖水平之間的關(guān)系提示， 采用本發(fā)明方法和化合物以適當(dāng)劑量可將血糖維持在理想水平。因此，本 發(fā)明的方法和化合物可用于調(diào)節(jié)，具體說(shuō)降低血糖水平。因此，本發(fā)明的 方法和化合物可用于治療性降低受試者的血糖水平，例如降低患有葡萄糖 調(diào)節(jié)疾病如高血糖癥或糖尿病受試者的血糖水平。實(shí)施例7 :飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病動(dòng)物模型的葡萄糖耐受增強(qiáng)采用喂養(yǎng)高脂飲食產(chǎn)生嚴(yán)重肥胖、高血糖癥和高胰島素血癥的 C57BL/6J小鼠作為飲食誘導(dǎo)肥胖、2型糖尿病和葡萄糖耐的模型。將獲自 Jackson Laboratory (Bar Harbor ME)的40只雄性C57BL/6J小鼠分成以下實(shí)驗(yàn)組組l :載體對(duì)照動(dòng)物，飼喂標(biāo)準(zhǔn)的小鼠口糧(n=10);組2 :飼 喂標(biāo)準(zhǔn)的小鼠口糧并口飼管給予75mg/kg/天的化合物E(r^10):組3 :載 體對(duì)照。動(dòng)物飼喂高脂小鼠口糧(研究飲食45%脂肪)(n=10);組4 :動(dòng) 物詞喂高脂小鼠口糧和口飼管給予75mg/kg/天的化合物E (n=10)。飼養(yǎng)方
案持續(xù)進(jìn)行14天，每天測(cè)定體重和食品消耗。在腹腔內(nèi)葡萄糖耐受試驗(yàn)(IPGTT)前動(dòng)物禁食4小時(shí)，采用kg體重2克葡萄糖負(fù)荷量。給予葡 萄糖后0、 15、 30 、 60和90分鐘取血樣作血糖水平測(cè)定。如圖5A所示，服用標(biāo)準(zhǔn)食糧與給予的(RxChow)化合物或不用(VeChow)化合物的小鼠，與服食高脂飲食用化合物(RxHF)治療的小 鼠，葡萄糖清除速率幾乎相同和基本上相同。然而，高脂飲食不用化合物(VeHF)的小鼠葡萄糖清除速率比其它組小鼠低。計(jì)算各動(dòng)物IPGTT曲線(AUC)下葡萄糖區(qū)域的差異，比較標(biāo)準(zhǔn)食糧加化合物(RxChow)和不用 化合物(VeChow)治療的動(dòng)物與高脂飲食不用(VeHF)的動(dòng)物差異有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義(t檢驗(yàn)，PO.OOl)。此外，當(dāng)比較高脂飲食不用化合物(VeHF)的 動(dòng)物與高脂飲食用化合物(RxHF)治療的動(dòng)物的葡萄糖AUC ，發(fā)現(xiàn)血糖 水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t檢驗(yàn)，P<0.05)。(見(jiàn)圖5B)。然而如圖5B所示， 標(biāo)準(zhǔn)飲食(RxChow )或高脂飲食(RxHF)治療小鼠與標(biāo)準(zhǔn)飲食不用化合 物(VeChow)小鼠之間的葡萄糖AUC無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這些數(shù)據(jù)表明，在飲食誘導(dǎo)的肥胖和葡萄糖耐受受損動(dòng)物模型中，用 本發(fā)明化合物治療的動(dòng)物血中葡萄糖清除改善、血糖水平降低、葡萄糖機(jī) 耐受正常化和葡萄糖體內(nèi)平衡得到恢復(fù)。這些結(jié)果提示受治療動(dòng)物的葡萄 糖利用和調(diào)節(jié)得到改善。本發(fā)明化合物恢復(fù)了飲食誘導(dǎo)的葡萄糖利用和調(diào) 節(jié)(如葡萄糖耐受受損)受損動(dòng)物模型的正常葡萄糖耐受，表明本發(fā)明的 方法和化合物可用于治療性恢復(fù)葡萄糖耐受受損病人的葡萄糖體內(nèi)平衡。