專利名稱：來自于真菌的免疫調(diào)節(jié)組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫調(diào)節(jié)組合物，所述組合物含有可以從真菌的液體培養(yǎng)物中分離出來的多糖。
背景技術(shù)：
眾所周知，來自真菌和酵母菌的葡聚糖能夠促進(jìn)健康。由于“香菇”真菌(Lentinus edodes)具有這種功效，其可以開發(fā)用于多種醫(yī)藥目的，如免疫刺激、抗病毒、抗腫瘤等。對(duì)香菇多糖的研究結(jié)果已經(jīng)表明它從多種途徑刺激宿主的免疫系統(tǒng)，例如活化輔助性T細(xì)胞，增強(qiáng)白細(xì)胞介素1以及白細(xì)胞介素2的產(chǎn)生，增強(qiáng)針對(duì)多種形式的癌的抗體的產(chǎn)生，以及降低血液中膽固醇水平。(Herbs for Health，jan/feb，1997；K.Jones，″ShiitakeMedicine in a mushroom″，p.40-50，54；Anticancer Res，Vol.17(4A)，1997；H.Matsouka，″Lentinan potentiates immunity and prolongs the survival timeof some patients″，p.2751-2755；Adv Appl Microbiol，Vol.39，1993；S.C.Jong，″Medicinal and therapeutic value of theshiitake mushroom″，p.153-184，Int J Immunopharmacol，Vol.14，1992；K.Irinoda，″Stimulation of microbiocidal host defencemechanism against aerosol influenza virus infection bylentinan，p.971-977.，Jpn J Cancer Res，Vol.76(1)，1985；D.Herlyn，″Monoclonal antibody-dependent murine macrophage-mediated cytotoxicity against human tumors is stimulated bylentinan，p.37-42)。
香菇的一個(gè)活性成分名為香菇多糖，是一種基于以β-(1，3)葡聚糖為骨架、帶有β-(1，6)側(cè)鏈的化合物的多糖。
″固體狀態(tài)″反應(yīng)器通常用于培養(yǎng)真菌，例如香菇。這一技術(shù)用于多種目的，如堆肥，生產(chǎn)生物制品，如酶、醬油、醋酸等。為了生產(chǎn)香菇多糖，可以將香菇培養(yǎng)在以樹干或木片的方式提供的適宜的固體基質(zhì)上，所述的基質(zhì)上經(jīng)常添加化學(xué)性化合物以促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)和子實(shí)體發(fā)育，大部分香菇多糖位于此處。子實(shí)體可以人工采收或機(jī)械采收，然后干燥研磨成粉末狀，可以直接使用，也可以制成片劑使用，或用于進(jìn)一步加工，例如提取香菇多糖。
由香菇制備的多糖產(chǎn)品作為″用于注射的香菇多糖″是商業(yè)上可以得到的(Eureka Bio-Chemicals Pty，澳大利亞)。該產(chǎn)品具有一些免疫刺激效果(請(qǐng)參見下文實(shí)施例)。
專利WO03/020944描述了多種從真菌純化細(xì)胞外免疫刺激組合物的方法，通常這些方法中都包含沉淀步驟。
不過，尚未公開具有高的免疫刺激性活性的組合物。因此本發(fā)明的目的是提供新型組合物，優(yōu)選來自具有高免疫調(diào)節(jié)活性的真菌的細(xì)胞外免疫刺激劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了含有具有顯著免疫調(diào)節(jié)活性的多糖的組合物。有趣的是本發(fā)明公開了多糖組合物的特定單糖成分對(duì)于免疫調(diào)節(jié)活性非常重要。
因此本發(fā)明的一個(gè)目的是提供含有一種或多種多肽和多糖混合物的組合物，其中，組合物中的大部分多糖優(yōu)選每個(gè)多糖的分子量至少為10000Da，且其中所述多糖混合物含有單糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例為(0-1.5)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(45-55)，優(yōu)選比例為1∶0～25∶1～50，例如比例為∶1∶0～25∶1～50。
另一種實(shí)施方式是組合物含有一種或多種多肽和多糖混合物，其中a)組合物中大部分多糖的分子量至少為30000Da，并且，其中所述的多糖混合物含有單糖半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50，或b)組合物中大部分多糖的分子量至少為100000Da，并且，其中所述的多糖混合物含有單糖半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是0～0.5∶0.5～10∶0.5～50，或c)組合物中大部分多糖的分子量至少為1000Da，并且，其中所述的多糖混合物含有單糖半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供生產(chǎn)所述組合物的方法，所述方法包括下列步驟i)在液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌，ii)從所述液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中純化所述組合物。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供用作藥物的藥物組合物，其中含有上述組合物以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供治療個(gè)體的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體有效量的本發(fā)明的組合物的步驟。
本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供本發(fā)明的組合物在制備用于治療或者預(yù)防性治療有此需要的個(gè)體的免疫受損性疾病的藥物中的應(yīng)用。
定義多糖本文中的“多糖”包括多糖，含有和/或共價(jià)地連接于肽、多肽或類似物質(zhì)的多糖，例如蛋白多糖。
含有單糖的多糖多糖被稱為含有單糖，其中所述的單糖共價(jià)地連接以形成多糖。多糖水解形成游離形式的形成所述多糖的單糖。多糖的單糖成分因而可以通過水解多糖和測(cè)定單獨(dú)單糖的存在來確定。多糖混合物中的單糖成分通過檢測(cè)全部多糖混合物中的單糖成分而確定。
比例多糖或多糖混合物被稱為含有具有指定比例的半乳糖、甘露糖和葡萄糖，指的是當(dāng)水解所述多糖或多糖混合物時(shí)會(huì)產(chǎn)生指定比例的半乳糖、甘露糖和葡萄糖。半乳糖、甘露糖和葡萄糖的比例為1∶a～b∶c～d的含義是對(duì)于每份半乳糖，含甘露糖在a～b份的范圍，含葡萄糖在c～d份的范圍，因此a，b，c和d代表數(shù)量值。因此，例如，多糖混合物含有半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是1∶5～25∶1～50指的是對(duì)于每份半乳糖，該多糖混合物含5～25份范圍的甘露糖，和1～50份范圍的葡萄糖。
分子量組合物中每種多糖被稱為具有至少一種指定數(shù)值的分子量。當(dāng)上述組合物通過過濾方式進(jìn)行純化時(shí)，最終指定數(shù)值的分子量被截留。類似的，組合物中每個(gè)多糖被稱為具有在指定范圍內(nèi)的分子量，當(dāng)所述組合物經(jīng)過一步或多步過濾純化步驟時(shí)，最終截留低值范圍的低分子量物質(zhì)和高值范圍的高分子量物質(zhì)。上述過濾步驟可以例如是超濾、和同孔過濾、超速離心或凝膠過濾方式。但是，對(duì)于其中每個(gè)多糖都有最低指定分子量或每個(gè)多糖都被稱為具有指定分子量范圍的組合物，也可以通過其它方式制備。
多肽此處所用的術(shù)語“多肽”包括蛋白質(zhì)、肽和多肽。其中，所述的蛋白質(zhì)、肽或多肽可以也可以不經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后修飾。轉(zhuǎn)錄后修飾可以是例如磷酸化、甲基化或糖基化。
發(fā)明詳述組合物本發(fā)明的組合物含有一種或多種多肽和多糖混合物。所述多肽可以任選地共價(jià)地與多糖連接。不過，所述的多肽或者不與所述多糖結(jié)合、或者以非共價(jià)鍵形式與所述多糖結(jié)合的情況也包括在本發(fā)明中。
因此，組合物含有可以是蛋白多糖、也可以不是蛋白多糖的多糖，或者該組合物可以含有二者的混合物。
本發(fā)明的組合物是分離或純化的組合物，即它們經(jīng)過一步或多步的純化步驟。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，它們通過使用包括按大小分級(jí)的至少一個(gè)步驟從真菌菌絲體的液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中純化出來。下面詳細(xì)介紹純化方法。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該組合物基本上由多糖和任選的多肽組成，更優(yōu)選該組合物基本上由多糖和多肽組成。經(jīng)常地，該組合物為液體組合物，因此優(yōu)選該組合物基本由多糖和溶解在任選的含有鹽和緩沖液的水溶液中的任選的多肽組成。
本發(fā)明的組合物的多糖優(yōu)選含有單糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖?？梢园ㄔ诒景l(fā)明的組合物中的多糖和多肽的例子包括但不限于β-(1，3)，β-(1，6)D-葡聚糖，裂殖菌多糖(schizophyllan)，灰樹花多糖(grifolan)，云芝多糖(coriolan)和雜色革蓋菌糖基化多肽(Coriolus versicolor glycosylated polypeptides)(例如PSK和PSP)，與α-甘露聚糖結(jié)合的多肽(例如KS-2)(其可以通過從香菇(Lentinus edodes)中分離得到)，和靈芝多糖(reishi)(其可以從靈芝(Ganoderma lucidum)中分離得到)，葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖；甘露-葡聚糖；葡甘露聚糖；半乳糖葡聚糖和/或半乳糖葡萄糖甘露聚糖。
真菌在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物是通過真菌生成的。優(yōu)選地，組合物從真菌細(xì)胞外環(huán)境純化得到。更優(yōu)選的是真菌，最好是真菌菌絲體，培養(yǎng)在液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，然后從液體培養(yǎng)基中純化得到上述組合物。
因此優(yōu)選通過下述方法制備本發(fā)明的組合物，所述方法包括以下步驟i) 在液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌，例如真菌菌絲體，和
ii)從所述液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分離組合物。
真菌菌絲體可以是任何真菌生物質(zhì)，其能在深層培養(yǎng)中生長(zhǎng)。該真菌生物質(zhì)可以是單個(gè)菌絲、孢子、菌絲體的集合、以及部分分化的菌絲體的形式。
液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以是任何以下描述的液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
真菌可以是任何真菌，優(yōu)選形成真菌菌絲的、更優(yōu)選絲狀真菌、更加優(yōu)選的是選自下述的真菌雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)，冬蟲夏草(Cordiceps sinensis)，金針菇(Flammulina velutipes)，靈芝(Ganoderma lucidum)，多葉奇果菌(Grifola frondosa)，香菇(Lentinus edodes)，糙皮側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)，裂褶菌(Schizophyllum commune)，核盤菌(Sclerotina sclerotium)，白腐擔(dān)子菌(Trametes(Coriolus)versicolor，采絨革蓋菌)，銀耳(Tremella fuciformis)，姬松茸(Agaricus blazei)，茶樹菇(Agrocybe aegerita)，柱狀田頭菇(Agrocybe cylindracea)，地花菌(Albatrellus confluens)，蜜環(huán)菌(Armillariella mellea)，木耳(Auricularia auricular-judae)，毛木耳(Auriculariapolytricha)，Collybia maracula，蛹蟲草(Cordiceps militari)，Dendropolyporus umbellatus，木蹄層孔菌(Fomes fomentarius)，松生層孔菌(Fomes pinicola)，平蓋靈芝(Ganoderma applanatum)，鐵杉靈芝(Ganoderma tsμgae)，猴頭(Hericium erinaceus)，玉蕈(Hypsizygus marmoreus)，樺褐纖孔菌(Inonotus obliquus)，硫色絢孔菌(Laetiporus sulphurous)，樺革裥菌(Lenzites betulinus)，大白樁菇(Leucopaxilllus giganteus)，灰離褶傘(Lyophyllumcinerascens)，外溶亞臍菇(Omphaina epichysium)，霉?fàn)钚W德蘑(Oudemansiella mucida)，晚生扇菇(Panellus serotinus)，樺滴孔菌(Piptoporus betulinus)，裂蹄木層孔菌(Phellinus linteus)，松木層孔菌(Phellinus pini)，光帽鱗傘(Pholiota nameko)，金頂側(cè)耳(Pleurotus citrinopileatus)，肺形側(cè)耳(Pleurotuspulmonarius)，Sarcedon asparatus，香栓菌(Trametes suavolens)，草菇(Volvariella volvacea)和茯苓(Wolfiporia cocos)。
然而更優(yōu)選的，真菌是從以下品種選出的雙孢蘑菇，冬蟲夏草，金針菇，靈芝，多葉奇果菌，香菇，糙皮側(cè)耳，裂褶菌，核盤菌，白腐擔(dān)子菌(采絨革蓋菌)和銀耳。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述真菌是姬松茸(Agaricus blazei)；在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述真菌屬于靈芝屬，例如靈芝；在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述真菌是傘狀真菌，例如選自A.blazei，A.blazei Murill，A.bisporus，A.hortensis，A.campestris。
在非常優(yōu)選的本發(fā)明的實(shí)施例中，所述真菌屬于擔(dān)子菌類，例如香菇屬真菌，如香菇。
在比利時(shí)微生物保藏協(xié)調(diào)中心(BCCM)保藏的香菇IHEM 18992(14Rue J.Wytsman，B-1050 Bruxelles，比利時(shí))提供了一種香菇的優(yōu)選菌株，其它可用的香菇可以從下列機(jī)構(gòu)獲得，例如ATCC(AmericanType Culture Collection，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)，CBC(Centraalbureau voor Schimmelcultures，PO Box 85167，3508 AD Utrecht，THE NETHERLANDS)和DSMZ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig GERMANY)。
另外有關(guān)的香菇屬物種，除香菇(Lentinus edodes)外，香菇種類還包括Lentinus albovelutinus G.Stev.(1964)＝Rhodocybealbovelutina(G.Stev.)E.Horak(1971)；Lentinus anthocepha lus(Lév.)Pegler；Lentinus badius Bres.；Lentinus castoreus Fr.(1838)＝北方小香菇(Lentinellus ursinus)(Fr.)Kühner(1926)；Lentinus chrysopeplus Berk.&M.A.Curtis(1869)＝Cyptotramaasprata(Berk.)Redhead & Ginns(1980)；Lentinus cochleatus Fr.；Lentinus concinnus Pat；Lentinus delicatus G.Stev.(1964)＝Marasmius delicatus(G.Stev.)E.Horak(1971)；Lentinusfasciatus Berk.；Lentinus hepatotrichus Berk.(1859)＝北方小香菇(Fr.)Kühner(1926)；Lentinus hyracinus Kalchbr.(1880)＝北方小香菇(Fr.)Kühner(1926)；潔麗香菇(Lentinuslepideus)sensu Colenso(1891)；潔麗香菇(Fr.)Fr.(1825)＝Lentinus suffrutescens (Brot.)Fr.(1825)；Lentinusnovaezelandiae Berk.(1855)＝Lentinellus ursinus(Fr.)Kühner(1926)；Lentinus pulvinulus Berk.(1859)＝Lentinelluspulvinulus(Berk.)Pegler(1965)；Lentinus punctaticeps Berk.& Broome(1883)；Lentinus punctaticeps cf.sensu Petersen，Nicholl & Hμghes(1997)；Lentinus pygmaeus Colenso(1887)＝Lentinus zelandicus Sacc.& Cub.(1887)；Lentinus sajor-caju(Fr.)Fr.；Lentinus squarrulosus Mont.；Lentinus strigosus(Schwein.)Fr.(1825)；Lentinus suffrutescens(Brot.)Fr.(1825)；and Lentinus tuber-regium Fr.；Lentinus zelandicus Sacc.& Cub.(1887)(參考http://nzfungi. landcareresearch.co.nz).
免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)本發(fā)明的組合物優(yōu)選用于免疫調(diào)節(jié)，優(yōu)選該組合物用于刺激免疫。例如通過增加抗體的產(chǎn)生或者通過輔助T細(xì)胞的激活，或通過白細(xì)胞介素如白細(xì)胞介素1和白細(xì)胞介素2的產(chǎn)量表現(xiàn)對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何適用于檢測(cè)組合物是否具有免疫調(diào)節(jié)性的測(cè)試都可以用于檢測(cè)本發(fā)明中的組合物是否具有免疫調(diào)節(jié)性。這些測(cè)試可以是體內(nèi)或體外測(cè)試。
一種優(yōu)選的測(cè)試是檢測(cè)該組合物是否能誘導(dǎo)IL-1的產(chǎn)生，如IL1-α和/或IL1-β的產(chǎn)生。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物能夠通過體外試驗(yàn)從至少-種IL-1產(chǎn)生細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1。該細(xì)胞可以是任何IL-1產(chǎn)生細(xì)胞，例如P388小鼠巨噬細(xì)胞，優(yōu)選的所述的細(xì)胞是IL-1β產(chǎn)生細(xì)胞。IL-1的產(chǎn)量可以采用任何適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)。通常使用特定的IL-1抗體，如特定的IL1-α和/或IL1-β抗體都適用。這些檢測(cè)可以是例如Western印跡，ELISA或其它類似的檢測(cè)，檢測(cè)可以通過實(shí)施例4所述的步驟進(jìn)行。
