專利名稱：Vlp－抗原偶聯(lián)物及其作為疫苗的用途的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供一種包含RNA噬菌體的病毒樣顆粒(VLP)和至少一種抗原的組合物，其中所述VLP是在宿主中重組產(chǎn)生的，并且其中所述VLP所包含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA的量最多為所述VLP原來(lái)所包含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA量的20％；并且其中所述VLP和所述至少一種抗原彼此連接。
本發(fā)明也提供制備本發(fā)明的組合物的方法。本發(fā)明的組合物可以用于制備治療疾病、障礙和病癥的疫苗。而且，本發(fā)明的組合物特別可用于有效誘導(dǎo)針對(duì)特定環(huán)境內(nèi)的抗原的強(qiáng)抗體應(yīng)答，同時(shí)降低或消除不希望的T細(xì)胞應(yīng)答。
相關(guān)技術(shù)已經(jīng)描述了與抗原連接的RNA-噬菌體的病毒樣顆粒(VLP)是有用的疫苗組合物。WO 02/056905描述了VLP-抗原偶聯(lián)物作為疫苗用于治療傳染病，預(yù)防或治療癌癥，以及有效地誘導(dǎo)自身特異性免疫應(yīng)答。而且，在自身特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)的內(nèi)容中，已經(jīng)公開了具體的VLP-抗原偶聯(lián)物，例如，用于治療變態(tài)反應(yīng)(WO 03/040164)或骨病(WO03/039225)，或者用于治療和預(yù)防與腎素活化的血管緊張肽系統(tǒng)有關(guān)的病癥(WO 03/031466)。
根據(jù)抗原的性質(zhì)和有關(guān)疾病，疫苗引起的某些類型的免疫應(yīng)答通常比另外一些更加期望。例如，盡管通常希望誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤細(xì)胞或病毒感染的強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答，但是這種應(yīng)答，特別是對(duì)于含有自身抗原的疫苗來(lái)說(shuō)，可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，如自身特異性T細(xì)胞的誘導(dǎo)(Orgogozo，J.M.等人，Neurology 61，46-54(2003)；Hock，C.等人，Natural Med.8，1270-75(2002)；Hock C.等人，Neuron 38，547-554，(2003))。
抗原特異性T細(xì)胞的活化主要依賴于T細(xì)胞與諸如樹突細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞(APC)之間的交叉應(yīng)答(cross-talk)，APC在MHC分子環(huán)境中呈遞T細(xì)胞抗原。導(dǎo)致APC活化的一種途徑是Th細(xì)胞上的CD40L與樹突細(xì)胞上的CD40的相互作用(Foy，T.M，等人，Annu.Rev.Immunol.14591(1996))。令人感興趣的是，這種CD40L-介導(dǎo)的樹突細(xì)胞成熟似乎負(fù)責(zé)對(duì)CTL應(yīng)答的輔助效應(yīng)。實(shí)際上，最近表明，Th細(xì)胞引起的CD40觸發(fā)使樹突細(xì)胞能夠啟動(dòng)CTL應(yīng)答(Ridge，J.P，等人，Nature 393474(1998)；Bennett，S.R.M，等人，Nature 393478(1998)；Schoenenberger，S.P，等人，Nature 393480(1998))。
導(dǎo)致APC活化的另外一種途徑是通過(guò)APC表達(dá)的toll-樣受體的活化。迄今為止已經(jīng)鑒定了10種人toll-樣受體，它們的配體表現(xiàn)出有限數(shù)量的與病原體有關(guān)的不變模式(Medzhitov，R.和Janeway，C.A，Jr，Cell 91295-298(1997))。這些模式的例子包括脂多糖(LPS)、富含非甲基化CG的DNA(CpG)或雙鏈RNA，它們分別對(duì)于細(xì)菌和病毒感染具有特異性。
刺激先天免疫的因子對(duì)APC的普遍活化通?？赡苁且l(fā)自身特異性淋巴細(xì)胞和自身免疫的原因。這種活化可導(dǎo)致共同刺激分子或細(xì)胞因子如IL-12或IFNα的表達(dá)提高。這一觀點(diǎn)與以下發(fā)現(xiàn)一致與甲狀腺提取物一起施用LPS能夠克服耐受并引發(fā)自身免疫性甲狀腺炎(Weigle，W.O，Adv.Immunol.30159(1980))。而且，在轉(zhuǎn)基因小鼠模型上，最近發(fā)現(xiàn)單獨(dú)施用自身肽不能引起自身免疫，除非APC被一種單獨(dú)的途徑活化(Garza，K.M.等人，J.Exp.Med.1912021(2000))。以下發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步說(shuō)明了先天免疫與自身免疫病之間的聯(lián)系LPS、病毒感染或APC的普遍活化延遲或防止了外周耐受的形成(Vella，A.T.等人，Immunity 2261(1995)；Ehl，S.等人，J.Exp.Med.187763(1998)；Maxwell，J.R.等人，J.Immunol.1622024(1999))。這樣，先天免疫不僅可增強(qiáng)自身特異性淋巴細(xì)胞的活化，而且可抑制其隨后的消失。
現(xiàn)有技術(shù)中描述的并且作為抗原載體用于接種的RNA噬菌體如Qβ或AP205的病毒樣顆粒已經(jīng)通過(guò)在大腸桿菌中重組表達(dá)而制備。然而，通過(guò)隨后從大腸桿菌裂解物中純化而獲得的VLP仍然含有包裹的大腸桿菌成分，主要是大腸桿菌RNA以及一些大腸桿菌蛋白質(zhì)。許多細(xì)菌成分，特別是細(xì)菌核酸，特別是細(xì)菌DNA和細(xì)菌RNA，通過(guò)toll-樣受體的活化而導(dǎo)致T細(xì)胞應(yīng)答的刺激。如前所述，T細(xì)胞應(yīng)答的活化可導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用。而且，在疫苗內(nèi)除已經(jīng)證明的藥學(xué)活性成分以外不希望存在諸如未鑒定的細(xì)菌成分的物質(zhì)，因?yàn)檫@些未鑒定的細(xì)菌成分可能會(huì)引起潛在的危險(xiǎn)或副作用。
因此，在本領(lǐng)域中仍然需要開發(fā)新的有效的疫苗用于治療較大范圍的疾病。特別是，在本領(lǐng)域中仍然需要開發(fā)新的疫苗，從而最大可能性地降低或消除不利的副作用如不希望的T細(xì)胞應(yīng)答的活化或刺激，同時(shí)保持最大的治療效果。
發(fā)明概述我們驚奇地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的組合物能夠誘導(dǎo)針對(duì)疫苗中所含抗原的強(qiáng)免疫應(yīng)答，特別是抗體應(yīng)答，而同時(shí)最小化或避免了不希望的T細(xì)胞應(yīng)答或其他不希望的副作用，如發(fā)熱。
先天免疫的刺激導(dǎo)致IgG2a和IgG2b型抗體的誘導(dǎo)，IgG2a和IgG2b在組織破壞方面比IgG1(小鼠)更強(qiáng)有力。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的組合物改變了抗體同種型分布，使之遠(yuǎn)離IgG2a和/或IgG2b或IgG1(人)。
另外，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的組合物是有效的疫苗，它誘導(dǎo)針對(duì)多種抗原，特別是自身抗原的強(qiáng)免疫應(yīng)答，這些抗原可以在治療諸如但不限于自身免疫病、炎性疾病、肥胖癥和藥物成癮的多種疾病中作為靶標(biāo)使用。
因此，在第一方面，本發(fā)明提供一種組合物，包含(a)一種病毒樣顆粒(VLP)，其包含RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段，其中所述VLP具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)，其中所述VLP是由宿主重組產(chǎn)生的，并且其中VLP包含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA的量為所述VLP原來(lái)所含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA的量的最多20％，優(yōu)選最多10％；(b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原(b)與所述VLP(a)通過(guò)所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物形成一種有序且重復(fù)的抗原陣列。所述至少一種抗原可以選自多肽、碳水化合物、類固醇激素、有機(jī)分子或半抗原，優(yōu)選地，所述至少一種抗原是自身抗原或半抗原。在此提供了典型和優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明測(cè)定RNA，優(yōu)選核酸的量的方法。
本發(fā)明的組合物和疫苗中宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸的量強(qiáng)烈降低，導(dǎo)致VLP或VLP-抗原偶聯(lián)物具有強(qiáng)烈降低的量的Toll-樣受體配體，或優(yōu)選地基本不含Toll-樣受體配體。Toll-樣受體被認(rèn)為是連接先天免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答的樞紐。Toll-樣受體的活化導(dǎo)致先天免疫系統(tǒng)的全面活化以及APC的活化，進(jìn)一步導(dǎo)致抗原特異性免疫應(yīng)答。因此，令人驚奇的是，包含VLP的本發(fā)明的組合物和疫苗，其中所述VLP含有的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA的量為VLP原來(lái)所含的量的最多20％，優(yōu)選最多10％，更優(yōu)選地VLP基本不含宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸，更優(yōu)選地基本不含Toll-樣受體，卻誘導(dǎo)強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答，特別是抗體應(yīng)答，卻同時(shí)典型地繞過(guò)Toll-樣受體的活化。而且，本發(fā)明的組合物和疫苗誘導(dǎo)針對(duì)該組合物中的特定抗原的強(qiáng)免疫應(yīng)答，同時(shí)最小化或不能引發(fā)CTL應(yīng)答。另外，本發(fā)明的組合物和疫苗減少了IgG2a和/或IgG2b的產(chǎn)生，并且改變了抗體同種型，使之遠(yuǎn)離更具組織破壞性的IgG2a和/或IgG2b。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種組合物，包含(a)一種病毒樣顆粒(VLP)，其包含RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段，其中所述VLP具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)，其中所述VLP是由宿主重組產(chǎn)生的，并且其中所述VLP基本不含宿主RNA，優(yōu)選地其中所述VLP基本不含宿主核酸；(b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原(b)與所述VLP(a)通過(guò)所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接。
我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的組合物和疫苗誘導(dǎo)針對(duì)與VLP連接的特定抗原的強(qiáng)免疫應(yīng)答，而沒(méi)有明顯的，或者典型且優(yōu)選地顯著的炎性T細(xì)胞的活化，炎性T細(xì)胞是Th1細(xì)胞的一個(gè)亞組，這通過(guò)IgG2a效價(jià)的降低，特別是通過(guò)獲得的低IgG2a/IgG1比而得到證明。T細(xì)胞不同亞組的活化導(dǎo)致不同抗體亞型的表達(dá)。例如，Th1細(xì)胞特別產(chǎn)生IFN-γ，IFN-γ促進(jìn)免疫球蛋白IgG2a的產(chǎn)生，IgG2a調(diào)理和補(bǔ)體固定抗體和介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化和抗體依賴性細(xì)胞毒性。Th2細(xì)胞的特征在于IL-4和IL-10產(chǎn)生，并為B細(xì)胞成熟和IgG1抗體的產(chǎn)生提供幫助。因此IgG2a/IgG1比是一個(gè)良好的并且公認(rèn)的確定Th1細(xì)胞相比Th2細(xì)胞的活化程度的參數(shù)。另外，如果不希望抗體亞類具有調(diào)理和補(bǔ)體固定性質(zhì)，例如對(duì)于為了誘導(dǎo)抗自身抗原抗體而開發(fā)的疫苗來(lái)說(shuō)，IgG2a和/或IgG2b的降低明顯有益。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物還包含至少一種與VLP結(jié)合的聚陰離子大分子。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，VLP包裹或包裝有至少一種聚陰離子大分子。至少一種聚陰離子大分子的存在一般導(dǎo)致更高的針對(duì)抗原的抗體效價(jià)，特別是IgG1效價(jià)，同時(shí)保持低IgG2a/IgG1比和低CTL應(yīng)答。而且，與VLP結(jié)合的，優(yōu)選被VLP包裹或包裝的至少一種聚陰離子大分子的存在一般有利和有益于RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段裝配為VLP，以及它們的穩(wěn)定化。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，聚陰離子大分子是聚陰離子多肽，更優(yōu)選地，聚陰離子大分子是聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明分別提供制備本發(fā)明的組合物和RNA-噬菌體的VLP-抗原偶聯(lián)物的方法。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明分別提供一種制備本發(fā)明的組合物和RNA-噬菌體的VLP-抗原偶聯(lián)物的方法，該方法包括以下步驟(a)由宿主重組產(chǎn)生具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒(VLP)，其中所述VLP包含RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段；(b)將所述病毒樣顆粒解裝配為所述RNA-噬菌體的所述外殼蛋白、其突變體或片段；(c)純化所述外殼蛋白、其突變體或片段；(d)將所述純化的所述RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段重裝配為病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆?；静缓拗鱎NA，優(yōu)選宿主核酸；和(e)將具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原與步驟(d)獲得的所述VLP進(jìn)行連接。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，重裝配所述純化的外殼蛋白的步驟在至少一種聚陰離子大分子的存在下實(shí)現(xiàn)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種疫苗組合物，其包含本發(fā)明的組合物，優(yōu)選地還包含一種緩沖劑。該疫苗可以向患者施用，不含或者含有至少一種佐劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種免疫方法，包括向動(dòng)物或人施用所述疫苗。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種治療疾病的方法，包括向動(dòng)物或人施用本發(fā)明的組合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療諸如但不限于炎性疾病、慢性自身免疫病、肥胖癥或藥物成癮的疾病的方法。
在另一方面，本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明的組合物和可接受的藥物載體的藥物組合物。
在另一方面，本發(fā)明的疫苗組合物基本不含細(xì)菌DNA以及其他細(xì)菌成分，分別產(chǎn)生更確定的組合物和疫苗。這不僅產(chǎn)生更安全的疫苗，而且符合生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)標(biāo)準(zhǔn)。
附圖簡(jiǎn)述圖1顯示在溴化乙錠染色的1％瓊脂糖凝膠上RNase A對(duì)QβVLP的RNA水解的分析。加到凝膠上的是下列樣品1.MBI Fermentas 1kbDNA梯子；2.現(xiàn)有技術(shù)QβVLP；3.在0.2x HBS緩沖液pH 7.2中用RNase A處理的QβVLP。
圖2顯示現(xiàn)有技術(shù)QβVLP和根據(jù)本發(fā)明重裝配的QβVLP的SDS-PAGE凝膠。泳道1分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2非還原條件下的現(xiàn)有技術(shù)QβVLP；泳道3分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道4還原條件下(25mM DTT)電泳的重裝配的QβVLP；泳道5非還原條件下電泳的重裝配的QβVLP。
圖3顯示用與現(xiàn)有技術(shù)QβVLP偶聯(lián)的尼古丁衍生物、RNase A處理的QβVLP和在不同聚陰離子大分子存在下重裝配的QβVLP免疫小鼠后的抗尼古丁抗體效價(jià)。
圖4顯示用與現(xiàn)有技術(shù)QβVLP偶聯(lián)的尼古丁衍生物、RNase A處理的QβVLP和在不同聚陰離子大分子存在下重裝配的QβVLP免疫小鼠后的抗尼古丁IgG1和IgG2a抗體效價(jià)。
圖5顯示大小排阻HPLC中裝配混合物的洗脫譜。(A)在沒(méi)有任意聚陰離子大分子的條件下裝配的AP205外殼蛋白；(B)在聚谷氨酸存在下裝配的AP205外殼蛋白。在7.83min處存在峰表明了AP205VLP的形成，該保持時(shí)間與現(xiàn)有技術(shù)AP205VLP相同。洗脫下未裝配的AP205外殼蛋白，保持時(shí)間為11.77min。
發(fā)明詳述定義抗體同種型除非另外說(shuō)明，在本申請(qǐng)中使用的抗體同種型的命名是小鼠命名。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道相應(yīng)的人類命名。例如，小鼠的抗體同種型IgG2a對(duì)應(yīng)于人類的抗體同種型IgG1。
抗原此處所用的術(shù)語(yǔ)“抗原”指如果被MHC分子呈遞，即能夠被抗體或T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合的分子。此處所用的術(shù)語(yǔ)“抗原”也包括T細(xì)胞表位。抗原還能夠被免疫系統(tǒng)識(shí)別，以及/或者能夠誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致B和/或T淋巴細(xì)胞的活化。然而，至少在某些情況下，這可能需要抗原含有或者連接于Th細(xì)胞表位，并且包含于佐劑中。一種抗原可能包含一種或多種表位(B和T表位)。上面提到的特異性反應(yīng)指抗原優(yōu)選地一般以高選擇性方式與其相應(yīng)的抗體或TCR反應(yīng)，而不與可能由其它抗原誘導(dǎo)的其它許多抗體或TCR反應(yīng)。此處所用的抗原也可以是幾種不同抗原的混合物。
第一附著位點(diǎn)此處所用的短語(yǔ)“第一附著位點(diǎn)”是指VLP中天然存在的或者人工添加到VLP中的一種元件，第二附著位點(diǎn)可與之連接。第一附著位點(diǎn)可以是蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次級(jí)代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、洋地黃毒苷、金屬離子、苯甲基磺酰氟)，或化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)如氨基、羧基、巰基、羥基、胍基、組氨?；蚱浣M合?；瘜W(xué)反應(yīng)性基團(tuán)作為第一附著位點(diǎn)的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是氨基酸如賴氨酸的氨基。第一附著位點(diǎn)一般位于VLP的表面上，優(yōu)選外表面上。多個(gè)第一附著位點(diǎn)一般以重復(fù)構(gòu)型存在于病毒樣顆粒的表面上，優(yōu)選外表面上。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)與VLP通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵，優(yōu)選通過(guò)至少一個(gè)肽鍵連接。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)天然存在于VLP中?；蛘?，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)被人工添加到VLP上。
第二附著位點(diǎn)如此處使用的短語(yǔ)“第二附著位點(diǎn)”是指天然存在于或者人工添加到本發(fā)明的抗原上的一種元件，第一附著位點(diǎn)可以與之連接。本發(fā)明的第二附著位點(diǎn)可以是蛋白質(zhì)、多肽、肽、氨基酸、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次級(jí)代謝產(chǎn)物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、洋地黃毒苷、金屬離子、苯甲基磺酰氟)、或化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)例如氨基、羧基、巰基、羥基、胍基、組氨?；?、或其組合。化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)作為第二附著位點(diǎn)的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是巰基，優(yōu)選氨基酸如半胱氨酸的巰基。因此術(shù)語(yǔ)“具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原”是指包含本發(fā)明的抗原和至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的構(gòu)建體。但是，特別是對(duì)于非天然存在于抗原內(nèi)的第二附著位點(diǎn)來(lái)說(shuō)，這種構(gòu)建體一般且優(yōu)選地還含有“連接體”。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，第二附著位點(diǎn)與本發(fā)明的抗原通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵，優(yōu)選通過(guò)至少一個(gè)肽鍵連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二附著位點(diǎn)天然存在于本發(fā)明的抗原內(nèi)。在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)連接體，優(yōu)選包含半胱氨酸的連接體，通過(guò)蛋白質(zhì)融合，將第二附著位點(diǎn)人工添加到本發(fā)明的抗原上。
結(jié)合如此處所用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”是指這樣的結(jié)合它可以是共價(jià)的，例如通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)，或者是非共價(jià)的，例如離子相互作用、疏水相互作用、氫鍵等。共價(jià)鍵可以是，例如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、酰亞胺、碳-硫鍵、碳-磷鍵等。該術(shù)語(yǔ)也包括物質(zhì)的包封或部分包封。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”比諸如“偶聯(lián)”、“融合”、“包封”、“包裝”和“附著”的術(shù)語(yǔ)范圍更廣，并且包括后面這些。例如，典型且優(yōu)選地，聚陰離子大分子如聚谷氨酸可以被VLP包裹或包裝，而典型且優(yōu)選地不存在實(shí)際上的結(jié)合。
外殼蛋白本申請(qǐng)中的術(shù)語(yǔ)“外殼蛋白”和可交換使用的術(shù)語(yǔ)“衣殼蛋白”是指能夠摻入病毒衣殼或VLP內(nèi)的病毒蛋白質(zhì)。一般且優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“外殼蛋白”是指RNA噬菌體的基因組或RNA噬菌體變體的基因組編碼的外殼蛋白。更優(yōu)選地，例如，術(shù)語(yǔ)“AP205的外殼蛋白”是指SEQ ID NO29或氨基酸序列，其中從SEQ ID NO29上切下第一個(gè)甲硫氨酸。更優(yōu)選地，例如，術(shù)語(yǔ)“Qβ的外殼蛋白”是指SEQ ID NO10(″QβCP″)和SEQ ID NO11(A1)，含有或不含位于N末端的甲硫氨酸(SEQ ID NO67)。噬菌體Qβ的衣殼主要由QβCP組成，含有少量A1蛋白。
表位如此處所用的術(shù)語(yǔ)“表位”是指在動(dòng)物、優(yōu)選哺乳動(dòng)物、最優(yōu)選在人中具有抗原性或免疫原活性的多肽的連續(xù)或不連續(xù)部分。表位在MHC分子環(huán)境下被抗體或被T細(xì)胞通過(guò)其T細(xì)胞受體來(lái)識(shí)別。
基本不含宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸如此處所用的術(shù)語(yǔ)“基本不含宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸”是指VLP所含的宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸的量，其典型且優(yōu)選地每mg VLP含有不到30μg，優(yōu)選不到20μg，更優(yōu)選不到10μg，甚至更優(yōu)選不到8μg，甚至更優(yōu)選不到6μg，甚至更優(yōu)選不到4μg，最優(yōu)選不到2μg。在上述內(nèi)容中使用的宿主是指在其中重組產(chǎn)生VLP的宿主，該宿主優(yōu)選地是細(xì)菌，進(jìn)一步優(yōu)選大腸桿菌。測(cè)定RNA，優(yōu)選核酸的量的常規(guī)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。典型且優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明測(cè)定RNA，優(yōu)選核酸的量的方法在實(shí)施例17中對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)QβVLP和本發(fā)明的QβVLP描述。對(duì)于含有Qβ以外的VLP的本發(fā)明的組合物，測(cè)定RNA，優(yōu)選核酸的量典型且優(yōu)選地使用相同、相似或類似的條件。最終需要的條件的改變是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識(shí)。測(cè)得的量的數(shù)值典型且優(yōu)選地被理解為包括所述數(shù)值±10％偏差，優(yōu)選±5％偏差的值。
免疫刺激性核酸如此處所用的術(shù)語(yǔ)“免疫刺激性核酸”是指能夠誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的核酸。
免疫刺激物如此處所用的術(shù)語(yǔ)“免疫刺激物”是指一種物質(zhì)，它能夠誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答，因此典型且優(yōu)選地誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)對(duì)本發(fā)明組合物中含有的抗原特異性的免疫應(yīng)答。
連接的如此處所用的術(shù)語(yǔ)“連接的”(或其名詞連接)是指所有可能的方式，優(yōu)選化學(xué)相互作用，通過(guò)這種方式，至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接在一起?；瘜W(xué)相互作用包括共價(jià)和非共價(jià)的相互作用。非共價(jià)相互作用的典型例子是離子相互作用、疏水相互作用或氫鍵，而共價(jià)相互作用例如基于共價(jià)鍵如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷鍵、碳-硫鍵如硫醚或酰亞胺鍵。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)和第二附著位點(diǎn)通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵連接，優(yōu)選通過(guò)至少一個(gè)非肽鍵連接，更優(yōu)選只通過(guò)非肽鍵連接。然而，如此處所用的術(shù)語(yǔ)“連接”應(yīng)當(dāng)不僅包括至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的直接連接，而且可替代地并且優(yōu)選地，包括至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)通過(guò)中間分子的間接連接，典型且優(yōu)選地通過(guò)使用至少一個(gè)，優(yōu)選一個(gè)異雙功能交聯(lián)劑連接。
連接體如此處所用的“連接體”將第二附著位點(diǎn)與本發(fā)明的抗原連接，或者已經(jīng)包含第二附著位點(diǎn)、基本由、或由第二附著位點(diǎn)組成。優(yōu)選地，如此處所用的“連接體”已經(jīng)包含第二附著位點(diǎn)，典型且優(yōu)選地-但不是必需地-為一個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選半胱氨酸殘基。如此處所用的“連接體”也被稱為“氨基酸連接體”，特別是當(dāng)本發(fā)明的連接體含有至少一個(gè)氨基酸殘基時(shí)。因此，術(shù)語(yǔ)“連接體”和“氨基酸連接體”在此可以交換使用。然而，這并不意味著這種連接體僅由氨基酸殘基組成，即使由氨基酸殘基組成的連接體是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案。連接體的氨基酸殘基優(yōu)選由本領(lǐng)域已知的天然氨基酸或非天然氨基酸、全L型或全D型或其混合物組成。本發(fā)明的連接體的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案是包含巰基或半胱氨酸殘基的分子，這些分子因此也包括在本發(fā)明中?？捎糜诒景l(fā)明的其他連接體是包含C1-C6烷基、環(huán)烷基如環(huán)戊基或環(huán)己基、環(huán)烯基、芳基或雜芳基部分的分子。而且，優(yōu)選包含C1-C6烷基、環(huán)烷基(C5，C6)、芳基或雜芳基部分和其他氨基酸的連接體也可以用作本發(fā)明的連接體，并且包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。連接體與本發(fā)明的抗原的連接優(yōu)選通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵，更優(yōu)選通過(guò)至少一個(gè)肽鍵。對(duì)于本發(fā)明的抗原非天然存在的第二附著位點(diǎn)，連接體與至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)如半胱氨酸連接，優(yōu)選通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵，更優(yōu)選通過(guò)至少一個(gè)肽鍵連接。
有序且重復(fù)的抗原陣列如此處所用的術(shù)語(yǔ)“有序且重復(fù)的抗原陣列”通常是指抗原的重復(fù)模式，其特征在于典型且優(yōu)選地，抗原的空間排列相對(duì)于病毒樣顆粒具有高度的均一性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這種重復(fù)模式可以是一種幾何模式。RNA噬菌體的VLP具有嚴(yán)格重復(fù)的類結(jié)晶抗原或抗原決定簇排列，優(yōu)選間隔1-30納米，優(yōu)選2-15納米，更優(yōu)選2-10納米，更優(yōu)選2-8納米，進(jìn)一步更優(yōu)選1.6-7納米。
包裝如此處所用的術(shù)語(yǔ)“包裝”是指聚陰離子大分子與VLP有關(guān)的狀態(tài)。如此處所用的術(shù)語(yǔ)“包裝”包括結(jié)合，這可以是共價(jià)的，例如化學(xué)偶聯(lián)，或者是非共價(jià)的，例如離子相互作用、疏水相互作用、氫鍵等。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“包裝”是指VLP包封或部分包封聚陰離子大分子。因此，聚陰離子大分子可以被VLP包封，而不需存在實(shí)際上的結(jié)合，特別是共價(jià)結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)聚陰離子大分子被包裝在VLP內(nèi)，最優(yōu)選地以非共價(jià)的方式。
聚陰離子大分子如此處所用的術(shù)語(yǔ)“聚陰離子大分子”是指包含重復(fù)負(fù)電荷基團(tuán)的高相對(duì)分子量的分子，其結(jié)構(gòu)基本包括實(shí)際上或概念上來(lái)源于低相對(duì)分子量的分子的多個(gè)重復(fù)單位。聚陰離子大分子的分子量應(yīng)當(dāng)為至少2000道爾頓，更優(yōu)選至少3000道爾頓，甚至更優(yōu)選至少5000道爾頓。如此處所用的術(shù)語(yǔ)“聚陰離子大分子”典型且優(yōu)選地指不能活化toll-樣受體的分子。因此術(shù)語(yǔ)“聚陰離子大分子”典型且優(yōu)選地不包括Toll-樣受體配體，甚至更優(yōu)選地不包括免疫刺激物，如Toll-樣受體配體、免疫刺激性核酸和脂多糖(LPS)。更優(yōu)選地，如此處所用的術(shù)語(yǔ)“聚陰離子大分子”是指不能誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生的分子。甚至更優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“聚陰離子大分子”不包括免疫刺激物。
聚天冬氨酸如此處所用的術(shù)語(yǔ)“聚天冬氨酸”應(yīng)當(dāng)是指一種多肽，在組成所述多肽的氨基酸總數(shù)中包含至少50％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少99％，更優(yōu)選100％的天冬氨酸分子。天冬氨酸分子是全L型或全D型或其混合物。
聚谷氨酸如此處所用的術(shù)語(yǔ)“聚谷氨酸”是指一種多肽，在組成所述多肽的氨基酸總數(shù)中包含至少50％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少99％，更優(yōu)選100％的谷氨酸分子。谷氨酸分子是全L型或全D型或其混合物。
聚(GluAsp)如此處所用的術(shù)語(yǔ)“聚(GluAsp)”是指一種多肽，在組成所述多肽的氨基酸總數(shù)中總共包含至少50％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少90％，或更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少99％的谷氨酸和天冬氨酸分子。谷氨酸分子和天冬氨酸分子是全L型或全D型或其混合物。
多肽如此處所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”是指由單體(氨基酸)通過(guò)酰胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接組成的分子。它是指氨基酸分子鏈，而不是指特定長(zhǎng)度的產(chǎn)物。因此，多肽的定義內(nèi)包括肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)也包括多肽的翻譯后修飾，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“重組VLP”是指通過(guò)包括至少一個(gè)重組DNA技術(shù)步驟的方法獲得的VLP。如此處所用的術(shù)語(yǔ)“重組產(chǎn)生的VLP”是指通過(guò)包括至少一個(gè)重組DNA技術(shù)步驟的方法獲得的VLP。因此，術(shù)語(yǔ)“重組VLP”和術(shù)語(yǔ)“重組產(chǎn)生的VLP”在此可以交換使用，并且應(yīng)當(dāng)具有相同的含意。
具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA，優(yōu)選核酸如此處所用的術(shù)語(yǔ)“具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA，優(yōu)選核酸”是指可以嵌入溴化乙錠，因此可以通過(guò)溴化乙錠在紫外光下的熒光而顯現(xiàn)的RNA，優(yōu)選核酸。根據(jù)本發(fā)明向具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸內(nèi)嵌入溴化乙錠的典型且優(yōu)選的方法在本發(fā)明的實(shí)施例2和3中以QβVLP為例描述。向Qβ以外的VLP所含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸內(nèi)嵌入溴化乙錠典型且優(yōu)選地使用相同、相似或類似的條件。最終需要的條件的改變是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識(shí)。
宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸如此處所用的術(shù)語(yǔ)“宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸”是指最初由宿主合成的RNA，或優(yōu)選核酸。然而，RNA，優(yōu)選核酸在減少或去除RNA，優(yōu)選核酸的量的過(guò)程中可能經(jīng)受化學(xué)和/或物理學(xué)改變，典型且優(yōu)選地通過(guò)本發(fā)明的方法，例如，RNA，優(yōu)選核酸的大小可能被縮短，或者其二級(jí)結(jié)構(gòu)可能改變。但是，甚至這種得到的RNA或核酸仍然被認(rèn)為是宿主RNA，或宿主核酸。
具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選核酸的量如此處所用的術(shù)語(yǔ)“具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選核酸的量”是指可以嵌入溴化乙錠，因此可以通過(guò)溴化乙錠在紫外光下的熒光顯現(xiàn)的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選核酸的量。根據(jù)本發(fā)明測(cè)定可以嵌入溴化乙錠的宿主RNA，優(yōu)選核酸的量，即測(cè)定VLP所包含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選核酸的量的典型且優(yōu)選的方法，是測(cè)定嵌入RNA，優(yōu)選核酸內(nèi)的溴化乙錠的量，如本發(fā)明的實(shí)施例2和3中以QβVLP為例所述。測(cè)定Qβ以外的VLP所含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸的量典型且優(yōu)選地使用相同、相似或類似的條件。最終需要的條件的改變是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識(shí)。