給予本發(fā)明化合物后葡萄糖利用和調(diào)節(jié)的改善和葡萄糖體內(nèi)平衡的恢 復(fù)，也可用口服葡萄糖耐受試驗(yàn)(OGTT)測(cè)定。進(jìn)行上述實(shí)施例7中所 述的類(lèi)似實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定給予的化合物對(duì)血糖水平的作用。將40只C57BL/6J 小鼠分成以下實(shí)驗(yàn)組組l :載體對(duì)照動(dòng)物，飼喂標(biāo)準(zhǔn)的小鼠口糧(11=10); 組2 :載體對(duì)照動(dòng)物，飼喂高脂小鼠口糧(研究飲食45%脂肪)(n=10); 組3 :動(dòng)物詞喂高脂小鼠口糧并口飼管給予75mg/kg/天的化合物E (n=10):組4 :動(dòng)物飼喂高脂小鼠口糧和口飼管給予75mg/kg/天的化合物 A(n=10)。飼養(yǎng)方案持續(xù)進(jìn)行28天，每周測(cè)定體重。在OGTT前動(dòng)物禁 食過(guò)夜，采用kg體重1克葡萄糖負(fù)荷量。給予葡萄糖后0、 30 、 60 、 90 、 120和180分鐘取血樣葡萄糖水平測(cè)定。 實(shí)施例8 :血紅素的糖化降低各種糖(最常見(jiàn)葡萄糖)通過(guò)結(jié)合于血紅素分子而形成糖化血紅素， 其形成的速度與務(wù)葡萄糖濃度成正比。測(cè)定糖化血紅素水平提供了前2-3 個(gè)月平均血糖濃度的精確指數(shù)。臨床上糖化血紅素水平可估計(jì)糖尿病病人 或高血糖癥病人的血糖控制情況。如下用糖尿病小鼠模型研究了給予化合物對(duì)糖化血紅素水平的作用。 使20只雄巧性db / db小鼠(Harlan)接受含載體(100pM組氨酸)或化 合物A(0.5mg/ml)的飲用水8周。研究開(kāi)始前和治療后4和8周，收集 尾靜脈血樣品，用HbAlcNow試劑盒(Metrika Inc.， Sunnyvale CA )測(cè)定 HbAlc水平。對(duì)照組8周時(shí)HbAlc水平y(tǒng)離基線顯著上升(PO.05)。如圖6所示， HbAlc從0周時(shí)的7.5%升高到8周時(shí)的10X?；衔镏委熃M的HbAlc不 隨時(shí)間而升高，8周20時(shí)顯著低于非治療組。用本發(fā)明化合物治療的動(dòng)物 8周時(shí)的HbAlc水平約為7.5 %。這些數(shù)據(jù)顯示，在2型糖尿病動(dòng)物模型中本發(fā)明化合物治療減少了糖 化血紅素的累積。HbAlc反映了糖尿病病人的整體血糖控制?；衔锝档?此模型HbAlc表明本發(fā)明的化合物可用于治療性改善糖尿病或高血糖癥病 人的血糖控制。實(shí)施例9 :體重的增加和降低脂肪儲(chǔ)存減少如下研究了本發(fā)明化合物對(duì)動(dòng)物體重?fù)p失和脂肪儲(chǔ)存的作用。通過(guò)口 飼管口服給予40只獲自Simonsen， Inc.的雄性Spmque Dawley大鼠(6-7 周齡)給予0.5% CMC( Sigma陽(yáng)Aldrich )或20 、 60 、 100 、 200mg/kg體 重的化合物B ，每天一次，連續(xù)14天。監(jiān)測(cè)動(dòng)物的體重變化和看得見(jiàn)的 毒性和死亡信號(hào)。第15天，讓動(dòng)物禁食過(guò)夜但可自由飲水，用異氟烷麻醉 動(dòng)物。將約lml的一份全血樣品收集到含EDTA的試管中作血液學(xué)分析， 將約lml的第二份樣品收集到不抗凝的試管中作血清化學(xué)分析。血樣分析 由IDEXX( West Sacramento, CA)進(jìn)行。收集血樣后，切取隔膜處死動(dòng)物。 記錄各動(dòng)物的顯微鏡觀察結(jié)果，并收集肝、腎、心臟、脾、肺、胃、小腸 和大腸作組織學(xué)評(píng)估。