因?yàn)殡y以校準(zhǔn)白介素1的檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)最好使用一個(gè)特定具體的組合物作參考。因此在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述組合物能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL1-α應(yīng)該比用市售香菇注射劑(Eureka Bio-ChemicalsPty，Little Collins Street.Melbourne 3000，澳大利亞)在平行條件下進(jìn)行的參考試驗(yàn)誘導(dǎo)的IL1-α的量多至少1.5倍，優(yōu)選是至少2倍，例如至少4倍，例如至少6倍，例如至少8倍，例如至少10倍，例如至少15倍，例如至少20倍，例如至少30倍，例如至少40倍。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，該組合物能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL1-β應(yīng)該比用市售香菇注射劑(Eureka Biochemicals Pty)在平行條件下進(jìn)行的參考試驗(yàn)誘導(dǎo)的IL1-β的量多至少1.5倍，優(yōu)選至少2倍，例如至少4倍，例如至少6倍，例如至少8倍，例如至少10倍，例如至少15倍，例如至少20倍。優(yōu)選地，上述試驗(yàn)按照實(shí)施例4所述的進(jìn)行，最優(yōu)選的是所述組合物如以上所述的誘導(dǎo)IL1-α和IL1-β二者的產(chǎn)生。
在本發(fā)明的另外的實(shí)施方式中，當(dāng)給予所述哺乳動(dòng)物時(shí)，所述組合物能夠提高在哺乳動(dòng)物中的抗體產(chǎn)生。哺乳動(dòng)物可以是例如小鼠，大鼠，兔子甚至人。優(yōu)選這樣的檢測(cè)通過在給予抗原(或者在佐劑的存在下)之前或同時(shí)向哺乳動(dòng)物給予該組合物來進(jìn)行。優(yōu)選地，在給予抗原之前的1～30天范圍，優(yōu)選1～10天的范圍，更優(yōu)選1～3天的范圍給予組合物。隨后可以確定抗體在哺乳動(dòng)物內(nèi)的產(chǎn)生。與沒有給予該組合物所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體量相比，該組合物優(yōu)選能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生至少1.5倍，更優(yōu)選至少2倍，甚至更優(yōu)選至少是2.5倍，例如3倍，例如至少4倍，例如6倍多的抗體。這樣的試驗(yàn)的例子請(qǐng)參見實(shí)施例6。
優(yōu)選該組合物在1個(gè)以上的檢測(cè)系統(tǒng)中具有免疫調(diào)節(jié)性，例如上述任何檢測(cè)系統(tǒng)的組合。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物的作用能提高TNF-α的產(chǎn)生，這可以通過實(shí)施例9所述的試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。
單糖成分本發(fā)明的組合物優(yōu)選包括多糖，其中大部分的多糖，優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％，甚至更優(yōu)選80％，當(dāng)然更優(yōu)選至少90％，甚至更優(yōu)選95％，當(dāng)然更優(yōu)選基本上所有的多糖，最優(yōu)選每個(gè)多糖的分子量大于10000Da，優(yōu)選大于30000Da，更優(yōu)選大于40000Da，甚至更優(yōu)選大于50000Da，例如至少100000Da，例如至少300000Da，例如至少1000000Da。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，組合物的大部分的多糖，優(yōu)選每個(gè)多糖的分子量在10000～3000000Da之間，例如30000～3000000之間，例如40000～3000000之間，例如50000～3000000之間，例如50000～100000之間，例如100000～300000的范圍，例如300000～1000000的范圍，例如1000000～3000000的范圍。
優(yōu)選地，該組合物通過涉及至少一個(gè)按大小分級(jí)的步驟進(jìn)行純化。因此優(yōu)選，該組合物是經(jīng)過至少一次分離步驟純化的，其中，一些分子量高于截留(cut off)分子量的多糖與那些分子量低于截留分子量的多糖得到分離。例如，如果用超濾法或微孔過濾法進(jìn)行分離，應(yīng)使用與截留分子量相同的過濾膜；如果用凝膠過濾法，應(yīng)使用與截留分子量相同的凝膠或使用某特定洗脫部分。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，使用大分子量的級(jí)分，其中，截留分子量?jī)?yōu)選為10000Da，更優(yōu)選是30000Da，甚至更優(yōu)選是40000Da，當(dāng)然更優(yōu)選是50000Da。
在本發(fā)明的其他的實(shí)施方式中，組合物已經(jīng)通過含有一個(gè)或多個(gè)大小分級(jí)的步驟純化后，其中最終得到的級(jí)分含有分子量高于截留分子量的多糖和分子量低于截留分子量的多糖。例如，如果大小級(jí)分是通過超濾或微孔過濾，第一個(gè)級(jí)分步驟可以使用具有較低截留分子量的濾膜進(jìn)行，可以收集大分子量片段并使之進(jìn)行用具有較高的截留分子量的濾膜進(jìn)行超濾或微孔過濾。在第二次分級(jí)步驟后，可以收集具有較低分子量的級(jí)分。如果用凝膠過濾，可以使用特定的洗脫級(jí)分；如果用超速離心法，可以使用具有較低截留分子量的濾膜和具有較高截留分子量的濾膜。
本發(fā)明的組合物含有多糖混合物，其中，所述的混合物含有單糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，比例為1∶5～25∶1～50。這個(gè)比例反映了在全部多糖混合物中的比例。因此，在混合物中的每個(gè)多糖中含有不同比例的單糖是可行的。
通常，比例測(cè)定是通過將全部多糖混合物降解成單糖，然后確定每種所述單糖的濃度而確定的。多糖可以通過水解，例如強(qiáng)酸水解，比如用HCl降解成它們的組成單糖，本領(lǐng)域人員可以利用能采用的常規(guī)方法分析水解產(chǎn)物，例如HPLC，質(zhì)譜法或NMR。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，多糖含有單糖葡萄糖和甘露糖。在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多糖含有單糖葡萄糖和半乳糖。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物的多糖含有單糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖。
優(yōu)選的多糖組合物中含有在5～25范圍內(nèi)，優(yōu)選在5～20范圍，更優(yōu)選在5～17范圍，甚至更優(yōu)選在6～15范圍，當(dāng)然更優(yōu)選在7～14，例如10～17的范圍，例如11～16的范圍，諸如12～15的范圍，例如13～14的范圍，諸如大約13.4+/-0.4，例如13.4+/-0.4份甘露糖，對(duì)應(yīng)于每份葡萄糖。
優(yōu)選的多糖組合物中含有在1～50范圍，優(yōu)選在1～40范圍，更優(yōu)選在1～30范圍，甚至更優(yōu)選在1～25范圍，當(dāng)然更優(yōu)選在1～20范圍，甚至更優(yōu)選在2～15，當(dāng)然更優(yōu)選在2～14，例如8～17的范圍，例如9～16的范圍，例如10～15的范圍，例如在11～14的范圍，例如大約12.6+/-1.3，例如12.6+/-1.3份的葡萄糖，對(duì)應(yīng)于每份半乳糖。
在更優(yōu)選的多糖混合物中，含有的甘露糖和葡萄糖的比例如上所述，含有葡萄糖和半乳糖的比例如上所述。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，其中多糖包含甘露糖和葡萄糖，并且含有它們的范圍優(yōu)選為0.1～30，例如在0.1～0.25的范圍，例如在0.25～0.5的范圍，例如在0.5～0.75的范圍，例如在0.75～1的范圍，諸如1～5的范圍，例如5～10的范圍，10～20的范圍，例如20～30范圍份的葡萄糖，對(duì)應(yīng)于每份甘露糖。優(yōu)選地，多糖含有0.5～2份葡萄糖，對(duì)應(yīng)于每份甘露糖，更優(yōu)選地，13.4+/-0.4份甘露糖，對(duì)應(yīng)于12.6+/--1.3份葡萄糖。
本發(fā)明非常優(yōu)選的組合物包含的多糖混合物含有單糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，比例是1∶5～25∶1～50，更優(yōu)選1∶13.4+/-0.4∶12.6+/-1.3。
本發(fā)明其它的實(shí)施方式中，該組合物含有多糖混合物，其中在所述混合物中的該多糖的分子量在50000～100000范圍，含有3～15份，優(yōu)選地在4～14的范圍，更優(yōu)選地在5～13的范圍，甚至更優(yōu)選地在6～12的范圍，當(dāng)然更優(yōu)選地在7～11的范圍，甚至更優(yōu)選地在7.9～9.9的范圍，例如大約8.9份甘露糖，對(duì)應(yīng)于每份半乳糖在該實(shí)施方式中，優(yōu)選多糖的分子量在50000～100000的范圍，含有1～5份范圍，優(yōu)選地在2～4的范圍，更優(yōu)選地在2.5～3.5的范圍，例如大約2.9份葡萄糖，對(duì)應(yīng)于每份半乳糖。更優(yōu)選地，所述組合物的多糖分子量范圍在50000～100000Da，含有單糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖的比例在1∶4～14∶1～5，優(yōu)選地比例大約為1∶8.9∶2.9。
本發(fā)明另外的實(shí)施方式中，組合物含有多糖混合物，其中所述混合物中的多糖的分子量范圍在100000～300000，含有3～15份，優(yōu)選地3～14的范圍，更優(yōu)選地3～13的范圍，甚至更優(yōu)選地3～12的范圍，當(dāng)然更優(yōu)選地4～11的范圍，甚至更優(yōu)選地5～10的范圍，當(dāng)然更優(yōu)選地在6.3～8.3的范圍，例如大約7.3份甘露糖，對(duì)應(yīng)于每份半乳糖。在該實(shí)施方式中，多糖的分子量?jī)?yōu)選100000～300000，含有1～5份范圍，優(yōu)選地2～4的范圍，甚至更優(yōu)選地2.5～3.5的范圍，例如大約2.9份葡萄糖，對(duì)應(yīng)于每份半乳糖。更優(yōu)選地，所述組合物的多糖的分子量范圍在50000～100000Da，含有單糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，比例在1∶3～13∶1～5，優(yōu)選比例是大約1∶7.3∶2.9。
本發(fā)明另外的實(shí)施方式中，組合物含有多糖混合物，其中所述混合物中的多糖的分子量范圍在300000～1000000，含有3～16份范圍，優(yōu)選地5～15的范圍，更優(yōu)選地5～14的范圍，甚至更優(yōu)選地6～13的范圍，當(dāng)然更優(yōu)選的7～12的范圍，甚至更優(yōu)選地8.9～10.9的范圍，例如大約9.9份甘露糖，對(duì)應(yīng)于每份半乳糖。在該實(shí)施方式中，優(yōu)選多糖的分子量在300000～1000000的范圍，其中含有1～5份，優(yōu)選地2～4的范圍，甚至更優(yōu)選地2.5～3.5的范圍，例如大約3.1份葡萄糖，對(duì)應(yīng)于每份半乳糖。優(yōu)選地，所述組合物的多糖的分子量范圍在300000～1000000Da，含有單糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，比例在1∶5～15∶1～5，優(yōu)選地比例大約是1∶9.9∶3.1。
在本發(fā)明另外的實(shí)施方式中，組合物含有多糖混合物，其中所述混合物中的多糖的分子量至少1000000，含有3～17份范圍，優(yōu)選地4～16的范圍，更優(yōu)選地5～15的范圍，甚至更優(yōu)選地6～14的范圍，當(dāng)然更優(yōu)選地7～13的范圍，甚至更優(yōu)選地8～12的范圍，甚至9.3～11.3份，例如大約10.3份甘露糖，對(duì)應(yīng)于每份半乳糖。在該實(shí)施方式中，多糖的分子量?jī)?yōu)選分子量至少1000000，其中含有1～5份，優(yōu)選的2～4份，更優(yōu)選的2.5～3.5份，例如大約2.9份葡萄糖，對(duì)應(yīng)于每份半乳糖。優(yōu)選地，所述組合物中的多糖的分子量至少在1000000Da，含有單糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，比例是1∶4～1∶5～15∶1～5，優(yōu)選比例大約是1∶10.3∶2.9。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明含有摩爾比為半乳糖甘露糖葡萄糖為1∶10～20∶30～50，例如1∶12～18∶35～45，例如1∶14～16∶38～42，例如1約15∶約40，如1∶15∶40。
因而，在一個(gè)組合物的實(shí)施方式中，多肽含有單糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，它們的比例(半乳糖甘露糖葡萄糖)為1∶0～25∶1～50，例如1∶10～20∶30～50，例如1∶12～18∶35～45，例如1∶14～16∶38～42，例如1∶約15∶約40，例如1∶15∶40。
在另外一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的多糖含有摩爾比為半乳糖甘露糖葡萄糖為1∶0.5～5∶6～12，例如1∶1～4∶7～11，例如1∶1.5～3.5∶7.5～10，例如1∶2.0～3.0∶7.5～9.5，例如1∶2.2～2.8∶8.0～9.0，例如1∶約2.5∶8.0～9.0，例如1∶2.5∶8.0～9.0，例如1∶2.5∶8.6。
本發(fā)明兩個(gè)優(yōu)選的組合物的實(shí)施方式中，含有乳糖甘露糖葡萄糖的摩爾比為1∶12∶40和1∶3∶5。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，糖組合物獲自姬松茸(Ganoderma)，并且含有10～20份甘露糖，30～50份葡萄糖和0～2份半乳糖，例如11～17份甘露糖，35～45份葡萄糖和0～1份半乳糖。更優(yōu)選地，糖組合物獲自姬松茸，并且含有約15份甘露糖，約40份葡萄糖和約1份半乳糖，這里的“約”指與所述的數(shù)值相差在20％之內(nèi)，例如與所述的數(shù)值相差在10％之內(nèi)，例如與所述的數(shù)值相差在5％之內(nèi)。
在本發(fā)明另外的優(yōu)選的實(shí)施方式中，糖組合物獲自靈芝，并且含有0.5～5份甘露糖，4～15份葡萄糖和0～2份半乳糖，例如2～3份甘露糖，7～9.5份葡萄糖和0.5～1.5份半乳糖。更優(yōu)選地，該糖組合物獲自靈芝，含有約2.5份甘露糖，約8.6份葡萄糖和約1份半乳糖，這里的“約”指與所述的數(shù)值相差在20％之內(nèi)，例如與所述的數(shù)值相差在10％之內(nèi)，例如與所述的數(shù)值相差在5％之內(nèi)。
具有指定范圍內(nèi)的分子量的多糖的單糖成分含量的確定可以通過對(duì)于組合物的分子大小的分級(jí)，例如通過超濾、微孔過濾、超速離心或凝膠過濾來確定，例如，這可以如實(shí)施例2中所述的進(jìn)行。
優(yōu)選多糖混合物含有單糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，比例為(0～1.5)∶(0～0.5)～(15～35)∶(0.5～1.5)～(45～55)，例如下面所述的任何一個(gè)(0-1.5)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(45-55)，(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(20-30)∶(0.5-1.5)～(45-55)，(0-1.5)∶(0-0.1)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(45-55)，(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(45-55)，(0-1.5)∶(0-0.5)～(20-30)∶(0.5-1.5)～(48-52)，(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(48-52)，(0-1.5)∶(0-0.1)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(48-52)，(0.8-1.2)∶(0-0.1)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(48-52)，(0-1.5)∶(0-0.5)～(20-30)∶(0.5-1.5)～(49-51)，
(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(49-51)，(0-1.5)∶(0-0.1)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(49-51)，(0.8-1.2)∶(0-0.1)～(20-30)∶(0.5-1.5)～(49-51)，(0-1.5)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(45-55)，(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(45-55)，(0-1.5)∶(0-0.5)～(20-30)∶(0.5-1.5)～(48-52)，(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(48-52)，(0-1.5)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(49-51)，(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(20-30)∶(0.5-1.5)～(49-51)。
在本發(fā)明另外一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物的糖組合物含有1-25份甘露糖，5-45份葡萄糖和0-1.5份半乳糖，(這里的“份”指相對(duì)摩爾比，即每1-25摩爾甘露糖，有5-45摩爾的葡萄糖和0-1.5摩爾的半乳糖)，進(jìn)而糖組合物可含有A)，B)和C)，如下A)從如下組中選出的1個(gè)數(shù)量的甘露糖1-25份1-20份1-15份1-10份1-4份1-3份1.5-2.5份4-6份7-15份7-23份9-19份12-20份10-25份12-17份
14-16份和B)從如下組中選出1個(gè)數(shù)量的葡萄糖5-45份5-13份7-13份7-15份8-15份8-12份8-10份8-9份8.4-8.7份8.6份10-20份20-30份30-40份30-45份35-45份35-42份37-45份39-41份40份以及C)從如下組中選出1個(gè)數(shù)量的半乳糖0-1.5份0.2-1.2份0.7-1.5份
0-0.2份0-1份0份1份1-1.5份。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，提供了下述組合物其含有一種或多種多肽和一種多糖混合物，其中a)組合物的大部分多糖的分子量至少是30000Da，并且，其中所述的多糖混合物含有單糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50，或b)組合物的大部分多糖的分子量至少是100000Da，并且，其中所述的多糖混合物含有單糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是0～0.5∶0.5～10∶0.5～50，或c)組合物的大部分多糖的分子量至少是1000Da，并且，其中所述的多糖混合物含有單糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，組合物的大部分多糖的分子量至少為10000Da，優(yōu)選至少30000Da，并且所述的多糖混合物含有單糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例為1∶0～25∶1～50，也可以為如下比例中的任何一個(gè)1∶0～15∶1～251∶15～25∶1～251∶0～25∶25～501∶15～25∶25～501∶0～7∶1～501∶0～7∶1～251∶7～15∶1～50