VLP原來(lái)所含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選核酸的量如此處所用的術(shù)語(yǔ)“VLP原來(lái)所含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選核酸的量”是指在宿主重組產(chǎn)生之后，但是在減少或去除(典型且優(yōu)選地)相同VLP的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選核酸的量之前，VLP所含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選核酸的量，典型且優(yōu)選地這種減少或去除是通過(guò)本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)的。在上下文中使用的“相同VLP”典型且優(yōu)選地是指來(lái)源于同一批表達(dá)的VLP。典型且優(yōu)選地，如此處所用的術(shù)語(yǔ)“VLP原來(lái)所含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選核酸的量”是指在宿主重組產(chǎn)生之后，而且在接著純化得到的VLP之后，但是在減少或去除(典型且優(yōu)選地)相同VLP的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選核酸的量之前，VLP所含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選核酸的量，典型且優(yōu)選地這種減少或去除是通過(guò)本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)的。如上所述，在上下文中使用的“相同VLP”典型且優(yōu)選地是指來(lái)源于同一批表達(dá)，優(yōu)選同一批純化的VLP。重組產(chǎn)生的VLP典型且優(yōu)選地從宿主細(xì)胞裂解物中純化。從宿主細(xì)胞裂解物中純化VLP的方法在現(xiàn)有技術(shù)中已有公開，例如WO 02/056905，WO 04/007538，或優(yōu)選地，本申請(qǐng)的實(shí)施例1對(duì)于QβVLP所述。典型且優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明減少具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選核酸通過(guò)如下步驟測(cè)定保留足夠一部分的重組表達(dá)的VLP，優(yōu)選純化后的VLP，以備后來(lái)，優(yōu)選地同時(shí)，首先測(cè)定該VLP原來(lái)所含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選核酸的量，其次測(cè)定本發(fā)明的VLP，即典型且優(yōu)選地在應(yīng)用本發(fā)明的方法之后獲得的VLP，所含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選核酸的量。如上所述，測(cè)定具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選核酸的量的典型且優(yōu)選的方法如本發(fā)明實(shí)施例2和3中以QβVLP為例所述。測(cè)定Qβ以外的VLP所含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸的量典型且優(yōu)選地使用相同、相似或類似的條件。最終需要的條件的改變是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識(shí)。
自身抗原如此處所用的術(shù)語(yǔ)“自身抗原”是指(i)由宿主DNA編碼的多肽或蛋白質(zhì)，或由宿主DNA編碼的多肽或RNA衍生的產(chǎn)物；(ii)與(i)具有高同源性的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述同源性為至少90％，更優(yōu)選至少92％，更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少97％，典型且優(yōu)選地誘導(dǎo)與(i)的多肽或蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體的體內(nèi)產(chǎn)生；以及(iii)如(i)定義的自身抗原的直向同源物(ortholog)。典型且優(yōu)選地，所述直向同源物誘導(dǎo)與(i)的多肽或蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體的體內(nèi)產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“直向同源物”是指從一個(gè)物種中獲得的多肽或蛋白質(zhì)，它是來(lái)自不同物種的多肽的功能對(duì)應(yīng)物。直向同源物之間的序列差異是物種形成的結(jié)果。如此處所用的術(shù)語(yǔ)“自身抗原”應(yīng)當(dāng)還包括化學(xué)修飾，包括但不限于如上所述的自身抗原的糖基化、乙?；?、磷酸化。而且，如此處所用的術(shù)語(yǔ)“自身抗原”優(yōu)選地也涉及由兩種或幾種自身抗原的組合產(chǎn)生的多肽。
自身抗原的片段如此處所用的術(shù)語(yǔ)“自身抗原的片段”是指這樣一種多肽，它包含自身抗原的一部分或者由其組成，優(yōu)選地具有至少4個(gè)、優(yōu)選至少5個(gè)、更優(yōu)選至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、或者更優(yōu)選至少12個(gè)或至少15個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，典型且優(yōu)選地誘導(dǎo)與自身抗原定義中的(i)的多肽或蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體的體內(nèi)產(chǎn)生。如此處所用的術(shù)語(yǔ)“自身抗原的片段”應(yīng)當(dāng)還包括化學(xué)修飾，包括但不限于如上定義的“自身抗原的片段”的糖基化、乙?；?、磷酸化。
自身抗原的變體如此處所用的術(shù)語(yǔ)“自身抗原的變體”是指與自身抗原定義中的(i)的多肽或蛋白質(zhì)具有同源性的多肽，其中所述同源性為至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少87％，典型且優(yōu)選地它誘導(dǎo)與自身抗原定義中的(i)的多肽或蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體的體內(nèi)產(chǎn)生。如此處所用的術(shù)語(yǔ)“自身抗原的變體”應(yīng)當(dāng)還包括化學(xué)修飾，包括但不限于如上定義的“自身抗原的變體”的糖基化、乙?；?、磷酸化。
Toll-樣受體(TLR)配體Toll-樣受體(TLR)由骨髓單核細(xì)胞和內(nèi)皮和上皮細(xì)胞以及來(lái)自各種器官系統(tǒng)的細(xì)胞表達(dá)。Toll-樣受體是跨膜蛋白，它們?nèi)季哂泄餐母缓涟彼岬陌庥蚝捅Ｊ氐陌|(zhì)域。TLR的胞質(zhì)域與IL-1和IL-18受體同源，并且含有這些受體共同的Toll/IL-1受體(TIR)同源域。Toll-樣受體具有相同的通過(guò)其TIR信號(hào)域介導(dǎo)的活化途徑，導(dǎo)致核轉(zhuǎn)位和促炎轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的活化(Abreu M.T.和Arditi M.J.Pediatrics(2004)，421-9)。迄今為止已經(jīng)從人類基因組中克隆了10種不同的TLR分子(Zarember KA等人，J.Immunol.(2002)，168554-61)，在小鼠中已經(jīng)克隆了11種TLR(Zhang等人，science，(2004)，3031522-6)。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“Toll-樣受體配體”或“TLR配體”是指任何能夠活化至少一種TLR的配體(參見例如，Beutler，B.2002，Curr.Opin.Hematol.，9，2-10，Schwarz等人，2003，Eur.J.Immunol，33，1465-1470)。本發(fā)明的TLR配體沒(méi)有限制地活化至少一種Toll-樣受體1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10或TLR11。例如，肽聚糖(PGN)或脂磷壁酸(LTA)典型且優(yōu)選地活化TLR2(Aliprantis等人，Science(1999)，285736-9；Underhill，等人，Nature，(1999)，401811-5)；雙鏈RNA，例如poly(I:C)，典型且優(yōu)選地活化TLR3(Alexopoulou等人，Nature(2001)，413732-8)；脂多糖(LPS)典型且優(yōu)選地活化TLR4(Poltorak等人，Science(1998)，2822085-8)；鞭毛蛋白典型且優(yōu)選地活化TLR5(Hayashi等人，Nature(2001)，4101099-103)；單鏈RNA，如細(xì)菌RNA，和某些合成物質(zhì)如咪唑喹啉，典型且優(yōu)選地活化TLR7和TLR8(Diebold S.等人，Science 3031529；Heil，F(xiàn)H.等人，Science 3031526)；細(xì)菌DNA，特別是含CpG基序的DNA，典型且優(yōu)選地活化TLR9(Schnare等人，Curr.Biol.(2000)，101139-42；Hemmi H等人，Nature(2000)，408740-5)。這些被引用的文章這里引入作為參考。TLR配體的概述在Abreu的綜述文章的表中給出，在此也引用作為參考(Abreu M.T.和Arditi M.J，Pediatrics(2004)，421-9)，關(guān)于TLR 11及其配體在Zhang等人，Science，(2004)，3031522-6中描述。通過(guò)參考這些引用的文章，再結(jié)合本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識(shí)，檢測(cè)一種分子是否是本發(fā)明的TLR配體，以及TLR配體是否活化至少一種TLR，是常規(guī)實(shí)驗(yàn)。
一種常用的、典型且優(yōu)選的測(cè)定本發(fā)明的Toll-樣受體活化的方法是，用能夠表達(dá)至少一種Toll-樣受體的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染一種不表達(dá)Toll-樣受體的細(xì)胞系。NF-kB活化的報(bào)道基因，如螢光素酶，能夠轉(zhuǎn)染到所述細(xì)胞系中，或者被所述細(xì)胞系的基因組所包含。向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加待測(cè)分子后，可以定量測(cè)定報(bào)道基因的活性并與未加入待測(cè)分子的細(xì)胞進(jìn)行比較。對(duì)于TLR1和TLR6活性檢測(cè)，TLR2的共表達(dá)是必要的。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的，某些不穩(wěn)定的TLR-配體，如具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA，需要穩(wěn)定化后進(jìn)行檢測(cè)。一種穩(wěn)定化方法是將具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA包裝到脂質(zhì)體或用于轉(zhuǎn)染的物質(zhì)(例如DOTAP)內(nèi)。
TLR序列的參考可在數(shù)據(jù)庫(kù)Swissprot中找到，登記號(hào)為TLR1_human；TLR2_human；TLR3_human；TLR4_human；TLR5_human；TLR6_human；TLR7_human；TLR8_human；TLR9_human。人TLR10可以在GenBank登記號(hào)AAQ88667或AAK26744下找到。在Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)中，小鼠序列的登記號(hào)相應(yīng)地為TLR1_mouse；TLR2_mouse；TLR3_mouse；TLR4_mouse；TLR5_mouse；TLR6_mouse；TLR7_mouse；TLR8_mouse；TLR9_mouse；TLR10_mouse。小鼠TLR11在GenBank中的登記號(hào)為AY531552。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以為其他哺乳動(dòng)物種的TLR受體建立相應(yīng)的試驗(yàn)。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行這種檢測(cè)的典型且優(yōu)選的例子如下3×106HEK293細(xì)胞在200伏和960μF條件下用1μg的TLR表達(dá)質(zhì)粒和20ng NF-KB螢光素酶報(bào)道分子-質(zhì)粒進(jìn)行電穿孔。質(zhì)粒DNA的總量通過(guò)加入適當(dāng)?shù)目毡磉_(dá)載體而維持恒定在每次電穿孔15μg。以每孔105個(gè)細(xì)胞的密度接種細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)后用受試配體刺激7到10個(gè)小時(shí)。已知TLR配體的濃度范圍的典型例子是25μg/ml與DOTAP復(fù)合的RNA40-42(促進(jìn)RNA在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)化)，1μM CpG-ODN 2006，10μMR-848，50μg/ml poly(I:C)或1μg/ml Pam3Cys(Heil，F(xiàn)H.等人，Science 3031526)。受刺激的細(xì)胞用報(bào)道裂解緩沖液(Promega，Mannheim，德國(guó))裂解，且根據(jù)廠商說(shuō)明，使用發(fā)光計(jì)，典型和優(yōu)選地使用Berthold發(fā)光計(jì)(Wildbad，德國(guó))，測(cè)定裂解物的螢光素酶活性。為了檢測(cè)任意配體而對(duì)前述試驗(yàn)作相應(yīng)調(diào)整是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識(shí)。
根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的螢光素酶活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著高于從陰性對(duì)照活性測(cè)得的閾值(同樣的試驗(yàn)、同樣的試驗(yàn)條件，只是不加入受試配體)時(shí)，認(rèn)為該配體活化TLR。這里所指的閾值被定義為六個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中陰性對(duì)照的螢光素酶活性的平均值加來(lái)自這六個(gè)試驗(yàn)的螢光素酶活性的標(biāo)準(zhǔn)差的三倍。典型和優(yōu)選地，當(dāng)配體的螢光素酶活性高于如上述所測(cè)的閾值時(shí)，認(rèn)為該配體″統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地″活化TLR。優(yōu)選地，當(dāng)配體的熒光素酶活性高于如上述所測(cè)的閾值至少兩倍，優(yōu)選高于三倍，更優(yōu)選高于五倍時(shí)，認(rèn)為該配體″統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地″活化TLR。
RNA噬菌體的病毒樣顆粒如此處使用的術(shù)語(yǔ)“RNA噬菌體的病毒樣顆粒”是指包含RNA噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段或者優(yōu)選基本由其組成或者由其組成的病毒樣顆粒。另外，RNA噬菌體的病毒樣顆粒類似于RNA噬菌體的結(jié)構(gòu)，并且是非復(fù)制性或非傳染性的，典型且優(yōu)選地是非復(fù)制性且非傳染性的。典型且優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“RNA噬菌體的病毒樣顆?！睉?yīng)當(dāng)還涉及這樣的RNA噬菌體的病毒樣顆粒其缺少編碼RNA噬菌體的復(fù)制機(jī)制的至少一個(gè)基因，優(yōu)選所有基因，典型且進(jìn)一步優(yōu)選地，甚至缺少編碼負(fù)責(zé)病毒附著或進(jìn)入宿主的蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因，優(yōu)選所有基因。然而，該定義應(yīng)當(dāng)也包括上述基因仍然存在但是無(wú)活性的RNA噬菌體的病毒樣顆粒，于是也產(chǎn)生非復(fù)制性和/或非傳染性的RNA噬菌體的病毒樣顆粒。而且，術(shù)語(yǔ)“RNA噬菌體的病毒樣顆?！痹谄渥顝V義的定義中應(yīng)當(dāng)也包括其基因組已通過(guò)物理或化學(xué)或遺傳方法滅活，因而該病毒顆粒不能感染和/或復(fù)制的RNA噬菌體的病毒顆粒。優(yōu)選的來(lái)源于RNA噬菌體的VLP表現(xiàn)為二十面體對(duì)稱，并且由180個(gè)亞單位組成。在本申請(qǐng)的公開內(nèi)容中，術(shù)語(yǔ)“亞單位”和“單體”可互換使用，并且在上下文中等同地使用。
多肽的氨基酸序列同一性可以使用諸如Bestfit程序的已知計(jì)算機(jī)程序常規(guī)確定。當(dāng)使用Bestfit或其它任何序列比對(duì)程序，優(yōu)選使用Bestfit確定一種特定序列與參照氨基酸序列是否例如95％相同時(shí)，將參數(shù)設(shè)置為使得在參照氨基酸序列的全長(zhǎng)上計(jì)算同一性百分?jǐn)?shù)，并且允許最多占參照序列中氨基酸殘基總數(shù)的5％的同源性缺口。上述測(cè)定多肽之間百分同一性的方法適用于本發(fā)明公開的所有蛋白質(zhì)、多肽或其片段。
一種或一個(gè)術(shù)語(yǔ)“一種”或“一個(gè)”在本申請(qǐng)中使用時(shí)，除非另外說(shuō)明，是指“至少一種/個(gè)”或“一種/個(gè)或一種/個(gè)以上”。
本發(fā)明提供一種組合物，包含(a)一種病毒樣顆粒(VLP)，其包含RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段，其中所述VLP具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)，其中所述VLP是由宿主重組產(chǎn)生的，并且其中VLP包含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸的量為所述VLP原來(lái)所含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸的量的最多20％，優(yōu)選最多10％，更優(yōu)選5％，更優(yōu)選3％，更優(yōu)選1％；(b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原(b)與所述VLP(a)通過(guò)所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的VLP基本不含宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種組合物，包含(a)一種病毒樣顆粒(VLP)，其包含RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段，其中所述VLP具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)，其中所述VLP是由宿主重組產(chǎn)生的，并且所述VLP基本不含宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸；(b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原(b)與所述VLP(a)通過(guò)所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種組合物，包含(a)一種病毒樣顆粒(VLP)，其包含RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段，其中所述VLP具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)，其中所述VLP是由宿主重組產(chǎn)生的，并且其中所述VLP含有不超過(guò)60μg，優(yōu)選不超過(guò)50μg，更優(yōu)選不超過(guò)40μg，更優(yōu)選不超過(guò)27μg，更優(yōu)選不超過(guò)20μg，更優(yōu)選不超過(guò)9μg，最優(yōu)選不超過(guò)5μg的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸；(b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原(b)與所述VLP(a)通過(guò)所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的VLP基本不含宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸。
本發(fā)明的病毒樣顆粒是重組VLP。典型且優(yōu)選地，重組VLP如下產(chǎn)生將編碼保留形成VLP能力的病毒外殼蛋白或其突變體或片段的基因克隆到表達(dá)載體中，在適合的宿主，如細(xì)菌中，典型且優(yōu)選地在大腸桿菌、酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)得到的構(gòu)建體。
優(yōu)選的例子已經(jīng)在WO02/056905中公開，在此引用作為參考。特別地，WO 02/056905的實(shí)施例18公開了由Qβ制備VLP顆粒的詳述。應(yīng)當(dāng)注意，現(xiàn)有技術(shù)如WO02/056905中描述的VLP-抗原偶聯(lián)物在通過(guò)上述方法表達(dá)而獲得并產(chǎn)生的VLP內(nèi)仍然含有一定量的宿主RNA。另一方面，VLP或本發(fā)明的VLP-抗原偶聯(lián)物已經(jīng)用本發(fā)明的方法制備或者進(jìn)一步處理，以排除、減少或者去除宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒樣顆粒包含、或者基本由、或者由RNA-噬菌體的外殼蛋白和/或其突變體和/或片段組成。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，該組合物包含具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的RNA-噬菌體的病毒樣顆粒。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，該RNA-噬菌體選自a)噬菌體Qβ；b)噬菌體R17；c)噬菌體fr；d)噬菌體GA；e)噬菌體SP；f)噬菌體MS2；g)噬菌體M11；h)噬菌體MX1；i)噬菌體NL95；j)噬菌體f2；k)噬菌體PP7和l)噬菌體AP205。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，RNA-噬菌體的外殼蛋白具有選自包括下列序列或由下列序列組成的組的氨基酸序列SEQ ID NO10；SEQ ID NO10和SEQ ID NO11的混合物；SEQ ID NO12；SEQ ID NO13；SEQ ID NO14；SEQ ID NO15；SEQ ID NO15和SEQ ID NO16的混合物；SEQ ID NO17；SEQ ID NO18；SEQ ID NO19；SEQ ID NO20；SEQ ID NO21；SEQ ID NO22；和SEQ ID NO29。
如此處使用的術(shù)語(yǔ)“外殼蛋白的片段”被定義為優(yōu)選地能夠裝配為RNA-噬菌體的病毒樣結(jié)構(gòu)并且長(zhǎng)度為野生型外殼蛋白的至少70％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％的多肽。優(yōu)選地，該片段通過(guò)至少一個(gè)內(nèi)部缺失或至少一個(gè)N和/或C末端的截短或至少一個(gè)其組合而獲得。外殼蛋白的片段還包括優(yōu)選能夠裝配為RNA-噬菌體的病毒樣顆粒并且與如上定義的外殼蛋白的片段具有至少80％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％的氨基酸序列同一性的多肽。
術(shù)語(yǔ)“突變外殼蛋白”或術(shù)語(yǔ)“外殼蛋白突變體”在本發(fā)明中可以交換使用，是指具有來(lái)源于野生型外殼蛋白的氨基酸序列的多肽，其序列與野生型序列至少80％，優(yōu)選至少85％，90％，95％，97％或99％相同，并且優(yōu)選地保留裝配為VLP的能力。突變的典型且優(yōu)選的例子包括相對(duì)于野生型外殼蛋白而言截短、內(nèi)部缺失、添加或置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，相對(duì)于野生型外殼蛋白而言優(yōu)選最多10個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選最多6個(gè)，更進(jìn)一步優(yōu)選最多4、3、2、1個(gè)氨基酸突變?！巴蛔兺鈿さ鞍住眱?yōu)選地也應(yīng)當(dāng)包括能夠裝配為VLP的野生型外殼蛋白的片段。另外，如此處使用的術(shù)語(yǔ)“突變外殼蛋白”優(yōu)選地也應(yīng)當(dāng)包括具有與相應(yīng)野生型外殼蛋白或其片段至少80％，優(yōu)選至少85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列，優(yōu)選地能夠裝配為VLP的多肽。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道的，通過(guò)在大腸桿菌中表達(dá)外殼蛋白或其突變體或片段，任選地通過(guò)凝膠過(guò)濾從細(xì)胞裂解物中純化衣殼，并且用免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(Ouchterlony試驗(yàn))或電子顯微鏡檢查(EM)(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137133-37(1993))分析衣殼的形成，可以檢測(cè)外殼蛋白或其突變體或片段向VLP的裝配。免疫擴(kuò)散試驗(yàn)和EM可以直接用細(xì)胞裂解物進(jìn)行。
在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，VLP是一種嵌合VLP，包含RNA噬菌體外殼蛋白和/或其突變體和/或片段的一個(gè)以上的序列，優(yōu)選兩個(gè)序列，或者由該序列組成。優(yōu)選地，嵌合VLP包含或者由RNA噬菌體的兩個(gè)不同的外殼蛋白組成，所述兩個(gè)外殼蛋白具有SEQ ID NO10和SEQ ID NO11，或SEQ ID NO15和SEQ ID NO16的氨基酸序列。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合VLP包含或者由RNA噬菌體的兩個(gè)不同的外殼蛋白組成，所述兩個(gè)外殼蛋白具有SEQ ID NO10和SEQ ID NO11的C末端截短，或SEQ ID NO15和SEQ ID NO16的C末端截短的氨基酸序列。如此處使用的術(shù)語(yǔ)“SEQID NO11的C末端截短”是指從SEQ ID NO11的C末端截短1，2，3，...50，...100，...150，...195或196個(gè)氨基酸產(chǎn)生的序列。
在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的病毒樣顆粒和組合物包含或者基本由或者由RNA噬菌體的外殼蛋白和/或其片段和/或突變體組成，該RNA噬菌體選自a)噬菌體AP205；b)噬菌體fr；c)噬菌體R17；d)噬菌體f2；e)噬菌體SP；f)噬菌體MS2；g)噬菌體M11；h)噬菌體MX1；i)噬菌體NL95；和j)噬菌體PP7。
在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的病毒樣顆粒和組合物包含或者基本由或者由RNA-噬菌體Qβ或RNA-噬菌體fr或RNA-噬菌體AP205或RNA噬菌體GA的外殼蛋白和/或其片段組成。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述RNA-噬菌體不是MS2。
RNA-噬菌體Qβ的衣殼或病毒樣顆粒顯示二十面體噬菌體樣衣殼結(jié)構(gòu)，直徑25nm，T＝3半對(duì)稱。該衣殼含有180個(gè)拷貝的外殼蛋白，它們通過(guò)二硫鍵連接為共價(jià)五聚體和六聚體(Golmohammadi R.等人，Structure 4543-5554(1996))，使Qβ衣殼具有顯著的穩(wěn)定性。然而，由重組Qβ外殼蛋白構(gòu)成的衣殼或VLP可能含有不通過(guò)二硫鍵與衣殼內(nèi)的其它亞單位連接的或不完全連接的亞單位。然而，在VLP內(nèi)一般約80％以上的亞單位通過(guò)二硫鍵彼此連接。Qβ衣殼蛋白也表現(xiàn)出對(duì)有機(jī)溶劑和變性劑的不同尋常的抗性。
WO 2004/007538，特別是在實(shí)施例1和實(shí)施例2中，描述了如何獲得包含或者由AP205外殼蛋白組成的VLP，以及特別是其表達(dá)和純化。WO 2004/007538，特別是實(shí)施例1和實(shí)施例2，在此引入作為參考。然而應(yīng)當(dāng)注意，WO 2004/007538描述的VLP-抗原偶聯(lián)物在通過(guò)表達(dá)獲得和產(chǎn)生的VLP內(nèi)仍然含有一定量的宿主RNA。另一方面，包含RNA噬菌體AP205的外殼蛋白、其突變體或片段的VLP或本發(fā)明的VLP-抗原偶聯(lián)物已經(jīng)用本發(fā)明的方法制備或者進(jìn)一步處理，以排除、減少或者去除宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸。
還發(fā)現(xiàn)其它RNA噬菌體外殼蛋白在細(xì)菌宿主中表達(dá)后自裝配(Kastelein，RA.等人，Gene 23245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287452-455(1986)，Adhin，MR.等人，Virology 170238-242(1989)，Ni，CZ.等人，Protein Sci.52485-2493(1996)，Priano，C.等人，J.Mol.Biol.249283-297(1995))。特別是已經(jīng)公開了GA(Ni，CZ，等人，Protein Sci.52485-2493(1996)，Tars，K等人，J.Mol.Biol.271759-773(1997))和fr(Pushko P.等人，Prot.Eng.6883-891(1993)，Liljas，L等人.J Mol.Biol.244279-290，(1994))的生物學(xué)和生化性質(zhì)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)置換或通過(guò)刪除而除去至少一個(gè)或至少兩個(gè)賴氨酸殘基，從而修飾RNA噬菌體的突變外殼蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)置換或通過(guò)插入而添加至少一個(gè)或至少兩個(gè)賴氨酸殘基，從而修飾RNA噬菌體的突變外殼蛋白。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變外殼蛋白是RNA噬菌體Qβ的突變外殼蛋白，其中已經(jīng)通過(guò)置換或通過(guò)刪除除去了至少一個(gè)或至少兩個(gè)賴氨酸殘基。在一個(gè)可替代的非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變外殼蛋白是RNA噬菌體Qβ的突變外殼蛋白，其中已經(jīng)通過(guò)置換或通過(guò)插入添加了至少一個(gè)或至少兩個(gè)賴氨酸殘基。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，RNA噬菌體Qβ的突變外殼蛋白具有選自SEQ ID NO23-27中任一個(gè)的氨基酸序列。至少一個(gè)賴氨酸殘基的缺失、置換或添加可以改變偶聯(lián)程度，即每個(gè)RNA-噬菌體VLP亞單位上本發(fā)明的抗原的量，特別是，用來(lái)匹配和適應(yīng)疫苗的要求。上述Qβ外殼蛋白、突變Qβ外殼蛋白VLP和衣殼的構(gòu)建、表達(dá)和純化分別在WO 02/056905中描述。特別參考上述申請(qǐng)的實(shí)施例18。應(yīng)當(dāng)注意，在現(xiàn)有技術(shù)如WO 02/056905中描述的VLP-抗原偶聯(lián)物在通過(guò)表達(dá)而獲得和產(chǎn)生的VLP內(nèi)仍然含有一定量的宿主RNA。另一方面，包含Qβ突變外殼蛋白的VLP或本發(fā)明的VLP-抗原偶聯(lián)物已經(jīng)通過(guò)本發(fā)明的方法制備或者進(jìn)一步處理，以排除、減少或去除宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸。
在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和疫苗具有0.05到4.0的抗原密度。如此處所用的術(shù)語(yǔ)“抗原密度”是指RNA噬菌體的VLP的每個(gè)亞單元上，優(yōu)選每個(gè)外殼蛋白上連接的抗原的平均數(shù)。因此，該值可以計(jì)算為在本發(fā)明的組合物或疫苗中VLP的所有亞單元或單體上的平均數(shù)。在其中抗原分子量等于或大于8KDa的本發(fā)明一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原密度優(yōu)選地為0.1至1.5。在其中抗原優(yōu)選地由5-30個(gè)氨基酸組成的一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原密度優(yōu)選地為0.5至4。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，VLP包含或者基本由或者由RNA噬菌體Qβ、fr、AP205或GA的突變外殼蛋白和/或其片段組成。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒樣顆粒包含或者基本由或者由Qβ的外殼蛋白、其突變體或片段組成，其中該外殼蛋白包含、基本由或者由上述一種突變體和相應(yīng)的A1蛋白的混合物組成。
在本發(fā)明的實(shí)踐中也可以使用AP205VLP的能夠裝配的突變形式，包括在氨基酸5位脯氨酸置換為蘇氨酸或在氨基酸14位天冬氨酰胺置換為天冬氨酸的AP205外殼蛋白，導(dǎo)致本發(fā)明的其他優(yōu)選的實(shí)施方案。
幾種RNA噬菌體的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定(Golmohammadi，R.等人，Structure 4543-554(1996))。利用這些信息，能夠確定表面暴露的殘基，從而能夠修飾RNA-噬菌體的外殼蛋白，以便能夠通過(guò)插入或置換插入一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)性氨基酸殘基。因此，噬菌體外殼蛋白的那些修飾形式也可用于本發(fā)明。來(lái)源于RNA噬菌體的VLP的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們?cè)诩?xì)菌中，特別是在大腸桿菌中的高表達(dá)產(chǎn)量，這允許以可承受的成本產(chǎn)生大量的物質(zhì)。
在本發(fā)明的另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該組合物還包含與VLP結(jié)合的至少一種聚陰離子大分子。優(yōu)選地，所述聚陰離子大分子包裝在VLP內(nèi)。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一種聚陰離子大分子選自(a)聚陰離子多肽；(b)聚陰離子糖，其中優(yōu)選地所述聚陰離子糖不是LPS；(c)聚陰離子有機(jī)聚合物；和(d)核酸，其中優(yōu)選地所述核酸不是Toll-樣受體配體，優(yōu)選地不是免疫刺激性核酸。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一種聚陰離子大分子是核酸，其中所述核酸不是Toll-樣受體配體。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，所述核酸包含或者由20種以上的核苷酸組成。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸是tRNA。tRNA可以購(gòu)自化學(xué)公司或者從生物體中提取。用于本發(fā)明的優(yōu)選的tRNA是，例如，小麥胚tRNA或酵母tRNA。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸是DNA，其中該DNA不含CpG基序，并且不刺激TLR9。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚陰離子多肽選自(a)聚谷氨酸；(b)聚天冬氨酸；(c)聚(GluAsp)；和(d)(a)至(c)的任意化學(xué)修飾?；瘜W(xué)修飾的例子包括但不限于糖基化、乙酰化和磷酸化。
在本發(fā)明其他優(yōu)選實(shí)施方案中，所述聚陰離子糖選自(a)陰離子葡聚糖；(b)磷酸纖維素；(c)聚葡萄糖醛酸；(d)聚半乳糖醛酸；(e)聚唾液酸；(f)透明質(zhì)酸；和(g)糖胺聚糖。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述陰離子葡聚糖選自(a)硫酸葡聚糖；(b)羧甲基葡聚糖；(c)磺丙基葡聚糖；(d)磺酸甲酯葡聚糖；和(e)磷酸葡聚糖。在另一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述糖胺聚糖選自(a)肝素；(b)硫酸乙酰肝素；(c)硫酸皮膚素；(d)硫酸軟骨素；和(e)硫酸角質(zhì)素。
在本發(fā)明的另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述聚陰離子有機(jī)聚合物選自(a)聚乙烯硫酸酯和(b)聚丙烯酸酯。
在本發(fā)明的特定優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一種聚陰離子大分子的分子量是約2,000到約200,000道爾頓，最低分子量?jī)?yōu)選為至少約3000道爾頓，更優(yōu)選至少約5000道爾頓，更優(yōu)選至少約7000道爾頓。最高分子量?jī)?yōu)選為最多約200,000道爾頓，優(yōu)選最多約180,000道爾頓，更優(yōu)選最多約160,000道爾頓，更優(yōu)選最多約150,000道爾頓。
根據(jù)聚陰離子大分子的性質(zhì)，優(yōu)選的分子量范圍不同。例如，對(duì)于聚陰離子多肽，特別是對(duì)于聚谷氨酸和聚天冬氨酸，優(yōu)選的分子量為5000道爾頓至150,000道爾頓。最低分子量?jī)?yōu)選為至少約5000道爾頓，更優(yōu)選至少約10,000道爾頓，更優(yōu)選至少約30,000道爾頓。最高分子量?jī)?yōu)選為最多約150,000道爾頓，優(yōu)選最多約120,000道爾頓，更優(yōu)選地最多約100,000道爾頓。
在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含至少一種聚陰離子大分子，其中優(yōu)選地所述聚陰離子大分子是至少一種聚陰離子多肽，更優(yōu)選地其中所述聚陰離子大分子是至少一種聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸。