如圖7A所示，用本發(fā)明化合物治療的動(dòng)物體重增加呈劑量依賴(lài)性減 少。動(dòng)物檢查表明，生長(zhǎng)沒(méi)有總體上延緩，因?yàn)橹委焺?dòng)物的大多數(shù)器官絕 對(duì)重量與對(duì)照的未治療動(dòng)物各器官重量相比，沒(méi)有顯著性差異。例如，化 合物治療動(dòng)物的心臟重量與對(duì)照相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(圖7B)。然而 治療動(dòng)物的器官相對(duì)重量比未治療對(duì)照有顯著增加。例如表示為機(jī)體總重 分?jǐn)?shù)的心臟相對(duì)重量，與對(duì)照相比，用100mg/kg化合物治療的動(dòng)物顯著 增加(p二0.036，單向圖氏差異分析(one-way AM3VA/Tukey's test))。由于器官的絕對(duì)重量，如心臟的重量沒(méi)有顯著減少，故受治療動(dòng)物的 總體生長(zhǎng)過(guò)程沒(méi)有延緩。另外，由于相對(duì)于機(jī)體總重的器官重量顯著增加， 故存在著其它組織的選擇性損失。如圖8所示當(dāng)用化合物治療時(shí)，顯示內(nèi) 臟脂肪呈劑量依賴(lài)性減少。上圖的箭頭顯示用低劑量化合物治療動(dòng)物中存 在的內(nèi)臟脂肪墊，而下圖顯示用高劑巧量化合物治療的動(dòng)物完全缺少脂肪 墊。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的方法和化合物可用于調(diào)節(jié)體重、誘導(dǎo)體重的 損失或減少，而不會(huì)伴有肌肉的損失，并能減少內(nèi)臟脂肪。綜合在一起， 這些結(jié)果表明，本發(fā)明的方法和化合物可用于有效控制體重增加，特別是 減少內(nèi)臟脂肪。這些方法和化合物對(duì)治療或預(yù)防肥胖具有優(yōu)越性，因此可 用于治療或預(yù)防肥胖相關(guān)糖尿病。實(shí)施例IO :飲食誘導(dǎo)肥胖動(dòng)物模型的體重增加降低 飼喂高脂食物發(fā)生嚴(yán)重肥胖、高血糖癥和高胰島素血癥的C57BL/6J小鼠是飲食誘導(dǎo)肥胖、2型糖尿病和葡萄糖耐受受損的一種模型。將購(gòu)自 Jackson Laboratory (Bar Harbor ME)的40只雄性C57BL/6J小鼠分成以下實(shí)驗(yàn)組組l :載體對(duì)照動(dòng)物，詞喂標(biāo)準(zhǔn)的小鼠口糧(n=10);組2 :載體對(duì)照動(dòng)物，飼喂高脂小鼠口糧(研究飲食45%脂肪)(n=10);組3 :動(dòng) 物詞喂高脂小鼠口糧并口飼管給予75mg/kg/天的化合物E (n=10):組4 : 動(dòng)物詞喂高脂小鼠口糧和口飼管給予75mg/kg/天的化合物A(n^10)。此詞 養(yǎng)方案持續(xù)進(jìn)行28天，每周測(cè)定體重。處死動(dòng)物收集它們的器官和脂肪墊 并秤重。如圖9A所示，飼喂高脂飲食(組2)的動(dòng)物體重顯著高于飼喂標(biāo)準(zhǔn)口 糧(組l)的動(dòng)物(P<0.05)。然而，飼喂高脂飲食但用化合物E或化合物 A治療的動(dòng)物(分別為組3和組4)顯示體重增加明顯為少(P<0.05)。 事實(shí)上，盡管高脂飲食，用化合物治療動(dòng)物的體重與飼喂正常飲食動(dòng)物(組 3和組4與組l比較)的基本上相同。類(lèi)似地，如圖9B所示，飼喂高脂 食物的動(dòng)物(組2)腹部脂肪墊比飼喂標(biāo)準(zhǔn)口糧的動(dòng)物(組l)和飼喂高脂 食物并用本發(fā)明化合物治療的動(dòng)物(組3和組4)顯著增加。如圖9B所示，飼喂高脂食物并用化合物治療的動(dòng)物的脂肪墊重量與正常飲食動(dòng)物的 基本相同。