1∶7～15∶40～501∶0～25∶1～401∶0～25∶25～401∶0～10∶1～50。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，組合物的大部分多糖的分子量至少是1000Da，例如至少5000Da，例如至少10000Da，例如至少20000Da，例如至少40000Da，例如至少50000Da，例如至少60000Da，75000Da，例如至少85000Da，最優(yōu)選的是至少100000Da；并且這里所說的多糖混合物含有單糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是0～0.5∶0.5～10∶0.5～50，或如下比例中的任何一個(gè)0～0.5∶0.5～7∶0.5～500～0.5∶0.5～4∶0.5～500～0.5∶0.5～2∶0.5～500～0.5∶3～10∶0.5～500～0.5∶5～10∶0.5～500～0.5∶3～7∶0.5～500～0.1∶0.5～7∶0.5～500～0.1∶0.5～4∶0.5～500～0.1∶0.5～2∶0.5～500～0.1∶3～10∶0.5～500～0.1∶5～10∶0.5～500～0.1∶3～7∶0.5～500～0.5∶0.5～7∶0.5～250～0.5∶0.5～4∶0.5～120～0.5∶0.5～2∶10～500～0.5∶3～10∶0.5～50～0.5∶5～10∶15～400～0.5∶3～7∶25～500～0.1∶0.5～7∶45～50
0～0.1∶0.5～4∶40～500～0.1∶0.5～2∶35～500～0.1∶3～10∶20～300～0.1∶5～10∶15～450～0.1∶3～7∶25～300～0.1∶0.5～1.5∶15～200～0.1∶0.5～1.5∶0.5～1.5優(yōu)選地，所述比例是大約0∶1∶18或大約0∶1∶1。
在另外的本發(fā)明的實(shí)施方式中，組合物的大部分多糖的分子量至少是500Da，例如至少800Da，例如至少1000Da，例如至少5000Da，例如至少10000Da，例如至少20000Da，例如至少40000Da，例如至少50000Da，例如是至少60000Da 75000Da；例如至少85000Da，例如至少100000Da，最優(yōu)選是至少1000Da，并且這里所說的多糖混合物含有單糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50，或如下的比例中的任何一個(gè)1∶0～25∶1～501∶0～20∶1～501∶0～15∶1～501∶0～10∶1～501∶0～5∶1～501∶10～25∶1～501∶10～15∶1～501∶15～25∶1～501∶17～25∶1～501∶10～18∶1～501∶0～25∶1～451∶0～25∶1～401∶0～25∶1～35
1∶0～25∶1～301∶0～25∶1～201∶0～25∶1～151∶0～25∶1～51∶0～25∶10～201∶0～25∶10～301∶0～25∶10～401∶0～25∶20～501∶0～25∶20～301∶0～25∶20～401∶0～25∶30～501∶0～25∶30～401∶0～25∶30～351∶0～25∶35～401∶0～25∶1～451∶0～20∶1～401∶0～15∶1～351∶0～10∶1～301∶0～5∶1～201∶10～25∶1～151∶10～15∶10～501∶15～25∶10～401∶17～25∶1～501∶10～18∶1～501∶8～15∶30～501∶11～13∶35～451∶11～13∶38～421∶1～5∶3～91∶2～4∶4～6
優(yōu)選，所述比率是大約1∶12∶40或大約1∶3∶5。
多肽本發(fā)明的組合物中優(yōu)選含有多肽。此處術(shù)語多肽包括蛋白質(zhì)、肽和多肽。所述的多肽可以以游離形式存在，也可以共價(jià)地與多糖連接，或者它們可以非共價(jià)地與多糖或者前的混合物結(jié)合。
優(yōu)選地，所述組合物含有足夠的多肽使得可以口服給予該組合物。如果該組合物含有過少的多肽，當(dāng)該組合物口服給予所述個(gè)體后，在個(gè)體中得不到或產(chǎn)生很低的免疫調(diào)節(jié)性。因此優(yōu)選本發(fā)明的組合物含有至少10μg/L，更優(yōu)選至少20μg/L，甚至更優(yōu)選25μg/L。例如含量在10～1000μg/L的范圍，如20～1000μg/L的范圍，如25～1000μg/L的范圍，如25～100μg/L的范圍，如25～35μg/L的范圍，優(yōu)選可溶性多肽。優(yōu)選含有上述濃度的多肽的組合物，包含范圍在0.1～2，更優(yōu)選在0.5～1.5范圍，甚至更優(yōu)選大約1mg/ml的多糖。如果該組合物含有多糖的含量有多有少，優(yōu)選地成比例的降低或增加多肽的含量。
制備組合物的方法優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物的制備方法包括以下步驟i)在液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌，ii)從所述液體培養(yǎng)基中純化所述組合物。
培養(yǎng)真菌的液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中通常包括所述真菌在水中生長(zhǎng)所需的溶解的營(yíng)養(yǎng)成分，將溶液轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)器中，并在生物反應(yīng)器中接種想要培養(yǎng)的真菌細(xì)胞或孢子，例如菌絲體或其片段(fraction)等。這些是在無菌環(huán)境中并且具有環(huán)境控制下進(jìn)行的，以此為真菌提供適合的物理化學(xué)環(huán)境。在液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌也稱為“液態(tài)”培養(yǎng)。
在“液態(tài)”培養(yǎng)中，具有真菌生物質(zhì)的培養(yǎng)基優(yōu)選進(jìn)行攪拌以減少梯度的出現(xiàn)和確保浸沒的細(xì)胞獲得氧氣。當(dāng)菌體在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)時(shí)，為液體培養(yǎng)基提供氧氣，用已知的方法控制提供的溶氧水平。
液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基是一種水溶液，優(yōu)選是含有營(yíng)養(yǎng)組合物的無菌水。該液體培養(yǎng)基支持真菌生長(zhǎng)，并且優(yōu)選能夠刺激細(xì)胞外組合物的產(chǎn)生，例如免疫調(diào)節(jié)物。液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中可以含有一種或多種微生物生物體生長(zhǎng)所需要的典型成分，如麥芽提取物，酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、蔗糖、鹽類提供磷酸鹽、鎂、鉀、玉米漿、維生素如硫胺素。更優(yōu)選地，含有用于菌絲體生長(zhǎng)，產(chǎn)生多糖的含有蔗糖，玉米漿，磷、鎂的培養(yǎng)基。
對(duì)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基的接種來說，可以用菌絲體，如從含有麥芽提取物，酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖的瓊脂板上得到的香菇菌絲體。真菌最初可以在含有上述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的瓊脂板上培養(yǎng)，以支持該真菌的生長(zhǎng)。用菌絲體接種平板，然后溫育，到在平板上至少有肉眼可見的菌體。根據(jù)菌體不同，該溫育通常可以進(jìn)行大約7天～大約24天，或大約10天～大約30天，通常是14天或者高達(dá)20天。溫度范圍在18～32℃，優(yōu)選是22℃～30℃之間，如約23℃～27℃，如在25℃左右等。
作為從瓊脂板接種菌絲體的替代方式，生長(zhǎng)培養(yǎng)基的接種可以用發(fā)酵液中的菌絲體，如含有支持細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的搖瓶培養(yǎng)基。培養(yǎng)菌絲體的搖瓶培養(yǎng)基最初可以用在瓊脂板培養(yǎng)的菌絲體接種。將菌絲體從瓊脂板上取得，在無菌狀態(tài)下轉(zhuǎn)移到搖瓶中，搖瓶中含有支持真菌菌絲體生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)鹽的無菌水。典型的生長(zhǎng)培養(yǎng)基含有蔗糖，玉米漿，磷和鎂。能夠提供最多的細(xì)胞外香菇多糖的產(chǎn)生的接種材料的量可以從下述初步試驗(yàn)中選出。
搖瓶溫育時(shí)間根據(jù)菌種不同而不同，通常搖瓶可以通過搖動(dòng)6～21天，優(yōu)選7～18天，更優(yōu)選8～14天；于溫度在18～32℃的范圍，優(yōu)選22～30℃之間，如大約23℃，如24℃，如25℃，如26℃，如27℃，如28℃，如29℃，如30℃進(jìn)行溫育。搖瓶也有可以是8～25天，更優(yōu)選10～20天，更優(yōu)選12～18天進(jìn)行溫育。溫度可以是18～37℃，優(yōu)選23～32℃，如大約25℃。
搖瓶中的物質(zhì)可以用于一個(gè)生物反應(yīng)器的接種，在這種情況下，反應(yīng)器含有營(yíng)養(yǎng)混合物無菌溶液和在水中的營(yíng)養(yǎng)鹽，以單一培養(yǎng)擔(dān)子菌絲體，或其片段，例如香菇菌絲體，如香菇。
通常生物反應(yīng)器發(fā)酵周期在50小時(shí)～300小時(shí)的范圍，優(yōu)選是在80～270小時(shí)的范圍，溫度控制在連續(xù)的18～32℃的范圍，優(yōu)選在22～31℃的范圍，例如大約23℃，例如24℃，例如25℃，如26℃，如27℃，如28℃，如29℃，如30℃。溫度也可以在18～37℃，優(yōu)選23～32℃，如大約25℃。
反應(yīng)器上有一個(gè)小口為發(fā)酵液提供空氣，并且發(fā)酵液最好保持連續(xù)攪拌狀態(tài)或者是最終以加入空氣作為結(jié)果的狀態(tài)，可以通過向反應(yīng)器中加入空氣進(jìn)行，或者通過使用適于提供反應(yīng)器的內(nèi)容物很好地混合的混合裝置。
優(yōu)選地，在用真菌菌絲體或其片段(如香菇菌絲體)接種前，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH值在大約3～大約7，例如，pH值在大約4.5～大約6.5，如在大約6。初次調(diào)節(jié)后，pH值可能隨發(fā)酵的過程而降低，可以用其它合適的pH值調(diào)控劑(如酸和堿等)將培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)在3～7的范圍內(nèi)的特定的值。生長(zhǎng)培養(yǎng)基的溫度優(yōu)選在18～32℃的范圍，優(yōu)選在22～31℃的范圍，如大約23℃，如24℃，如25℃，如26℃，如27℃，如28℃，如29℃，如30℃。溫度可以在18～37℃，如優(yōu)選23～32℃，如大約25℃。
可以從生物反應(yīng)器中獲得樣品并且分析生物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，分析結(jié)果可以在發(fā)酵過程中輔助生物反應(yīng)器的操作者。典型的分析通常是進(jìn)行生物質(zhì)、殘余糖濃度和細(xì)胞外多糖濃度的確定。針對(duì)這方面，可以使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道的用于分析的方法。
優(yōu)選地，制備本發(fā)明的組合物的方法包括從真菌菌絲體中純化液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的細(xì)胞外部分。該液體發(fā)酵培養(yǎng)基的細(xì)胞外部分(extracellar fraction)也稱為上清液，并且該部分可以通過離心或過濾從真菌菌絲體中分離出來，或能夠獲得基本上無任何菌絲體存在于其中的液體級(jí)分的任何其它方法。術(shù)語“基本上沒有任何菌絲體”表明包括真菌菌絲體片段的菌絲體的濃度減少到至少103，如減少到104，如至少105，如減少到至少106。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，純化包括至少一個(gè)按大小級(jí)分進(jìn)行分離的步驟。優(yōu)選地，該按大小級(jí)分進(jìn)行分離的步驟是對(duì)細(xì)胞外級(jí)分進(jìn)行的。該按大小級(jí)分進(jìn)行分離的步驟可以確保每個(gè)組合物的多糖具有既定的數(shù)值(參見上文)。該按大小級(jí)分進(jìn)行分離的步驟可以是任何本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的任何大小級(jí)分分離法。例如超速離心法、超濾法、微孔過濾法或凝膠過濾法。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過涉及下述一種或者多種純化步驟的方法從液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中純化該組合物，所述的一種或者多種純化步驟選自超速離心法、超濾法、微孔過濾法和凝膠過濾。優(yōu)選地，該純化步驟選自超濾法、微孔過濾法和/或超速離心法，甚至更優(yōu)選超濾法和微孔過濾法。
超濾是一種膜過程，過濾膜根據(jù)液體中成分的大小進(jìn)行分離。過濾膜結(jié)構(gòu)通常是交互流通的，從而使得含有相關(guān)物質(zhì)的液體能夠流過其中。有些液體含有的物質(zhì)比過濾膜的孔尺寸小則可以透過，大于過濾膜孔尺寸的分子則被截留，一般期望的物質(zhì)在截留物中或在濾液中。如果為制備組合物進(jìn)行超濾，在所述的組合物中的每個(gè)多糖具有高于既定值的分子量，期望的產(chǎn)物在截留物中。如果制備系列級(jí)分，該產(chǎn)物可以在截留物或者濾液中。微孔過濾是一個(gè)膜過程，類似于超濾，不過具有更大的膜的孔尺寸，可以允許更大的粒子通過。
凝膠過濾是一種色譜分析技術(shù)，該技術(shù)中，根據(jù)大小進(jìn)行顆粒分離。過濾介質(zhì)通常是小凝膠珠，該凝膠珠保留可以通過凝膠珠孔徑的分子。較大的則被通過凝膠柱而不被凝膠珠保留。
凝膠過濾、超濾或微孔過濾可參考R Hatti-Kaul和B Mattiasson(2001)((2001)，Downstream Processing in Biotechnology，in BasicBiotechnology，eds C Ratledge and B Kristiansen，CambridgeUniversity Press)pp 189所述內(nèi)容進(jìn)行。
實(shí)施例1，7和8描述了制備本發(fā)明組合物的非限制性方法。
已經(jīng)描述過對(duì)從液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中純化細(xì)胞外物質(zhì)需要乙醇沉淀過程。然而，乙醇沉淀作用將降低免疫調(diào)節(jié)效果，因此在純化過程中運(yùn)用乙醇沉淀獲得的組合物不是最優(yōu)選的。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，不包括乙醇沉淀的步驟，更優(yōu)選的所述方法不涉及沉淀步驟。
藥物組合物及其使用在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了將本發(fā)明的組合物在需要這樣的刺激的個(gè)體中刺激免疫系統(tǒng)的方法。該組合物可以通過例如對(duì)個(gè)體進(jìn)行口服或皮下注射有效量的組合物來刺激其免疫系統(tǒng)。對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激可以表現(xiàn)為例如抗體產(chǎn)量的增加、輔助T細(xì)胞的活化、或白細(xì)胞介素(如白細(xì)胞介素1和白細(xì)胞介素2)的量的增加。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是本發(fā)明的組合物在制備用于治療需要這樣的治療的個(gè)體的免疫受損疾病的藥物中的用途。個(gè)體的免疫受損疾病可以表現(xiàn)為免疫系統(tǒng)因子，例如抗體數(shù)量不足，或抗體產(chǎn)生降低，表現(xiàn)為輔助T細(xì)胞數(shù)量不足，個(gè)體B細(xì)胞的產(chǎn)生降低，自然殺傷細(xì)胞(NK)數(shù)量不足，或個(gè)體NK細(xì)胞的產(chǎn)生降低，或個(gè)體中白介素(如白細(xì)胞介素1和白細(xì)胞介素2)的數(shù)量不足，或者白介素(如白細(xì)胞介素1和白細(xì)胞介素2)的產(chǎn)生降低。免疫受損疾病可以是下述中的任何一種。治療可以是預(yù)防，緩解或治愈病癥。
此處所述的“數(shù)量不足”和“產(chǎn)生降低”表現(xiàn)為通常是指醫(yī)學(xué)專家認(rèn)為這些數(shù)量和產(chǎn)生低于正常的健康個(gè)體的預(yù)定水平或數(shù)值。數(shù)量和/或產(chǎn)量通常與以下因素有關(guān)年齡、常規(guī)身體狀況等。由于這個(gè)原因，醫(yī)學(xué)專家會(huì)根據(jù)個(gè)體基礎(chǔ)情況確定不同預(yù)定水平或數(shù)值。通常個(gè)體免疫受損疾病的表現(xiàn)是通過一段時(shí)間，如幾天、幾周、幾個(gè)月或幾年的測(cè)量，抗體數(shù)量逐漸出現(xiàn)降低，CD4(陽性)細(xì)胞的數(shù)量逐漸降低，或每單位(血液)樣品中的輔助T細(xì)胞數(shù)量逐漸降低。
本發(fā)明的一方面涉及含有本發(fā)明的組合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，本藥物組合物可通過常規(guī)技術(shù)制備，如在RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy 1995，edited by E.W.Martin，Mack Publishing Company，19thedition Easton，Pa)所述的。組合物可以做成常規(guī)形式，如膠囊，片劑，粉狀，糖漿，溶液或混懸液。
本發(fā)明另一方面涉及對(duì)診斷出患有免疫受損疾病的個(gè)體進(jìn)行治療的方法，所述的方法方法包括對(duì)所述個(gè)體給予有效劑量的本發(fā)明組合物或本發(fā)明藥物組合物以治療所述的免疫受損疾病。
給予劑量可以是對(duì)上述免疫受損疾病進(jìn)行預(yù)防性治療的有效劑量。
還提供了對(duì)由手術(shù)恢復(fù)的個(gè)體和處于患有免疫受損疾病的風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體的治療方法，所述方法包括對(duì)所述個(gè)體給予能激發(fā)所述個(gè)體的免疫系統(tǒng)的有效量的本發(fā)明的組合物和本發(fā)明藥物組合物。
另外還提供了對(duì)診斷出患有或處于患上獲得性免疫缺陷綜合癥的個(gè)體的治療方法，所述方法包括對(duì)所述個(gè)體給予對(duì)所述綜合癥為治療有效劑量的或預(yù)防性治療有效劑量的的本發(fā)明組合物和本發(fā)明藥物組合物。
可能引發(fā)免疫受損疾病的病癥有傳染性疾病，寄生性疾病，嗜血桿菌腦膜炎，肺炎雙球菌腦膜炎，鏈狀球菌腦膜炎，葡萄球菌腦膜炎，其它生物體引起的腦膜炎，腦炎，病毒性肺炎，肺炎球菌性肺炎，其它細(xì)菌性肺炎，除了細(xì)菌以外的的特定的生物體引起的肺炎，支氣管肺炎，不明確生物體引起的肺炎，流行性感冒，不明確性腹瀉，不明確性肝炎，急性和亞急性肝臟壞死，慢性肝炎，以及肝臟膿腫。