聚陰離子大分子可以方便地購(gòu)自化學(xué)公司。例如，聚谷氨酸和聚天冬氨酸可以購(gòu)自Sigma(Sigma，New Jersey，USA)，包括寬范圍的分子量(聚谷氨酸750-1,500，1,500-3,000，3,000-15,000，15,000-50,000，50,000-100,000；聚天冬氨酸5,000-15,000，15,000-50,000)。分子量的測(cè)定基于粘度(Idelson，M.和Blout，E.R.(1958)J.Am.Chem.Soc.80，p.4631)和LALLS法，即小角激光光散射法。
聚半乳糖醛酸(MW，25,000-50000)可以購(gòu)自Fluka(Fluka，Buchs，Switzerland)，硫酸葡聚糖(MW 5,000，8,000和10000)購(gòu)自Sigma，硫酸葡聚糖(MW 100,000)購(gòu)自Fluka。分子量通過(guò)LALLS、粘度法或凝膠過(guò)濾法測(cè)定。有機(jī)聚合物如聚乙烯硫酸酯(MW～170,000)購(gòu)自Aldrich。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種分別制備本發(fā)明的組合物和RNA-噬菌體的VLP-抗原偶聯(lián)物的方法，包括以下步驟(a)由宿主重組產(chǎn)生具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒(VLP)，其中所述VLP包含RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段；(b)將所述VLP與能夠水解宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸的含有金屬離子的溶液溫育；和(c)連接具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原與從(a)或(b)獲得的所述VLP，優(yōu)選從步驟(b)獲得的所述VLP。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，金屬離子選自鋅(Zn)離子、銅(Cu)離子和鐵(Fe)離子。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述VLP的溫育步驟之后為至少一個(gè)純化所述VLP的步驟，優(yōu)選通過(guò)透析除去被消化的核酸。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種分別制備本發(fā)明的組合物和RNA-噬菌體的VLP-抗原偶聯(lián)物的方法，包括以下步驟(a)由宿主重組產(chǎn)生具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒(VLP)，其中所述VLP包含RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段；(b)將所述VLP與RNase溫育；和(c)連接具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原與從步驟(a)或(b)獲得的所述VLP，優(yōu)選從步驟(b)獲得的所述VLP。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，RNase是RNase A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述VLP與所述RNase，優(yōu)選所述RNase A的溫育在低離子強(qiáng)度緩沖液中進(jìn)行，其中優(yōu)選地，所述低離子強(qiáng)度緩沖液具有低于50mM，更優(yōu)選低于40mM，更優(yōu)選等于或低于30mM的濃度，其中進(jìn)一步優(yōu)選地，所述低離子強(qiáng)度緩沖液具有30mM的濃度。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述VLP的溫育步驟之后為至少一個(gè)純化所述VLP的步驟，優(yōu)選通過(guò)透析除去被消化的核酸。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種分別制備本發(fā)明的組合物和RNA-噬菌體的VLP-抗原偶聯(lián)物的方法，包括以下步驟(a)由宿主重組產(chǎn)生具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒(VLP)，其中所述VLP包含RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段；(b)將所述病毒樣顆粒解裝配為所述RNA-噬菌體的所述外殼蛋白、其突變體或片段；(c)純化所述外殼蛋白、其突變體或片段；(d)將所述純化的所述RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段重裝配為病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆?；静缓拗鱎NA，優(yōu)選宿主核酸；和(e)連接具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原與從步驟(d)獲得的所述VLP。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，純化的外殼蛋白的重裝配在存在和/或添加至少一種聚陰離子大分子的條件下實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的方法特別有利，因?yàn)樗貏e是通過(guò)解裝配步驟允許釋放基本上全部的宿主核酸。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒的解裝配優(yōu)選地在變性條件下進(jìn)行。優(yōu)選的變性條件是高鹽濃度，如0.5M至1M氯化鎂或5M以上的尿素。進(jìn)一步優(yōu)選地，純化所述外殼蛋白、其突變體或片段的步驟通過(guò)陽(yáng)離子交換層析和/或大小排阻層析實(shí)現(xiàn)，特別是，從而分離宿主核酸和所述外殼蛋白、其突變體或片段。
在另一方面，本發(fā)明提供一種分別制備本發(fā)明的組合物和RNA-噬菌體的VLP-抗原偶聯(lián)物的方法，包括以下步驟(a)由宿主重組產(chǎn)生RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段；(b)純化所述外殼蛋白、其突變體或片段；(c)形成具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆?；静缓拗鱎NA，優(yōu)選宿主核酸；和(d)連接具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原與從步驟(c)獲得的所述VLP。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，純化的外殼蛋白的重裝配在存在和/或添加至少一種聚陰離子大分子的條件下實(shí)現(xiàn)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種分別制備本發(fā)明的組合物和RNA-噬菌體的VLP-抗原偶聯(lián)物的方法，其中VLP和抗原通過(guò)至少一個(gè)肽鍵連接。該方法包括以下步驟(a)由宿主重組產(chǎn)生含有RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段和抗原的融合蛋白；(b)純化所述融合蛋白；(c)形成病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆?；旧喜缓拗鱎NA，優(yōu)選宿主核酸。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，純化的融合蛋白的重裝配在存在和/或添加至少一種聚陰離子大分子的條件下實(shí)現(xiàn)。
可替代的方法包括以下步驟由宿主重組產(chǎn)生一種病毒樣顆粒(VLP)，其中所述VLP包含含有RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段和至少一種抗原的融合蛋白；將所述VLP解裝配為所述融合蛋白；純化所述融合蛋白；將所述純化的融合蛋白重裝配為VLP，其中所述病毒樣顆?；静缓拗鱎NA，優(yōu)選宿主核酸。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，純化的融合蛋白的重裝配在存在和/或添加至少一種聚陰離子大分子的條件下實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，VLP是RNA噬菌體AP205的VLP。
在本發(fā)明一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含RNA噬菌體Qβ、AP205、fr或GA的，更優(yōu)選RNA噬菌體Qβ或GA的，最優(yōu)選RNA噬菌體Qβ的基本不含宿主核酸的VLP，該組合物還包含至少一種聚陰離子分子，優(yōu)選聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸。在本發(fā)明的另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該組合物包含基本不含宿主核酸的RNA噬菌體AP205或fr的VLP，進(jìn)一步不含至少一種聚陰離子大分子。
在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一種抗原選自蛋白質(zhì)、多肽、碳水化合物、類固醇激素、有機(jī)分子和半抗原。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是半抗原。優(yōu)選的半抗原是激素、藥物和毒性化合物。進(jìn)一步優(yōu)選的是藥物，特別是成癮性藥物和濫用藥物，特別是消閑性藥物(recreationaldrug)。這種抗原的代表性例子包括類罌粟堿和嗎啡衍生物，如可待因、芬太尼、海洛英、嗎啡和鴉片；弛緩劑，如地西泮；興奮劑，如安非他命、可卡因、MDMA(亞甲基二氧基甲基苯丙胺)、甲基苯丙胺、哌甲酯和尼古丁；致幻劑，如PCP、LSD、麥斯卡林和西洛西賓；大麻素類，如印度大麻(hashish)和大麻(marijuana)；以及地昔帕明/米帕明類藥物，和去甲替林/阿米替林類藥物。尼古丁成癮的治療也可以針對(duì)尼古丁衍生物，如O-琥珀?；?S′-羥甲基-尼古丁，代謝物，包括降煙堿和可替寧。
連接尼古丁或尼古丁衍生物或其它濫用藥物如可卡因與VLP的詳述在WO 2004/009116中，特別是第61頁(yè)第28行至第66頁(yè)第13行公開。WO 2004/009116的一般性和具體的公開內(nèi)容在此引用作為參考。
因此在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是選自成癮性藥物的有機(jī)分子，其中優(yōu)選地所述成癮性藥物是尼古丁或可卡因，優(yōu)選尼古丁。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是自身抗原或其片段或變體。優(yōu)選地，該自身抗原是適合誘導(dǎo)針對(duì)所述自身抗原的免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)或其片段。因此，本發(fā)明提供適合在預(yù)防和/或減弱由“自身”基因產(chǎn)物(例如腫瘤壞死因子)引起或加重的疾病或狀況的方法中使用的疫苗組合物。因此，本發(fā)明的疫苗組合物包括導(dǎo)致產(chǎn)生預(yù)防和/或減弱由“自身”基因產(chǎn)物引起或加重的疾病或狀況的抗體的組合物。這類疾病或狀況的例子包括移植物抗宿主疾病、IgE-介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)、過(guò)敏癥、成人型呼吸窘迫綜合征、克羅恩病、變應(yīng)性哮喘、急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、格雷夫斯氏病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、炎性自身免疫病、重癥肌無(wú)力、免疫增生性淋巴結(jié)病(IPL)、血管免疫增生性淋巴結(jié)病(AIL)、免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)病(IBL)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、牛皮癬、心肌炎、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默病和骨質(zhì)疏松癥。
在本發(fā)明一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的至少一種抗原選自淋巴毒素(例如淋巴毒素α(LTα)，淋巴毒素β(LTβ))，淋巴毒素受體，核因子kB配體的受體激活物(RANKL)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGF-R)，白介素-5，白介素-17，白介素-13，IL-23 p19，生長(zhǎng)素釋放肽(Ghrelin)，CCL21，CXCL 12，SDF-1，M-CSF，MCP-1，Endoglin，GnRH，TRH，嗜酸細(xì)胞活化趨化因子(Eotaxin)，緩激肽，BLC，腫瘤壞死因子α，淀粉樣β肽(Aβ1-42)，Aβ1-6，血管緊張肽，胃泌素，前胃泌素，CETP，CCR5，C5a，CXCR4，Des-Arg-緩激肽，或上述抗原的片段或變體。用于上述抗原時(shí)，術(shù)語(yǔ)這些抗原的“片段”是指(i)包含或者優(yōu)選地由下列氨基酸組成的任何多肽相應(yīng)抗原的序列的，或者對(duì)于自身抗原而言，GeneBank登錄的野生型抗原的人序列的，或來(lái)自任何其他動(dòng)物的相應(yīng)直向同源物的，優(yōu)選GeneBank登錄的野生型抗原的人序列的至少4、5、優(yōu)選至少6、7、8、9、10、11、12、17、18、19、20、25或30個(gè)連續(xù)氨基酸；以及(ii)與(i)的任意一種多肽具有氨基酸序列同一性的任何多肽，其中所述氨基酸序列同一性大于65％，優(yōu)選大于80％，更優(yōu)選大于90％，更優(yōu)選大于95％。此外，術(shù)語(yǔ)上述抗原的“片段”應(yīng)當(dāng)包括至少一個(gè)抗原性位點(diǎn)。優(yōu)選地，如此處所用的術(shù)語(yǔ)上述抗原的“片段”應(yīng)當(dāng)是指長(zhǎng)度不超過(guò)100個(gè)氨基酸，優(yōu)選不超過(guò)80個(gè)氨基酸，優(yōu)選不超過(guò)60個(gè)氨基酸，更優(yōu)選不超過(guò)40個(gè)氨基酸，更優(yōu)選不超過(guò)30個(gè)氨基酸，更優(yōu)選不超過(guò)20個(gè)氨基酸的多肽。進(jìn)一步優(yōu)選地，如此處所用的并且當(dāng)用于自身抗原時(shí)，術(shù)語(yǔ)上述抗原的“片段”應(yīng)當(dāng)是指當(dāng)根據(jù)本發(fā)明呈遞時(shí)應(yīng)當(dāng)能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的多肽，這種抗體特異性結(jié)合上述相應(yīng)的抗原。而且，如此處所用的術(shù)語(yǔ)上述抗原的“片段”應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地指由相應(yīng)抗原的至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)，更優(yōu)選一個(gè)截短或內(nèi)部缺失而產(chǎn)生的多肽。測(cè)定蛋白質(zhì)的抗原性位點(diǎn)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/569,322從第26頁(yè)第一段到第27頁(yè)第四段詳細(xì)描述了一些這樣的方法，這些具體公開內(nèi)容在此引用作為參考。應(yīng)當(dāng)注意，這些方法通常適用于其他多肽抗原，因此不限于如US 60/569,322所述的IL-23 p19。
當(dāng)用于上述抗原時(shí)，術(shù)語(yǔ)這些抗原的“變體”應(yīng)當(dāng)指包含或者優(yōu)選由任何天然或基因工程多肽或蛋白質(zhì)組成的任何多肽或任何蛋白質(zhì)，它與上述抗原的序列，或者對(duì)于自身抗原而言，與GeneBank登錄的野生型抗原的人序列或來(lái)自任何其他動(dòng)物的相應(yīng)直向同源物的序列，優(yōu)選地與GeneBank登錄的野生型抗原的人序列，具有70％以上，優(yōu)選80％以上，甚至更優(yōu)選90％以上，再更優(yōu)選95％以上，最優(yōu)選97％以上的氨基酸序列同一性。產(chǎn)生蛋白質(zhì)變體的優(yōu)選方法是通過(guò)基因工程，優(yōu)選通過(guò)插入、置換、缺失或其組合。蛋白質(zhì)的變體當(dāng)根據(jù)本發(fā)明呈遞時(shí)，應(yīng)當(dāng)能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生，該抗體特異性結(jié)合上述相應(yīng)的抗原。
在本申請(qǐng)中，如果抗體與本發(fā)明的抗原、抗原蛋白質(zhì)、抗原片段或抗原變體結(jié)合的結(jié)合親和力(Ka)為106M-1或更高，優(yōu)選107M-1或更高，更優(yōu)選108M-1或更高，最優(yōu)選109M-1或更高，則該抗體被定義為特異性結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地測(cè)定抗體的親和力，典型且優(yōu)選地通過(guò)Scatchard分析。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述至少一種抗原是GnRH-肽(促性腺激素釋放激素，也被稱為促黃體激素釋放激素，或LHRH)。PCT/EP2005/053858中公開了在疫苗生產(chǎn)中有用的VLP-GnRH偶聯(lián)物，在此完整引入作為參考。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“GnRH-肽”是包含或者基本由或者由以下成分組成的多肽至少一個(gè)，優(yōu)選一個(gè)哺乳動(dòng)物GnRH，特別是SEQ ID NO1或SEQ ID NO28，優(yōu)選SEQ ID NO1的至少一個(gè)氨基酸序列，優(yōu)選一個(gè)氨基酸序列，或其片段或變體。在一些實(shí)施方案中，GnRH肽包含N末端焦谷氨酸(puroglutamic acid)(pGlu或pE)。在其他實(shí)施方案中，GnRH肽包含C末端甘氨酸酰胺(G-NH2)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，GnRH肽包含一個(gè)以上的GnRH肽或其片段，例如兩個(gè)如SEQ ID NOs30-32所示的，三個(gè)或更多的串聯(lián)的GnRH肽或其片段。本發(fā)明的串聯(lián)-GnRH肽也包括其中GnRH序列通過(guò)間隔區(qū)互相連接的肽。間隔基的性質(zhì)可能非常不同，從一個(gè)或多個(gè)氨基酸到較短或較長(zhǎng)的烴鏈和其他化合物基團(tuán)或分子。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，GnRH肽與包含半胱氨酸或者由半胱氨酸組成的氨基酸連接體連接。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氨基酸連接體是與GnRH肽的N或C末端融合的半胱氨酸。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，半胱氨酸與SEQ ID NO1的N或C末端融合(產(chǎn)生SEQ ID NO4或5)，優(yōu)選與SEQ ID NO1的N末端融合(SEQ ID NO4)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，連接體CGG與GnRH肽的N末端融合，優(yōu)選地與SEQ ID NO1或SEQ ID NO28的N末端融合，更優(yōu)選地與SEQID NO1的N末端融合，產(chǎn)生SEQ ID NO2。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接體GGC與GnRH肽的C末端融合，優(yōu)選與SEQ ID NO1或SEQ ID NO28的C末端融合，更優(yōu)選與SEQ ID NO1的C末端融合，產(chǎn)生SEQ ID NO3。
這種含有GnRH作為至少一種抗原的本發(fā)明的組合物可以向諸如豬的哺乳動(dòng)物施用，以防止肉的膻味。這種含有GnRH的組合物可以向諸如狗、貓、綿羊、牛的動(dòng)物施用，以控制它們的繁殖行為和/或降低它們的繁殖力。這種含有GnRH的修飾的VLP可以向患有依賴于類固醇性激素的癌癥的人施用。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的至少一種抗原是淀粉樣β肽(Aβ1-42)，其具有氨基序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO86)，或其片段，如具有氨基序列DAEFRH(SEQ IDNO87)的Aβ1-6。淀粉樣β肽的積累可能引起或加重阿爾茨海默病，因此本發(fā)明的組合物提供一種治療或緩解該疾病狀態(tài)的方法。各種Aβ片段與各種VLP如Qβ或fr的偶聯(lián)和它們對(duì)小鼠的免疫已經(jīng)在WO02/056905的實(shí)施例13、15、17和54中公開，在此完整引入作為參考。Aβ1-6片段與病毒外殼蛋白的融合在WO04/016282的實(shí)施例7、8、9、10、11中已經(jīng)公開；Aβ1-6與VLP的偶聯(lián)在實(shí)施例13、18、20中公開；VLP-Aβ1-6對(duì)動(dòng)物的免疫和產(chǎn)生的疫苗效果在WO04/016282的實(shí)施例12、14、16、17、19和20中已經(jīng)公開。
在本發(fā)明的另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是生長(zhǎng)素釋放肽或其片段或變體。生長(zhǎng)素釋放肽是進(jìn)食行為的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。外周施用生長(zhǎng)素釋放肽增加了食物攝取，導(dǎo)致體重增加(Tschop等人，Nature 407908-12)。因此，根據(jù)本發(fā)明針對(duì)生長(zhǎng)素釋放肽免疫提供了一種治療肥胖癥的方法。優(yōu)選的生長(zhǎng)素釋放肽或生長(zhǎng)素釋放肽的肽已經(jīng)在WO04/009124的第68-74頁(yè)公開。除人類以外，生長(zhǎng)素釋放肽可以選自其他哺乳動(dòng)物種，如狗和貓。WO04/009124的實(shí)施例8、9、13、15公開了一些偶聯(lián)生長(zhǎng)素釋放肽和VLP的方法，在此引用作為參考。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是包含或者由氨基酸序列SEQ ID NO77，SEQ ID NO78，SEQ ID NO79或SEQ ID NO82或SEQ ID NO85組成的生長(zhǎng)素釋放肽片段。在另一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，所述至少一種抗原是包含或者由SEQ IDNO83組成的生長(zhǎng)素釋放肽片段，其中所述本發(fā)明的組合物優(yōu)選地向狗施用；或者是包含或者由SEQ ID NO84的生長(zhǎng)素釋放肽片段，其中所述本發(fā)明的組合物優(yōu)選地向貓施用。
在本發(fā)明的另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是IL-23 p19蛋白或IL-23 p19片段，如PCT/EP2005/004980所述，其在此完整引用作為參考。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，IL-23蛋白包含、或者基本由、或者由SEQ ID NO6或SEQ ID NO7組成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，IL-23片段包含、或者基本由、或者由選自以下的任意序列組成(a)SEQ ID NOs8-9和(b)SEQ ID NOs33-44(c)序列(a)和(b)中任一個(gè)的片段或變體。
在本發(fā)明的另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是血管緊張肽或其片段。如此處所用的術(shù)語(yǔ)“血管緊張肽”應(yīng)當(dāng)包括含有血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II的序列或其片段的任何肽。其序列如下血管緊張肽原DRVYIHPFHLVIHN(SEQ ID NO108)；血管緊張肽IDRVYIHPFHL(SEQ ID NO109)；血管緊張肽IIDRVYIHPF(SEQ ID NO110)。典型地，一個(gè)或多個(gè)另外的氨基酸被添加到血管緊張肽序列的C末端或N末端。這些另外的氨基酸特別地具有與VLP定向且有序地結(jié)合的價(jià)值。進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案在WO03/031466中已經(jīng)公開，在此引用作為參考。特別優(yōu)選的具有第二附著位點(diǎn)的血管緊張肽片段序列選自a)CGGDRVYIHPF(SEQ IDNO111)；b)CGGDRVYIHPFHL(SEQ ID NO112)；c)DRVYIHPFHLGGC(SEQID NO113)；d)CDRVYIHPFHL(SEQ ID NO114)；e)CHPFHL(SEQ IDNO115)；f)CGPFHL(SEQ ID NO116)；g)CYIHPF(SEQ ID NO117)；h)CGIHPF(SEQ ID NO118)；i)CGGHPF(SEQ ID NO119)；j)DRVYIGGC(SEQ ID NO120)；k)DRVYGGC(SEQ ID NO121)；和l)DRVGGC(SEQID NO122)。因此本發(fā)明的組合物提供一種治療或緩解高血壓的疾病狀態(tài)的方法。該組合物的制備及其用途的詳細(xì)描述在WO 03/031466中已經(jīng)公開，該完整申請(qǐng)?jiān)诖艘米鳛閰⒖肌?br> 在本發(fā)明的另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是RANKL(NF kB配體的受體激活物)，或其片段或變體。RANKL是一種245個(gè)氨基酸的跨膜蛋白，屬于TNF超家族。胞外區(qū)部分(178aa)可以被TACE-樣蛋白酶釋放出(Lum等人，J Biol Chem.27413613(1999))。人RANKL的胞外部分的氨基酸序列在WO02/056905的SEQ IDNO221(TrEMBL014788)中顯示，人同種型的氨基酸序列在SEQ IDNO222中顯示。鼠RANKL和同種型的胞外部分的序列在WO02/056905的SEQ ID NO223(TrEMBL035235)和SEQ ID NO224(TrEMBLQ9JJK8和TrEMBLQ9JJK9)中顯示。
已經(jīng)表明RANKL是破骨細(xì)胞生成(osteoclastogenesis)中的一種重要因子。RANKL與其受體RANK的相互作用的抑制可以導(dǎo)致破骨細(xì)胞生成的抑制，因此提供了一種終止在骨質(zhì)疏松癥和其他疾病中所見的過(guò)度骨再吸收的方法。
本發(fā)明的一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案是一種人-RANKL構(gòu)建體，它具有含有半胱氨酸殘基的N末端氨基酸連接體，該連接體與RANKL的胞外部分融合。關(guān)于RANKL的生理學(xué)功能、其表達(dá)方法的其他信息在WO02/056905第62至64頁(yè)已經(jīng)公開，人-RANKL構(gòu)建體在WO02/056905的實(shí)施例6中已經(jīng)公開，在此引入作為參考。RANKL蛋白、片段或RANKL肽變體的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案在WO03/039225第223至235段中已經(jīng)公開，在此引入作為參考。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是白介素-17(IL-17)，或其片段或變體。人IL-17是一種32-kDa的、二硫鍵連接的、具有可變糖基化的同型二聚體蛋白質(zhì)(Yao，Z.等人，J.Immunol.1555483-5486(1995))。人和小鼠IL-17的氨基酸序列在WO02/056905的SEQ ID No228(登記號(hào)AAC50341)和SEQ ID NO229(登記號(hào)AAA37490)中分別給出。
臨床研究表明IL-17可能參與許多炎性疾病。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中已經(jīng)報(bào)道了高水平的IL-17(Ziolkowska M.等人，J Immunol.1642832-8(2000))。白介素17已經(jīng)表明對(duì)鼠膝關(guān)節(jié)中的蛋白聚糖降解具有影響(Dudler J.等人，Ann Rheum Dis.59529-32(2000))，并且引起滑膜基質(zhì)的破壞(Chabaud M.等人，Cytokine.721092-9(2000))。在多發(fā)性硬化患者的單核細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IL-17 mRNA水平升高(Matusevicius，D.等人，Mult.Scler.5101-104(1999))。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中觀察到IL-17血清水平升高(Wong CK.等人，Lupus 9589-93(2000))。另外，在從病變的牛皮癬皮膚上分離的T細(xì)胞中IL-17 mRNA水平升高(Teunissen，M.B.等人，J.Invest.Dermatol.111645-649(1998))。IL-17參與腎移植排斥已經(jīng)得到證明(Fossiez F.等人，Int.Rev.Immunol.16541-51(1998))。上述發(fā)現(xiàn)提示IL-17在炎癥反應(yīng)的引發(fā)或保持中可能起關(guān)鍵作用(Jovanovic，D.V.等人，J.Immunol.1603513-3521(1998))。人和小鼠IL-17序列在WO02/056905的SEQ ID NO228(AAC50341)和SEQ ID NO229(AAA37490)中給出。表達(dá)IL-17的方法在WO02/056905的第69頁(yè)已經(jīng)描述，在此引用作為參考。
在本發(fā)明的另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是白介素-13(IL-13)，或其片段或變體。前體人IL-13的氨基酸序列在WO02/056905的SEQ ID No230中顯示，加工后的人IL-13的氨基酸序列在SEQ ID No231中顯示。前體蛋白的前20個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)于信號(hào)肽，在加工后的蛋白質(zhì)中不存在。
IL-13是T輔助細(xì)胞2衍生的細(xì)胞因子(類似于IL-4、IL-5)，最近表明它與變應(yīng)性氣管反應(yīng)(哮喘)有關(guān)。在許多腫瘤類型(例如何杰金淋巴瘤)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IL-13和IL-13受體的上調(diào)。白介素13由何杰金和Reed-Sternberg細(xì)胞分泌并刺激該細(xì)胞的生長(zhǎng)(Kapp U等人，J Exp Med.1891939-46(1999))。因此針對(duì)IL-13免疫提供了一種治療上述疾病如哮喘或何杰金淋巴瘤的方法。表達(dá)IL-13的方法在WO02/056905第70頁(yè)已經(jīng)描述，IL-13構(gòu)建體在WO02/056905的實(shí)施例9中已經(jīng)公開，在此引用作為參考。
在本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是白介素-5(IL-5)，或其片段或變體。IL-5是嗜酸細(xì)胞生成(eosinophilopoiesis)的譜系特異性的細(xì)胞因子，在與嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量增多有關(guān)的疾病如哮喘中起重要作用。前體和加工后的人IL-5的序列分別在WO02/056905的SEQ ID No233和SEQ ID No234中提供，加工后的鼠氨基酸序列在WO02/056905的SEQ ID No235中顯示。
在幾項(xiàng)研究中已經(jīng)表明了IL-5的生物學(xué)功能(Coffman R.L.等人，Science 245308-10(1989)；Kopf等人，Immunity 415-24(1996))，這些研究針對(duì)在通過(guò)嗜酸粒細(xì)胞介導(dǎo)的疾病中抑制IL-5功能的有益作用。IL-5作用的抑制提供了一種治療哮喘和其他與嗜酸粒細(xì)胞有關(guān)的疾病的方法。
在本發(fā)明的另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是CCL-21，或其片段或變體。在一個(gè)相關(guān)的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原是CXCL 12，也被稱為SDF-1。已經(jīng)表明，趨化因子受體CCR7和CXCR4在乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)，其各自的配體CCL21和CXCL 12在作為乳腺癌轉(zhuǎn)移第一目標(biāo)的器官中高度表達(dá)(Müller等人.Nature 41050-6(2001))。因此，針對(duì)CCL21和CCL12免疫分別提供了治療癌癥，更特別是乳腺癌的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的方法。另外，CCL12/CXCR4趨化因子-受體對(duì)已經(jīng)顯示提高更初級(jí)的造血組細(xì)胞向骨髓歸巢(homing)的效力。另外，提出CXCR4和SDF-1影響慢性淋巴細(xì)胞性白血病的分布。因此，針對(duì)CXCL 12免疫提供了一種治療慢性淋巴細(xì)胞性白血病的方法。而且，據(jù)報(bào)道CCL12-CXCR4相互作用在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜中的CD4+T細(xì)胞積累中起中心作用(Nanki等人，2000)。針對(duì)SDF-1免疫因此提供了一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法。
人和小鼠CCL21序列分別在WO02/056905的SEQ ID No236(SwissprotSY21_human)和SEQ ID NO237(SwissprotSY21_mouse)中顯示。人和小鼠CCL 12序列分別在WO02/056905的SEQ ID NO238(SwissprotSDF1_human)和SEQ ID NO239(SwissprotSDF1_mouse)中顯示。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是B-淋巴細(xì)胞化學(xué)引誘物(BLC，CXCL 13)，或其片段或變體。人和小鼠BLC序列分別在WO02/056905的SEQ ID NO240(登記號(hào)NP_006410)和SEQ IDNO241(登記號(hào)NP_061354)中顯示。人和小鼠的信號(hào)肽分別是前22或21個(gè)氨基酸。本發(fā)明的含有BLC的組合物優(yōu)選地含有成熟形式的蛋白質(zhì)。
BLC的其他生理學(xué)功能和制備組合物的方法在WO02/056905的第74和75頁(yè)已經(jīng)公開，在此引用作為參考。針對(duì)BLC的免疫可以提供一種治療涉及淋巴新生的自身免疫病如類風(fēng)濕性滑膜炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或I型糖尿病的方法。
在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的至少一種抗原是嗜酸細(xì)胞活化趨化因子，或其片段或變體。盡管IL-5似乎負(fù)責(zé)嗜酸粒細(xì)胞從骨髓到血液的遷移，但是嗜酸細(xì)胞活化趨化因子負(fù)責(zé)在組織中的局部遷移(Humbles等人，J.Exp.Med.186601-12(1997))。人嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-1的序列在WO02/056905的SEQ ID NO242中顯示(aa1-23對(duì)應(yīng)于信號(hào)肽)，人嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-2的序列在SEQ ID NO243中顯示(aa 1-26對(duì)應(yīng)于信號(hào)肽)，人嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-3的序列在SEQ ID NO.244中顯示(aa 1-23對(duì)應(yīng)于信號(hào)肽)，小鼠嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-1的序列在SEQ ID No.245中顯示(aa 1-23對(duì)應(yīng)于信號(hào)肽)，小鼠嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-2的序列在SEQ ID No.246中顯示(aa 1-2對(duì)應(yīng)于信號(hào)肽)，因此該申請(qǐng)?jiān)诖艘米鳛閰⒖?。嗜酸?xì)胞活化趨化因子的其他生理學(xué)、生化信息及其根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)和構(gòu)建在WO02/056905的第75和76頁(yè)公開，在此引用作為參考。
在本發(fā)明的另一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF或CSF-1)，或其片段或變體。M-CSF和其受體表達(dá)升高與幾種上皮癌癥如乳腺癌、子宮癌和卵巢癌的較差預(yù)后有關(guān)。關(guān)于可溶性形式的M-CSF的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)可以獲得(晶體結(jié)構(gòu)Pandit等人，Science 2551358-62(1992))。人序列在WO02/056905的SEQID NO247(登記號(hào)NP_000748)中顯示。本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的抗原包括由SEQ ID NO247的殘基33-181或33-185組成的N-末端片段，其對(duì)應(yīng)于受體的可溶性形式。小鼠序列(登記號(hào)NP_031804)在WO02/056905的SEQ ID NO248中顯示。M-CSF的其他生物學(xué)信息以及其表達(dá)和根據(jù)本發(fā)明的組合物的構(gòu)建在WO02/056905的第77和78頁(yè)公開，在此引用作為參考。
在本發(fā)明的另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是TNF-超家族成員，或其片段或變體。如此處所用的術(shù)語(yǔ)“TNF-超家族成員”是指包含TNF樣域的蛋白質(zhì)。如此處所用的術(shù)語(yǔ)“TNF-超家族成員”包括在人、貓、狗、小鼠、大鼠、一般的真哺乳亞綱動(dòng)物、一般的哺乳動(dòng)物以及其它的動(dòng)物中已知的所有形式的TNF-超家族成員。TNF-超家族成員包含約150個(gè)殘基的球狀TNF-樣胞外域，該域在保守域數(shù)據(jù)庫(kù)CDD中被分類為cd00184、pfam00229或smart00207(Marchler-Bauer A等人(2003)，″CDDa curated Entrez databaseof conserved domain alignments″，Nucleic Acids Res.31383-387)。如此處所用的TNF-超家族成員包括TNFα、LTα、LTα/β、FasL、CD40L、TRAIL、RANKL、CD30L、4-1BBL、OX40L、GITRL和BAFF、CD27L、TWEAK、APRIL、TL1A、EDA和在其中可以識(shí)別出TNF-樣域的任何其他的多肽。