研究28天后也測(cè)定了動(dòng)物各器官的重量。如圖9C所示，腎、肝心臟 的重量在實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)差異。這些結(jié)果表明，觀察到的體重差異歸因于脂 肪儲(chǔ)存的減少，而不是生長(zhǎng)速度的減少。這些數(shù)據(jù)顯示，用本發(fā)明的化合 物治療動(dòng)物，消除了與高脂飲食相關(guān)的體重增加。本發(fā)明化合物這種防止 體重增加的作用，表明本發(fā)明化合物可用于在甚至不良的飲食攝取入時(shí)治 療性減少體重增加。此外，本發(fā)明的方法和化合物可用于對(duì)體重增加的改 變，提示這類(lèi)化合物可能用于治療性調(diào)節(jié)肥胖病人的體重減輕。實(shí)施例ll :肥胖小鼠體重減輕按以下方法研究了給予本發(fā)明化合物對(duì)體重減輕的作用。從Jackson Laboratory, (Bar Harbor ME)獲得C57BL/6J小鼠。飼喂高脂食物發(fā)生嚴(yán)重 肥胖、高血糖癥和高胰島素血癥的C57BL/6J小鼠是飲食誘導(dǎo)肥胖、2型糖 尿病和葡萄糖耐受受損的一種模型。給小鼠飼喂高脂食物8周后變成肥胖。 將肥胖小鼠分成二實(shí)驗(yàn)組組l動(dòng)物為對(duì)照的肥胖小鼠，組2動(dòng)物為用本 發(fā)明化合物治療的肥胖小鼠。另一組年齡相配的非肥胖小鼠也包含在本研 究中。每天用本發(fā)明化合物或用載體對(duì)照治療動(dòng)物。21天內(nèi)每周二次測(cè)定 小鼠體重。第21天秤重小鼠并處死。分離腹部脂肪墊、肝、腎和心臟并秤 重作分析。給予化合物后體重減輕表明本發(fā)明的化合物可用于治療性減少肥胖病 人的體重。實(shí)施例12 :參與血壓調(diào)節(jié)基因的表達(dá)增加高血壓是糖尿病和糖尿病相關(guān)疾病和病癥的危險(xiǎn)因素。如下研究了本 發(fā)明化合物對(duì)調(diào)節(jié)血壓的作用。發(fā)用化合物B或化合物D治療動(dòng)物，如 實(shí)施例4所述制備RNA樣品。用以下方法測(cè)定iNOSmRNA水平。用lpM 隨機(jī)六聚引物、l嗎總RNA和OMNISCRIPT逆轉(zhuǎn)錄酶(Qiagen)按制造 商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA合成。用水5倍稀釋得到的cDNA至100pL最終體 積。用FASTSTARTDNAMASTER SYBR GREEN I試劑盒(Roche)和基 因特異性引物，用LIGHTCYCLER系統(tǒng)(Roche)，按照制造商說(shuō)明書(shū)， 以定量PCR進(jìn)行基因表達(dá)相對(duì)水平的分析。樣品加熱至90 °C 6分鐘，然 后總共42輪循環(huán)95°C 15秒，6(TC5秒，和72°C 10秒?？烧T導(dǎo)的一氧化 氮合酶(iNOS) —特異性引物如下m-iNOS-F2 CCCAGGAGGAGAGAGATCCGATT (SEQ ID NO:l) m-iNOS-R2 AGGTCCCTGGCTAGTGCTTCAGA (SEQ ID NO:2)測(cè)定了 18S核糖體RNA基因表達(dá)的相對(duì)水平作為對(duì)照。用 QUANTITECT SYBR GREEN PCR試劑盒(Qiagen)和基因特異性引物，， 用LGHTCYCLER系統(tǒng)(Roche),按照制造商說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行定量PCR 。 樣品加熱至9(TC 15分鐘，然后總共42輪循環(huán)95。C15秒，60。C20秒， 和72°C 10秒。