另外，免疫受損疾病可以是由感染性或寄生性疾病引起的，或者來自霍亂病菌，沙門氏菌，志賀氏菌，大腸埃希氏菌，其它的特定的細(xì)菌導(dǎo)致的腸道感染，艱難梭菌，病毒性腸胃炎，傳染性結(jié)腸炎，腸炎和腸胃炎，感染性腹瀉，結(jié)核病，李氏桿菌病，巴斯德氏菌病，分支桿菌病，白喉，百日咳，腦膜炎球菌，鏈球菌敗血病，葡萄球菌敗血病，肺炎球菌敗血病，厭氧菌引起的敗血病，其它革蘭氏陰性生物體引起的敗血病，放線菌感染，氣性壞疽，中毒性休克綜合征，壞死性筋膜炎，弗里德蘭桿菌，流感桿菌，假單胞菌，AIDS/HIV感染，急性脊髓灰質(zhì)炎，克-雅氏病，亞急性全腦炎硬化，進(jìn)行性多病灶白質(zhì)腦病，未明確的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢病毒感染，柯薩奇病毒，未明確的病毒性腦膜炎，淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎，未明確的病毒性腦炎，水痘，帶狀皰疹，單純性皰疹，甲型病毒性肝炎，乙型病毒性肝炎，其它明確的病毒性肝炎，慢性肝炎，肝臟膿腫或急性壞死，傳染性單核細(xì)胞增多癥，傳染性單核細(xì)胞增多癥，巨大細(xì)胞包涵體病，衣原體，腺病毒，病毒感染，梅毒，念珠菌，未明確的組織胞漿菌病，曲霉病，隱球菌病，霉菌病，類圓線蟲病，腸道寄生蟲感染，弓形體病，肉狀瘤病，卡氏肺囊蟲，后脊髓灰質(zhì)炎癥，嗜血桿菌腦膜炎，肺炎球菌腦膜炎，鏈球菌性腦膜炎，葡萄球菌腦膜炎，腦炎，腺病毒引起的肺炎，呼吸道合胞病毒引起的肺炎，副流感病毒引起的肺炎，其它病毒引起的肺炎，病毒性肺炎，肺炎球菌性肺炎，肺炎克雷白菌引起的肺炎，假單胞菌引起的肺炎，流感嗜血桿菌引起的肺炎，鏈球菌引起的肺炎，葡萄球菌引起的肺炎，和細(xì)菌性肺炎。
個(gè)體可以是哺乳動(dòng)物，如人類。
本發(fā)明組合物可以使用任何適合給藥的形式進(jìn)行給藥，不過通常，給藥方式為口服或者非腸道給藥；口服給藥優(yōu)選含有該組合物的漿液形式，和/或包含含有該組合物的漿液的膠囊，或該組合物的粉末形式。
所需要的劑量根據(jù)所使用的特定的組合物、給藥途徑和所治療的特定個(gè)體的情況而不同。最理想地，要通過本方法進(jìn)行治療的個(gè)體將接受最大耐受劑量的藥物學(xué)有效量的化合物。
通常每日口服劑量相對(duì)于全部體重，為大約0.001～大約100mg/kg，優(yōu)選在0.01～50mg/kg的范圍，更優(yōu)選在0.1～10mg/kg的范圍，甚至更優(yōu)選在1～2mg/kg的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也會(huì)清楚，該組合物的個(gè)體劑量的最佳量將取決于想要治療的疾病的性質(zhì)和程度、給藥的形式、途徑和位點(diǎn)以及所治療的特定患者?？梢酝ㄟ^傳統(tǒng)技術(shù)確定這些最佳方案。也可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定最佳治療療程，即本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用傳統(tǒng)治療療程確定測(cè)試來決定在確定的天數(shù)里的每日的組合物的劑量數(shù)。
本發(fā)明的組合物和藥物組合物也可以是包含所述組合物和帶有給藥劑量和時(shí)間的指導(dǎo)的劑量使用說明書的試劑盒的一部分。
功能性食品在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物用于生產(chǎn)功能性食品，因此在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，任何此處所述的組合物可以包括在功能性食品和營(yíng)養(yǎng)添加劑中，優(yōu)選是適用于人類的。所述的功能性食品優(yōu)選使生存率提高、延長(zhǎng)生命、促進(jìn)健康和/或是微生物數(shù)量的調(diào)節(jié)劑。更優(yōu)選，所述功能食品促進(jìn)健康和/或是微生物數(shù)量的調(diào)節(jié)劑。優(yōu)選該功能性食品適合至少每周口服攝取，例如每日口服攝取。或者，所述功能食品可以適合非腸道性或者腸道性營(yíng)養(yǎng)使用，優(yōu)選含有其他本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的制劑聯(lián)合。
由本發(fā)明生產(chǎn)的產(chǎn)品可以用于促進(jìn)人體健康，如用于維持、強(qiáng)化或促進(jìn)骨骼和心血管健康。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，功能性食品能夠用于預(yù)防或者降低骨質(zhì)疏松癥，在另外優(yōu)選的本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述的功能性食品是常規(guī)消費(fèi)品，例如，一天一次或一天兩次或一天三次，可以導(dǎo)致患如感冒、咳嗽的風(fēng)險(xiǎn)降低，以及減少倦怠疲勞。
盡管給藥或消費(fèi)的方法不同，功能性食品優(yōu)選作為他或者她每日飲食的成分為人類所攝取。任何在此描述的組合物可以與液體載體，例如，水，牛奶，植物油，果汁等；或可攝取的固體或半固體食物聯(lián)合。例如，它們可以混合到其它食物，如奶昔，奶昔混合物，早餐飲料，果汁，風(fēng)味飲料，風(fēng)味飲料的混合物，酸奶，布丁，冰激凌，冰牛奶，糖粉，凍酸奶，奶酪蛋糕餡，塊糖，包括″健康棒″比如麥片或水果棒，口香糖，硬糖，蛋黃醬，蛋糕餡，如水果餡或者奶油餡，谷物，面包，填料，敷料和即食土豆混合物。本發(fā)明因而涉及生產(chǎn)功能性食品組合物的方法，該方法包括將任何此處所述的組合物(如從香菇中獲得)與食品材料混合。
例如，所說的功能性食品可以選自膳食替代品，食品添加劑、冰淇淋、醬油、敷料、涂抹劑、壓塊、糖果、點(diǎn)心、谷類、飲料。
在另外優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的功能性食品是食品添加劑，優(yōu)選適合于攝取的藥丸，膠囊，片劑或液體形式。
在一個(gè)實(shí)施方式中，制備本發(fā)明的產(chǎn)品，進(jìn)而將此處所述的任何組合物(例如，來自香菇)加入到食品產(chǎn)品中，進(jìn)而使組合物在食品中達(dá)到每100克產(chǎn)品含5～5000毫克的組合物的水平。
乳制品在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，功能性食品是乳制品，進(jìn)而，所述的功能性食品可以例如選自下述的任何一種形式培養(yǎng)的乳制品、酸奶、白軟干酪、奶油奶酪、奶片，酸奶酪，奶昔，黃油，蛋黃醬，低脂涂抹劑、奶酪、松軟干酪、乳酪涂抹劑、兒童奶酪條″strings″，奶酪片、酸奶、基于酸奶的碳酸飲料、可飲用酸奶、低脂酸奶、冷凍澆汁，酸奶油、冰淇淋、奶油、低脂奶油替代物、發(fā)酵乳如酸乳酒。
在本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方式中，所述的乳制品是基于奶酪的制品，如選自低脂乳酪、硬奶酪，軟奶酪、干酪、乳酪涂抹劑、兒童奶酪″strings″或用于三明治的奶酪片。
在本發(fā)明另外的優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的乳制品是基于酸奶的制品，如選自酸奶組合，軟的或者可流動(dòng)的酸奶，以酸奶為基礎(chǔ)的碳酸飲料，飲用或者可飲用的酸奶，低脂酸奶。所述的以酸奶為基礎(chǔ)的制品可以例如是用保加利亞乳桿菌發(fā)酵和/或嗜熱鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)的。
在本發(fā)明的另外的優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述乳制品是培養(yǎng)的乳制品，如培養(yǎng)液(如可飲用的酸奶/酸奶思樂冰(yogurt/yogurtsmoothies)，酸乳酒、probiotic shots；非飲用型酸奶(例如在杯子或管中)；和/或另外的非流動(dòng)性培養(yǎng)的乳制品(例如干酪、奶油乳酪、奶片或酸奶油)。
本發(fā)明另外的優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的乳制品是其它類型的乳制品，如選自冷凍澆汁，酸牛奶，冰激凌，奶油，低脂奶油替代品，發(fā)酵牛奶如酸乳酒，發(fā)酵飲料，如可飲用酸奶和酸乳酒。
健康飲料在本發(fā)明另外的優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的功能性食品是健康飲料。所述健康飲料在一個(gè)實(shí)施方式中是基于果汁的，其可以濃縮為“squash”，可稀釋成符合口味的。所述的果汁和濃縮汁優(yōu)選含有濃縮果汁。優(yōu)選的果汁包括但不限于柑橘汁如橙子，柚子，檸檬和酸柚，或它們的組合。在另外優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的果汁或者濃縮汁包括(優(yōu)選被濃縮的)漿果汁，如樹莓、草莓、黑莓、羅甘莓，酸果蔓的果實(shí)，紅漿果、黑漿果、藍(lán)莓，或其組合，和/或與柑橘汁混合的果汁。在另外優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的果汁或者濃縮汁包括來自鳳梨、西番蓮、芒果、蘋果、梨、杏、石榴、番石榴、番茄和/或與任何其它類型的果汁的組合中的一種或者多種。優(yōu)選果汁基于選自下述水果·蘋果·杏·香蕉·黑莓·藍(lán)莓·陽桃(楊桃)·櫻桃·棗·無花果·什錦水果·葡萄·柚子·奇異果·檸檬·桔子·芒果·西瓜·油桃·橙子·番木瓜·桃子·梨
·菠蘿·車前草·李子·樹莓·草莓·橘子·西瓜或其組合進(jìn)一步地，優(yōu)選的果汁基于選自下述水果·蘋果·胡蘿卜·酸果蔓的果實(shí)·葡萄·柚子(粉紅或白色)·檸檬·酸橙·橙子·菠蘿·菠蘿·李子·橘子·西紅柿或其組合。
以上所說得健康飲品業(yè)可以是基于水的飲料，如基于礦泉水的產(chǎn)品，例如基于風(fēng)味的礦泉水產(chǎn)品。所述的風(fēng)味優(yōu)選來自果汁和/或其它天然產(chǎn)品。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的健康飲料是能量激發(fā)飲料，其中含有糖和其他的能量提供制品，例如含在25或30cl的瓶中。
在另外的本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的健康飲料是酒精飲料，例如基于乳品的酒精飲料。
在另外的本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的健康飲料是膳食品替代性飲料。
這是可以想象到的，本發(fā)明的健康飲料也可以制成濃縮的或預(yù)混的，可以在下一階段包裝成飲料，由消費(fèi)者自行決定。
固體功能性食品在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，功能性食品是固體功能性食品，例如選自下述的食品餅干，早餐麥片，湯，牛奶什錦早餐，口香糖，甜品(如煮沸的甜品)，新鮮烘培食品(新鮮面包，蛋糕，松餅，華夫餅等)，干烘培食品(薄脆餅干，小點(diǎn)心，餅干等)，谷物制品(早餐麥片，纖維和固醇豐富的面粉，牛奶什錦早餐，谷物與牛奶什錦早餐混合的食品塊，這樣的食品塊可以含有巧克力塊，意大利面食品，小吃等)，麩皮產(chǎn)品(顆粒和/或烘烤的麩皮產(chǎn)品，有特定口味的和/或涂有固醇類的麩產(chǎn)品和麩-麩混合產(chǎn)品等)。
在另外的本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的固體功能性食品是已經(jīng)混合的(優(yōu)選以粉的形式)，或者用于烘培(如面包，蛋糕，松餅，華夫，皮薩，烤薄餅)，或用于烹飪(如湯，調(diào)味料，甜點(diǎn)，布丁)，以用于制備或者生產(chǎn)食品。
在本發(fā)明另外的優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的固體功能性食品是肉類產(chǎn)品(香腸，肉類球，冷盤等)。
在本發(fā)明另外的優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的固體功能性食品是面包或者早餐/烘培點(diǎn)心，因此，所述的面包可以是白面包，黑面包或全麥面包。在本發(fā)明另外優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的面包可以選自下屬的面包類型麥芽面包，牛奶面包，麩皮強(qiáng)化面包和混合谷物面包。面包可以是任何形狀，如圓形，十字花烤包，小屋形狀，仙人掌形狀，燈籠狀，桶狀，成批狀，三明治狀，罐狀，維也納面包或者農(nóng)舍狀。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的面包可以選自任何下述的面包類型全麥面包，黑面包，小麥面包(面包中加工小麥的含量不少于10％)。
柔軟谷物面包(由面粉制備，但與傳統(tǒng)的白面包相比，添加了軟化的黑麥顆粒和小麥以增加面包纖維含量(優(yōu)選30％))。
谷物面包，麥芽面包。
在本發(fā)明另外的優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的面包選自下述面包類型的任何一種皮塔餅圓盤烤餅仙人掌狀面包蘇打面包或者黑蘇打面包(用全麥粉制備)黑麥面包，法國(guó)長(zhǎng)棍面包，新月形面包，百吉餅在本發(fā)明的另外的優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的面包是扁平的面包，例如選自下述面包類型中的任何一種恰巴提，Paratas and Roti，墨西哥玉米粉圓餅，囊或烤薄餅等。
在本發(fā)明的另外的優(yōu)選的實(shí)施方式中，功能性食品是早餐小吃或烘培產(chǎn)品所述的烘培食品可以是甜味的或開胃味道的，如開胃食品。
優(yōu)選的烘培產(chǎn)品包括但不限于卷和面包片卷，烤制產(chǎn)品例如松餅和松脆圓餅和厚松餅，烤餅，茶點(diǎn)餅干，小圓面包和其它加水果的產(chǎn)品，鐵板類食品例如烤薄餅和熱餅，松餅和土豆餅，熱交叉小面包圈，新月形面包，奶油蛋卷，巧克力面包，百吉餅，美國(guó)甜松餅和其它半甜面包產(chǎn)品。
基于植物油的產(chǎn)品在本發(fā)明的其他的優(yōu)選的實(shí)施方式中，功能性食品是基于植物油的產(chǎn)品(涂抹劑，色拉油，蛋黃醬等)。
冷凍糖果食品在本發(fā)明的其他的優(yōu)選的實(shí)施方式中，功能性食品是冷凍糖果食品。就本發(fā)明的目的來說，術(shù)語冷凍糖果食品包括含乳的冷凍甜品，如冰激凌，冷凍酸奶，冰凍果子露，冰凍果子露，冰牛奶和奶油凍，刨冰，格蘭尼塔冰品和冷凍水果湯。
優(yōu)選冷凍糖果(如糖，油脂，調(diào)味劑等)中固體水平大于3wt％，最優(yōu)選10～70wt％，如40～70wt％。
冰淇淋通常含有2～20wt％的油脂，0～20wt％甜味劑，2～20wt％非脂肪乳成分和其它任選的成分，如乳化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、調(diào)味成分、維生素、礦物質(zhì)等，余下為水。通常，冰激凌都會(huì)充氣超過20～400％，更普遍地為40～200％。冷凍溫度從-2～-200℃，更普遍為-10～-30℃。冰淇淋中含有的鈣水平在大約為0.1wt％。
通常用于冷凍糖果的原料的平均規(guī)格為66g。本發(fā)明中的組合物可以被裝入膠囊，或者與乳化劑，清潔劑或其它試劑聯(lián)合應(yīng)用以確保產(chǎn)品中的物質(zhì)的可溶性和穩(wěn)定性。
膳食替代品在本發(fā)明的其他的優(yōu)選的實(shí)施方式中，該功能性食品是膳食替代物。膳食替代物飲料通?；谝后w為基本成分，其可以被凝膠或纖維膳食稠化，并且向其中添加礦物質(zhì)和維生素的混合物。該飲料可被調(diào)整風(fēng)味成期望的口味，如水果味或可可味。典型的規(guī)格為330ml或330g。
本發(fā)明中的組合物可以被裝入膠囊，或者與乳化劑，清潔劑或其它試劑聯(lián)合應(yīng)用以確保飲料中的物質(zhì)的可溶性和穩(wěn)定性。
膳食替代小吃或塊狀食品通常含有其中可以混合本發(fā)明的組合物的可食用性材料的混合物，例如該混合物可以是基于脂肪類的(如巧克力層或者巧克力)，或可以是基于烘培類的(面包，面團(tuán)或餅干等)，或可以是基于成塊的顆粒狀的(米，谷子，堅(jiān)果，葡萄干，水果粒等)。小吃或者膳食替代塊狀物的典型規(guī)格是20-200g，一般是40～100g。還可以加入其它成分，如風(fēng)味材料，維生素，礦物質(zhì)等。
組合物本發(fā)明的一個(gè)方面，該功能性食品含有本發(fā)明的組合物與其它添加劑的組合，所述的添加劑包括如提高生存的物質(zhì)，促長(zhǎng)壽物質(zhì)，健康促進(jìn)物質(zhì)和/或微生物數(shù)量調(diào)解物。
例如，一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的功能性食品是含有一種或多種本發(fā)明的組合物和益生菌的例如在益生菌丸中的食品，在另外的優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的功能性食品是含有本發(fā)明的組合物以及共生菌的例如在共生菌丸中的食品。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，含有本發(fā)明組合物和一種共生菌的功能性食品。優(yōu)選的用于上述的丸中的細(xì)菌可以是下述中任何一種乳酸菌，如嗜酸乳桿菌，干酪乳酸菌，發(fā)酵乳桿菌，唾液乳桿，乳酸乳球菌，植物乳桿菌素，羅伊氏乳桿菌，鼠李糖乳桿菌和/或唾液乳桿菌。在發(fā)明其他的優(yōu)選的實(shí)施方式中，優(yōu)選的用于上述的丸中的細(xì)菌可以是下述中的任何一種雙歧桿菌，如雙歧桿菌，短雙歧桿菌，乳酸雙歧桿菌和/或龍根雙歧桿菌。本發(fā)明其他的優(yōu)選的實(shí)施方式中，優(yōu)選的用于上述的丸中的細(xì)菌可以是下述中的任何一種糞腸球菌、大腸桿菌、布拉第酵母、釀酒酵母和/或嗜熱鏈球菌。
本發(fā)明的組合物還可以與其他成分在飲食添加劑中組合使用，所述的飲食添加劑例如植物性添加劑，和/或在維生素E膠囊中，或在硒藥片中。在所述的飲食添加劑中的進(jìn)一步優(yōu)選的組合可以是與例如與下述的一種或者多種物質(zhì)的組合抗氧化劑，維生素C、維生素E、β胡蘿卜素。
本發(fā)明的功能性食品能夠另外含有其它的健康性成分，如維生素A、B、C、D、E，礦物質(zhì)如鈣、鉀、鎂、鐵、銅、鋅、硒及抗氧化劑如維生素E、多酚。例如該功能性食品可以含有本發(fā)明的組合物(如香菇多糖)和維生素C，該組合可以使攝取所述食品的個(gè)體降低感冒和流感的發(fā)生。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物還可以含有被認(rèn)為能夠預(yù)防或降低骨質(zhì)疏松的成分，例如食品添加劑，如鈣、維生素D、鎂等成分。
本發(fā)明的合適的功能性食品的優(yōu)選的實(shí)施方式描述如下飲料含有任何本文所述的組合物量在0.1-5％，優(yōu)選0.5-1％。
新鮮烘焙產(chǎn)品含有任何本文所述的組合物在量在0.9-16％，優(yōu)選2.4-10％，并且更優(yōu)選3-5％。
干烘焙品含有任何本文所述的組合物量在1.0-20％，優(yōu)選3.2-15％，并且更優(yōu)選4.4-10％。
谷類產(chǎn)品含有任何本文所述的組合物的量在0.8-20％，優(yōu)選1.6-16％，更優(yōu)選2-10％。
麩皮產(chǎn)品含有任何本文所述的組合物量在4％-25％，優(yōu)選6-20％。
乳產(chǎn)品或非乳產(chǎn)品(如發(fā)酵的谷類產(chǎn)品)含有任何本文所述的組合物量在0.1-20％，優(yōu)選0.8-8％。
基于植物油的產(chǎn)品含有任何本文所述的組合物量在0.6-16％，優(yōu)選2.6-10％，更優(yōu)選2.6-5％。
肉類產(chǎn)品含有任何本文所述的組合物量在0.1-16％，優(yōu)選0.2-5％。
乳制品含有任何本文所述的組合物量在0.1-16％，優(yōu)選0.2-5％。
因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明考慮了任何本文所述的組合物在制備功能性食品中的應(yīng)用，例如任何本文所述的功能性食品。
實(shí)施例下面的實(shí)施例例示了本發(fā)明的實(shí)施方式，不能被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。
實(shí)施例1碳水化合物香菇在搖瓶的液體培養(yǎng)基中于25℃下培養(yǎng)，所述的培養(yǎng)基含有15克/升的葡萄糖，3克/升的麥芽提取物，3克/升的酵母提取物以及5克/升的蛋白胨。培養(yǎng)后的生物質(zhì)用過濾方式從剩余的發(fā)酵液中分離出來，將上清液用標(biāo)準(zhǔn)孔大小為50000Da的膜進(jìn)行超濾。殘留物(此處稱為MediMush產(chǎn)品)用于分析單糖成分。
為了比較，商業(yè)上可得到的香菇注射液(Eureka Bio-ChemicalsPty，Little Collins Street.Melbourne 3000，澳大利亞)被用于平行進(jìn)行的參照試驗(yàn)中(下文中將本產(chǎn)品稱為“Eureka”)。
樣品在1N HCl 100℃下水解成構(gòu)成它們的單糖，水解物用采用了Dionex MA-1柱，以600mM氫氧化鈉作為流動(dòng)相的HPLC進(jìn)行分析。使用脈沖電流分析法檢測(cè)。
MediMush產(chǎn)品的主要單糖是甘露糖、葡萄糖以及一些半乳糖。表A列出了MediMush產(chǎn)品及Eureka中的相對(duì)的含量。
表A