在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的至少一種抗原是TNF-肽。如此處所用的“TNF-肽”是指一種肽，它包含與保守域pfam00229(SEQ ID NO45)的共有序列的氨基酸殘基3到8同源的，即在本文中，相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，優(yōu)選與保守域pfam 00229(SEQ ID NO45)的共有序列的氨基酸殘基1到8同源的肽序列，更優(yōu)選與所述共有序列的氨基酸殘基1到13同源的肽序列。當(dāng)TNF-肽是來(lái)自人或小鼠TNFα的肽時(shí)，所述TNF-肽由長(zhǎng)度為6到18個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選6到16個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選6到14個(gè)氨基酸殘基的肽組成。同源性肽是這樣一種肽，它來(lái)源于一種動(dòng)物，包括人類的TNF-超家族成員，特別是哺乳動(dòng)物TNF-超家族成員，例如小鼠或人RANKL或小鼠或人TNFα，表現(xiàn)對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO45的氨基酸殘基。這些同源性肽對(duì)于技術(shù)人員來(lái)說(shuō)通過(guò)比對(duì)TNF超家族的共有序列(SEQ ID NO45)和另一種動(dòng)物的所述TNF-超家族成員是可以確認(rèn)的。如上所述，TNF-肽包括對(duì)應(yīng)于共有序列的上述氨基酸殘基的肽序列。也就是，在具有共有序列的特定同源區(qū)之外(例如共有序列的氨基酸殘基3-8)，TNF-肽可能不同于是TNF超家族成員的多肽。但是優(yōu)選地，位于上述具有共有序列的同源區(qū)之外的TNF-肽的部分與是TNF超家族成員，優(yōu)選哺乳動(dòng)物TNF-超家族成員，更優(yōu)選人TNF-超家族成員的多肽至少70％相同，更優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或甚至100％相同。
在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的至少一種抗原是具有序列SSRTPSDKPVAHVVANPQAE(SEQ ID NO88)的人TNFα肽(4-23)。在本發(fā)明的另一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗原是具有序列SSQNSSDKPVAHVVANHQVE(SEQ ID NO89)的小鼠TNFα肽(4-23)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，該抗原是成熟鼠TNF-α的氨基酸殘基22-32VEEQLEWLSQR(SEQ ID NO90)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗原是人TNF-α的氨基酸殘基22-32AEGQLQWLNRR(SEQ ID NO91)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，含有TNFα肽(4-23)的本發(fā)明的組合物用于生產(chǎn)治療自身免疫病或骨相關(guān)疾病的藥物，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎性腸病、多發(fā)性硬化、糖尿病、自身免疫性甲狀腺病、自身免疫性肝炎、牛皮癬和牛皮癬性關(guān)節(jié)炎，其中所述骨相關(guān)疾病選自骨質(zhì)疏松癥、牙周變性(periondontis)、假體周圍骨溶解、骨轉(zhuǎn)移、骨癌痛、佩吉特病、多發(fā)性骨髓瘤、舍格倫綜合征和原發(fā)性膽汁性肝硬變。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述自身抗原可以是如WO02/056905的第55和56頁(yè)公開的VEGF或VEGFR，或其片段或變體；WO02/056905的第79和80頁(yè)公開的淋巴毒素β；WO02/056905第93頁(yè)的淋巴毒素β和淋巴毒素α和淋巴毒素β受體。這些信息在此引用作為參考。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是CXCR4或其片段或變體。趨化因子受體CXCR4，也被稱為L(zhǎng)ESTR或融合素，屬于七跨膜域G-蛋白偶聯(lián)受體家族(Federsppiel等人(1993)，Genomics16707)。CXCR4的唯一已知的配體是SDF-1(Pelchen-Mattews，等人(1999)Immunol.Rev.16833)。CXCR4和SDF-1被認(rèn)為參與人生理學(xué)的許多領(lǐng)域，如血細(xì)胞生成、T細(xì)胞活化和向炎癥部位的遷移和細(xì)胞歸巢、血管化、腦發(fā)育和胚胎發(fā)生(Murdoch，(2000)Immunol.Rev.177175)。
CXCR4后來(lái)被確定為HIV的共同受體(Feng等人(1996)Science272872)。因此，其進(jìn)入需要CXCR4的HIV株被分類為X4株。SDF-1已經(jīng)顯示阻止HIV-1的進(jìn)入(Oberlin等人(1996)，Nature 382833；Bleul，等人(1996)Nature 382829)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原包含或者由CXCR4胞外域的片段組成。CXCR4胞外域的片段具有至少6、7個(gè)，優(yōu)選至少8、9、10個(gè)氨基酸，CCR5胞外域的片段具有少于30個(gè)，優(yōu)選20個(gè)，更優(yōu)選15個(gè)，甚至更優(yōu)選12個(gè)氨基酸。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原包含或者由CXCR4的N-末端胞外域組成。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，CXCR4的N-末端胞外域包含或者由SEQ ID NO66組成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原包含或者由CXCR4胞外域ECL2的片段組成。優(yōu)選地，所述片段具有至少6個(gè)，優(yōu)選7個(gè)氨基酸。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一種抗原包含或者由具有如SEQ ID NO65所示氨基酸序列的CXCR4胞外域ECL2的片段組成。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是CCR5或其片段或變體。HIV R5株使用細(xì)胞表面分子CD4和CCR5附著并進(jìn)入巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞。CCR5是一種七跨膜受體，具有4個(gè)胞外域N末端序列和三個(gè)暴露于胞外間隙的環(huán)，它們后來(lái)分別被稱為PNt、ECL-1、ECL-2和ECL-3。天然CCR5配體RANTES、M1P-1α、MIP-1β及其類似物能夠阻斷病毒-共同受體的相互作用，并進(jìn)一步引起CCR5的內(nèi)化(Lederman等人，2004，Science 306，p485)。CCR5特異性自身抗體已經(jīng)在12.5％的重復(fù)暴露于HIV但是仍未感染的女性中發(fā)現(xiàn)(Lopalco等人，2000，J.Immunology 164，3426)。這些抗體表現(xiàn)為結(jié)合CCR5的第一胞外環(huán)(ECL-1)，并且能夠抑制外周血單核細(xì)胞(PBMC)的R5-向性HIV感染。女性中的同種異體免疫導(dǎo)致能夠在體外抑制R5-HIV感染的CCR5特異性抗體(Wang等人，2002，Clin.Exp.Immunol.129，493)。
單克隆α-CCR5抗體能夠防止HIV感染(Olson等人，1999，J.Virol.73，4145；Wu和LaRosa等人，1997，J.Exp.Med.186，1373)。與對(duì)應(yīng)于小胞外環(huán)ECL-2A(Arg168-Thr177)的環(huán)肽結(jié)合的抗體抑制HIV-1 R5的感染(Misumi等人，2001，J.Virol.75，11614)。用線性CCR5肽(來(lái)自N-末端，ECL-1或ECL-2序列)免疫猴子產(chǎn)生的抗體在外體具有病毒抑制作用(Lehner等人，2001，J.Immunology 166，7446)。CCR5的N-末端域也展示在乳頭瘤病毒樣顆粒上，并免疫猴子。在所有5只檢測(cè)的猴子中，病毒載量較低，較快速地下降，最終成為不可檢測(cè)的(Chackerian等人，2004，J.Virol.78，4037)，盡管在6只對(duì)照恒河猴中有一半其血漿結(jié)合的病毒也下降到不可檢測(cè)的水平。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原包含或者由CCR5胞外域的片段組成。CCR5胞外域的片段具有至少6或7個(gè)，優(yōu)選至少8、9或10個(gè)氨基酸，CCR5胞外域的片段具有不到35個(gè)，優(yōu)選不到30個(gè)，優(yōu)選不到20個(gè)，更優(yōu)選不到15個(gè)，甚至更優(yōu)選不到12個(gè)氨基酸。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，CCR5胞外域的片段包含或者由ECL2A組成。如本領(lǐng)域中公知的，ECL2A優(yōu)選地開始于ECL2的第一個(gè)氨基酸，優(yōu)選地終止于在ECL2中恰好位于半胱氨酸之前的蘇氨酸。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，ECL2A包含或者由SEQ ID NO62組成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，ECL2A被環(huán)化。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，環(huán)化的ECL2A包含或者由SEQ ID NO62組成。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，ECL2A是如SEQ ID NO61所示的環(huán)肽，其中該肽通過(guò)兩個(gè)末端處的C和G殘基環(huán)化。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原包含或者由CCR5胞外域PNt組成。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，PNt域包含或者優(yōu)選由SEQ ID NO63組成。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是胃泌素和/或前胃泌素。胃泌素(G17)是一組經(jīng)典的腸肽激素，它們?cè)诮Y(jié)腸和胰臟中含量非常低(Koh，Regulatory Peptides.93，37-44(2000))。胃泌素是從它的前體前胃泌素(G34)加工而來(lái)的。胃泌素和前胃泌素都以C末端甘氨酸延伸的形式和C末端苯丙氨酸酰胺化的形式存在。
眾所周知胃泌素具有刺激胃酸分泌的能力(Pharmacol Ther.98，109-127(2003))。相關(guān)的激素膽囊收縮素(CCK)，其具有如胃泌素的C-末端四肽酰胺，在十二指腸中合成，并負(fù)責(zé)胰酶分泌。酰胺化的G17與CCK-2受體結(jié)合，CCK與CCK-1受體和CCK-2受體都結(jié)合(Steel.IDrugs.5，689-695(2002))。甘氨酸延長(zhǎng)的胃泌素的受體仍然不清楚。最近的數(shù)據(jù)提示胃泌素可能促進(jìn)胃腸道癌癥的發(fā)展(Watson.Aliment Pharmacol Ther.14，1231-1247(2000))。相反，非酰胺化的胃泌素刺激結(jié)腸粘膜生長(zhǎng)，加速結(jié)腸癌形成的早期步驟，并且在結(jié)腸癌患者的腫瘤和循環(huán)中升高(Watson.Aliment Pharmacol Ther.14，1231-1247(2000))。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原包含或優(yōu)選地由G17(SEQ ID NO50)組成。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一種抗原包含或者由在C末端添加了甘氨酸的G17(SEQ ID NO51)組成。在一個(gè)可替代的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一種抗原包含或優(yōu)選地由最后一個(gè)氨基酸F被酰胺化的G17組成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原包含或者由前胃泌素G34(SEQ ID NO52)組成。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一種抗原包含或者由在C末端增加有另一個(gè)甘氨酸的前胃泌素G34(SEQ ID NO53)組成。在一個(gè)可替代的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一種抗原包含或者由最后一個(gè)氨基酸F被酰胺化的前胃泌素G34組成。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原包含或者由G17 1-9片段(SEQ ID NO49)組成，優(yōu)選地具有與其C末端融合的連接序列，更優(yōu)選地具有與C末端融合的連接序列SSPPPPC。
在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，與連接體融合的至少一種抗原包含或者由如SEQ ID NO54所示的氨基酸序列組成。
應(yīng)當(dāng)指出，作為胃泌素序列一部分的EGPWLEEEE的位點(diǎn)1處的E可以是E、pyro E或Q。當(dāng)另外的氨基酸融合到EGPWLEEEE的N端時(shí)，序列EGPWLEEEE的位點(diǎn)1處的E可以是E，或者優(yōu)選Q。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是C5a或其片段或變體。C5a是一種74個(gè)氨基酸的四螺旋束糖蛋白(Fernandez和Hugli，J.Biol.Chem.253，6955-6964，1978)，負(fù)責(zé)產(chǎn)生針對(duì)細(xì)胞系統(tǒng)，特別是嗜中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的大量多樣化的效應(yīng)，以誘導(dǎo)局部炎癥來(lái)對(duì)抗傳染性微生物(Ward P，Nat.Rev.Immunol.4133，2004)。但是，通過(guò)相同的方式，膿毒癥中C5a的過(guò)量產(chǎn)生導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞的嚴(yán)重的功能缺陷(Czermak等人，Nat.Med.5788，1999；Huber-Lang等人，J.Immunol.1661193，2001)。提高的C5a的活化也與許多原發(fā)和/或慢性炎性疾病有關(guān)，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Jose P.Ann Rheum.Dis.49747，1990)、牛皮癬(Takematsu H，Arch.Dermatol.12974，1993)、成人型呼吸窘迫綜合征(Langlois P，Heart Lung 1871，1989)、再灌注損傷(Homeister，J.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.3417，1994)、狼瘡腎炎和大皰性類天皰瘡。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原包含或由C5a組成。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，C5a蛋白具有SEQ ID NO57的氨基酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原包含或由C5a組成。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，C5a片段具有SEQ ID NO59的氨基酸序列。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是CETP或其片段或變體。膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)是一種血漿糖蛋白，其介導(dǎo)膽固醇酯(CE)和甘油三酯(TG)在高密度脂蛋白(HDL)顆粒和富含apoB的顆粒如極低密度脂蛋白(VLDL)顆粒或低密度脂蛋白(LDL)顆粒之間的交換。CETP也轉(zhuǎn)移磷酯(PL)。人CETP cDNA編碼476個(gè)氨基酸的分子量為53000的蛋白質(zhì)，其通過(guò)糖基化產(chǎn)生Mr 74000的糖蛋白。
HDL被認(rèn)為是抗動(dòng)脈粥樣硬化的，因?yàn)樵贖DL-膽固醇水平和冠心病(CHD)之間已經(jīng)觀察到負(fù)相關(guān)(Barter P.J.和Rye K.-A.(1996)Atherosclerosis 1211-12)。相反，LDL和VLDL是致動(dòng)脈粥樣化的脂蛋白。人的CETP缺陷與HDL-c水平升高和LDL-c水平降低有關(guān)，它們一般都是抗動(dòng)脈粥樣硬化的。受代謝性綜合征影響的患者具有低HDL-c，富含的一部分小密度LDL顆粒，輕度至中度高甘油三酯血癥、輕度高血壓、軀干性肥胖和胰島素抵抗，特別是CHD的危險(xiǎn)。非胰島素依賴性糖尿病或家族性復(fù)合高脂血癥患者也具有低HDL-c，并且具有CHD的危險(xiǎn)(Barter P.J.和Rye K.-A.(1996)Atherosclerosis 1211-12)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原包含或者由具有SEQID NO69的氨基酸序列的CETP片段組成。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原包含或者由緩激肽、其片段或變體組成。緩激肽(BK，KRPPGFSPFR，SEQ ID NO80)是一種重要的血管擴(kuò)張肽，在血壓、血流和血管通透性的局部調(diào)節(jié)中起重要作用(Margolius H.S，等人，Hypertension，1995)。另外還描述了緩激肽的幾種另外的生物活性，包括平滑肌收縮和舒張、傷害感受和痛覺過(guò)敏的誘導(dǎo)、和炎癥反應(yīng)的介導(dǎo)。緩激肽通過(guò)B2受體發(fā)揮其作用。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原包含或者由des-Arg9-緩激肽、其片段或變體組成。des-Arg9-BK(KRPPGFSPF，SEQID NO81)與緩激肽既有重疊的也有不同的功能。證據(jù)表明des-Arg9-BK在組織損傷后快速產(chǎn)生，并且調(diào)節(jié)在炎癥過(guò)程期間觀察到的大多數(shù)事件，包括血管擴(kuò)張、血管通透性增加、血漿外滲、細(xì)胞遷移、疼痛和痛覺過(guò)敏(Calixto J.B.等人，Pain 2000)。Des-Arg9-BK通過(guò)B1受體發(fā)揮其作用。
已經(jīng)報(bào)道BK和Des-Arg9-BK在幾種炎性疾病中起作用。例如，在抗原誘導(dǎo)的慢性或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的過(guò)程中觀察到滑液成纖維細(xì)胞中B2和B1-受體的上調(diào)和血清激肽產(chǎn)生的增加(Cruwys S.C.等人，Br J Pharmacol，1994；Cassim B.等人，Immunopharmacology1997)。實(shí)驗(yàn)證據(jù)提示BK和des-Arg9-BK在哮喘的發(fā)展過(guò)程中起作用。在哮喘患者的BALF中發(fā)現(xiàn)BK和des-Arg9-BK水平升高(ChristiansenS.C.等人，Am.Rev.Dis.1992)。BK和Des-Arg9-BK在原發(fā)性和慢性炎性疾病，特別是在變應(yīng)原或顆?？乖绮《菊T導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎和氣管炎癥中起作用。
本發(fā)明進(jìn)一步包括含有此處所述抗原的模擬位的組合物。關(guān)于在本發(fā)明的疫苗組合物中使用模擬位的其他信息在WO02/056905第83-85頁(yè)已經(jīng)公開，在此引用作為參考。
至少一種抗原可以通過(guò)從天然來(lái)源中純化，或優(yōu)選地通過(guò)重組表達(dá)，甚至更優(yōu)選地在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中，最優(yōu)選地在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)而制備。為了純化目的，本發(fā)明的抗原通常表達(dá)為具有諸如組氨酸標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、myc標(biāo)簽的標(biāo)簽或抗體恒定區(qū)(Fc區(qū))的融合蛋白。典型但不是必須的，在抗原和標(biāo)簽之間有一個(gè)腸激酶切割位點(diǎn)，使該標(biāo)簽可以被切割。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，不超過(guò)50個(gè)氨基酸的至少一種抗原通過(guò)化學(xué)方法合成。
應(yīng)當(dāng)注意，現(xiàn)有技術(shù)如WO02/056905、WO03/031446、WO03/039225、WO03/040164、WO04/009116、WO04/009124、WO04/016282、US60/569322、WO 03/031466、WO 2004/007538以及其他引入本發(fā)明的參考文獻(xiàn)中公開的VLP-抗原偶聯(lián)物在通過(guò)表達(dá)而獲得和產(chǎn)生的VLP內(nèi)仍然含有一定量的宿主RNA。另一方面，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的VLP-抗原偶聯(lián)物含有的宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸的量減少或基本去除。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的VLP和本發(fā)明的至少一種抗原通過(guò)至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)融合，即通過(guò)至少一個(gè)肽鍵融合。這種融合例如可以通過(guò)將本發(fā)明的至少一種抗原與病毒外殼蛋白，即病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)單元(building block)融合來(lái)實(shí)現(xiàn)，典型地通過(guò)基因工程融合。
編碼本發(fā)明的抗原(優(yōu)選不到100個(gè)氨基酸，更優(yōu)選不到80個(gè)氨基酸，更優(yōu)選不到60個(gè)氨基酸，更優(yōu)選不到40個(gè)，最優(yōu)選不到20個(gè)氨基酸的抗原)的基因，在內(nèi)部或優(yōu)選地在N末端或C末端與編碼VLP外殼蛋白的基因符合讀框地連接。也可以通過(guò)向VLP亞單位的變體內(nèi)插入抗原的序列來(lái)實(shí)現(xiàn)融合，其中亞單位序列的一部分缺失，被稱為截短突變體。截短突變體可能有VLP外殼蛋白的部分序列的N端或C端缺失或內(nèi)部缺失。優(yōu)選地，融合蛋白保留裝配為VLP的能力，這可以通過(guò)電鏡檢查。
可加入側(cè)翼氨基酸殘基來(lái)增加外殼蛋白和外源表位之間的距離。甘氨酸和絲氨酸殘基是用于側(cè)翼序列的特別有利的氨基酸。這種側(cè)翼序列賦予額外的柔性，可減少外源序列融合進(jìn)入VLP外殼蛋白序列時(shí)可能的去穩(wěn)定效應(yīng)，并且可減少外源表位的存在對(duì)裝配的干擾。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，修飾的VLP是嵌合VLP，其中優(yōu)選地，所述嵌合VLP包含或由至少一個(gè)融合蛋白和至少一個(gè)病毒外殼蛋白組成。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的至少一種抗原，優(yōu)選由不到50個(gè)氨基酸組成的抗原，能夠與許多病毒外殼蛋白，例如QβA1蛋白截短形式的C-末端融合(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 399-15(1996))，或插入CP延伸區(qū)的第72和73位之間。例如Kozlovska等人(Intervirology，399-15(1996))描述了其中的表位融合到在第19位截短的QβCP延伸區(qū)的C-末端的QβA1蛋白融合體。作為另一個(gè)例子，抗原可以插入fr CP的第2和3位氨基酸之間，形成抗原-fr CP融合蛋白(Pushko P.等人，Prot.Eng.6883-891(1993))。而且，抗原能夠與RNA噬菌體MS-2外殼蛋白的N末端突出β-發(fā)夾融合(WO92/13081)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原與AP205噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段的N-或C-末端融合。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一種抗原與AP205噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段的N-或C-末端通過(guò)間隔區(qū)融合。通常，柔性的間隔區(qū)是有利的。第一多肽和第二多肽之間間隔區(qū)的構(gòu)建可以通過(guò)重組DNA技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，間隔區(qū)的氨基酸序列選自(a)GSGG(SEQ ID NO92)；(b)GSG(SEQ ID NO93)；(c)GTAGGGSG(SEQ ID NO94)；和(d)GSGTAGGGSGS(SEQ ID NO95)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含或者基本由具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒組成，該病毒樣顆粒與具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵連接，優(yōu)選地該共價(jià)鍵是非肽鍵。典型的固有的高度重復(fù)和組織的RNA噬菌體VLP結(jié)構(gòu)有利地助于在優(yōu)選高度有序且重復(fù)的陣列中展示本發(fā)明的抗原的能力，進(jìn)一步通過(guò)如本發(fā)明公開的定向和確定的連接來(lái)確保這種展示。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)包含或優(yōu)選地是氨基，優(yōu)選賴氨酸殘基的氨基。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二附著位點(diǎn)包含，或優(yōu)選地是巰基，優(yōu)選半胱氨酸的巰基。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二附著位點(diǎn)包含或優(yōu)選是與至少一種抗原連接，優(yōu)選共價(jià)連接的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)。
US 5,698,424描述了一種能夠形成衣殼的修飾的噬菌體MS-2外殼蛋白，其中通過(guò)向N端發(fā)夾區(qū)中插入一個(gè)半胱氨酸殘基，以及通過(guò)將位于N端發(fā)夾區(qū)外部的每一個(gè)半胱氨酸殘基置換為非半胱氨酸氨基酸殘基，來(lái)修飾外殼蛋白。插入的半胱氨酸然后可以直接連接到欲呈遞的期望的分子種類如表位或抗原性蛋白質(zhì)上。
然而我們注意到，衣殼中存在暴露的游離半胱氨酸殘基可通過(guò)形成二硫鍵導(dǎo)致衣殼寡聚化。而且，衣殼和抗原性蛋白質(zhì)之間通過(guò)二硫鍵的連接是不穩(wěn)定的，特別是對(duì)于含有巰基部分的分子不穩(wěn)定，而且，在血清中例如比硫醚連接的穩(wěn)定性差(Martin FJ.和Papahadjopoulos D.(1982)Irreversible Coupling ofImmunoglobulin fragments to Preformed Vesicles.J.Biol.Chem.257286-288)。
因此，在一個(gè)進(jìn)一步非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，VLP與至少一種抗原的連接不包括二硫鍵。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)包含，或優(yōu)選地是巰基。而且，在本發(fā)明一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，VLP與至少一種抗原的連接不包括硫-硫鍵。在一個(gè)進(jìn)一步非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)不是或者不包含半胱氨酸的巰基。在一個(gè)進(jìn)一步非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)不是或不包含巰基。
在本發(fā)明的一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)包含或優(yōu)選地是氨基，更優(yōu)選賴氨酸的氨基，并且第二附著位點(diǎn)包含，或者優(yōu)選地是巰基，更優(yōu)選半胱氨酸的巰基。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)化學(xué)交聯(lián)，一般且優(yōu)選地通過(guò)使用異雙功能交聯(lián)劑，將至少一種抗原與VLP連接。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，異雙功能交聯(lián)劑含有能夠與優(yōu)選的第一附著位點(diǎn)(即含有氨基，優(yōu)選VLP的賴氨酸殘基的氨基)反應(yīng)的一個(gè)官能團(tuán)，和能夠與優(yōu)選的第二附著位點(diǎn)(即巰基，優(yōu)選本發(fā)明的抗原固有的或人工添加的半胱氨酸殘基的巰基，任選地也可通過(guò)還原用于反應(yīng))反應(yīng)的另一個(gè)官能團(tuán)。有幾種異雙功能交聯(lián)劑在本領(lǐng)域公知。包括優(yōu)選的交聯(lián)劑SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和例如可從Pierce ChemicalCompany獲得的其它交聯(lián)劑。上述交聯(lián)劑均導(dǎo)致在與氨基反應(yīng)后形成酰胺鍵和與巰基反應(yīng)后形成硫醚鍵。適用于實(shí)施本發(fā)明的另一類交聯(lián)劑的特征在于偶聯(lián)時(shí)在抗原與VLP之間引入二硫鍵。屬于這一類的優(yōu)選交聯(lián)劑包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物還包含連接體。因此，在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，通過(guò)連接包含適合作為第二附著位點(diǎn)的氨基酸或者由其組成的連接體，實(shí)現(xiàn)向抗原上構(gòu)建第二附著位點(diǎn)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，連接體通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵，優(yōu)選地通過(guò)至少一個(gè)，典型一個(gè)肽鍵與抗原連接。優(yōu)選地，連接體包含或者由第二附著位點(diǎn)組成。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接體包含半胱氨酸殘基的巰基。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接體是半胱氨酸殘基。
連接體的選擇取決于抗原的性質(zhì)，取決于其生化性質(zhì)，如pI、電荷分布和糖基化。柔性的氨基酸連接體通常是有利的。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接體由氨基酸組成，其中進(jìn)一步優(yōu)選地，連接體由最多25個(gè)，優(yōu)選最多20個(gè)，更優(yōu)選最多15個(gè)氨基酸組成。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸連接體含有不超過(guò)10個(gè)氨基酸。連接體的優(yōu)選實(shí)施方案選自(a)CGG(SEQ ID NO96)；(b)N-端γ-1連接體(例如CGDKTHTSPP，SEQ ID NO97)；(c)N-端γ-3連接體(例如CGGPKPSTPPGSSGGAP，SEQ ID NO48)；(d)Ig鉸鏈區(qū)；(e)N-端甘氨酸連接體(例如GCGGGG，SEQ ID NO98)；(f)(G)kC(G)n，其中n＝0-12，k＝0-5；(g)N-端甘氨酸-絲氨酸連接體((GGGGS)n，n＝1-3，具有另外一個(gè)半胱氨酸(例如SEQ ID NO99，它相當(dāng)于其中n＝1的實(shí)施方案)；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2(例如SEQ ID NO100，它相當(dāng)于其中n＝1，k＝1，l＝1且m＝1的實(shí)施方案)；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C端γ-1連接體(例如DKTHTSPPCG，SEQ ID NO101)；(m)C-端γ-3連接體(例如PKPSTPPGSSGGAPGGCG，SEQ ID NO102)；(n)C-端甘氨酸連接體(GGGGCG，SEQ ID NO103)；(o)(G)nC(G)k，其中n＝0-12，k＝0-5；(p)C-端甘氨酸-絲氨酸連接體((SGGGG)n，n＝1-3，具有另外一個(gè)半胱氨酸(例如SEQ ID NO104，它相當(dāng)于其中n＝1的實(shí)施方案)；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，o＝0-8(SEQ ID NO37)(例如SEQ ID NO105，它相當(dāng)于其中n＝1，k＝1，l＝1，o＝1且m＝1的實(shí)施方案)。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接體融合到抗原的N末端。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，接連體融合到抗原的C末端。
本發(fā)明優(yōu)選的連接體是甘氨酸連接體(G)n，其還含有半胱氨酸殘基作為第二附著位點(diǎn)，如N-末端甘氨酸連接體(GCGGGG)和C-末端甘氨酸連接體(GGGGCG)。進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案是C-末端甘氨酸-賴氨酸連接體(GGKKGC，SEQ ID NO106)和N-末端甘氨酸-賴氨酸連接體(CGKKGG，SEQ ID NO107)，位于肽的C-末端的GGCG、GGC或GGC-NH2(″NH2″代表酰胺化)連接體或位于其N-末端的CGG。甘氨酸殘基通常插入大氨基酸與作為第二附著位點(diǎn)的半胱氨酸之間，以避免偶聯(lián)反應(yīng)中較大氨基酸的可能的空間位阻。
在本發(fā)明的一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，連接體與本發(fā)明的抗原通過(guò)化學(xué)相互作用連接，優(yōu)選地通過(guò)至少一個(gè)非肽鍵的共價(jià)鍵連接。
連接抗原與VLP的其他方法包括使用碳化二亞胺EDC和NHS交聯(lián)抗原和VLP的方法。本發(fā)明的抗原也可以先通過(guò)，例如與SATA、SATP或亞胺硫醇反應(yīng)而被硫醇化。在另外一些方法中，使用例如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce)的同型雙功能交聯(lián)劑或其他已知的具有對(duì)VLP氨基或羧基反應(yīng)性的官能團(tuán)的同型雙功能交聯(lián)劑將抗原與VLP連接。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)包含或優(yōu)選地是巰基，更優(yōu)選天然存在的或人工添加到外殼蛋白上的半胱氨酸的巰基，該外殼蛋白包含于VLP中或者基本組成VLP。第二附著位點(diǎn)是連接體如MBS(m-馬來(lái)酰亞胺基苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯)或SMPH(琥珀酰亞胺基-6-[β-馬來(lái)酰亞胺基丙酰胺基]己酸)的馬來(lái)酰亞胺基，它與抗原化學(xué)結(jié)合，優(yōu)選地與抗原共價(jià)結(jié)合，更優(yōu)選地與抗原的氨基共價(jià)結(jié)合，更優(yōu)選地通過(guò)連接體的NHS-酯基與抗原的N-末端氨基酸的氨基共價(jià)結(jié)合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原，優(yōu)選不超過(guò)70個(gè)，更優(yōu)選不超過(guò)50個(gè)，更優(yōu)選不超過(guò)30個(gè)氨基酸的抗原，優(yōu)選地化學(xué)合成，并且馬來(lái)酰亞胺基優(yōu)選地與N-末端氨基酸的氨基連接。第一附著位點(diǎn)和第二附著位點(diǎn)通過(guò)硫醚鍵連接。
在該組合物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)包含或優(yōu)選地是氨基，優(yōu)選賴氨酸的氨基，并且所述第二附著位點(diǎn)包含或優(yōu)選地是馬來(lái)酰亞胺基。第一附著位點(diǎn)，即賴氨酸的氨基，可以天然存在或人工添加到外殼蛋白上。優(yōu)選地，第二附著位點(diǎn)是上述段落中詳述的連接體的基團(tuán)。VLP的氨基用異雙功能交聯(lián)劑如N-琥珀酰亞胺基-S-乙?；虼宜?SATA)或2-亞氨硫醇(Iminothiolane)衍生化為巰基，巰基對(duì)于連接體的馬來(lái)酰亞胺基具有反應(yīng)性。
含有至少一個(gè)馬來(lái)酰亞胺基的優(yōu)選的連接體是，例如SMPH、Sulfo-MBS。進(jìn)一步優(yōu)選的連接體是Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和其他可以獲得的交聯(lián)劑，例如從Pierce Chemical Company獲得，并且含有一個(gè)氨基反應(yīng)性官能團(tuán)和一個(gè)巰基反應(yīng)性官能團(tuán)。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的VLP和至少一種抗原通過(guò)化學(xué)相互作用連接，其中這些化學(xué)相互作用中的至少一個(gè)不是共價(jià)鍵。VLP與抗原的連接可以通過(guò)生物素化VLP并將抗原表達(dá)為鏈霉抗生物素蛋白-融合蛋白而實(shí)現(xiàn)?；蛘?，抗原和VLP都被生物素化，如WO 00/23955所述。其他結(jié)合對(duì)，如配體-受體、抗原-抗體，也可以按照與生物素-抗生物素蛋白相似的方式用作偶聯(lián)試劑。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種含有本發(fā)明的組合物的疫苗組合物。優(yōu)選地，該疫苗組合物還含有合適的緩沖液。疫苗組合物中與VLP連接的抗原可以來(lái)源于動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物或人。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原來(lái)源于人、牛、狗、貓、小鼠、大鼠、豬或馬。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該疫苗組合物進(jìn)一步包含至少一種佐劑。所述至少一種佐劑的施用可以在施用本發(fā)明的組合物之前、同時(shí)或之后進(jìn)行。所述至少一種佐劑的例子包括鋁鹽、單磷酰脂質(zhì)A(MPL)、不完全弗氏佐劑(IFA)。佐劑誘導(dǎo)局部抗原儲(chǔ)庫(kù)(depot)的形成。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物不含佐劑。本發(fā)明的一個(gè)有利的特征是組合物的高免疫原性，甚至在不含佐劑時(shí)。而且，不含佐劑使得不希望的炎性T細(xì)胞應(yīng)答的發(fā)生減至最少，這是針對(duì)自身抗原的接種中的一個(gè)安全性問(wèn)題。因此，優(yōu)選地向患者施用本發(fā)明的疫苗組合物而不需在施用該疫苗之前、同時(shí)或之后向同一名患者施用至少一種佐劑。