核糖體RNA-特異性引物如下185-mt-2B TAGGCACGGCGACTACCATCGA (SEQ ID NO:3)185陽(yáng)rat-2B CGGCGGCTTTGGTGACTCTAGAT (SEQ ID NO:4)每次PCR運(yùn)行包括包括標(biāo)準(zhǔn)曲線形和水空白對(duì)照。此外，在完成每次 PCR運(yùn)行后跑解鏈杯以估計(jì)擴(kuò)增的特異性。將樣品的iNOS基因表達(dá)相對(duì) 于18S核糖體的RNA表達(dá)水平作標(biāo)準(zhǔn)化。如圖IOA所示，編碼iNOS基因的表達(dá)在用本發(fā)明化合物處理8小 時(shí)后升高，此后回落到對(duì)照水平。另外，iNOS的誘導(dǎo)是劑量依賴(lài)的，用本 發(fā)明二種化合物(化合物B和D )都可獲得。這二種化合物是二種不同 的藥效基團(tuán)， 一種是菲咯琳衍生物， 一種是雜環(huán)酰胺，可用于本發(fā)明方法 中。這些結(jié)果表明，用本發(fā)明化合物治療可提高iN0S (—種參與血管舒張 調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì))的表達(dá)。因此，本發(fā)明的方法和化合物可用于誘導(dǎo)血管舒 張和降低血壓。為了測(cè)定腎上腺髓質(zhì)素mRNA的表達(dá)，如以上實(shí)施例4所述制備樣 品并雜交分析。如圖10B所示，用本發(fā)明化合物B治療動(dòng)物的各種組織 中腎上腺髓質(zhì)素(代表參與血管舒張蛋白質(zhì)的編碼基因)增加。在用化合 物B治療后的時(shí)間中，心臟、腎和肺中的腎上腺髓質(zhì)激素mRNA水平顯 示表達(dá)快速上升，然后在16-24小時(shí)內(nèi)回落到對(duì)照水平。綜合在一起，這些結(jié)果表明，本發(fā)明的方法和化合物可用于提供了通 過(guò)舒張機(jī)制激活參與調(diào)節(jié)血壓基因表達(dá)的工具。這類(lèi)基因包括但不限于 可誘導(dǎo)的一氧化氮合酶和緊上腺髓質(zhì)素。治療性上調(diào)血管舒張因子提供了 降低血壓的有效方法，從而向代謝失調(diào)疾病如糖尿病病人提供了益處。通 過(guò)降低血壓，本發(fā)明的方法和化合物可用于為治療或預(yù)防糖尿病、高血糖 癥和其它糖尿病相關(guān)代謝疾病等提供了方法。實(shí)施例13 :血清甘油三脂降低用糖尿病小鼠模型如下研究了給予化合物對(duì)甘油三脂水平的作用該研究采用在leptin受體中含純合型功能喪失突變的20只雄性db/db小鼠 (Harlan, Indianapolis, Indiana )。與正常小鼠相比，db/db小鼠的甘油三脂 水平通常高1.5-2倍(Nishina等，Metabolism 43 : 549-553， 1994)。隨年齡 增力H db/db小鼠的甘油三脂水平進(jìn)行性增加(Tuman禾Q Doisy . Diabetologia 13 : 7-11 , 1977)。小鼠接受含載體(lOOpM組氨酸)或化合物 A(0.5mg/ml ，用lOO^M組氨酸配)的飲水8周。研究末，動(dòng)物禁食過(guò)夜， 在全麻下從尾靜脈插管中取血樣品置于血清分離試管中。將血樣品送到 Quality Clinical Labs ( Mountain View, CA)作分析。如圖11所示，實(shí)驗(yàn)?zāi)?duì)照的db/db小鼠甘油三脂的水平大約為 120mg/dL 。然而，用本發(fā)明化合物治療的動(dòng)物甘油三脂水平約為 85mg/dL ，顯著低于對(duì)照。甘油三脂水平升高與心血管疾病危險(xiǎn)升高相關(guān)， 升高的甘油三脂是代謝綜合征的一種成分。因?yàn)楸景l(fā)明的方法和化合物可 有效降低或維持通常的甘油三脂升高相關(guān)疾病，如糖尿病、綜合癥X 、大 血管疾病或其它脂質(zhì)代謝障礙血癥中的甘油三脂水平，故本發(fā)明的方法可 用于治療具有或有患這類(lèi)疾病危險(xiǎn)的個(gè)體。