實(shí)施例2按分子量分級(jí)由于分子量表征它們的生物活性，將MediMush樣本通過Microsep(Pall Life Sciences)離心超濾儀在6℃和7500xg的條件下進(jìn)行離心，使用標(biāo)準(zhǔn)的MWCO值為50000-1000000的濾膜。分析結(jié)果(見表2)顯示進(jìn)行了酸水解產(chǎn)生的物質(zhì)半乳糖、甘露糖以及葡萄糖，通過了所有使用的4個(gè)MWCO的膜。
表2

實(shí)施例3可溶性蛋白質(zhì)樣品中的可溶性蛋白通過微量型考馬斯染料結(jié)合測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。(Mousdale，D.M，Campbell，M.S.，Coggins，J.R.″Purificationand characterisation of bifunctional dehydroquinase-shikimateNADP dehydrogenase from pea seedlings″。Phytochemistry 367，217-222(1987)。可溶性蛋白在兩種產(chǎn)品中的量如下所示

實(shí)施例4免疫刺激性組織培養(yǎng)P388細(xì)胞是老鼠的類巨噬細(xì)胞，該細(xì)胞受到刺激時(shí)分泌大量白細(xì)胞介素-1(白介素-1)(關(guān)于該細(xì)胞的詳細(xì)信息可獲自ECACC)。可用基于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法)定量所分泌的IL-1的量，并以此測(cè)定細(xì)胞受到多大的刺激。請(qǐng)注意對(duì)于這種試驗(yàn)不存在用于校準(zhǔn)的吸收值，因此優(yōu)選平行分析參照樣品，由此IL-1的產(chǎn)量的評(píng)價(jià)可以通過與參照樣品所誘導(dǎo)的IL-1的比較來進(jìn)行。IL-1有兩種形式，即IL1-α和IL1-β。接種P388細(xì)胞在12孔培養(yǎng)板中，并使之培養(yǎng)過夜，添加不同濃度的不同的刺激物質(zhì)，并且在37℃溫育24小時(shí)。
ELISA
來自每孔的50μl的刺激培養(yǎng)基與包被緩沖液混合，再分成等份加入到96孔ELISA板中，使之在4℃包被過夜。這個(gè)步驟可以使抗原(IL-1)結(jié)合在ELISA板的表面。用兩種產(chǎn)生自山羊的針對(duì)兩種不同形式的IL-1的抗體(第一抗體)檢測(cè)IL-1。在下一步中使用另一個(gè)抗體檢測(cè)山羊抗體(第二抗體)。當(dāng)?shù)孜锛尤霑r(shí)，與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗體提供了顯色反應(yīng)。通過分光光度計(jì)(ELISA讀數(shù)器)檢測(cè)出與存在的IL-1的量對(duì)應(yīng)的顏色的量，因而定量對(duì)組織培養(yǎng)細(xì)胞的刺激程度。
結(jié)果所有樣品測(cè)試兩個(gè)產(chǎn)品在一濃度范圍內(nèi)被測(cè)試，發(fā)現(xiàn)最佳值對(duì)于IL1α而言是50g/ml，對(duì)于IL1β而言是100μg/ml。結(jié)果提供于表3。
表3