本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種免疫方法，包括向動(dòng)物或人施用本發(fā)明的疫苗。動(dòng)物優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物，如貓、綿羊、豬、馬、牛、狗、大鼠、小鼠，特別是人。疫苗可以用本領(lǐng)域所知的各種方法向動(dòng)物或人施用，但是通常通過(guò)注射、輸注、吸入、口服或其他適當(dāng)?shù)奈锢矸椒▉?lái)施用?；蛘撸悸?lián)物可以肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施用。用于施用的偶聯(lián)物的成分包括無(wú)菌水溶液(例如生理鹽水)或非水溶液和懸液。非水溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、和注射用有機(jī)酯如油酸乙酯?？梢岳幂d體或封閉敷料提高皮膚通透性并促進(jìn)抗原吸收。
如果接受個(gè)體能夠耐受本發(fā)明的疫苗的施用，則認(rèn)為該疫苗是“藥學(xué)可接受的”。進(jìn)而，本發(fā)明的疫苗將以“治療有效量”(即產(chǎn)生希望的生理學(xué)效果的量)施用。免疫應(yīng)答的性質(zhì)或類型不是本申請(qǐng)公開內(nèi)容的限制因素。并非意在通過(guò)以下機(jī)制的解釋來(lái)限制本發(fā)明，本發(fā)明的疫苗可以誘導(dǎo)結(jié)合本發(fā)明的抗原，因而減少其濃度和/或干擾其生理學(xué)或病理學(xué)功能的抗體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種藥物組合物和可接受的藥物載體。當(dāng)向個(gè)體施用本發(fā)明的疫苗時(shí)，它可以是含有鹽、緩沖液、佐劑或其他改善偶聯(lián)物的效果所需的物質(zhì)的形式。適合在制備藥物組合物中使用的材料的例子在許多來(lái)源中提供，包括REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES(Osol，A，ed，Mack PublishingCo，(1990))。
本發(fā)明提供一種使用本發(fā)明的組合物治療和/或減弱疾病或狀況的方法，其中本發(fā)明的至少一種抗原在動(dòng)物或人中發(fā)揮重要的病理學(xué)功能。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的組合物在制備用于治療動(dòng)物或人的疾病的藥物中的用途，其中本發(fā)明的至少一種抗原發(fā)揮重要的病理學(xué)功能。
實(shí)施例為了簡(jiǎn)便起見，術(shù)語(yǔ)“現(xiàn)有技術(shù)VLP”和“本發(fā)明的VLP”以及更具體的術(shù)語(yǔ)“現(xiàn)有技術(shù)QβVLP”、“本發(fā)明的QβVLP”、“現(xiàn)有技術(shù)AP205VLP”和“本發(fā)明的AP205VLP”等，特別在該實(shí)施例部分和


部分中使用。如在該實(shí)施例部分使用的術(shù)語(yǔ)“現(xiàn)有技術(shù)VLP”以及更具體的術(shù)語(yǔ)“現(xiàn)有技術(shù)QβVLP”、“現(xiàn)有技術(shù)AP205VLP”等，是指如WO 02/056905、WO 04/007538或特別地如本申請(qǐng)的實(shí)施例1所述，通過(guò)從大腸桿菌中重組表達(dá)隨后純化而獲得的VLP。如在該實(shí)施例部分使用的術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的VLP”以及更具體的術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的QβVLP”、“本發(fā)明的AP205VLP”等，是指本發(fā)明的VLP，特別是通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的VLP。而且，為了進(jìn)一步簡(jiǎn)便起見，術(shù)語(yǔ)“重裝配的VLP”以及更具體的術(shù)語(yǔ)“重裝配的QβVLP”、“重裝配的AP205VLP”等在該實(shí)施例部分中用于典型且優(yōu)選地指通過(guò)如權(quán)利要求35，37，39或41所述的本發(fā)明的方法獲得的VLP。另外，術(shù)語(yǔ)“RNase處理的VLP”以及更具體的術(shù)語(yǔ)“RNase處理的QβVLP”、“RNase處理的AP205VLP”等在該實(shí)施例部分中用于典型且優(yōu)選地指通過(guò)如權(quán)利要求43的本發(fā)明的方法獲得的VLP。另外，術(shù)語(yǔ)“金屬離子處理的VLP”以及更具體的術(shù)語(yǔ)“金屬離子處理的QβVLP”、“金屬離子處理的AP205VLP”等在該實(shí)施例部分中用于典型且優(yōu)選地指通過(guò)如權(quán)利要求44所述的本發(fā)明的方法獲得的VLP。
實(shí)施例1Qβ外殼蛋白的表達(dá)和產(chǎn)生的現(xiàn)有技術(shù)QβVLP的純化用Qβ外殼蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。在含20μg/ml氨芐青霉素的5ml LB液體培養(yǎng)基中接種用Qβ外殼蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的克隆。接種后的培養(yǎng)物不加振搖在37℃溫育16-24小時(shí)。培養(yǎng)物隨后用含有20μg1ml氨芐青霉素的100-300ml新鮮LB培養(yǎng)基1∶100稀釋，并且不加振搖在37℃溫育過(guò)夜。獲得的二次接種物在瓶中用含有1％酪蛋白氨基酸和0.2％葡萄糖的M9培養(yǎng)基1∶50稀釋，并在37℃振搖下溫育過(guò)夜。通過(guò)離心沉淀細(xì)胞，并凍存。
純化純化程序使用的溶液和緩沖液1.裂解緩沖液LB50mM Tris-HCl pH8.0，含5mM EDTA，0.1％tritonX100和新鮮制備的5μg/ml的PMSF，不含溶菌酶和DNAse。
2.飽和硫酸銨水溶液(SAS)。
3.緩沖液NET20mM Tris-HCl，pH 7.8，含5mM EDTA和150mM NaCl。
4.PEGNET中的40％(w/v)聚乙二醇6000破碎與裂解將冷凍的細(xì)胞以2ml/g的濃度重懸浮于LB中?；旌衔镆?2kH超聲處理5次各15秒，間隔1分鐘，在冰上冷卻該溶液。然后用Janecki K 60轉(zhuǎn)頭以14 000rpm離心裂解物1小時(shí)。除非另外說(shuō)明，以下描述的離心步驟全都用相同的轉(zhuǎn)頭進(jìn)行。上清液貯存于4℃，而細(xì)胞碎片用LB洗滌2次。離心后合并裂解物的上清液和洗滌級(jí)分。
分級(jí)分離在攪拌下，向上述合并的裂解物中逐滴加入飽和硫酸銨溶液。調(diào)節(jié)SAS的體積為總體積的1/5，獲得20％的飽和度。溶液靜置過(guò)夜，次日以14 000rpm離心20分鐘。沉淀物用少量20％硫酸銨洗滌，再次離心。合并獲得的上清液，逐滴加入SAS，獲得40％的飽和度。溶液靜置過(guò)夜，次日以14 000rpm離心20分鐘。將獲得的沉淀物溶解于NET緩沖液中。
層析將溶解于NET緩沖液中的衣殼或VLP蛋白上樣到SepharoseCL-4B柱上。在層析過(guò)程中洗脫出3個(gè)峰。第一個(gè)峰主要含有膜和膜片段，不予收集。衣殼含于第二個(gè)峰中，而第三個(gè)峰含有其它大腸桿菌蛋白質(zhì)。
合并峰級(jí)分，將NaCl濃度調(diào)節(jié)至終濃度為0.65M。在攪拌下逐滴加入體積相當(dāng)于合并峰級(jí)分一半的PEG溶液。該溶液不加攪拌靜置過(guò)夜。以14 000rpm離心20分鐘沉淀衣殼蛋白。然后將其溶解于最小體積的NET中，再次上樣到Sepharose CL-4B柱上。合并峰級(jí)分，用60％飽和(w/v)的硫酸銨沉淀。離心并溶解于NET緩沖液后，將衣殼蛋白上樣到Sepharose CL-6B柱上再次進(jìn)行層析。
透析和干燥合并以上獲得的峰級(jí)分，用無(wú)菌水充分透析，凍干保存。
實(shí)施例2RNase A水解包裹在現(xiàn)有技術(shù)QβVLP中的RNA通過(guò)加入RNaseA(Qiagen AG，瑞士)至終濃度為300μg/ml，消化在0.2x HBS(4mM HEPES，30mM NaCl，pH 7.4)中濃度為1.0mg/ml的現(xiàn)有技術(shù)QβVLP。樣品在650rpm的恒溫混勻器中37℃溫育3小時(shí)。然后樣品在300,000分子量截止膜中用0.2HBS緩沖液透析過(guò)夜，其中更換一次緩沖液。來(lái)自同一批的足夠的一部分現(xiàn)有技術(shù)QβVLP不用RNaseA處理，而是保存起來(lái)用于在后續(xù)的程序中測(cè)定RNA，優(yōu)選核酸的量。
為了測(cè)定保留在VLP內(nèi)的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA，優(yōu)選核酸的量，將等量(基于重量)的RNaseA-處理的QβVLP和未用RNaseA處理的現(xiàn)有技術(shù)QβVLP加樣到含有溴化乙錠(典型且優(yōu)選地濃度為0.5μg/ml)的1％瓊脂糖凝膠上，溴化乙錠會(huì)嵌入RNA，優(yōu)選核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)。按照廠商(BIO-RAD)給出的標(biāo)準(zhǔn)方案，典型且優(yōu)選地使用白蛋白(PIERCE)作為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)Bradford試驗(yàn)在同一實(shí)驗(yàn)內(nèi)測(cè)定未用RNaseA-處理的現(xiàn)有技術(shù)QβVLP和RNaseA處理的QβVLP的蛋白質(zhì)濃度，實(shí)現(xiàn)等量的VLP加樣。如此處所用的“等量”意思是加樣到凝膠上的RNase-處理的VLP，優(yōu)選RNaseA-處理的VLP，更優(yōu)選RNaseA-處理的QβVLP的量與加樣到凝膠上的現(xiàn)有技術(shù)VLP，優(yōu)選現(xiàn)有技術(shù)QβVLP的量相差不超過(guò)5％，優(yōu)選不超過(guò)3％，更優(yōu)選不超過(guò)1％。典型且優(yōu)選地在80V下電泳典型且優(yōu)選地1小時(shí)后，凝膠暴露于紫外線，典型且優(yōu)選地如Sambrook，J.等人，eds，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)所述，特別如第6.15和6.19章所述。RNA的量用嵌入到RNA內(nèi)的溴化乙錠的熒光強(qiáng)度表示。未用RNaseA處理的現(xiàn)有技術(shù)QβVLP顯示出強(qiáng)熒光強(qiáng)度，而RNaseA-處理的VLP的強(qiáng)度強(qiáng)烈降低。用光密度法(Kodak 1D ScientificImaging System)定量熒光強(qiáng)度表明RNaseA-處理的VLP所含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA，優(yōu)選核酸的量不到未用RNaseA處理的現(xiàn)有技術(shù)QβVLP所含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA，優(yōu)選核酸的量的10％(各個(gè)實(shí)驗(yàn)得到3-9％的值)(圖1)。
假定通過(guò)實(shí)施例17所述的方法測(cè)定，現(xiàn)有技術(shù)QβVLP所含的宿主RNA的量為300μg/mg VLP，則RNaseA-處理的QβVLP內(nèi)保留的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA，優(yōu)選核酸的量不到30μg/mg VLP(或相當(dāng)于各個(gè)實(shí)驗(yàn)的9-27μg/mg VLP)。
實(shí)施例3VLP的RNA內(nèi)容物的非酶水解VLP核酸內(nèi)容物的ZnSO4依賴的降解現(xiàn)有技術(shù)QβVLP(1.0mg/ml，在0.2x HBS緩沖液中)在2.5mMZnSO4存在下60℃溫育24小時(shí)。得到的樣品在300,000分子量截止值的膜中用0.2HBS緩沖液透析過(guò)夜，其中更換一次緩沖液。來(lái)自同一批的足夠的一部分現(xiàn)有技術(shù)QβVLP不用ZnSO4處理，而是保留起來(lái)用于在隨后的程序中測(cè)定具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA，優(yōu)選核酸的量。
為了測(cè)定保留在VLP內(nèi)的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA，優(yōu)選核酸的量，將等量(基于重量)的ZnSO4-處理的QβVLP和未用ZnSO4處理的現(xiàn)有技術(shù)QβVLP加樣到含有溴化乙錠(典型且優(yōu)選地濃度為0.5μg/ml)的1％瓊脂糖凝膠上，溴化乙錠會(huì)嵌入RNA，優(yōu)選核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)。按照廠商(BIO-RAD)給出的標(biāo)準(zhǔn)方案，典型且優(yōu)選地使用白蛋白(PIERCE)作為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)Bradford試驗(yàn)在同一實(shí)驗(yàn)內(nèi)測(cè)定未處理的現(xiàn)有技術(shù)QβVLP和ZnSO4-處理的QβVLP的蛋白質(zhì)濃度，實(shí)現(xiàn)等量的VLP加樣。如此處所用的“等量”意思是加樣到凝膠上的ZnSO4-處理的VLP，優(yōu)選ZnSO4-處理的QβVLP的量與加樣到凝膠上的現(xiàn)有技術(shù)VLP，優(yōu)選現(xiàn)有技術(shù)QβVLP的量相差不超過(guò)5％，優(yōu)選不超過(guò)3％，更優(yōu)選不超過(guò)1％。典型且優(yōu)選地在80V下電泳典型且優(yōu)選地1小時(shí)后，凝膠暴露于紫外線，典型且優(yōu)選地如Sambrook，J.等人，eds，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)所述，特別如第6.15和6.19章所述。RNA的量用嵌入到RNA內(nèi)的溴化乙錠的熒光強(qiáng)度表示。未處理的現(xiàn)有技術(shù)QβVLP顯示出強(qiáng)熒光強(qiáng)度，而ZnSO4-處理的VLP的強(qiáng)度強(qiáng)烈降低。用光密度法(Kodak 1DScientific Imaging System)定量熒光強(qiáng)度表明與ZnSO4-處理的VLP結(jié)合的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA，優(yōu)選核酸的量為與未用ZnSO4處理的現(xiàn)有技術(shù)QβVLP結(jié)合的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA，優(yōu)選核酸的量的9％。
假定通過(guò)實(shí)施例17所述的方法測(cè)定，現(xiàn)有技術(shù)QβVLP包含的宿主RNA的量為300μg/mg VLP，則ZnSO4-處理的QβVLP內(nèi)保留的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA的量為27μg/mg VLP。
實(shí)施例4在不同聚陰離子大分子存在下通過(guò)解裝配/重裝配制備本發(fā)明的QβVLP產(chǎn)生重裝配的QβVLP(A)現(xiàn)有技術(shù)QβVLP的解裝配從大腸桿菌裂解物中純化的溶于PBS(20mM磷酸鹽，150mM NaCl，pH 7.5)中的45mg現(xiàn)有技術(shù)QβVLP(2.5mg/ml，通過(guò)Bradford分析確定)在攪拌條件下于室溫用10mM DTT還原15分鐘。然后加入氯化鎂至0.7M的終濃度，繼續(xù)在攪拌條件下于室溫溫育15分鐘，導(dǎo)致包裹的宿主細(xì)胞RNA沉淀。溶液于4℃以4000rpm離心10分鐘(Eppendorf 5810R，在下列所有步驟中使用固定角轉(zhuǎn)頭A-4-62)，以從溶液中除去沉淀的RNA。含有釋放的二聚Qβ外殼蛋白的上清液用于層析純化步驟。
(B)通過(guò)陽(yáng)離子交換層析和大小排阻層析純化Qβ外殼蛋白含有二聚體外殼蛋白、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和殘留的宿主細(xì)胞RNA的解裝配反應(yīng)的上清液用水1∶15稀釋，以調(diào)節(jié)電導(dǎo)率低于10mS/cm，并加樣到SP-Sepharose FF柱(xk16/20，6ml，Amersham Bioscience)上。該柱預(yù)先用20mM磷酸鈉緩沖液pH 7平衡。結(jié)合的外殼蛋白的洗脫用20mM磷酸鈉/500mM氯化鈉的分步梯度來(lái)完成，以大約25ml的級(jí)分體積收集蛋白質(zhì)。以5ml/min的流速在室溫下進(jìn)行層析，在260nm和280nm處測(cè)量吸光度。
在第二步中，分離的Qβ外殼蛋白(從陽(yáng)離子交換柱上洗脫的級(jí)分)加樣到(進(jìn)行兩次)用20mM磷酸鈉/250mM氯化鈉；pH 6.5平衡的Sephacryl S-100HR柱(xk26/60，320ml，Amersham Bioscience)上。以2.5ml/min的流速在室溫下進(jìn)行層析，在260nm和280nm處測(cè)量吸光度。收集5ml的級(jí)分。
(C1)通過(guò)透析重裝配QβVLP純化的Qβ外殼蛋白(2.2mg/ml，在20mM磷酸鈉pH 6.5中)、一種聚陰離子大分子(2mg/ml水溶液)、尿素(7.2M水溶液)和DTT(0.5M水溶液)混合至終濃度為1.4mg/ml外殼蛋白，0.14mg/ml各自的聚陰離子大分子，1M尿素和2.5mM DTT?；旌衔?各1ml)使用3.5kDa截止值的膜在20mM TrisHCl，150mM NaCl pH 8中5℃透析2天。聚陰離子大分子是聚半乳糖醛酸(25000-50000，F(xiàn)luka)、硫酸葡聚糖(MW 5000和10000，Sigma)、聚-L-天冬氨酸(MW 11000和33400，Sigma)、聚-L-谷氨酸(MW 3000，13600和84600，Sigma)和來(lái)自面包酵母和小麥胚的tRNA。
(C2)通過(guò)滲濾重裝配QβVLP33ml純化的Qβ外殼蛋白(1.5mg/ml，在20mM磷酸鈉pH 6.5，250mM NaCl中)與水和尿素(7.2M水溶液)、NaCl(5M水溶液)和聚-L-谷氨酸(2mg/ml水溶液，MW84600)混合。混合物的體積為50ml，成分的終濃度為1mg/ml外殼蛋白，300mM NaCl，1.0M尿素和0.2mg/ml聚-L-谷氨酸。然后在使用Pellicon XL膜柱(Biomax 5K，Millipore)的正切流動(dòng)過(guò)濾裝置中，應(yīng)用10ml/min的橫流速和2.5ml/min的滲透流速，將混合物用500ml 20mM TrisHCl pH 8，50mMNaCl在室溫滲濾。
重裝配的Qβ-VLP的分析(D1)Qβ-VLP中二硫鍵的形成如實(shí)施例4(C1)和4(C2)所述在不同聚陰離子大分子存在下重裝配的Qβ-VLP通過(guò)非還原SDS-PAGE分析，并與現(xiàn)有技術(shù)QβVLP比較。重裝配的Qβ-VLP顯示為二硫鍵連接的五聚體和六聚體形式的外殼蛋白的帶；這類似于現(xiàn)有技術(shù)QβVLP，表明在重裝配的QβVLP中外殼蛋白單元具有正確的結(jié)構(gòu)排列(圖2)。
(D2)通過(guò)分析型大小排阻層析，在不同聚陰離子大分子存在下重裝配的Qβ-VLP的流體動(dòng)力學(xué)大小如實(shí)施例4(C1)和4(C2)所述在不同聚陰離子大分子存在下重裝配的Qβ-VLP樣品通過(guò)分析型大小排阻層析來(lái)分析，并與現(xiàn)有技術(shù)QβVLP比較。重裝配的QβVLP顯示一個(gè)峰，該峰遷移的保留時(shí)間與代表現(xiàn)有技術(shù)QβVLP的峰相同，表明重裝配的VLP的總體大小和結(jié)構(gòu)與現(xiàn)有技術(shù)VLP相同。
實(shí)施例5AP205 VLP的體外裝配(A)AP205外殼蛋白的純化解裝配20ml AP205 VLP溶液(1.6mg/ml，在PBS中，從大腸桿菌提取物中純化)與0.2ml 0.5M DTT混合，室溫溫育30分鐘。加入5ml 5M NaCl，混合物然后于60℃溫育15分鐘，導(dǎo)致DTT-還原的外殼蛋白沉淀。將渾濁的混合物離心(轉(zhuǎn)頭Sorvall SS34，10000g，10min，20℃)，棄去上清液，將沉淀物分散到20ml 1M尿素/20mM檸檬酸鈉pH 3.2中。室溫?cái)嚢?0分鐘后，加入1.5M Na2HPO4將分散液調(diào)節(jié)至pH 6.5，然后離心(轉(zhuǎn)頭Sorvall SS34，10000g，10min，20℃)，獲得含有二聚體外殼蛋白的上清液。
陽(yáng)離子交換層析上清液(見上)用20ml水稀釋，以調(diào)節(jié)電導(dǎo)率約為5mS/cm。將得到的溶液加至預(yù)先用20mM磷酸鈉pH 6.5緩沖液平衡的6ml SP Sepharose FF柱(Amersham Bioscience)上。加樣后，用48ml 20mM磷酸鈉pH 6.5緩沖液洗柱，然后用20倍柱體積上達(dá)1M NaCl的線性梯度洗脫結(jié)合的外殼蛋白。合并主峰級(jí)分，通過(guò)SDS-PAGE和UV光譜法分析。根據(jù)SDS-PAGE，分離的外殼蛋白是從其他蛋白質(zhì)污染物中基本純化的。根據(jù)UV光譜法，蛋白質(zhì)濃度為0.6mg/ml(總量12mg)，1個(gè)A280單位反映1.01mg/ml AP205外殼蛋白。此外，A280值(0.5999)與A260值(0.291)的比為2，表明該制品基本不含核酸。
(B)AP205 VLP的裝配在不含任何聚陰離子大分子的條件下的裝配將上述洗脫的蛋白質(zhì)級(jí)分滲濾并且通過(guò)TFF濃縮，至蛋白質(zhì)濃度為在20mM磷酸鈉pH 6.5中1mg/ml。500μl該溶液與50μl 5M NaCl溶液混合，室溫溫育48小時(shí)?；旌衔镏兄匮b配的VLP的形成通過(guò)非還原SDS-PAGE和大小排阻HPLC顯示(圖5A)。HPLC分析使用用20mM磷酸鈉，150mM NaClpH 7.2平衡的TSKgel G5000 PWXL柱(Tosoh Bioscience)。
在聚谷氨酸存在下的裝配375μl純化的AP205外殼蛋白(1mg/ml，在20mM磷酸鈉pH 6.5中)與50μl NaCl貯存溶液(5M水溶液)、50μl聚谷氨酸貯存溶液(2mg/ml水溶液，MW86400，Sigma)和25μl水混合?；旌衔镌谑覝販赜?8小時(shí)?；旌衔镏兄匮b配的VLP的形成通過(guò)非還原SDS-PAGE和大小排阻HPLC顯示(圖5B)?；旌衔镏械耐鈿さ鞍讕缀跬耆尤氲絍LP中，表明裝配效率高于在不含任何聚陰離子大分子情況下裝配的AP205外殼蛋白(圖5A)。
實(shí)施例6在聚陰離子大分子存在下重裝配的fr VLP或重裝配的GA的制備如實(shí)施例1和4所公開的類似的實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)用于在大腸桿菌中重組產(chǎn)生現(xiàn)有技術(shù)fr或GA VLP，純化和解裝配這些VLP，和純化獲得的相應(yīng)RNA噬菌體的外殼蛋白。類似的實(shí)驗(yàn)條件然后應(yīng)用于將外殼蛋白重裝配為重裝配的fr VLP或重裝配的GA VLP。
實(shí)施例7偶聯(lián)尼古丁衍生物到現(xiàn)有技術(shù)QβVLP和本發(fā)明的QβVLP上適合與VLP偶聯(lián)的尼古丁衍生物根據(jù)Langone等人(1982，見上)所述合成。反式-4′-羧基可替寧可從商業(yè)來(lái)源獲得。通過(guò)反式-4′-羧基可替寧與甲醇硫酸反應(yīng)生成反式-4′-羧基可替寧的甲酯。該溶液用碳酸氫鈉中和，用氯仿抽提，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮，從醚-丙酮中重結(jié)晶。用醚中的氫化鋁鋰還原甲酯生成反式-3′-羥甲基尼古丁。然后加入苯中的琥珀酸酐生成O′-琥珀酰-羥甲基尼古丁。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮該溶液。然后加入EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)實(shí)現(xiàn)羧基的活化，生成O′-琥珀酰-羥甲基尼古丁的N-羥基琥珀酰亞胺酯(下面縮寫為″Suc-Nic″)。
現(xiàn)有技術(shù)QβVLP和本發(fā)明的QβVLP，包括RNase A處理的QβVLP，如圖3所示在不同聚陰離子大分子存在下重裝配的QβVLP，用Hepes-緩沖的鹽水HBS(50mM Hepes，150mM NaCl，pH 8.0)透析。尼古丁衍生物Suc-Nic以121mM的濃度溶解于HBS中。將其以1x、5x、50x、100x和500x摩爾過(guò)量加入不同的QβVLP溶液(0.14mM)中，在振蕩器上室溫溫育2小時(shí)。反應(yīng)溶液然后用HBS，pH 8.0(截止值10000Da)透析，在液氮中急凍，貯存于-80℃。在形成酰胺鍵的條件下，尼古丁衍生物suc-nic與Qβ表面上的賴氨酸反應(yīng)。生成的共價(jià)偶聯(lián)物在此分別被稱為“現(xiàn)有技術(shù)QβVLP-Nic”和“本發(fā)明的QβVLP-Nic”。
實(shí)施例8本發(fā)明的QβVLP-Nic誘導(dǎo)特異性抗體應(yīng)答(A)小鼠的免疫7-8周大的雌性Balb/c小鼠分別接種60μg現(xiàn)有技術(shù)QβVLP-Nic和本發(fā)明的QβVLP-Nic疫苗兩次，其中尼古丁衍生物是Suc-Nic。該疫苗在200μl無(wú)菌PBS中稀釋，皮下注射到左和右腹股溝區(qū)。第一次免疫14天后對(duì)小鼠加強(qiáng)免疫。在第14天(加強(qiáng)前)和第21天(加強(qiáng)7天后)采集血清。通過(guò)ELISA測(cè)定血清中尼古丁-特異性抗體的效價(jià)。
(B)ELISA微量滴定板(Maxisorp，Nunc)用PBS(pH 7.3-7.7)中的5μg/ml與BSA偶聯(lián)的尼古丁(BSA-NicB01)包被過(guò)夜。洗滌(0.05％Tween20/PBS)并用PBS中的2％BSA封閉后，加入在2％BSA/1％FCS/PBS中不同稀釋的血清。為了檢測(cè)IgE，通過(guò)與蛋白G珠(Pharmacia)溫育從血清中除去IgG。室溫溫育2小時(shí)后，洗板，加入HRP-標(biāo)記的小鼠IgG特異性抗體(山羊抗-小鼠IgG(H+L)，Jackson ImmunoResearch)、IgG1(兔抗-小鼠IgG1，Zymed)、IgG2a(大鼠抗-小鼠IgG2a，Pharmingen)和IgE(山羊抗-小鼠IgE)。溫育1小時(shí)后，洗板，按照使用說(shuō)明加入溶于檸檬酸緩沖液中的顯色底物OPD(Fluka)。5分鐘后用5％H2SO4終止顯色反應(yīng)。用ELISA讀板器(Benchmark，Biorad)讀取450nm處的光密度。ELISA效價(jià)被定義為在ELISA中獲得半數(shù)最大光密度信號(hào)(OD 50％)的血清稀釋度的倒數(shù)。
所有本發(fā)明的QβVLP-Nic疫苗誘導(dǎo)的尼古丁特異性抗體的水平都與現(xiàn)有技術(shù)QβVLP-Nic疫苗誘導(dǎo)的抗體效價(jià)相當(dāng)(圖3)。在第14天和第21天為總IgG應(yīng)答測(cè)定每組3只小鼠的合并血清的ELISA效價(jià)。如圖3所示，在第21天，本發(fā)明的QβVLP-Nic疫苗的IgG效價(jià)類似于現(xiàn)有技術(shù)QβVLP-Nic疫苗的效價(jià)。
圖4顯示通過(guò)ELISA測(cè)定的第21天的亞類IgG1和IgG2a的抗-尼古丁效價(jià)?，F(xiàn)有技術(shù)QβVLP-Nic誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，具有高IgG2a效價(jià)。IgG2a/IgG1效價(jià)之比約為0.5。RNAse-處理的QβVLP-Nic不影響IgG1效價(jià)，但是明顯降低IgG2a效價(jià)，導(dǎo)致比值為0.006，總抗體效價(jià)與現(xiàn)有技術(shù)VLP相比下降。重裝配的QβVLP-Nic疫苗誘導(dǎo)較高的IgG1效價(jià)，但是與現(xiàn)有技術(shù)QβVLP-Nic相比降低了IgG2a效價(jià)。這由低于0.035的IgG2a/IgG1效價(jià)比反映出來(lái)，表明更多Th2型應(yīng)答。然而，盡管更多TH2應(yīng)答，但是在用重裝配的QβVLP-Nic接種的血清中未能檢測(cè)出IgE。同樣，在用現(xiàn)有技術(shù)QβVLP-Nic接種的血清中未能檢測(cè)出IgE。
數(shù)據(jù)表明重裝配的QβVLP-Nic保持高免疫原性，而同時(shí)免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)移到更多Th2型應(yīng)答，而不誘導(dǎo)IgE產(chǎn)生。
實(shí)施例9GnRH肽與重裝配的QβVLP的偶聯(lián)化學(xué)合成下列含有GnRH的氨基酸1-10(SEQ ID NO1)的肽類似物，它們延長(zhǎng)了一個(gè)半胱氨酸作為偶聯(lián)附著位點(diǎn)，或者兩個(gè)甘氨酸殘基加一個(gè)半胱氨酸殘基作為附著位點(diǎn)CGG-GnRH CGGEHWSYGLRPG-NH2(SEQ ID NO2)GnRH-GGC pEHWSYGLRPGGGC (SEQ ID NO3)C-GnRH CEHWSYGLRPG-NH2 (SEQ ID NO4)GnRH-C pEHWSYGLRPGC (SEQ ID NO5)如下所述將肽與重裝配的QβVLP偶聯(lián)。
通過(guò)于25℃用20倍摩爾過(guò)量的SMPH(100mM，在DMSO中，Pierce)將50mM NaCl，20mM Hepes pH7.2中的重組產(chǎn)生的重裝配的QβVLP(2mg/ml)衍生化0.5小時(shí)，可實(shí)現(xiàn)CGG-GnRH(SEQ ID NO2)的高偶聯(lián)效率(＞90％的帶有至少一個(gè)肽的單體)。然后使用10,000MWCO透析管用2OmM Hepes pH 7.2在4℃透析反應(yīng)物2次各2小時(shí)，以除去未反應(yīng)的SMPH。以7倍摩爾過(guò)量加入GnRH肽(5mM，在DMSO中)，在恒溫混勻器中25℃反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)物用20mM Hepes pH7.2透析過(guò)夜，以除去未偶聯(lián)的肽。
通過(guò)于25℃用18倍摩爾過(guò)量的SMPH將20mM Hepes pH7.2中的重裝配的QβVLP(1mg/ml)衍生化0.5小時(shí)，可實(shí)現(xiàn)肽CGG-GnRH(SEQID NO2)和GnRH-GGC(SEQ ID NO3)的中偶聯(lián)效率(82％的帶有至少一個(gè)肽的單體)。反應(yīng)物隨后用20mM Hepes pH7.2透析，通過(guò)在恒溫混勻器上25℃溫育2小時(shí)，與10倍摩爾過(guò)量的GnRH肽(10mM，在DMSO中)偶聯(lián)。
通過(guò)于25℃用20倍摩爾過(guò)量的SMPH(50mM，在DMSO中)將20mMHepes pH7.2中的重裝配的QβVLP(2.8mg/ml)衍生化0.5小時(shí)，進(jìn)行肽C-GnRH(SEQ ID NO4)和GnRH-C(SEQ ID NO5)的偶聯(lián)，然后用20mM Hepes pH 7.2透析過(guò)夜。然后通過(guò)在恒溫混勻器上分別與7倍和2.5倍摩爾過(guò)量的肽(5mM，在DMSO中)25℃溫育2小時(shí)，可獲得高(＞90％)和低(60-71％)偶聯(lián)效率。反應(yīng)物用20mM Hepes pH7.2透析過(guò)夜以除去未偶聯(lián)的肽。離心Qβ-GnRH偶聯(lián)產(chǎn)物，上清液在還原條件下的SDS-PAGE凝膠上分析。根據(jù)用于偶聯(lián)的相應(yīng)的肽(SEQ ID NO2，3，4和5)，Qβ-GnRH偶聯(lián)產(chǎn)物被命名為Qβ-CGG-GnRH、GnRH-GGC-Qβ、Qβ-C-GnRH和GnRH-C-Qβ。
實(shí)施例10偶聯(lián)人IL-23 p19與本發(fā)明的VLP重裝配的Qβ病毒樣顆粒(2g/l)、AP205(2g/l)、fr(2g/l)和GA(2g/l)，RNase A處理的Qβ病毒樣顆粒(2g/l)、AP205(2g/l)、fr(2g/l)和GA(2g/l)，ZnSO4處理的Qβ病毒樣顆粒(2g/l)、AP205(2g/l)、fr(2g/l)和GA(2g/l)，用0.714mM SMPH(Pierce，PerbioScience)于25℃衍生化30分鐘，然后用20mM Hepes pH8，150mM NaCl透析。人IL-23 p19蛋白(SEQ ID NO7，0.28g/l)和衍生化的Qβ顆粒(0.5g/l)在1mM EDTA和10μM、30μM或90μM TCEP(Pierce，Perbio Science)的存在下25℃溫育2小時(shí)。偶聯(lián)產(chǎn)物通過(guò)SDS-page分析。疫苗的抗原密度通過(guò)光密度分析來(lái)確定。
實(shí)施例11Aβ1-6肽與CP延伸位點(diǎn)19處截短的QβA1蛋白C末端的融合在以pQβ10作為模板的PCR反應(yīng)中使用一條與QβA1基因5′末端退火的引物和一條與A1基因3′末端退火的引物，該引物還含有編碼序列為DAEFRH或DAEFGH的Aβ1-6肽的序列元件。將PCR產(chǎn)物克隆到pQβ10(Kozlovska T.M.等人，Gene 137133-37(1993))中，在與實(shí)施例1所述類似的條件下表達(dá)和純化含有融合蛋白的VLP。
將純化的QβVLP-Aβ1-6如實(shí)施例4所述解裝配。純化的Qβ-Aβ1-6融合蛋白(2.2mg/ml，在20mM磷酸鈉pH 6.5中)、一種聚陰離子大分子(2mg/ml，水溶液)、尿素(7.2M，水溶液)和DTT(0.5M，水溶液)混合為終濃度為1.4mg/ml融合蛋白，0.14mg/ml各自的聚陰離子大分子，1M尿素和2.5mM DTT。使用3.5kDa截止值的膜，將混合物(各1ml)在20mM TrisHCl，150mM NaCl pH 8中5℃透析2天。聚陰離子大分子是聚半乳糖醛酸(25000-50000，F(xiàn)luka)、聚-L-谷氨酸(MW 3000，13600和84600，Sigma)或來(lái)自面包酵母或小麥胚的tRNA。
實(shí)施例12在fr外殼蛋白的位點(diǎn)2和3之間插入Aβ1-6肽通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，將編碼序列為DAEFRH或DAEFGH的Aβ1-6肽序列并且含有Bsp119I匹配末端和允許框內(nèi)插入的其他核苷酸的互補(bǔ)引物插入到pFrd8載體(Pushko，P.等人，Prot.Eng.6883-91(1993))的Bsp119I位點(diǎn)中?；蛘?，pFrd8載體的突出端在用Bsp119I消化后用Klenow補(bǔ)平，編碼Aβ1-6肽序列的核苷酸和用于框內(nèi)克隆的其它核苷酸在Klenow處理后連接到pFrd8中。含有正確方向的插入的克隆通過(guò)測(cè)序進(jìn)行分析。嵌合融合蛋白在大腸桿菌JM109或大腸桿菌K802中的表達(dá)和純化如Pushko，P.等人，Prot.Eng.6883-91(1993)所述進(jìn)行，區(qū)別是使用Sepharose CL-4B或Sephacryl S-400(Pharmacia)柱進(jìn)行層析步驟。類似于實(shí)施例1中關(guān)于Qβ所述的程序，細(xì)胞裂解物用硫酸銨沉淀，通過(guò)連續(xù)兩個(gè)凝膠過(guò)濾純化步驟純化。
純化的嵌合fr VLP-Aβ1-6如實(shí)施例4所述解裝配。純化的fr Aβ1-6融合蛋白(2.2mg/ml，在20mM磷酸鈉pH 6.5中)、一種聚陰離子大分子(2mg/ml，水溶液)、尿素(7.2M，水溶液)和DTT(0.5M，水溶液)混合至終濃度為1.4mg/ml融合蛋白，0.14mg/ml各自的聚陰離子大分子，1M尿素和2.5mM DTT。使用3.5kDa截止值的膜，將混合物(各1ml)在20mM TrisHCl，150mM NaCl pH 8中5℃透析2天。聚陰離子大分子是聚半乳糖醛酸(25000-50000，F(xiàn)luka)、硫酸葡聚糖(MW 5000和10000，Sigma)、聚-L-天冬氨酸(MW 11000和33400，Sigma)。
實(shí)施例13來(lái)源于血管緊張肽I和血管緊張肽II的肽與重裝配的AP205VLP和GA VLP的偶聯(lián)，以及用獲得的偶聯(lián)物對(duì)小鼠的免疫A.偶聯(lián)物的產(chǎn)生化學(xué)合成下列血管緊張肽的肽部分CGGDRVYIHPF(“Angio 1”)，CGGDRVYIHPFHL(“Angio 2”)，DRVYIHPFHLGGC(“Angio 3”)，CDRVYIHPFHL(“Angio 4”)，CHPFHL(“Angio 5”)，CGPFHL(“Angio 6”)，CYIHPF(“Angio 7”)，CGIHPF(“Angio 8”)，CGGHPF(“Angio 9”)，DRVYIGGC(“Angio13”)，DRVYGGC(“Angio 14”)，DRVGGC(“Angio 15”)。它們?nèi)缦滤鲇脕?lái)與重裝配的AP205或GA VLP化學(xué)偶聯(lián)。
對(duì)于肽Angio 1-Angio 45ml重裝配的2mg/ml AP205或GA VLP在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.4中的溶液與507μl 13mg/mlSulfo-MBS(Pierce)水溶液在搖床上25℃反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.4透析兩次各2小時(shí)。665μl透析后的反應(yīng)混合液然后與2.8μl每種相應(yīng)100mM肽貯存溶液(DMSO溶液)在25℃搖床上反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)混合液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.4透析2次各2小時(shí)。
對(duì)于肽Angio 5-9和Angio 13-153ml重裝配的2mg/ml AP205或GA VLP在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的溶液與86μl 100mM SMPH(琥珀酰亞胺基-6-(β-馬來(lái)酰亞氨基丙酰氨基己酸酯，Pierce)的DMSO溶液在25℃搖床上反應(yīng)50分鐘。反應(yīng)溶液隨后在4℃下用2L20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2透析兩次各2小時(shí)。514μl透析后的反應(yīng)混合液然后與3.6μl每種相應(yīng)100mM肽貯存溶液(DMSO溶液)在25℃搖床上反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)混合液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2透析2次各2小時(shí)。
B.免疫對(duì)雌性Balb/C小鼠接種與重裝配的AP205或GA VLP偶聯(lián)的9種血管緊張肽衍生物之一，其中不添加佐劑。每種樣品的50μg(Angio1-4疫苗)或20μg(Angio 5-9疫苗)總蛋白用PBS稀釋為200μl，于第0天和第14天皮下注射(100μl，腹部?jī)蓚?cè))。小鼠在第21天眼眶后放血，用血管緊張肽特異的ELISA分析其血清。
應(yīng)當(dāng)注意到，人和鼠的血管緊張肽序列彼此相同地對(duì)應(yīng)。因此，分別用包含本發(fā)明的血管緊張肽部分作為抗原決定簇的疫苗或偶聯(lián)物免疫人或小鼠，是針對(duì)自身抗原的接種。