實(shí)施例14 :化合物和HIFa穩(wěn)定的鑒定可采用基于2-氧化[1-14C]戊二酸羥化-偶聯(lián)脫梭基試驗(yàn)，鑒定能調(diào)節(jié) HIF特異性脯氨酞輕化酶活性的化合物(見(jiàn)Hirsila等，J Biochem 278 : 30772-30750 ， 2003)。該反應(yīng)25°C在1.0ml的反應(yīng)體積中進(jìn)行，其中含 10-100微升洗滌劑如Triton-X-100 、獲自表達(dá)內(nèi)源性HIF脯氨酞經(jīng)化酶 或重組HIF脯氨酞輕化酶的裂解細(xì)胞提取液、0.05pM DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (SEQ ID NO:5)、 0.005pM FeS04 0.16pM 2-氧 化[l-"C]戊二酸、2pM抗壞血酸、60嗎過(guò)氧化氫酶、O.l(iM 二硫蘇糖 醇和50 pM Tris-鹽酸緩沖液，調(diào)pH至ij 7.8。 37°C進(jìn)行酶反應(yīng)20分鐘。 該反應(yīng)產(chǎn)生的14C02被捕捉在懸褂于反應(yīng)混合物上方大氣中浸泡堿液的濾 紙上，并在液閃計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。如下檢測(cè)了用本發(fā)明的方法和化合物對(duì)HIFoc的穩(wěn)定。將衍生自腺病 毒轉(zhuǎn)化的胎腎上皮(239A)、宮頸上皮腺癌(Hda)、肝細(xì)胞癌(H印3B)、 鱗狀上皮癌(SSC-25)的人細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞(HLF)(見(jiàn)美國(guó)典型培養(yǎng)物 保存中心，Manassas VA禾H Qbiogene， Carlsbad CA)分別接種在100mm培 養(yǎng)皿中，在37。C 、 20% 02 、 10%CO2下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為HeLa細(xì)胞為 Dulbeeco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)， 2%胎牛血清(FBS ); HLF細(xì) 胞為DMEM ， 10 % FBS; 293細(xì)胞為DMEM ， 5%FBS; Hep3B細(xì)胞為極 限必需培養(yǎng)基(MEM ), Earle，s BSS (Mediatech In . Herndon VA)， 2mM L-谷 氨酞胺，O.lmM非必須氨基酸，lmM丙酮酸鈉，10%FBS。當(dāng)細(xì)胞層達(dá)到 鋪滿時(shí)，用OPTI誦MEM培養(yǎng)基(Invitrogen Life Technologies , Carlsbad CA) 替換原培養(yǎng)基，在37^C 、 20% 02 、 10% C02下培養(yǎng)細(xì)胞層約24小時(shí)。 然后在當(dāng)前培養(yǎng)基中加入本發(fā)明化合物(化合物B 、 F 、 G和H之一) 或DMSO(0.5-1.0。/。)，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)后取出培養(yǎng)基，離心并保存待分析。用冷磷酸緩沖鹽水(PBS) 洗滌細(xì)胞二次，然后用1.0ml的10mM Tris (pH7.4) , lmM EDTA， 150mM NaCl，0.5。/。IGEPAL (Sigma-Aldrich， St丄ouis MO)和蛋白酶抑制劑混合物 (Roche Molecular Biochemicals )冰上裂解細(xì)胞15分鐘。4°C 3 ，OOOxg離 心細(xì)胞裂解物5分鐘，收集胞質(zhì)組分(上清液)。