MediMush產(chǎn)品具有明顯的免疫刺激性，Eureka產(chǎn)品顯示出一定的免疫刺激性，但是遠(yuǎn)不如MediMush產(chǎn)品。MediMush產(chǎn)品誘導(dǎo)產(chǎn)生IL1α及IL1β的量分別是Eureka誘導(dǎo)產(chǎn)生的量的58倍和20倍。
級(jí)分檢測(cè)檢測(cè)濾液，因此大于濾膜截留值的分子不會(huì)存在于該檢測(cè)中。結(jié)果以吸光度的形式顯示，只是作為相對(duì)免疫刺激指標(biāo)，沒有絕對(duì)吸收值用于校準(zhǔn)此類試驗(yàn)。
表4

所有過濾物質(zhì)都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的免疫刺激性。
實(shí)施例5為了比較兩種不同的制備方法，將如實(shí)施例1所述而制備的MediMush產(chǎn)品的免疫刺激活性與由多糖組合物的免疫刺激活性相比較，其未進(jìn)行大小級(jí)分分離。
本產(chǎn)品是通過如實(shí)施例1所述在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)香菇獲得的。向由此獲得的上清液中加入大約2倍體積的無水乙醇以沉淀該物質(zhì)。取出沉淀用無水乙醇清洗，再放入蒸餾水中懸浮。
免疫刺激測(cè)試如實(shí)施例4所述進(jìn)行。將使用MediMush產(chǎn)品的結(jié)果提供在表5中，并且將使用沉淀產(chǎn)品的結(jié)果提供在表6中。
表5