實(shí)施例14在聚谷氨酸的存在下重裝配的QβVLP導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞應(yīng)答消除C57BL/6小鼠通過(guò)皮下注射150μg與LCMV-肽gp33(KAVYNFATM)化學(xué)偶聯(lián)的QβVLP(Qβx33)而免疫。一組小鼠接受完整的QβVLPx33顆粒，而另一組用在不同量的聚-L-谷氨酸存在下重裝配的QβVLPx33(Qβ/poly L-Glu/x33，使用0.1mg/ml，0.2mg/ml和0.4mg/ml聚-L-谷氨酸)處理。8天后分析被免疫動(dòng)物的血液中g(shù)p33-特異性CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增。將血液收集在FACS緩沖液(PBS，2％FCS，5mM EDTA，pH 8.2)中，用PE標(biāo)記的具有g(shù)p33-肽的H2-Db-四聚體(Proimmune，Oxford，UK)于37℃染色10分鐘，然后用APC標(biāo)記的大鼠抗-小鼠CD8a-抗體(BD PharMingen，San Jose，USA)于4℃染色30分鐘。洗滌后，紅細(xì)胞用BD-裂解溶液(BD Biosciences，San Jose，USA)室溫裂解10分鐘。最后，使用軟件CellQuest在FACS Calibur上分析細(xì)胞。首先，在前向散射和側(cè)向散射中獲得細(xì)胞，并且將淋巴細(xì)胞畫門(gate)。從這個(gè)淋巴細(xì)胞群體中，分別用FL2和FL3檢測(cè)器檢測(cè)gp33-PE標(biāo)記的和CD8-APC標(biāo)記的細(xì)胞。gp33-特異性T細(xì)胞的量計(jì)算為總CD8陽(yáng)性淋巴細(xì)胞中CD8陽(yáng)性且gp33陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
流式細(xì)胞分析顯示，與接受現(xiàn)有技術(shù)QβVLPx33的動(dòng)物相比，沒(méi)有Qβ/poly L-Glu/x33樣品誘導(dǎo)gp33-特異性CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的擴(kuò)增(見表1)。
在測(cè)定gp33-特異的T細(xì)胞應(yīng)答后，用1.5×106pfu表達(dá)gp33-肽的重組痘苗病毒激發(fā)小鼠。5天后，檢測(cè)這些小鼠卵巢中的病毒滴度。卵巢的單細(xì)胞懸液在BSC40細(xì)胞的系列稀釋液中溫育。在5％CO2下37℃溫育過(guò)夜后，細(xì)胞用結(jié)晶紫染色(500ml 96％乙醇，5g結(jié)晶紫(Sigma C-3886)，8g NaCl，450ml H2O，50ml甲醛)，以顯示病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解產(chǎn)生的細(xì)胞層中的噬斑。卵巢中殘余病毒的數(shù)量計(jì)算為噬斑形成單位(pfu)。與接受現(xiàn)有技術(shù)QβVLPx33的小鼠組相比，接受重裝配的QβVLPx33疫苗的小鼠中噬斑形成單位明顯較高(見表1)。
表1
實(shí)施例15RNase A消化的與小鼠TNF偶聯(lián)的QβVLP，及其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答A.小鼠TNF蛋白與現(xiàn)有技術(shù)QβVLP的偶聯(lián)由含有半胱氨酸的連接體、六組氨酸標(biāo)簽和成熟鼠TNF蛋白(對(duì)應(yīng)于未成熟蛋白的氨基酸78至233)組成的融合蛋白(SEQ ID NO67)在大腸桿菌中重組表達(dá)，并且通過(guò)親和層析純化為均質(zhì)的。在20mMHEPES，150mM NaCl，pH 7.2中含有1.4mg/ml該蛋白質(zhì)的溶液與等摩爾量的TCEP在室溫溫育60分鐘。
500μl 3.06mg/ml現(xiàn)有技術(shù)QβVLP在20mM HEPES，150mM NaClpH 7.2中的溶液然后與4.2μl SMPH溶液(65mM，在DMSO中)在室溫反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)溶液于4℃用更換的兩份31 20mM HEPES pH 7.2分別透析2小時(shí)和14小時(shí)。將60μl衍生化且已透析的Qβ溶液與30μl H2O和180μl純化的和預(yù)先還原的小鼠TNF蛋白混合，并在15℃溫育4小時(shí)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)。用分子量阻斷值為300,000Da的纖維素酯膜于4℃用PBS透析兩次各2小時(shí)除去未偶聯(lián)的蛋白質(zhì)。
B. Qβ-mTNF的RNase消化300μl從A1獲得的與鼠TNFα偶聯(lián)的現(xiàn)有技術(shù)Qβ(Qβ-mTNF，0.7mg/ml)與3μl RNase A(100mg/ml)在輕輕攪拌下37℃溫育3小時(shí)?，F(xiàn)有技術(shù)Qβ中所含的RNA的消化程度通過(guò)對(duì)一份反應(yīng)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及隨后用溴化乙錠染色來(lái)證實(shí)。在這個(gè)處理后約95％的大腸桿菌宿主RNA被消化。RNase-處理的Qβ-mTNF用過(guò)量的20mMHEPES pH 7.2透析過(guò)夜。
C.小鼠的免疫用現(xiàn)有技術(shù)Qβ-mTNF免疫3只雌性balb/c小鼠，用RNase-處理的Qβ-mTNF免疫5只雌性balb/c小鼠。25μg總蛋白在PBS中稀釋成200μ1，在第0、14天皮下注射(在兩個(gè)腹側(cè)，100μl)。小鼠在第0和21天眼眶后取血，通過(guò)ELISA分析血清中的鼠TNF-特異性抗體效價(jià)。
D.ELISA微量滴定板(Maxisorp，Nunc)用1μg/ml重組鼠TNFα包被過(guò)夜。血清中的總IgG效價(jià)和對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)或重裝配的QβVLP和TNFα具有特異性的不同亞類(IgG1，IgG2a)效價(jià)通過(guò)與實(shí)施例8所述基本相同的ELISA進(jìn)行測(cè)定。
表2顯示現(xiàn)有技術(shù)Qβ-mTNF和RNase-處理的Qβ-mTNF誘導(dǎo)的鼠TNFα特異性抗體?，F(xiàn)有技術(shù)Qβ-mTNF誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，具有高IgG2a效價(jià)。IgG2a/IgG1效價(jià)的平均比約為0.75。Qβ-mTNF的RNAse-處理不影響IgG1效價(jià)，但是顯著降低IgG2a效價(jià)，導(dǎo)致0.135的比值。這些數(shù)據(jù)表明，與現(xiàn)有技術(shù)Qβ-mTNF誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答相比，RNase-處理的Qβ-mTNF誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答從更多Th1免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變?yōu)楦郥h2應(yīng)答。
表2
實(shí)施例16鼠TNFα(4-23)肽與現(xiàn)有技術(shù)QβVLP以及與重裝配的Qβ和AP205VLP的偶聯(lián)3ml 3.06mg/ml完整QβVLP在20mM HEPES，150mM NaCl pH7.2中的溶液與99.2μl SMPH溶液(65mM，在DMSO中)室溫反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)溶液用更換一次的20mM HEPES，150mM NaCl pH 7.2于4℃透析分別4小時(shí)和14小時(shí)。69μl衍生化并透析后的Qβ溶液與265.5μl 20mM HEPES pH 7.2和7.5μl具有與N末端融合的第二附著位點(diǎn)CGG的mTNFα(4-23)肽(23.6mg/ml，在DMSO中)混合，于15℃溫育2小時(shí)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)。通過(guò)于4℃用PBS透析2次各2小時(shí)除去未偶聯(lián)的肽。偶聯(lián)產(chǎn)物在還原條件下的12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分析。
類似的條件應(yīng)用于將鼠TNFα(4-23)分別與重裝配的Qβ和AP205VLP偶聯(lián)。
實(shí)施例17VLP中包裹的RNA的量的測(cè)定VLP樣品(見表2，1mg/ml)在10mM MgCl2和0.1M NaHCO3pH 9.7中60℃溫育約16小時(shí)。這將包裹的RNA，優(yōu)選核酸水解為核苷酸，并且沉淀蛋白質(zhì)。使用轉(zhuǎn)頭F45-30-11(Eppendorf))將樣品以14000rpm離心5分鐘，分離從可溶性核苷酸中沉淀的蛋白質(zhì)。
加入0.5M磷酸鈉緩沖液pH 7將上清液的pH調(diào)節(jié)為pH 7。通過(guò)系列稀釋進(jìn)一步調(diào)節(jié)每個(gè)樣品中的核苷酸濃度，以允許在低于2AU(AU表示“吸收單位”)的吸收范圍內(nèi)記錄紫外數(shù)據(jù)。用相同，但是不含VLP的緩沖液作為參照。
考慮1 AU相當(dāng)于33μg RNA/ml，由260nm處的吸收值計(jì)算對(duì)應(yīng)于最初RNA，優(yōu)選核酸的量的核苷酸濃度。樣品的RNA濃度總結(jié)在表3中。
表3
實(shí)施例18馬來(lái)酰亞胺-GnRH與現(xiàn)有技術(shù)QβVLP和重裝配的QβVLP的偶聯(lián)(A)馬來(lái)酰亞胺-GnRH的制備肽GnRH按照標(biāo)準(zhǔn)方法化學(xué)合成。MBS(m-馬來(lái)酰亞胺苯甲酰-N-羥基硫代琥珀酰亞胺酯)或SMPH(琥珀酰亞胺基-6-[β-馬來(lái)酰亞胺基丙酰胺基]己酸)在肽的N末端與氨基共價(jià)連接。
(B)QβVLP的氨基轉(zhuǎn)化為巰基現(xiàn)有技術(shù)QβVLP和重裝配的QβVLP(PBS中的貯存溶液)與0.1M磷酸鈉pH 7和2-亞氨硫醇(200mM，在DMSO中的貯存溶液)混合至終濃度為2mg/ml QβVLP，50mM磷酸鈉pH 7，和15mM 2-亞氨硫醇。該混合物室溫溫育2小時(shí)，隨后通過(guò)凝膠過(guò)濾(Sephadex G25，在PBS中)除去過(guò)量的未反應(yīng)的2-亞氨硫醇，生成純化的、SH修飾的QβVLP溶液，濃度約為1.4mg/ml。
(C)馬來(lái)酰亞胺-GnRH的偶聯(lián)由步驟(B)獲得的SH-修飾的現(xiàn)有技術(shù)QβVLP和SH-修飾的重裝配的QβVLP(1.4mg/ml)與1/20體積的馬來(lái)酰亞胺-GnRH貯存溶液(10mM，在DMSO中)混合，室溫溫育1小時(shí)。使用300kDa的膜通過(guò)滲濾除去未偶聯(lián)的馬來(lái)酰亞胺-GnRH。偶聯(lián)結(jié)果通過(guò)SDS-PAGE凝膠法證實(shí)。
實(shí)施例19熱原試驗(yàn)該試驗(yàn)按照如歐洲藥典第4版第2.6.8章第131-132頁(yè)的標(biāo)準(zhǔn)熱原試驗(yàn)程序進(jìn)行，在此引用作為參考。
試驗(yàn)樣品是在聚谷氨酸的存在下重裝配的QβVLP，RNase處理的QβVLP，ZnSO4處理的QβVLP，和含有大腸桿菌RNA的現(xiàn)有技術(shù)Qβ。QβVLP的濃度為0.3mg/ml。在注射前將樣品預(yù)加溫到38.5℃。
該試驗(yàn)中使用的動(dòng)物是體重約為3kg的健康成年兔。每組檢測(cè)3只兔。
簡(jiǎn)要地說(shuō)，在不超過(guò)4分鐘的時(shí)間內(nèi)將0.3ml/kg體重的量的樣品緩慢注射到每只兔的耳邊緣靜脈內(nèi)。每只兔的初始溫度是在注射樣品前緊接的40分鐘內(nèi)以30分鐘間隔記錄的該兔的兩個(gè)溫度讀數(shù)的平均值。每只兔的最高溫度是在注射后3小時(shí)內(nèi)記錄的該兔的最高溫度。以不超過(guò)30分鐘的間隔記錄每只兔的溫度，從樣品注射前至少90分鐘開始，在注射后繼續(xù)3小時(shí)。以每只兔的最高溫度和初始溫度之差作為它的應(yīng)答。研究了被檢測(cè)的VLP在兔中誘導(dǎo)發(fā)熱的能力，并與現(xiàn)有技術(shù)VLP比較。
實(shí)施例20IL-5與重裝配的QβVLP的偶聯(lián)和它誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的測(cè)定實(shí)施例21IL-5與現(xiàn)有技術(shù)QβVLP以及與在聚-L-谷氨酸存在下重裝配的QβVLP的偶聯(lián)，和它誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的測(cè)定與N末端γ3氨基酸連接體(SEQ ID NO48)融合的小鼠IL-5(SEQID NO46)或人IL-5(SEQ ID NO47)在大腸桿菌中重組產(chǎn)生并且純化?，F(xiàn)有技術(shù)QβVLP和在聚-L-谷氨酸存在下重裝配的QβVLP用10倍摩爾過(guò)量的SMPH于25℃衍生化30分鐘。衍生化反應(yīng)物在MWCO為10,000的Slide-A-Lyzer透析盒中用1000倍體積的由20mM Hepes，150mM NaCl；pH 7.4組成的透析緩沖液透析2次各2小時(shí)。純化的小鼠IL-5用2倍摩爾過(guò)量的pH中和的TCEP預(yù)還原60分鐘。還原的小鼠IL-5(42μM)分別與根據(jù)實(shí)施例1制備的40μM SMPH-衍生化的現(xiàn)有技術(shù)QβVLP和42μM小鼠IL-5在20℃溫育3小時(shí)，與根據(jù)實(shí)施例4制備的40μM SMPH-衍生化的在聚-L-谷氨酸存在下重裝配的QβVLP于20℃溫育3小時(shí)。使用300kDa截止值的透析膜透析偶聯(lián)反應(yīng)物12小時(shí)，再用PBS pH 8.0透析6小時(shí)。
每組5只雌性BalbC小鼠在第0、14、28天皮下注射在200μl PBS中的50μg、25μg和50μg的“現(xiàn)有技術(shù)-Qβ-小鼠IL-5”或“重裝配的Qβ-小鼠IL-5”疫苗(100μl，兩腹側(cè))。作為對(duì)照，5只小鼠在第0、14、28天只用現(xiàn)有技術(shù)QβVLP或在聚-L-谷氨酸存在下重裝配的QβVLP免疫。疫苗施用時(shí)不加佐劑。小鼠在免疫方案的第0、14、21、28天采血。
微量滴定板(Maxisorp，Nunc)用2μg/ml重組鼠IL-5或2μg/ml現(xiàn)有技術(shù)Qβ或2μg/ml在聚-L-谷氨酸存在下重裝配的Qβ包被過(guò)夜。血清中的總IgG效價(jià)和對(duì)現(xiàn)有技術(shù)或重裝配的QβVLP和IL-5具有特異性的不同亞類(IgG1，IgG2a)效價(jià)通過(guò)基本與實(shí)施例8所述相同的ELISA進(jìn)行測(cè)定。
表4
表4顯示現(xiàn)有技術(shù)-Qβ-小鼠-IL-5和重裝配的Qβ-小鼠-IL-5誘導(dǎo)的鼠IL-5特異性抗體?，F(xiàn)有技術(shù)Qβ-IL-5誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，具有高IgG2a效價(jià)。IgG2a/IgG1效價(jià)的平均比約為2.5。而用在聚-L-谷氨酸存在下重裝配的QβVLP制備的Qβ-小鼠-IL-5疫苗免疫小鼠顯著降低了IgG2a效價(jià)，得到0.0077的平均比。這些數(shù)據(jù)表明，與現(xiàn)有技術(shù)Qβ-mIL-5誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答相比，含有聚-L-谷氨酸的重裝配的Qβ-mIL-5誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答從Th1免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變?yōu)楦郥h2應(yīng)答。注意，合并來(lái)自5只小鼠(每組包括5只小鼠)的血清進(jìn)行ELISA分析。
一致地，抗-Qβ效價(jià)顯示針對(duì)VLP的相同的免疫應(yīng)答。使用現(xiàn)有技術(shù)QβVLP誘導(dǎo)針對(duì)Qβ的Th1型免疫應(yīng)答，具有高IgG2a效價(jià)。相反，使用在聚-L-谷氨酸存在下重裝配的QβVLP誘導(dǎo)更多Th2型的針對(duì)Qβ的免疫應(yīng)答(數(shù)據(jù)未顯示)。
嗜酸粒細(xì)胞增多模型利用變應(yīng)性氣管炎癥的一種實(shí)驗(yàn)性哮喘模型來(lái)評(píng)價(jià)接種對(duì)嗜酸粒細(xì)胞增多的效果。Balb/c小鼠(每組5只)如上所述用與小鼠IL-5偶聯(lián)的重裝配的QβVLP免疫。在接種程序的第35天，對(duì)小鼠腹膜內(nèi)注射在Alumn(Alu-Gel-S)中的50μg卵白蛋白(OVA)。不接受免疫的第三組4只小鼠也進(jìn)行注射。10天后(即第33天)，小鼠每天接受鼻內(nèi)給藥的PBS中的100μg OVA，共4天。最后一次激發(fā)后24小時(shí)，處死小鼠，用PBS洗肺。支氣管肺泡灌洗液(BAL)中所含的細(xì)胞用Maigrünwald-Giemsa染色，并計(jì)數(shù)嗜酸粒細(xì)胞的數(shù)目(TrifilieffA，等人.Clin Exp Allergy.2001 Jun；31(6)934-42)。
實(shí)施例21胃泌素片段與重裝配的QβVLP偶聯(lián)按照標(biāo)準(zhǔn)程序化學(xué)合成下列具有融合的連接體序列的胃泌素片段。
G17(1-9)C2pEGPWLEEEESSPPPPC(SEQ ID NO72)c1G17 pEGPWLEEEEEAYGWMDFGGC(SEQ ID NO73)nG17amide CGGQGPWLEEEEEAYGWMDFCONH2(SEQ ID NO74)nG17-GCGGQGPWLEEEEEAYGWMDFG(SEQ ID NO54)nG34amidc CGGQLGPQGPPHLVADPSKKQGPWLEEEEEAYGWMDFCONH2(SEQ ID NO75)nG34-GCGGQLGPQGPPHLVADPSKKQGPWLEEEEEAYGWMDFG(SEQ ID NO76)2ml 2.0mg/ml重裝配的QβVLP在20mM Hepes，150mM NaClpH 7.2中的溶液與114.4μl SMPH(Pierce)溶液(來(lái)自溶于DMSO中的50mM貯存溶液)于25℃反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)溶液隨后用2L 20mMHepes，150mM NaCl，pH 7.2于4℃透析兩次2小時(shí)。
然后用透析后的衍生化QβVLP來(lái)偶聯(lián)c1G17。簡(jiǎn)要地說(shuō)，1ml衍生化的QβVLP(濃度為2mg/ml)與167μl 10mM肽在DMSO中的溶液和100μl乙腈在15℃反應(yīng)2小時(shí)。偶聯(lián)反應(yīng)物然后以16 100rcf離心5分鐘，收集上清液，并透析1次2小時(shí)，然后用2L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2于4℃透析過(guò)夜。偶聯(lián)的產(chǎn)物被命名為Qβ-clG17。在基本上相同的條件下，nG17amide、nG17-G、nG34amide和nG34-G與重裝配的QβVLP偶聯(lián)。
實(shí)施例22用Qβ-clG17、Qβ-nG17amide、Qβ-nG17-G、Qβ-nG34amide、Qβ-nG34-G、Qβ-G17(1-9)C2和DT-G17(1-9)C2免疫小鼠，和通過(guò)ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)成年雌性C57BL/6小鼠接種Qβ-clG17(每組5小鼠)、Qβ-nG17amide、Qβ-nG17-G、Qβ-nG34amide或Qβ-nG34-G(每組3小鼠)。50μg Qβ-clG17或25μg Qβ-nG17amide、Qβ-nG17-G、Qβ-nG34amide和Qβ-nG34-G(在實(shí)施例21中獲得)用PBS稀釋至200μl的體積，并在第0、14天皮下注射(100μl，在兩腹側(cè))。不加佐劑施用疫苗。作為對(duì)照，一組小鼠注射50μg重裝配的Qβ。用Qβ-ClG17免疫的小鼠在第0，14，21，28，42，69和101天眼眶后采血，用Qβ-nG17amide、Qβ-nG17-G、Qβ-nG34amide和Qβ-nG34-G免疫的小鼠在第0，14，21，28，42，56和77天眼眶后采血。
5mg/ml RNase和0.2mM SPDP(終濃度)室溫溫育1小時(shí)。RNase-SPDP溶液用PD10柱(Amersham)純化。純化后，將10mM EDTA和1mM肽加入RNase-SPDP溶液中。
ELISA板(96孔MAXIsorp，NUNC)用在包被緩沖液(0.1M NaHCO3，pH 9.6)中濃度為10μg/ml的RNase-偶聯(lián)的clG17或nG17amide、nG17-G、nG34smide、nG34-G包被，4℃過(guò)夜。用洗滌緩沖液(PBS-0.05％Tween)洗板后，板用封閉緩沖液(2％BSA-PBS-Tween 20溶液)37℃封閉2小時(shí)，然后再次洗滌，并與系列稀釋的小鼠血清一起溫育。作為對(duì)照，也檢測(cè)了同一小鼠的免疫前血清。板在室溫下溫育2小時(shí)。進(jìn)一步洗滌后，用HRPO-標(biāo)記的Fc特異性山羊抗小鼠IgG抗體(JacksonImmunoresearch)檢測(cè)結(jié)合的抗體，室溫溫育1小時(shí)。進(jìn)一步洗滌后，將板用OPD溶液(1片OPD片，25μl OPD緩沖液和8μl H2O2)顯色6分鐘，用5％H2SO4溶液終止反應(yīng)。用ELISA讀板器(Biorad Benchmark)在450nm處讀板。ELISA效價(jià)表示為在ELISA測(cè)定中達(dá)到半數(shù)最大OD的血清稀釋度。
實(shí)施例23CXCR4片段與現(xiàn)有技術(shù)和重裝配的QβVLP的偶聯(lián)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序(Peter Henklein，Charite，Berlin，Germany)化學(xué)合成具有與CXCR4片段1-39的N-或C-末端融合的CGG或GGC連接體序列的CXCR4片段1-39(SEQ ID NO66)，和通過(guò)將在N末端添加的C與在C末端添加的G連接而環(huán)化的CXCR4片段176-185(SEQ IDNO65)。
3ml(1.0mg/ml)現(xiàn)有技術(shù)或重裝配的QβVLP在20mM Hepes，pH 7.2中的溶液與85μl SMPH(50mM在DMSO中，Pierce)25℃反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)物然后用3L 20mM Hepes，pH 7.2于4℃透析2次2小時(shí)。然后利用透析后的衍生化的現(xiàn)有技術(shù)Qβ或重裝配的VLP偶聯(lián)肽CXCR4-CGG-1-39、CXCR4-1-39-GGC或CXCR4-C-176-185-G。簡(jiǎn)要地說(shuō)，1ml濃度為1mg/ml的衍生化的現(xiàn)有技術(shù)或重裝配的QβVLP與70μl 5mM肽溶液在20mM Hepes，pH 7.2中25℃反應(yīng)2小時(shí)。偶聯(lián)反應(yīng)物然后以13 000rpm離心5分鐘，收集上清液，用1L 20mMHepes，pH 7.2于4℃透析一次2小時(shí)，然后過(guò)夜。
實(shí)施例24用Qβ-CXCR4-CGG-1-39、Qβ-CXCR4-1-39-GGC或Qβ-CXCR4-C-176-185-G免疫小鼠及抗體亞型的檢測(cè)成年雌性C57BL/6小鼠(每組3只)接種與CXCR4片段偶聯(lián)的現(xiàn)有技術(shù)或重裝配的QβVLP(實(shí)施例23中獲得的)，僅使用現(xiàn)有技術(shù)或重裝配的QβVLP作為對(duì)照。來(lái)自每個(gè)樣品的100μg透析后的疫苗用PBS稀釋至體積為200μl，在第0天和第14天皮下注射(100μl，在兩腹側(cè))。施用疫苗時(shí)不使用或使用佐劑(Allhydrogel，1mg/注射)。小鼠在第14、21、28天眼眶后采血，并通過(guò)與實(shí)施例8所述基本相同的ELISA測(cè)定小鼠中的IgE效價(jià)、總IgG效價(jià)和對(duì)CXCR4片段具有特異性的不同亞類(IgG1，IgG2a)的效價(jià)。
實(shí)施例25CCR5片段與現(xiàn)有技術(shù)或重裝配的QβVLP的偶聯(lián)和小鼠的免疫按照標(biāo)準(zhǔn)程序化學(xué)合成在C末端具有另外一個(gè)酰胺化的Cys的環(huán)肽ECL2A(SEQ ID NO61)或PNt(SEQ ID NO63)。
2g/l現(xiàn)有技術(shù)或重裝配的QβVLP用1.43mM SMPH(Pierce，Perbio Science)于25℃衍生化30分鐘，然后用20mM Hepes pH8，150mM NaCl透析。將1g/l衍生化的QβVLP溶解在20％乙腈，150mM NaCl，20mM磷酸鹽pH7.5中。加入0.286mM CCR5片段ECL2A或PNt，于25℃溫育2小時(shí)。
6只雌性黑色小鼠在第0天用50μg與CCR5片段偶聯(lián)的現(xiàn)有技術(shù)或重裝配的QβVLP初次免疫(皮下，在0.2ml PBS中)，并與只用50μg現(xiàn)有技術(shù)或重裝配的QβVLP免疫的BalbC小鼠進(jìn)行比較。在第14天用相同疫苗加強(qiáng)免疫后，在第14天和第21天通過(guò)ELISA檢測(cè)抗-Qβ和抗-CCR5抗體的效價(jià)。
實(shí)施例26CCR5特異性小鼠多克隆抗體的純化及其在HIV-中和測(cè)定中的作用來(lái)自被免疫小鼠的血清(在實(shí)施例25中獲得)以14,000rpm離心5分鐘。將上清液加樣到3.3ml預(yù)洗的蛋白Gsepharose柱(AmershamBiosciences)上。然后用PBS洗柱，用100mM甘氨酸pH2.8洗脫。將1ml級(jí)分收集到預(yù)先裝有100μl 1M Tris pH8的管中。合并在280nm處具有吸收的峰級(jí)分。
CCR5共同受體特異的株，JR-FL和SF162，以前已有描述(O′Brien等人，Nature 1990，348，69；和Shioda等人，Nature 1991，349，167)。用測(cè)定培養(yǎng)基將貯存溶液中的HIV-1接種物調(diào)節(jié)為含有大約1,000至4,000 TCID50/ml(TCID5050％組織培養(yǎng)感染劑量)。
刺激的排除CD8的初級(jí)PBMC(用于HIV中和測(cè)定)簡(jiǎn)言之，使用Rosette Sep混合物(StemCell Technologies Inc.，BIOCOBA AG，Switzerland)將從3名健康獻(xiàn)血者獲得的血沉棕黃層除去CD8+T細(xì)胞，通過(guò)Ficoll-Hypaque離心(Amersham-PharmaciaBiotech)分離PBMC。將細(xì)胞用培養(yǎng)基(RPMI 1640，10％FCS，100U/mlIL-2，谷氨酰胺和抗生素)調(diào)節(jié)為4×106/ml，分成三份，并用5μg/ml植物凝集素(PHA)、0.5μg/ml PHA或1mg/l抗-CD3 MAb OKT3刺激。72小時(shí)后，將所有三種刺激的細(xì)胞混合，作為刺激的CD4+T細(xì)胞的來(lái)源用于感染和病毒中和實(shí)驗(yàn)。
簡(jiǎn)言之，細(xì)胞與系列稀釋的純化的多克隆小鼠IgG或?qū)φ湛贵w2D7(25μg/ml-25ng/ml；Pharmingen)在96-孔培養(yǎng)板中37℃溫育1小時(shí)。然后加入病毒接種物(100 TCID50；50％組織培養(yǎng)感染劑量；Trkila等人，J.Virol.，1999，8966)，將培養(yǎng)板培養(yǎng)4-14天?？偢腥倔w積為200μL。優(yōu)選地，在感染后的第6天，如以前所述(Moore等人，1990.Science 250，1139)，利用免疫測(cè)定法測(cè)定上清液基質(zhì)中HIV-1 p24抗原的產(chǎn)生。
實(shí)施例27緩激肽(BK)和des-Arg-緩激肽(des-Arg9-BK)與現(xiàn)有技術(shù)和重裝配的QβVLP偶聯(lián)按照標(biāo)準(zhǔn)程序化學(xué)合成具有與序列N末端融合的Cys的緩激肽(BK)(SEQ ID NO55)和des-Arg9-緩激肽(SEQ ID NO56)或具有與C末端融合的Cys的緩激肽(BK)。
3ml(1.0mg/ml)現(xiàn)有技術(shù)或重裝配的QβVLP在20mM Hepes，pH 7.2中的溶液與84μl SMPH(50mM，在DMSO中，Pierce)25℃反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)物然后用3L 20mM Hepes，pH 7.2于4℃透析2次2小時(shí)。然后利用透析后的衍生化的QβVLP偶聯(lián)緩激肽或des-Arg9-緩激肽。簡(jiǎn)要地說(shuō)，3ml濃度為1mg/ml的衍生化的現(xiàn)有技術(shù)或重裝配的QβVLP與42μl 50mM緩激肽或des-Arg-緩激肽在20mM Hepes，pH 7.2中25℃反應(yīng)2小時(shí)。偶聯(lián)反應(yīng)物然后以13 000rpm離心5分鐘，收集上清液，用3L 20mM Hepes，pH 7.2于4℃透析一次2小時(shí)，然后過(guò)夜。
實(shí)施例28用Qβ-BK和Qβ-des-Arg9-BK免疫小鼠及抗體亞型的檢測(cè)成年雌性C57BL/6小鼠(每組10只)接種與現(xiàn)有技術(shù)或重裝配的QβVLP偶聯(lián)的Qβ-BK或Qβ-des-Arg9-BK(實(shí)施例27中獲得的)。來(lái)自每個(gè)樣品的50μg透析后的疫苗用PBS稀釋至體積為200μl，在第0、14、28天皮下注射(100μl，在兩腹側(cè))。施用疫苗時(shí)不使用佐劑。作為對(duì)照，一組小鼠注射PBS。小鼠在第0、14、21、33天眼眶后采血。
通過(guò)與實(shí)施例8所述基本相同的ELISA測(cè)定血清中的總IgG效價(jià)和對(duì)現(xiàn)有技術(shù)或重裝配的QβVLP和TNFα具有特異性的不同亞類(IgG1，IgG2a)的效價(jià)。ELISA血清效價(jià)(表5和表6)被定義為達(dá)到飽和時(shí)測(cè)定的光密度的50％所需的稀釋度的倒數(shù)。
表5在第0、14、28天分別用現(xiàn)有技術(shù)Qβ、重裝配的Qβ、Qβ-BK或Qβ-des-Arg9-BK免疫的小鼠中抗-現(xiàn)有技術(shù)Qβ、抗-重裝配的Qβ、抗-BK和抗-des-Arg9-BK特異性tIgG、IgG2a和IgG1(以稀釋倍數(shù)表示)的平均值。數(shù)據(jù)表明，與未偶聯(lián)或偶聯(lián)到抗原上的現(xiàn)有技術(shù)QβVLP誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答相比，重裝配的QβVLP，無(wú)論與抗原偶聯(lián)或未偶聯(lián)，均已從更多Th1免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變至更多Th2應(yīng)答。
表6
數(shù)據(jù)表明，與現(xiàn)有技術(shù)Qβ-mTNF誘導(dǎo)的應(yīng)答相比，未偶聯(lián)或偶聯(lián)到抗原上的重裝配的QβVLP已經(jīng)從更多Th1免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變?yōu)楦郥h2應(yīng)答。
實(shí)施例29與AP205VLP的C末端融合的CETP片段的克隆、表達(dá)和純化通過(guò)使兩種編碼CETP片段并分別含有Kpn2I和Mph1103I限制性位點(diǎn)的互補(bǔ)寡核苷酸退火而產(chǎn)生編碼CETP片段(SEQ ID NO69)的DNA片段。獲得的片段用Kpn2I和Mph1103I消化，并且克隆到載體pAP405-61(如美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/611,308的實(shí)施例1所述)的相同限制性位點(diǎn)內(nèi)，處于大腸桿菌色氨酸操縱子啟動(dòng)子的控制下。獲得的構(gòu)建體是AP205外殼蛋白-GTAGGGSG-FGFPEHLLVDFLQSLS。
AP205-11-CETP1蛋白基本如WO04/007538所述表達(dá)和純化。除去AP205VLP內(nèi)包裝的大腸桿菌RNA的其他步驟基本與以上實(shí)施例5所述相同。
實(shí)施例30CETP肽CETP1與重裝配的QβVLP的化學(xué)偶聯(lián)具有與N末端融合的額外CGG連接體的CETP片段(SEQ ID NO69)由EMC microcollections GmbH(Germany)固相化學(xué)法合成。該肽在C末端酰胺化。
2ml(2.0mg/ml)重裝配的QβVLP(實(shí)施例4獲得的)在20mMHepes，150mM NaCl pH 7.4中的溶液與57μl SMPH溶液(在DMSO中的50mM貯存液，Pierce)25℃反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)物然后用2L 20mM Hepes，pH 7.2于4℃透析2次2小時(shí)。然后利用透析后的衍生化的重裝配的QβVLP偶聯(lián)CETP片段。簡(jiǎn)要地說(shuō)，1ml濃度為2mg/ml的衍生化的重裝配的QβVLP與100μl 50mM肽溶液在20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.4中15℃反應(yīng)2小時(shí)。偶聯(lián)反應(yīng)物然后以16 000g離心5分鐘，收集上清液，用2L 20mM Hepes，pH 7.4于4℃透析兩次2小時(shí)。
實(shí)施例31在膽固醇飼養(yǎng)的兔動(dòng)脈粥樣硬化模型中CETP疫苗的檢測(cè)新西蘭白兔(每組n＝12)在第0天皮下接種200μg如實(shí)施例30或?qū)嵤├?9獲得的VLP-CETP片段疫苗或VLP，在第3、6、9、12、15、19、23、27周加強(qiáng)免疫。在第16周將兔置于高膽固醇(0.25％)飲食下，在該飲食下再保持16周。以固定間隔從禁食的兔中收集血漿樣品，用于抗體效價(jià)、脂蛋白、膽固醇和CETP活性測(cè)定。在第32周處死動(dòng)物，取出主動(dòng)脈進(jìn)行動(dòng)脈粥樣硬化病變分析。在主動(dòng)脈″e(cuò)nface″制備后，主動(dòng)脈用油紅0染色，并計(jì)算每只動(dòng)物被病變覆蓋的主動(dòng)脈的百分比。
實(shí)施例32mC5acys與重裝配的QβVLP偶聯(lián)含有N-末端CGSGG連接體的鼠C5a氨基酸序列(SEQ ID NO58，下文中稱為mC5acys)由Dictagene SA化學(xué)合成?；瘜W(xué)合成(EMCMicrocollections GmbH，Germany)鼠C5a序列的C-末端19個(gè)氨基酸，它在N末端具有一個(gè)額外的CGG連接體(SEQ ID NO71，下文中稱為mC5acys59-77)。
143μM重裝配的QβVLP在4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)緩沖液(20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.2)中的溶液與2倍摩爾過(guò)量的(286μM)SMPH(Pierce)在振搖下25℃反應(yīng)30分鐘。使用具有10,000Da分子量截止值的透析單位，將反應(yīng)產(chǎn)物用更換一次的Dulbecco′s PBS(Gibco)透析(Slide-A-Lyzer，Pierce)。
將等摩爾量的mC5acys加入到36μM SMPH-衍生化的QβVLP溶液中。反應(yīng)體積為100μl，平行進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)。反應(yīng)物在15℃振搖下溫育2小時(shí)。偶聯(lián)后，將等份于4℃以16,000×g離心3分鐘，以沉淀不可溶的物質(zhì)。疫苗在可溶的級(jí)分中。
將2倍摩爾過(guò)量的mC5acys59-77加入到5摩爾過(guò)量的SMPH-衍生化的QβVLP的107μM溶液中。反應(yīng)體積為100μl，平行進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)。反應(yīng)物在15℃振搖下溫育2小時(shí)。偶聯(lián)后，將等份于4℃以16,000×g離心3分鐘，以沉淀不可溶的物質(zhì)。使用10,000MW截止值的透析盒，將可溶的疫苗用PBS透析2次各2小時(shí)。
實(shí)施例33在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中用Qβ-mC5acys VLP免疫小鼠6周大的雄性DBA/1JCr1小鼠(Charles River，Deutschland)在脅部用在Dulbecco′s PBS中稀釋的50μg重裝配的Qβ-mC5acys(n＝8)或只用30μg重裝配的QβVLP(n＝8)皮下免疫。在初次免疫后的第15和24天皮下給予另外兩次加強(qiáng)免疫。通過(guò)ELISA測(cè)定抗-mC5acys抗體效價(jià)。在初次免疫后的第35和57天，用使用玻璃注射器在弗氏完全佐劑(CFA)中以1∶1比例乳化的100μg II型牛膠原(MDBiosciences)在小鼠尾巴根部皮內(nèi)免疫兩次。然后通過(guò)每日測(cè)量前肢和后肢關(guān)節(jié)厚度以及通過(guò)每日評(píng)估關(guān)節(jié)的臨床得分，監(jiān)測(cè)小鼠中膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的誘導(dǎo)和嚴(yán)重程度。使用恒定張力卡尺測(cè)量關(guān)節(jié)厚度。
實(shí)施例34用Qβ-CCR5片段免疫小鼠及抗體亞型的檢測(cè)成年雌性C57BL/6小鼠(每組3只)接種與CCR5片段偶聯(lián)的現(xiàn)有技術(shù)或重裝配的QβVLP(實(shí)施例25中獲得的)，使用現(xiàn)有技術(shù)或重裝配的QβVLP作為對(duì)照。來(lái)自每個(gè)樣品的100μg透析后的疫苗用PBS稀釋至體積為200μl，在第0天和第14天皮下注射(100μl，在兩腹側(cè))。施用疫苗時(shí)不使用或使用佐劑(Allhydrogel，1mg/注射)。小鼠在第14、21、28天眼眶后采血，并通過(guò)ELISA測(cè)定小鼠中的IgE效價(jià)、總IgG效價(jià)和對(duì)CCR5片段具有特異性的不同亞類(IgG1，IgG2a)的效價(jià)。
微量滴定板(Maxisorp，Nunc)用10μg/ml與RNAse偶聯(lián)的CCR5片段包被過(guò)夜。血清中的總IgG效價(jià)和對(duì)現(xiàn)有技術(shù)或重裝配的QβVLP和TNFα具有特異性的不同亞類(IgG1，IgG2a)的效價(jià)通過(guò)與實(shí)施例8所述基本相同的ELISA進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例35針對(duì)Qβ-BK、Qβ-des-Arg9-BK接種在治療膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎中的效果在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)鼠模型中檢測(cè)重裝配的Qβ-BK或Qβ-des-Arg9-BK的效果。每組10只雄性DBA/1小鼠用50μg Qβ-BK、Qβ-des-Arg9-BK或單獨(dú)的Qβ皮內(nèi)免疫三次(第0、14、28天)。然后給小鼠皮內(nèi)注射兩次(第34、55天)與完全弗氏佐劑混合的200μg II型牛膠原。
第二次膠原/CFA注射后，定期檢查小鼠，并根據(jù)觀察到的變紅和腫脹程度給予每一肢從0到3之間的臨床得分。在第二次膠原/CFA注射后三周，確定三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中每肢的平均臨床得分。