重懸細(xì)胞核用lOOpl 20mM HEPES (pH7.2) , 400mM NaCl ， lmM EDTA ，lmM 二硫蘇糖醇和蛋白酶混合 物(Roche Molecular Biochemicals)裂解，4°C 13000xg離心5分鐘，收集 核蛋白組分(上清液)。根據(jù)蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)化核組分，加到4-12% TG凝膠上，在還原條件 下分級(jí)。在500mA下1.5小時(shí)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Invitrogen Corp., Carlsbad CA)上。用T-TBS， 2%牛奶室溫封閉該膜1小時(shí)，與用T-TBS , 2 %牛奶1:250稀釋的小鼠抗HIF-la抗體(BD Biosciences, Bedford MA) 培育過(guò)夜。用SUPERSIGNALWEST化學(xué)發(fā)光底物(Pierce , Rockford IL) 顯色印跡。如圖12A所示，本發(fā)明的代表性化合物(化合物D)以劑量依 賴(lài)方式穩(wěn)定了各種類(lèi)型細(xì)胞中的HIFoc，使細(xì)胞中積累了 HIFou或者，用核抽提試劑盒制備核組分，并用TRANSAMHIF-1 ELISA試 劑盒子(Active Motif)按照制造商說(shuō)明書(shū)分析HIF-la。如圖12B所示， Hep3B細(xì)胞當(dāng)用本發(fā)明化合物處理時(shí)，顯示了劑量依賴(lài)性穩(wěn)定HIFa。圖 12B也顯示上皮細(xì)胞(293A)和肝細(xì)胞癌(Hep3B)用本發(fā)明各種化合物 (化合物B 、 F 、 G和H )處理后，與載體處理的對(duì)照細(xì)胞相比，顯示 了HIFa的穩(wěn)定和積累。除了本文所示和描述的以外，本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得可根據(jù)上述描寫(xiě)對(duì) 本發(fā)明作各種修改。這些修改都落在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文引用的所有參考文獻(xiàn)的內(nèi)容納入本文作參考。
<110>法布羅根股份有限公司(FibroGen, Inc.)V-京策爾一普卡爾(Guenzler-Pukall, Volkmar) S. J.克勞斯(Klaus, St印hen J.) L蘭斯特姆帕羅博克(Langsetmo Parobok, Ingrid) T.W.西利(Seeley, Todd W.)<120>糖尿病等的治療<130> FP0602.1 PCT<150> 60/431,351 <151〉 2002-12-06<150> 60/476,331 <151〉 2003-06-06<150> 60/476,726 <151> 2003-06-06<150> 未知 <151> 2003-12-04<160〉 5<170〉 Patentln version 3.2<210> 1 <211〉 23 〈212〉 DNA<213> 小家鼠(Mus musculus) <400> 1cccagg鄉(xiāng)a gagagatccg att<210> 2 <211> 23 <212〉 DNA<213> 小家鼠(Mus musculus) <400> 2aggtccctgg ctagtgcttc aga
<210> 3 <211> 22 <212〉 DNA<213> 黑鼠(Rattus rattus〉 <400> 3taggcacggc gactaccatc ga 22<210> 4 <211> 23 <212> DNA<213〉 黑鼠(Rattus rattus) <400> 4cggcggcttt ggtgactcta gat 23<210> 5 <211〉 19 <212> PRT<213> 智人(Homo sapiens) <400〉 5Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala Pro Tyr lie Pro Met Asp Asp Asp 15 10 15Phe Gin Leu