表6

測(cè)試并沒有平行進(jìn)行，所獲得的數(shù)值進(jìn)而無法比較。但是，由于Eureka被用作兩項(xiàng)研究的參照，所以結(jié)果就可以作為例如相對(duì)于Eureka增加的倍數(shù)進(jìn)行比較。這些數(shù)值在下表7中給出。顯然，兩項(xiàng)試驗(yàn)中組合物都顯著地比Eureka的免疫刺激性強(qiáng)。但是MediMush產(chǎn)品比沉淀物有更高的免疫刺激性。
表7

實(shí)施例6為確定免疫刺激性的特點(diǎn)，可以運(yùn)用下列方法在免疫2日前，12周齡的Sprague Dawley大鼠接受本發(fā)明的組合物(0.5毫升0.09的生理鹽水)。對(duì)照動(dòng)物接受1毫克酪蛋白。動(dòng)物用含有0.25弗氏完全佐劑的BSA(0.5毫克)進(jìn)行免疫，在免疫11天后獲得血樣以檢測(cè)抗體反應(yīng)。采用夾心酶聯(lián)免疫分析(″sandwich″ELISA)測(cè)定針對(duì)絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)抗體BSA的特異性抗BSA抗體的濃度。
實(shí)施例7a傘菌培養(yǎng)方案培養(yǎng)條件溫度25℃±1℃pH中性pH水自來水培養(yǎng)基葡萄糖30g/l真菌蛋白胨10g/l酵母提取物6g/l麥芽提取物6g/l發(fā)酵罐(3升)培養(yǎng)傘菌(Agaricus sp.)取1.7升培養(yǎng)基放入發(fā)酵罐，在121℃下滅菌20分鐘。設(shè)置發(fā)酵條件25℃，200-300轉(zhuǎn)/分，空氣0.2-0.5vvm。用含有6-8天時(shí)間的發(fā)酵培養(yǎng)基或類似的能夠促進(jìn)良好生長(zhǎng)的培養(yǎng)基的搖瓶接種發(fā)酵罐。需要時(shí)添加適當(dāng)?shù)南輨?通常在整個(gè)過程)。6-8天后收獲。
收獲傘菌生物質(zhì)用孔徑為45的尼龍布作為過濾介質(zhì)從發(fā)酵液中濾出生物質(zhì)，用水徹底清洗生物質(zhì)，然后放入設(shè)定為解凍的微波爐烘干直至干燥(通常規(guī)格的樣品需要大約15分鐘)。儲(chǔ)存在干燥器中冷卻然后稱重。
發(fā)酵液發(fā)酵液中免疫刺激劑的濃度是以ppt通過加入無水乙醇決定的。必要時(shí)可加入無菌蒸餾水調(diào)節(jié)濃度到所需水平。高壓滅菌并保存獲得的溶液。
醫(yī)學(xué)分級(jí)將不含有生物質(zhì)的發(fā)酵液通過具有截留分子量為例如300kD的超濾膜。當(dāng)移去70％～80％的液體后，向殘留物加水以洗滌溶液。重復(fù)這個(gè)過程直到溶液失去其(大部分)顏色直至表現(xiàn)為清澈。
實(shí)施例7b將傘菌(Agaricus blazei)如實(shí)施例7a所述在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)好后將生物菌體用過濾方式從發(fā)酵液中分離出來，表層懸浮物取決于離心過濾用的截留不同分子量的濾器。去除所有低于100kD的成分后將獲得最初的產(chǎn)品(即MediMush產(chǎn)品II)，即剩下的溶液中含有MediMush產(chǎn)品II；通過從表層去除所有低于1kD的成分后將獲得第二產(chǎn)品(即MediMush產(chǎn)品III)，即剩余溶液中的物質(zhì)含有“MediMush產(chǎn)品III”。
樣品在1N HCl 100℃的條件下水解成構(gòu)成它們的單糖，水解產(chǎn)物用HPLC方式分析，利用Dionex MA-1柱，以600mM氫氧化鈉作為流動(dòng)相，脈沖電流分析法檢測(cè)。
MediMush產(chǎn)品II和III中主要單糖是甘露糖、葡萄糖以及一些半乳糖。表B列出了MediMush產(chǎn)品II和III相關(guān)單糖成分。
表B

實(shí)施例8靈芝孢子以與上述實(shí)施例7a中在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)傘菌類似的方式培養(yǎng)。通過過濾使培養(yǎng)后的生物質(zhì)從殘留的發(fā)酵液中分離出來，將上清液進(jìn)行如實(shí)施例7a所述的離心過濾。去除所有低于100kD的成分后將獲得第一產(chǎn)品(命名為MediMush產(chǎn)品IV)，即剩下溶液中含有MediMush產(chǎn)品IV；通過從上清液去除所有低于1kD的成分后獲得第二產(chǎn)品(命名為MedidiMush產(chǎn)品V)，即剩余溶液中的物質(zhì)含有“MediMush產(chǎn)品V”。
樣品在1N HCl、100℃條件下水解成它們的構(gòu)成單糖，水解產(chǎn)物用采用Dionex MA-1柱、以600mM氫氧化鈉作為流動(dòng)相的HPLC進(jìn)行分析。以脈沖電流分析法檢測(cè)。
MediMush產(chǎn)品IV和V的主要單糖是甘露糖、葡萄糖，以及一些半乳糖。表C列出了MediMush產(chǎn)品IV和V相對(duì)單糖含量。
表C

實(shí)施例9通過小鼠腹膜滲出細(xì)胞(PEC)及脾細(xì)胞研究口服及腹腔注射Medimush產(chǎn)品對(duì)致炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響。
原料及方法小鼠本研究用24只5周齡的雄性小鼠，從路易斯安那州的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系處購(gòu)買。所有研究按照LSU IACUC規(guī)定04-120中描述的進(jìn)行。
用Medimush產(chǎn)品治療小鼠分成四組。第一組按照2毫克/公斤接受溶解在0.15M氯化鈉中的香菇多糖(腹腔注射)第2組接受同等體積的生理鹽水，腹腔注射，第3組按照10毫克/公斤灌胃接受Medimush產(chǎn)品(口腔)和4組給予同等數(shù)量水，口服。所有小鼠每天接受一次治療，共5天。在最后一次治療的24個(gè)小時(shí)后，放血處死小鼠進(jìn)行細(xì)胞分離。
腹膜腔滲出細(xì)胞(PEC)的分離和刺激如先述(1)所述進(jìn)行腹腔灌洗收集PEC。細(xì)胞在RPMI1640中懸浮到1×106/毫升，所述RPMI1640含2Mm L-谷氨酰胺、100單位/毫升青霉素和100μg/mL鏈霉素(中型)，并且將其按照1mL/孔分別加入到24孔組織培養(yǎng)板里。培養(yǎng)板在1200×g下離心10分鐘，置于37℃、5％二氧化碳環(huán)境里2小時(shí)。棄去培養(yǎng)基，用溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基洗孔一次，用1.5ml添加了10％胎牛血清(Hyclone，Inc.Logan，UT)(完全培養(yǎng)基)的溫?zé)崤囵B(yǎng)基替換。每組一半的孔用10ng/ml大腸桿菌脂多糖(LPS；Sigma Chemical Co.，St。Louis，MO)處理，細(xì)胞放置在37℃、5％二氧化碳環(huán)境里12或24小時(shí)。使用針對(duì)藻紅蛋白標(biāo)記的CD3和CD14(eBioscience，SanDiego，CA)的抗體與用熒光素(Jackson ImmunoResearch，Avondale，PA)標(biāo)記的小鼠抗IgG抗體，通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)測(cè)定細(xì)胞類型。
脾細(xì)胞的分離與刺激從每只小鼠身上取下脾臟，一部分先速凍用于進(jìn)一步的mRNA分析。剩余的脾臟集中起來分組、粉碎并通過一個(gè)70μm的尼龍濾網(wǎng)(Becton Dickenson Labware，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)。洗滌一次脾細(xì)胞，將沉淀物重新懸浮于氯化銨緩沖溶液中，冰浴，5分鐘。細(xì)胞洗滌兩次，以4×107/mL重新懸浮于24孔組織培養(yǎng)板的完全培養(yǎng)基中，每孔放置1.5mL。用10ng/ml濃度的大腸桿菌脂多糖LPS或5μg/mL濃度的伴刀豆凝集素(Concanavilin)A(ConA；SigmaChemical Co.)刺激代表性的孔，細(xì)胞在37℃、5％二氧化碳環(huán)境里放置12或24小時(shí)。
細(xì)胞因子的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附)測(cè)定TNFα、IL-1β、IL-6和IL-12的細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定在血清和培養(yǎng)上清液中進(jìn)行，照廠家eBioscience)描述的精確操作。未稀釋的上清液測(cè)定三次。血清按照1∶10稀釋進(jìn)行測(cè)定。
結(jié)果及討論對(duì)于重量增加的測(cè)定，Medimush對(duì)它們的生長(zhǎng)沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。但是，腹腔注射Medimush產(chǎn)品對(duì)從腹膜灌洗中分離出的細(xì)胞的數(shù)量和表型產(chǎn)生影響?？诜幬锏男∈蠛湍切└骨蛔⑸潲}水的小鼠類似，但是對(duì)于經(jīng)過腹腔注射Medimush產(chǎn)品處理的小鼠，從腹膜分離出的細(xì)胞的總量激增(數(shù)據(jù)未顯示)。細(xì)胞數(shù)量的增加主要是由于嗜中性粒細(xì)胞的增加(表2)。與巨噬細(xì)胞相比，PMN引起的實(shí)驗(yàn)結(jié)果此時(shí)還無法預(yù)計(jì)，但是也許與受腹腔注射Medimush產(chǎn)品處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同。相反的，口服藥物組小鼠細(xì)胞數(shù)量和表型都很類似，因此它們比較的結(jié)果應(yīng)該具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
腹腔注射Medimush產(chǎn)品處理的結(jié)果是12小時(shí)之內(nèi)，腹膜滲出細(xì)胞(PEC)和脾細(xì)胞產(chǎn)生TNFα的量分別增加了4倍(表3)和3倍(表4)，受LPS處理的腹膜滲出細(xì)胞和脾細(xì)胞產(chǎn)生TNFα的量分別增加了30％和2倍?？诜﨧edimush產(chǎn)品處理的腹膜滲出細(xì)胞和脾細(xì)胞產(chǎn)生TNFα的量變化不大，有趣的是接受LPS處理的腹膜滲出細(xì)胞產(chǎn)生TNFα的量降低了20％(表4)。這些結(jié)果反映出對(duì)TNFα的影響可能是從局部開始產(chǎn)生，并且/或需要直接接觸Medimush產(chǎn)品。
口服Medimush產(chǎn)品和腹腔注射Medimush產(chǎn)品治療效果都大大提高了。由PEC生產(chǎn)IL-1β(分別為18倍和6倍，表4)。此外，由腹腔經(jīng)過TNF處理的小鼠的IL-1β對(duì)體外LPS的反應(yīng)超過了3倍，口服Medimush產(chǎn)品并受體外LPS刺激的小鼠由PEC產(chǎn)生的IL-1β的量降低了2倍。
被處理的和未經(jīng)過處理的小鼠的脾細(xì)胞在培養(yǎng)基的前12小時(shí)會(huì)產(chǎn)生少量IL-1β。當(dāng)小鼠給予Medimush產(chǎn)品(無論口服還是腹腔注射)，小鼠脾細(xì)胞經(jīng)過LPS或ConA的處理都會(huì)產(chǎn)生IL-1β(T細(xì)胞分裂素)。
一般而言，Medimush產(chǎn)品對(duì)腹膜滲出細(xì)胞的IL-6的產(chǎn)生有影響，盡管這對(duì)于非LPS處理細(xì)胞(表7)只有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。相反，在未受刺激的脾細(xì)胞中，IL-6的產(chǎn)生能夠被中等程度地提高，但是，在口服和腹腔注射這兩種處理中，由LPS或ConA刺激的脾細(xì)胞的IL-6的生成卻被中等程度地降低。IL-6水平在后來的12個(gè)小時(shí)的培養(yǎng)中持續(xù)升高(表9，表10)。
除了ConA刺激的脾細(xì)胞培養(yǎng)，其他細(xì)胞的白細(xì)胞介素12在12小時(shí)的時(shí)候只達(dá)檢測(cè)限水平(表12)。在腹腔注射Medimush產(chǎn)品的情況下，經(jīng)過LPS的處理，小鼠產(chǎn)生了大量的IL-12。
口服Medimush產(chǎn)品能使腹膜滲出細(xì)胞逐漸降低促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，但在脾細(xì)胞中，能夠逐漸增加促炎性細(xì)胞因子的生長(zhǎng)，這說明口服Medimush產(chǎn)品的系統(tǒng)性應(yīng)答可能不同于在之前研究的局部應(yīng)答(nasal，i.p.，i.v.)。
Medimush產(chǎn)品口服用藥與腹腔注射給藥不能進(jìn)行直接比較，因?yàn)樗玫腗edimush產(chǎn)品的給藥劑量不同。
參考文獻(xiàn)1.Coligan，JE，Kruisbeek，AM，Margulies，DH，Shevach，EM，Strober，W(eds.).1994.″In vitro assays for mouselymphocytes″in Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons，Inc.，Indianapolis，IN，p 3.15.4。
表1Medimush產(chǎn)品治療對(duì)重量增加的影響