實(shí)施例36針對(duì)Qβ-BK和Qβ-des-Arg9-BK接種在治療變應(yīng)性氣管炎癥(AAI)中的效果利用變應(yīng)性氣管炎癥的一個(gè)實(shí)驗(yàn)哮喘模型評(píng)估針對(duì)緩激肽(BK)和des-Arg9-緩激肽(des-Arg9-BK)接種對(duì)Th2-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的效果，該免疫應(yīng)答的特征在于嗜酸性粒細(xì)胞向肺內(nèi)流入，細(xì)胞因子(IL-4，IL-5，IL-13)產(chǎn)生，IgE抗體和粘液產(chǎn)生，和支氣管高反應(yīng)性(BHR)。Balb/c小鼠(每組5只)如實(shí)施例15所述用Qβ-BK或Qβ-des-Arg9-BK免疫，或單獨(dú)注射Qβ。第一次免疫35天后，對(duì)小鼠腹膜內(nèi)注射50μg卵白蛋白(OVA)，其中使用或不使用佐劑(Alhydrogel，1mg AlOH/注射)。10天后(即第45天)，所有小鼠每天用PBS中的50μg OVA鼻內(nèi)激發(fā)，連續(xù)4天。最后一次激發(fā)后24小時(shí)，用全身容積描記器測(cè)定BHR。然后在特定時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，分析肺的炎癥和Th2-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。用PBS/1％BSA進(jìn)行肺灌洗。用Coulter計(jì)數(shù)器(Instrumenten Gesellschaft AG)計(jì)數(shù)支氣管肺泡灌洗液(BAL)中所含的細(xì)胞，并用如前所述(Trifilieff A，等人.ClinExp Allergy.2001 Jun；31(6)934-42)的Maigrünwald-Giemsa染色進(jìn)行鑒別。
序列表<110>賽托斯生物生物技術(shù)公司M·巴克曼K·普羅巴P·毛雷爾E·米杰林克K·施瓦茨<120>VLP-抗原偶聯(lián)物及其作為疫苗的用途<130>P1035PC00<160>122<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>10<212>PRT<213>哺乳動(dòng)物<400>1Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly1 5 10<210>2<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GnRH類似物CGG-GnRH<400>2Cys Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly1 5 10<210>3<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GnRH類似物GnRH-GGC<400>3Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Gly Cys1 5 10<210>4<211>11<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>GnRH類似物C-GnRH<400>4Cys Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly1 5 10<210>5<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GnRH類似物GnRH-C<400>5Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Cys1 5 10<210>6<211>189<212>PRT<213>人<400>6Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr1 5 10 15Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln20 25 30Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His35 40 45Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr50 55 60Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln65 70 75 80Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly85 90 95Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu100 105 110Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu115 120 125
Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr130 135 140Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu145 150 155 160Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala165 170 175Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro180 185<210>7<211>170<212>PRT<213>人<400>7Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln Cys Gln Gln1 5 10 15Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His Pro Leu Val20 25 30Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr Thr Asn Asp35 40 45Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln Gly Leu Arg50 55 60Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly Leu Ile Phe65 70 75 80Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser Leu85 90 95Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly Leu100 105 110Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr Gln Gln Ile115 120 125Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu Leu Arg Phe130 135 140Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala Ala Arg Val145 150 155 160
Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro165 170<210>8<211>20<212>PRT<213>人<400>8Gln Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala1 5 10 15His Pro Leu Val20<210>9<211>21<212>PRT<213>人<400>9Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly Leu1 5 10 15Ser Gln Leu Leu Gln20<210>10<211>132<212>PRT<213>噬菌體Q-beta<400>10Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>11<211>329<212>PRT<213>噬菌體Q-beta<400>11Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly1 5 10 15Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser65 70 75 80Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser85 90 95Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu100 105 110Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln115 120 125Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140
Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro145 150 155 160Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu165 170 175Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala180 185 190Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu195 200 205Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr210 215 220Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr225 230 235 240Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu245 250 255Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu260 265 270Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His275 280 285Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly290 295 300Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile305 310 315 320Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala325<210>12<211>129<212>PRT<213>噬菌體R17<400>12Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly1 5 10 15Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val35 40 45Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val50 55 60Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala65 70 75 80Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu100 105 110Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile115 120 125Tyr<210>13<211>130<212>PRT<213>噬菌體fr<400>13Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr1 5 10 15Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu20 25 30Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser35 40 45Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu50 55 60Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val65 70 75 80Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe85 90 95Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr
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1 5 10 15Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys50 55 60Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe85 90 95Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>16<211>329<212>PRT<213>噬菌體SP<400>16Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp1 5 10 15Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val50 55 60Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp65 70 75 80
Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe Thr85 90 95Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala100 105 110Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu Asn115 120 125Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Val Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp130 135 140Asn Pro Ser Asp Pro Asp Val Pro Val Val Pro Asp Val Lys Pro Pro145 150 155 160Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly165 170 175Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg180 185 190Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu195 200 205Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp210 215 220Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp225 230 235 240Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly245 250 255Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu260 265 270Leu Asn Ile Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Val Thr Ala275 280 285Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser290 295 300Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro305 310 315 320Val Gln Thr Val Ile Ile Ile Pro Ser325
<210>17<211>130<212>PRT<213>噬菌體MS2<400>17Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr1 5 10 15Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu20 25 30Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser35 40 45Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu50 55 60Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val65 70 75 80Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe85 90 95Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu100 105 110Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly115 120 125Ile Tyr130<210>18<211>133<212>PRT<213>噬菌體M11<400>18Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly1 5 10 15Asp Val Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr65 70 75 80Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Val Thr Phe Ser85 90 95Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Val Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu100 105 110Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Val Asn Ala Ile Asp Asn115 120 125Leu Asn Pro Ala Tyr130<210>19<21l>133<212>PRT<213>噬菌體MXl<400>19Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Asn Gly1 5 10 15Asp Val Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr65 70 75 80Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser85 90 95Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu100 105 110Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn
115 120 125Leu Asn Pro Ala Tyr130<210>20<211>330<212>PRT<213>噬菌體NL95<400>20Met Ala Lys Leu Asn Lys Val Thr Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly1 5 10 15Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe85 90 95Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly130 135 140Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro145 150 155 160Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly165 170 175Glu Leu Ile Thr Glu Ala Lys Asp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys180 185 190
Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu195 200 205Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp210 215 220Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Val Asp Leu Asp225 230 235 240Ala Ser Val Met Gln Ser Asp Glu Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp245 250 255Val Val Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr260 265 270Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala275 280 285Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser290 295 300Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro305 310 315 320Val Gln Thr Val Ile Val Ile Pro Ser Leu325 330<210>21<211>129<212>PRT<213>噬菌體f2<400>21Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly1 5 10 15Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val35 40 45Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val50 55 60Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala65 70 75 80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu100 105 110Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile115 120 125Tyr<210>22<211>128<212>PRT<213>噬菌體PP7<400>22Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu1 5 10 15Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val20 25 30Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn35 40 45Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp50 55 60Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg65 70 75 80Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr85 90 95Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala100 105 110Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg115 120 125<210>23<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體Qbeta 240突變體<400>23Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>24<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體Q-beta 243突變體<400>24Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>25<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體Q-beta 250突變體<400>25Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>26<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體Q-beta 251突變體<400>26Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>27<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體Q-beta 259突變體
<400>27Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>28<21l>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GnRH類似物GnRH 1Q-10<400>28Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly1 5 10<210>29<211>131<212>PRT<213>噬菌體AP205<400>29Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100 105 110Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115 120 125Thr Thr Ala130<210>30<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GnRH類似物串聯(lián)序列<400>30Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly1 5 10 15Leu Arg Pro Gly20<210>31<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GnRH類似物串聯(lián)序列<400>31Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gln His Trp Ser Tyr Gly
1 5 10 15Leu Arg Pro Gly20<210>32<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GnRH類似物串聯(lián)序列<400>32Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gln His Trp Ser Tyr Gly1 5 10 15Leu Arg Pro Gly20<210>33<211>14<212>PRT<213>人<400>33Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu1 5 10<210>34<211>22<212>PRT<213>人<400>34Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser1 5 10 15Leu Leu Pro Asp Ser Pro20<210>35<211>17<212>PRT<213>人<400>35Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln1 5 10 15
Pro<210>36<211>27<212>PRT<213>人<400>36Gly Glu Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala1 5 10 15Ser Leu Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro20 25<210>37<211>19<212>PRT<213>人<400>37Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro1 5 10 15Ser Gln Pro<210>38<211>8<212>PRT<213>人<400>38Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro1 5<210>39<211>7<212>PRT<213>人<400>39Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala1 5<210>40<211>39<212>PRT<213>人<400>40
Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser1 5 10 15Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly20 25 30Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro35<210>41<211>6<212>PRT<213>人<400>41Leu Leu Pro Asp Ser Pro1 5<210>42<211>28<212>PRT<213>人<400>42Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser Leu Leu Pro Asp1 5 10 15Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly20 25<210>43<211>32<212>PRT<213>人<400>43Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser1 5 10 15Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly20 25 30<210>44<211>7<212>PRT<213>人<400>44Gln Pro Glu Gly His His Trp
1 5<210>45<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TNF-超家族成員之間的同源序列<400>45Lys Pro Ala Ala His Leu Val Gly Lys Pro Leu Gly Gln Gly Pro Leu1 5 10 15Ser Trp Glu Asn Asp Gly Gly Thr Ala20 25<210>46<211>113<212>PRT<213>小鼠<400>46Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu1 5 10 15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro20 25 30Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln35 40 45Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu50 55 60Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65 70 75 80Lys Glu Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp85 90 95Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu100 105 110Gly<210>47
<211>115<212>PRT<213>人<400>47Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1 5 10 15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg20 25 30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile35 40 45Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr50 55 60Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65 70 75 80Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe85 90 95Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile100 105 110Ile Glu Ser115<210>48<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端gamma 3連接體<400>48Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala1 5 10 15Pro<210>49<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>胃泌素片段1-9<400>49Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu1 5<210>50<211>17<212>PRT<213>人<400>50Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp1 5 10 15Phe<210>51<211>18<212>PRT<213>人<400>51Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp1 5 10 15Phe Gly<210>52<211>34<212>PRT<213>人<400>52Glu Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys1 5 10 15Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met20 25 30Asp Phe<210>53<211>35<212>PRT<213>人
<400>53Glu Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys1 5 10 15Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met20 25 30Asp Phe Gly35<210>54<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>胃泌素CCG1-17G<400>54Cys Gly Gly Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly1 5 10 15Trp Met Asp Phe Gly20<210>55<211>9<212>PRT<213>小鼠<400>55Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg1 5<210>56<211>8<212>PRT<213>小鼠<400>56Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe1 5<210>57<211>74<212>PRT<213>人<400>57Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser
1 5 10 15Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu20 25 30Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile35 40 45Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser Gln Leu Arg Ala Asn50 55 60Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg65 70<210>58<211>82<212>PRT<213>小鼠<400>58Cys Gly Ser Gly Gly Asn Leu His Leu Leu Arg Gln Lys Ile Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser Val Pro Lys Lys Cys Cys Tyr Asp20 25 30Gly Ala Arg Val Asn Phe Tyr Glu Thr Cys Glu Glu Arg Val Ala Arg35 40 45Val Thr Ile Gly Pro Leu Cys Ile Arg Ala Phe Asn Glu Cys Cys Thr50 55 60Ile Ala Asn Lys Ile Arg Lys Glu Ser Pro His Lys Pro Val Gln Leu65 70 75 80Gly Arg<210>59<211>20<212>PRT<213>人<400>59Cys Val Val Ala Ser Gln Leu Arg Ala Asn Ile Ser His Lys Asp Met1 5 10 15Gln Leu Gly Arg
20<210>60<211>352<212>PRT<213>人<400>60Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr1 5 10 15Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Leu20 25 30Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn35 40 45Met Leu Val Ile Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Met50 55 60Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Phe Phe Leu65 70 75 80Leu Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe85 90 95Gly Asn Thr Met Cys Gln Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe Ile Gly Phe100 105 110Phe Ser Gly Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu115 120 125Ala Val Val His Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe130 135 140Gly Val Val Thr Ser Val Ile Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser145 150 155 160Leu Pro Gly Ile Ile Phe Thr Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr165 170 175Thr Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn180 185 190Phe Gln Thr Leu Lys Ile Val Ile Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu195 200 205
Val Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys210 215 220Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg Leu Ile Phe Thr Ile225 230 235 240Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Ala Pro Tyr Asn Ile Val Leu Leu245 250 255Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser260 265 270Asn Arg Leu Asp Gln Ala Met Gln Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr275 280 285His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe290 295 300Arg Asn Tyr Leu Leu Val Phe Phe Gln Lys His Ile Ala Lys Arg Phe305 310 315 320Cys Lys Cys Cys Ser Ile Phe Gln Gln Glu Ala Pro Glu Arg Ala Ser325 330 335Ser Val Tyr Thr Arg Ser Thr Gly Glu Gln Glu Ile Ser Val Gly Leu340 345 350<210>61<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>環(huán)狀CCR5 ECL2A<400>61Cys Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr Gly1 5 10<210>62<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CCR5 ECL2A<400>62Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr1 5 10