權(quán)利要求
1. 穩(wěn)定HIFα的制劑用于制造用于具有患糖尿病危險(xiǎn)的個(gè)體治療或預(yù)防糖尿病的藥物的用途，其特征在于所述制劑是雜環(huán)羰基甘氨酸。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述雜環(huán)羰基甘氨酸是抑制HIF羥 化酶活性的化合物。
3. 如權(quán)利要求2所述的用途，其中所述化合物抑制HIF脯氨酰羥化酶 活性。
4. 穩(wěn)定HIFa的制劑用于制造治療或預(yù)防患有與血糖水平升高相關(guān)疾 病的個(gè)體中的藥物的用途，其特征在于所述制劑是雜環(huán)羰基甘氨酸。
5. 如權(quán)利要求4所述的用途，其中所述疾病選自高血糖癥，肥胖，高 血壓，高血脂癥，腎病，視網(wǎng)膜病變，葡萄糖耐受受損，動(dòng)脈粥樣硬化和 血管疾病。
6. 如權(quán)利要求4所述的用途，其中所述雜環(huán)羰基甘氨酸是抑制HIF羥 化酶活性的化合物。
7. 如權(quán)利要求6所述的用途，其中所述化合物抑制HIF脯氨酰羥化酶 活性。
8. 穩(wěn)定HIFa的制劑用于制造的藥物的用途，所述藥物用于a. 調(diào)節(jié)葡萄糖代謝或葡萄糖代謝過(guò)程；b. 實(shí)現(xiàn)葡萄糖體內(nèi)平衡；c. 降低血糖水平；d. 降低糖化血紅素水平；e. 提高葡萄糖調(diào)節(jié)因子的表達(dá)；f. 改變糖酵解因子表達(dá)；g. 降低胰島素耐受；或h. 提高血糖水平控制； 其特征在于所述制劑是雜環(huán)羰基甘氨酸。
9. 如權(quán)利要求8所述的用途，其中所述葡萄糖代謝過(guò)程選自葡萄糖攝 取，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，葡萄糖儲(chǔ)存，葡萄糖加工和葡萄糖利用。
10. 如權(quán)利要求8所述的用途，其中所述葡萄糖調(diào)節(jié)因子選自磷酸果糖 激酶-P，磷酸果糖激酶-L，烯醇化酶，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1，乳酸脫氫酶、醛 縮酶-1、己糖激酶-1、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-l和胰島素祥生長(zhǎng)因子。
11. 如權(quán)利要求8所述的用途，其中所述糖酵解因子選自磷酸果糖激酶 -P，磷酸果糖激酶-L，烯醇化酶-1，乳酸脫氫酶、醛縮酶-1、己糖激酶-1。
12.如權(quán)利要求8所述的用途，其中所述雜環(huán)羰基甘氨酸是抑制HIF羥 化酶活性的化合物。
13.如權(quán)利要求12所述的用途，其中所述化合物抑制HIF脯氨酰羥化酶活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、實(shí)現(xiàn)葡萄糖體內(nèi)平衡和降低血糖水平的方法和化合物。也提供了治療或預(yù)防糖尿病、高血糖癥和與葡萄糖代謝改變或受損相關(guān)的疾病和病癥的方法和化合物。
文檔編號(hào)A61K31/70GK101396559SQ20081017613
公開(kāi)日2009年4月1日 申請(qǐng)日期2003年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月6日
發(fā)明者I·蘭斯特姆帕羅博克, S·J·克勞斯, T·W·西利, V·京策爾-普卡爾 申請(qǐng)人:法布羅根股份有限公司