<210>63<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CCR5 PNt<400>63Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr1 5 10 15Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg20 25 30<210>64<211>352<212>PRT<213>人<400>64Met Glu Gly Ile Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met1 5 10 15Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu20 25 30Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Ser Ile Ile35 40 45Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile Leu Val Met Gly50 55 60Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp Lys Tyr Arg Leu His Leu65 70 75 80Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val85 90 95Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Phe Leu Cys Lys Ala Val100 105 110His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile Leu Ala115 120 125Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Asn Ser130 135 140
Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys Val Val Tyr Val Gly Val145 150 155 160Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe Ile Phe Ala Asn165 170 175Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr Pro Asn180 185 190Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln His Ile Met Val Gly Leu195 200 205Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys Tyr Cys Ile Ile Ile Ser210 215 220Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln Lys Arg Lys Ala Leu Lys Thr225 230 235 240Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr245 250 255Ile Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu Leu Glu Ile Ile Lys Gln260 265 270Gly Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His Lys Trp Ile Ser Ile Thr Glu275 280 285Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe290 295 300Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln His Ala Leu Thr Ser Val305 310 315 320Ser Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly325 330 335His Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu Ser Ser Ser Phe His Ser Ser340 345 350<210>65<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CXCR4 176-185<400>65
Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile1 5 10<210>66<211>39<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CXCR4 1-39<400>66Met Glu Gly Ile Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met1 5 10 15Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu20 25 30Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile35<210>67<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在N末端具有含his和cys的連接體的小鼠TNF<400>67Met Gly Cys Gly Gly Gly His His His His His His Gly Ser Leu Arg1 5 10 15Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala20 25 30Asn His Gln Val Glu Glu Gln Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg Ala Asn35 40 45Ala Leu Leu Ala Asr Gly Met Asp Leu Lys Asp Asn Gln Leu Val Val50 55 60Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly65 70 75 80Gln Gly Cys Pro Asp Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg Phe85 90 95Ala Ile Ser Tyr Gln Glu Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Val Lys Ser
100 105 110Pro Cys Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp Tyr115 120 125Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Gln130 135 140Leu Ser Ala Glu Val Asn Leu Pro Lys Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser145 150 155 160Gly Gln Val Tyr Phe Gly Val Ile Ala Leu165 170<210>68<211>476<212>PRT<213>人<400>68Cys Ser Lys Gly Thr Ser His Glu Ala Gly Ile Val Cys Arg Ile Thr1 5 10 15Lys Pro Ala Leu Leu Val Leu Asn His Glu Thr Ala Lys Val Ile Gln20 25 30Thr Ala Phe Gln Arg Ala Ser Tyr Pro Asp Ile Thr Gly Glu Lys Ala35 40 45Met Met Leu Leu Gly Gln Val Lys Tyr Gly Leu His Asn Ile Gln Ile50 55 60Ser His Leu Ser Ile Ala Ser Ser Gln Val Glu Leu Val Glu Ala Lys65 70 75 80Ser Ile Asp Val Ser Ile Gln Asn Val Ser Val Val Phe Lys Gly Thr85 90 95Leu Lys Tyr Gly Tyr Thr Thr Ala Trp Trp Leu Gly Ile Asp Gln Ser100 105 110Ile Asp Phe Glu Ile Asp Ser Ala Ile Asp Leu Gln Ile Asn Thr Gln115 120 125Leu Thr Cys Asp Ser Gly Arg Val Arg Thr Asp Ala Pro Asp Cys Tyr130 135 140
Leu Ser Phe His Lys Leu Leu Leu His Leu Gln Gly Glu Arg Glu Pro145 150 155 160Gly Trp Ile Lys Gln Leu Phe Thr Asn Phe Ile Ser Phe Thr Leu Lys165 170 175Leu Val Leu Lys Gly Gln Ile Cys Lys Glu Ile Asn Val Ile Ser Asn180 185 190Ile Met Ala Asp Phe Val Gln Thr Arg Ala Ala Ser Ile Leu Ser Asp195 200 205Gly Asp Ile Gly Val Asp Ile Ser Leu Thr Gly Asp Pro Val Ile Thr210 215 220Ala Ser Tyr Leu Glu Ser His His Lys Gly His Phe Ile Tyr Lys Asn225 230 235 240Val Ser Glu Asp Leu Pro Leu Pro Thr Phe Ser Pro Thr Leu Leu Gly245 250 255Asp Ser Arg Met Leu Tyr Phe Trp Phe Ser Glu Arg Val Phe His Ser260 265 270Leu Ala Lys Val Ala Phe Gln Asp Gly Arg Leu Met Leu Ser Leu Met275 280 285Gly Asp Glu Phe Lys Ala Val Leu Glu Thr Trp Gly Phe Asn Thr Asn290 295 300Gln Glu Ile Phe Gln Glu Val Val Gly Gly Phe Pro Ser Gln Ala Gln305 310 315 320Val Thr Val His Cys Leu Lys Met Pro Lys Ile Ser Cys Gln Asn Lys325 330 335Gly Val Val Val Asn Ser Ser Val Met Val Lys Phe Leu Phe Pro Arg340 345 350Pro Asp Gln Gln His Ser Val Ala Tyr Thr Phe Glu Glu Asp Ile Val355 360 365Thr Thr Val Gln Ala Ser Tyr Ser Lys Lys Lys Leu Phe Leu Ser Leu370 375 380Leu Asp Phe Gln Ile Thr Pro Lys Thr Val Ser Asn Leu Thr Glu Ser385 390 395 400
Ser Ser Glu Ser Ile Gln Ser Phe Leu Gln Ser Met Ile Thr Ala Val405 410 415Gly Ile Pro Glu Val Met Ser Arg Leu Glu Val Val Phe Thr Ala Leu420 425 430Met Asn Ser Lys Gly Val Ser Leu Phe Asp Ile Ile Asn Pro Glu Ile435 440 445Ile Thr Arg Asp Gly Phe Leu Leu Leu Gln Met Asp Phe Gly Phe Pro450 455 460Glu His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser465 470 475<210>69<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CETP 461-476<400>69Phe Gly Phe Pro Glu His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser1 5 10 15<210>70<211>82<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CGSGG小鼠C5a<400>70Cys Gly Ser Gly Gly Asn Leu His Leu Leu Arg Gln Lys Ile Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser Val Pro Lys Lys Cys Cys Tyr Asp20 25 30Gly Ala Arg Val Asn Phe Tyr Glu Thr Cys Glu Glu Arg Val Ala Arg35 40 45Val Thr Ile Gly Pro Leu Cys Ile Arg Ala Phe Asn Glu Cys Cys Thr50 55 60Ile Ala Asn Lys Ile Arg Lys Glu Ser Pro His Lys Pro Val Gln Leu
65 70 75 80Gly Arg<210>71<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CGG小鼠C5a59-77<400>71Cys Gly Gly Thr Ile Ala Asn Lys Ile Arg Lys Glu Ser Pro His Lys1 5 10 15Pro Val Gln Leu Gly Arg20<210>72<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>G17(1-9)C2<400>72Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys1 5 10 15<210>73<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>clG17<400>73Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp1 5 10 15Phe Gly Gly Cys20<210>74<211>20<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>nGl7amide<220>
<221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>F被酰胺化<400>74Cys Gly Gly Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly1 5 10 15Trp Met Asp Phe20<210>75<211>37<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>nG34amide<400>75Cys Gly Gly Gln Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp1 5 10 15Pro Ser Lys Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr20 25 30Gly Trp Met Asp Phe35<210>76<211>38<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>nG34-G<400>76Cys Gly Gly Gln Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp1 5 10 15Pro Ser Lys Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr20 25 30Gly Trp Met Asp Phe Gly35
<210>77<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人生長(zhǎng)素釋放肽1-6<400>77Gly Ser Ser Phe Leu Ser1 5<210>78<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人生長(zhǎng)素釋放肽1-7<400>78Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro1 5<210>79<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人生長(zhǎng)素釋放肽1-8<400>79Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu1 5<210>80<211>10<212>PRT<213>人<400>80Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg1 5 10<210>81<211>9<212>PRT<213>人<400>81
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe1 5<210>82<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人生長(zhǎng)素釋放肽1-14<400>82Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln1 5 10<210>83<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>狗生長(zhǎng)素釋放肽1-13<400>83Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln1 5 10<210>84<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>貓生長(zhǎng)素釋放肽1-13<400>84Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln1 5 10<210>85<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人生長(zhǎng)素釋放肽1-10<400>85Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln1 5 10
<210>86<211>42<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人Ab 1-42<400>86Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210>87<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人Ab1-6<400>87Asp Ala Glu Phe Arg His1 5<210>88<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人TNF 4-23<400>88Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn1 5 10 15Pro Gln Ala Glu20<210>89<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>小鼠TNF 4-23
<400>89Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn1 5 10 15His Gln Val Glu20<210>90<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>小鼠TNF 22-32<400>90Val Glu Glu Gln Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg1 5 10<210>91<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人TNF 22-32<400>91Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg1 5 10<210>92<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>AP205間隔區(qū)1<400>92Gly Ser Gly Gly1<210>93<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>AP205間隔區(qū)2
<400>93Gly Ser Gly1<210>94<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>AP205間隔區(qū)3<400>94Gly Thr Ala Gly Gly Gly Ser Gly1 5<210>95<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>AP205間隔區(qū)4<400>95Gly Ser Gly Thr Ala Gly Gly Gly Ser Gly Ser1 5 10<210>96<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>連接體1<400>96Cys Gly Gly1<210>97<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>gamma連接體1<400>97Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro1 5 10
<210>98<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N末端甘氨酸連接體<400>98Gly Cys Gly Gly Gly Gly1 5<210>99<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端甘氨酸絲氨酸連接體<400>99Cys Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>100<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GCGSGGGGS連接體<400>100Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>101<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-末端gamma 1連接體<400>101Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly1 5 10<210>102<211>18<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>C末端gamma連接體3<400>102Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly1 5 10 15Cys Gly<210>103<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C末端甘氨酸連接體<400>103Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5<210>104<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C末端甘氨酸絲氨酸連接體<400>104Ser Gly Gly Gly Gly Cys1 5<210>105<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GSGGGGSGCG連接體<400>105Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly1 5 10<210>106<211>6<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>甘氨酸賴氨酸連接體<400>106Gly Gly Lys Lys Gly Cys1 5<210>107<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>甘氨酸賴氨酸連接體2<400>107Cys Gly Lys Lys Gly Gly1 5<210>108<211>14<212>PRT<213>人<400>108Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu Val Ile His Asn1 5 10<210>109<211>10<212>PRT<213>人<400>109Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu1 5 10<210>110<211>8<212>PRT<213>人<400>110Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe1 5<210>111<211>11<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>CGGDRVYIHPF<400>111Cys Gly Gly Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe1 5 10<210>112<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CGGDRVYIHPFHL<400>112Cys Gly Gly Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu1 5 10<210>113<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>DRVYIHPFHLGGC<400>113Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu Gly Gly Cys1 5 10<210>114<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDRVYIHPFHL<400>114Cys Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu1 5 10<210>115<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CHPFHL<400>115
Cys His Pro Phe His Leu1 5<210>116<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CGPFHL<400>116Cys Gly Pro Phe His Leu1 5<210>117<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CYIHPF<400>117Cys Tyr Ile His Pro Phe1 5<210>118<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CGIHPF<400>118Cys Gly Ile His Pro Phe1 5<210>119<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CGGHPF<400>119Cys Gly Gly His Pro Phe1 5<210>120
<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>DRVYIGGC<400>120Asp Arg Val Tyr Ile Gly Gly Cys1 5<210>121<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>DRVYGGC<400>121Asp Arg Val Tyr Gly Gly Cys1 5<210>122<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>DRVGGC<400>122Asp Arg Val Gly Gly Cys1 權(quán)利要求
1.一種組合物，包含(a)一種病毒樣顆粒(VLP)，其包含RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段，其中所述VLP具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)，其中所述VLP是由宿主重組產(chǎn)生的，并且其中所述VLP包含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的所述宿主RNA的量最多為所述VLP原來(lái)所含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA的量的20％；(b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原(b)與所述VLP(a)通過(guò)所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接。
2.一種組合物，包含(a)一種病毒樣顆粒(VLP)，其包含RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段，其中所述VLP具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)，其中所述VLP是由宿主重組產(chǎn)生的，并且所述VLP基本不含宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸；(b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原(b)與所述VLP(a)通過(guò)所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接。
3.權(quán)利要求2或3的組合物，還包含與所述VLP結(jié)合的至少一種聚陰離子大分子，優(yōu)選地所述聚陰離子大分子被包裝在所述VLP內(nèi)。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述聚陰離子大分子的分子量為10,000到100,000道爾頓。
5.權(quán)利要求3或權(quán)利要求4的組合物，其中所述聚陰離子大分子選自(a)聚陰離子多肽；(b)聚陰離子糖；(c)聚陰離子有機(jī)聚合物；和(d)核酸，其中所述核酸不是toll-樣受體配體。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述核酸是tRNA。
7.權(quán)利要求5的組合物，其中所述聚陰離子多肽選自(a)聚谷氨酸；(b)聚天冬氨酸；(c)聚(GluAsp)；和(d)(a)-(c)的任意化學(xué)修飾物。
8.權(quán)利要求3或4的組合物，其中所述聚陰離子大分子是聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸，其中優(yōu)選地所述聚陰離子大分子是聚谷氨酸。
9.權(quán)利要求5的組合物，其中所述聚陰離子糖選自(a)陰離子葡聚糖；(b)磷酸纖維素；(c)聚葡萄糖醛酸；(d)聚半乳糖醛酸；(e)聚唾液酸；(f)透明質(zhì)酸；和(g)糖胺聚糖。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述陰離子葡聚糖選自(a)硫酸葡聚糖；(b)羧甲基葡聚糖；(c)磺丙基葡聚糖；(d)磺酸甲酯葡聚糖；和(e)磷酸葡聚糖。
11.權(quán)利要求9的組合物，其中所述糖胺聚糖選自(a)肝素；(b)硫酸乙酰肝素；(c)硫酸皮膚素；(d)硫酸軟骨素；和(e)硫酸角質(zhì)素。
12.權(quán)利要求5的組合物，其中所述聚陰離子有機(jī)聚合物選自(a)聚乙烯硫酸酯；和(b)聚丙烯酸酯。
13.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的組合物，其中所述RNA-噬菌體選自(a)噬菌體Qβ；(b)噬菌體R17；(c)噬菌體fr；(d)噬菌體GA；(e)噬菌體SP；(f)噬菌體MS2；(g)噬菌體M11；(h)噬菌體MX1；(i)噬菌體NL95；(j)噬菌體f2；(k)噬菌體PP7；和(l)噬菌體AP205。
14.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的組合物，其中所述VLP包含RNA-噬菌體Qβ、fr、AP205或GA的外殼蛋白，和/或其突變體，和/或其片段。
15.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的組合物，其中所述第一附著位點(diǎn)與所述第二附著位點(diǎn)通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵連接，優(yōu)選通過(guò)至少一個(gè)非肽共價(jià)鍵連接。
16.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的組合物，其中所述第一附著位點(diǎn)包含氨基，優(yōu)選賴氨酸的氨基。
17.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的組合物，其中所述第二附著位點(diǎn)包含巰基，優(yōu)選半胱氨酸的巰基。
18.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的組合物，其中所述第一附著位點(diǎn)包含賴氨酸的氨基，并且所述第二附著位點(diǎn)包含半胱氨酸的巰基。
19.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的組合物，還包含連接體。
20.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的組合物，其中所述至少一種抗原選自(a)多肽；(b)碳水化合物；(c)類固醇激素；(d)有機(jī)分子；和(e)半抗原。
21.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的組合物，其中所述至少一種抗原是自身抗原，或其片段，或其變體。
22.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的組合物，其中所述抗原選自(a)淋巴毒素(優(yōu)選淋巴毒素α(LTα)，淋巴毒素β(LTβ))；(b)淋巴毒素受體；(c)核因子kB配體的受體激活物(RANKL)；(d)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；(e)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGF-R)；(f)白介素-5；(g)白介素-17；(h)白介素-13；(i)IL-23 p19；(j)生長(zhǎng)素釋放肽；(k)CCL21；(l)CXCL12；(m)SDF-1；(n)M-CSF；(o)MCP-1；(p)Endoglin；(q)GnRH；(r)TRH；(s)嗜酸細(xì)胞活化趨化因子；(t)緩激肽；(u)BLC；(v)腫瘤壞死因子α；(w)淀粉樣β肽(Aβ1-42)；(x)Aβ1-6；(y)血管緊張肽；(z)胃泌素和/或前胃泌素；(aa)CETP；(bb)CCR5；(cc)C5a；(dd)CXCR4；(ee)Des-Arg-緩激肽；(ff)GnRH肽；(gg)血管緊張肽；(hh)TNF-肽；(ii)上述抗原(a)至(hh)的片段；和(jj)上述抗原(a)至(hh)的變體。
23.一種包含前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的組合物的疫苗組合物。
24.權(quán)利要求23的疫苗組合物，其中所述疫苗不含佐劑。
25.權(quán)利要求23的疫苗組合物，還包含至少一種佐劑。
26.一種分別制備本發(fā)明的組合物和RNA-噬菌體的VLP-抗原偶聯(lián)物的方法，包括以下步驟(a)由宿主重組產(chǎn)生具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒(VLP)，其中所述VLP包含RNA-噬菌體的外殼蛋白，其突變體或片段；(b)將所述病毒樣顆粒解裝配為所述RNA-噬菌體的所述外殼蛋白、其突變體或片段；(c)純化所述外殼蛋白、其突變體或片段；(d)將所述純化的所述RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段重裝配為病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆?；静缓拗鱎NA，優(yōu)選宿主核酸；和(e)將具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原與步驟(d)獲得的所述VLP進(jìn)行連接。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述純化的外殼蛋白的所述重裝配在至少一種聚陰離子大分子的存在下實(shí)現(xiàn)。
28.一種制備RNA-噬菌體的VLP-抗原偶聯(lián)物的方法，包括以下步驟(a)由宿主重組產(chǎn)生一種病毒樣顆粒(VLP)，其中所述VLP包含含有RNA-噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段和至少一種抗原的融合蛋白；(b)將所述VLP解裝配為所述融合蛋白；(c)純化所述融合蛋白；(d)將所述純化的融合蛋白重裝配為VLP，其中所述病毒樣顆?；静缓拗鱎NA，優(yōu)選宿主核酸。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述純化的外殼蛋白的所述重裝配在至少一種聚陰離子大分子的存在下實(shí)現(xiàn)。
30.權(quán)利要求28或權(quán)利要求29的方法，其中所述VLP是RNA噬菌體AP205的VLP。
31.一種免疫方法，包括向動(dòng)物或人施用權(quán)利要求23-25中任意一項(xiàng)的疫苗組合物。
32.權(quán)利要求1-22中任意一項(xiàng)的組合物或權(quán)利要求23-25中任意一項(xiàng)的疫苗組合物在制備治療疾病的藥物中的用途，其中所述疾病優(yōu)選地是炎性疾病和/或慢性自身免疫病。
33.一種治療疾病的方法，包括向動(dòng)物或人施用權(quán)利要求1-22中任意一項(xiàng)的組合物或權(quán)利要求23-25中任意一項(xiàng)的疫苗組合物，其中所述疾病優(yōu)選地是炎性疾病和/或慢性自身免疫病。
34.一種藥物組合物，含有(a)權(quán)利要求1-22中任意一項(xiàng)的組合物；和(b)一種可接受的藥物載體。
35.一種可以通過(guò)權(quán)利要求26-30中任意一項(xiàng)的方法獲得的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供一種包含RNA噬菌體的病毒樣顆粒(VLP)和至少一種抗原的組合物，其中所述VLP是在宿主中重組產(chǎn)生的，并且其中所述VLP所包含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA的量最多為所述VLP原來(lái)所包含的具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的宿主RNA量的20％；并且其中所述VLP和至少一種抗原彼此連接。而且，本發(fā)明的組合物特別可用于有效誘導(dǎo)針對(duì)特定環(huán)境內(nèi)的抗原的強(qiáng)抗體應(yīng)答，同時(shí)降低或消除不希望的T細(xì)胞應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61K39/39GK101052411SQ200580032183
公開日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2005年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月5日
發(fā)明者M·巴克曼, P·毛雷爾, E·米杰林克, K·普羅巴, K·施瓦茨 申請(qǐng)人:賽托斯生物技術(shù)公司