a.0.15M鹽水作為腹腔注射的對(duì)照，蒸餾水作為口服對(duì)照**表明治療組與對(duì)照組有顯著性差異表2培養(yǎng)中的細(xì)胞的表型

a.由CD3染色確定b.由表面免疫球蛋白染色確定c.基于流式細(xì)胞術(shù)的側(cè)部分散d.基于CD14亮染色e.0.15M鹽水作為腹腔注射對(duì)照，蒸餾水作為口服對(duì)照表3Medimush產(chǎn)品對(duì)腹膜滲出細(xì)胞(PEC)產(chǎn)生TNFα(在12小時(shí)培養(yǎng)后)的影響

a.檢測(cè)限8pg/mlb.0.15M鹽水作為腹腔注射對(duì)照，蒸餾水作為口服對(duì)照c.使用StatXact v6.0，Cytel Sudio，2004進(jìn)行的雙t測(cè)試**統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異達(dá)到p＜0.005
表4Medimush產(chǎn)品處理對(duì)脾細(xì)胞產(chǎn)生TNFα(培養(yǎng)12小時(shí)后)的影響

a.檢測(cè)限8pg/mlb.0.15M鹽水作為腹腔注射對(duì)照，蒸餾水作為口服對(duì)照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004進(jìn)行的雙t測(cè)試**統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異達(dá)到p＜0.005表5Medimush產(chǎn)品處理對(duì)腹膜滲出細(xì)胞(PEC)產(chǎn)生IL-1β(在培養(yǎng)12小時(shí)后)的影響

a.檢測(cè)限8pg/mlb.0.15M鹽水作為腹腔注射對(duì)照，蒸餾水作為口服對(duì)照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004進(jìn)行的雙t測(cè)試**統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異達(dá)到p＜0.005
表6.Medimush產(chǎn)品處理對(duì)脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β(在培養(yǎng)12小時(shí)后)的影響

a.檢測(cè)限8pg/mlb.0.15M鹽水作為腹腔注射對(duì)照，蒸餾水作為口服對(duì)照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004進(jìn)行的雙t測(cè)試**統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異達(dá)到p＜0.005表7.Medimush產(chǎn)品處理對(duì)用腹膜滲出細(xì)胞(PEC)產(chǎn)生IL-6(在培養(yǎng)12小時(shí)后)的影響

a.檢測(cè)限8pg/mlb.015M鹽水作為腹腔注射對(duì)照，蒸餾水作為口服對(duì)照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004進(jìn)行的雙t測(cè)試**統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異達(dá)到p＜0.005
表8.Medimush產(chǎn)品處理對(duì)脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-6(在培養(yǎng)12小時(shí)后)的影響

a.檢測(cè)限8pg/mlb.0.15M鹽水作為腹腔注射對(duì)照，蒸餾水作為口服對(duì)照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004進(jìn)行的雙t測(cè)試**統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異達(dá)到p＜0.005表9Medimush產(chǎn)品處理對(duì)腹膜滲出細(xì)胞(PEC)產(chǎn)生IL-6(在培養(yǎng)12小時(shí)后)的影響

a.檢測(cè)限8pg/mlb.0.15M鹽水作為腹腔注射對(duì)照，蒸餾水作為口服對(duì)照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004進(jìn)行的雙t測(cè)試**統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異達(dá)到p＜0.005
表10 Medimush產(chǎn)品處理對(duì)脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-6(在培養(yǎng)12小時(shí)后)的影響

a.檢測(cè)限8pg/mlb.015M鹽水作為腹腔注射對(duì)照，蒸餾水作為口服對(duì)照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004進(jìn)行的雙t測(cè)試**統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異達(dá)到p＜0.005表11.Medimush產(chǎn)品處理對(duì)腹膜滲出細(xì)胞(PEC)產(chǎn)生IL-12(在培養(yǎng)12小時(shí)后)的影響

a.檢測(cè)限8pg/mlb.0.15M鹽水作為腹腔注射對(duì)照，蒸餾水作為口服對(duì)照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004進(jìn)行的雙t測(cè)試**統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異達(dá)到p＜0.005
表12Medimush產(chǎn)品對(duì)脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-12(培養(yǎng)12小時(shí)后)的影響

a.檢測(cè)限8pg/mlb.0.15M鹽水作為腹腔注射對(duì)照，蒸餾水作為口服對(duì)照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004進(jìn)行的雙t測(cè)試**統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異達(dá)到p＜0.005功能食品產(chǎn)品的實(shí)施例現(xiàn)在要通過介紹適合用于本發(fā)明的優(yōu)選的功能性食品的實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明，可以確信本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠運(yùn)用所提供的說明制備本發(fā)明的其它產(chǎn)品。
實(shí)施例10條塊(Bar)將75克黑巧克力在70℃下熔化，然后與600毫克Medimush產(chǎn)品混合，將混合溶液倒入條狀容器，冷卻過夜。
實(shí)施例11奶昔將100毫升香草冰淇淋與100毫升冷牛奶，10毫升草莓糖漿和1毫升蘑菇培養(yǎng)物的提取液混合，將混合溶液投入攪拌器，攪拌好后即可食用。
實(shí)施例12奶油杏仁條成分重量(克)水70
Hyfoama(乳化劑)3.5明膠2.0糖515葡萄糖糖漿60DE 250葡萄糖糖漿35DE 250脫脂奶粉115脂肪501克蘑菇培養(yǎng)物的提取液制備方法將hyfoama和白明膠溶解在水中，加入150克糖，打泡。將剩余的糖加熱至130℃，然后緩緩加入到剛才的泡沫溶液中，加入脂肪，葡萄糖糖漿，奶粉和1克蘑菇培養(yǎng)物的提取液。使之冷卻后分成50克的小條。
實(shí)施例13-果汁飲料11種成分，200克水果濃縮汁(香蕉，菠蘿，柑桔，葡萄，杏，檸檬，西番蓮，番石榴，芒果)，5克果糖，1克菊粉，10克，0.1克Medimush產(chǎn)品IV，0.9克植物固醇脂肪酸脂(＝0.54克固醇等同物)5克卵磷脂，1.5克乳酸鈣775克水。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其中包含一種或多種多肽和多糖混合物a)組合物中多糖主要成分的分子量至少為30000Da，其中所述多糖混合物含有單糖∶半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50，或b)組合物中多糖主要成分的分子量至少是100000Da，其中所述多糖混合物含有單糖∶半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是0～0.5∶0.5～10∶0.5～50；或c)組合物中多糖主要成分的分子量至少是1000Da，其中所述多糖混合物含有單糖∶半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50。
2.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物是由真菌生產(chǎn)的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述組合物，其中所述組合物是由包括下述步驟的方法生產(chǎn)的i)在液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌，和ii)從所述液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基分離所述組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中從液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基分離所述組合物的方式包括超速離心、超濾、微孔過濾或凝膠過濾。
5.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述的真菌是真菌菌絲體。
6.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述的真菌屬于香菇屬。
7.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述真菌選自雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)，冬蟲夏草(Cordiceps sinensis)，金針菇(Flammulina velutipes)，靈芝(Ganoderma lucidum)，多葉奇果菌(Grifola frondosa)，香菇(Lentinus edodes)，糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus)，裂褶菌(Schizophyllum commune)，核盤菌(Sclerotinasclerotium)，白腐擔(dān)子菌(Trametes(coriolus)versicolor，采絨革蓋菌)，銀耳(Tremella fuciformis)，姬松茸(Agaricus blazei)，茶樹菇(Agrocybe aegerita)，柱狀田頭菇(Agrocybe cylindracea)，地花菌(Albatrellus confluens)，蜜環(huán)菌(Armillariella mellea)，木耳(Auricularia auricular-judae)，毛木耳(Auriculariapolytricha)，Collybia maracula，蛹蟲草(Cordiceps militari)，Dendropolyporus umbellatus，木蹄層孔菌(Fomes fomentarius)，松生層孔菌(Fomes pinicola)，平蓋靈芝(Ganoderma applanatum)，鐵杉靈芝(Ganoderma tsμ gae)，猴頭(Hericium erinaceus)，玉蕈(Hypsizygus marmoreus)，樺褐纖孔菌(Inonotus obliquus)，硫色絢孔菌(Laetiporus sulphurous)，樺革裥菌(Lenzites betulinus)，大白樁菇(Leucopaxilllus giganteus)，灰離褶傘(Lyophyllumcinerascens)，外溶亞臍菇(Omphalina epichysium)，霉?fàn)钚W德蘑(Oudemansiella mucida)，晚生扇菇(Panellus serotinus)，樺滴孔菌(Piptoporus betulinus)，裂蹄木層孔菌(Phellinus linteus)，松木層孔菌(Phellinus pini)，光帽鱗傘(Pholiota nameko)，金頂側(cè)耳(Pleurotus citrinopileatus)，肺形側(cè)耳(Pleurotus pulmonarius)，Sarcedon asparatus，香栓菌(Trametes suavolens)，草菇(Volvariella volvacea)和茯苓(Wolfiporia cocos)。
8.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述的真菌選自雙孢蘑菇，冬蟲夏草，金針菇，靈芝，多葉奇果菌，香菇，糙皮側(cè)耳，裂褶菌，核盤菌，白腐擔(dān)子菌(采絨革蓋菌)和銀耳。
9.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物具有免疫調(diào)節(jié)性。
10.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物具有免疫刺激性。
11.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物能夠在體外試驗(yàn)中誘導(dǎo)至少一種白介素IL-1生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)生白介素IL-1。
12.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中當(dāng)向所述哺乳動(dòng)物給予時(shí)，所述組合物能夠提高在該哺乳動(dòng)物中的抗體產(chǎn)生。
13.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述多糖混合物含有單糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶5～25∶1～50。
14.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述多糖混合物含有單糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶13.4+/-0.4∶12.6+/-1.3。
15.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物的每個(gè)多糖的分子量至少是10000Da。
16.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物的每個(gè)多糖的分子量至少是50000Da。
17.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物的多糖含有單糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶7～11∶2.5～3.5。
18.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物的多糖的分子量在50000Da～100000Da的范圍，其含有單糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶4～14∶1～5。
19.如權(quán)利要求18的組合物，其中所述的比例約為1∶8.9∶2.9。
20.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物的多糖的分子量在100000Da～300000Da的范圍，其含有單糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶3～13∶1～5。
21.如權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述的比例約為1∶7.3∶2.9。
22.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物的多糖的分子量在300000Da～1000000Da的范圍，其含有單糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶5～15∶1～5。
23.如權(quán)利要求22所述的組合物，其中所述的比例約為1∶9.9∶3.1。
24.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物的多糖的分子量大于1000000Da，其含有單糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶5～15∶1～5。
25.如權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述的比例約為1∶10.3∶2.9。
26.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的組合物含有至少10μg/L的可溶性多肽。
27.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物含有在10～1000μg/L范圍的可溶性多肽。
28.一種生產(chǎn)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物的方法，該方法包括以下步驟i)在液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌，ii)從所述的液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中純化所述組合物。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的純化包括將分子量至少為10000Da的多糖從其它多糖中分離出來。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的分離通過超速離心法、超濾法、微孔過濾法或凝膠過濾法實(shí)施。
31.一種用作藥物的藥物組合物，包含權(quán)利要求1的組合物和藥學(xué)上可接受的載體。
32.一種治療下述個(gè)體的方法，所述個(gè)體為i)診斷具有免疫受損疾病，和/或ii)處于感染免疫受損疾病的風(fēng)險(xiǎn)，和/或iii)由手術(shù)或疾病中恢復(fù)，并且處于感染免疫受損疾病的風(fēng)險(xiǎn)，和/或iv)診斷具有或處于感染獲得性免疫缺陷綜合癥的風(fēng)險(xiǎn)，所述方法包括給予所述個(gè)體有效量的權(quán)利要求1所述的組合物，以治療或預(yù)防性治療所述免疫受損疾病、或所述綜合癥、或刺激所述個(gè)體的免疫系統(tǒng)。
33.權(quán)利要求32所述的方法，其中的免疫受損疾病選自傳染性疾病，寄生性疾病，嗜血桿菌腦膜炎，肺炎雙球菌腦膜炎，鏈狀球菌腦膜炎，葡萄球菌腦膜炎，其它生物體引起的腦膜炎，腦炎，病毒性肺炎，肺炎球菌性肺炎，其它細(xì)菌性肺炎，除了細(xì)菌以外的特定的生物體引起的肺炎，支氣管肺炎，不明確生物體引起的肺炎，流行性感冒，不明確性腹瀉，不明確性肝炎，急性和亞急性肝臟壞死，慢性肝炎，以及肝臟膿腫。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其中的免疫受損疾病是由下列傳染性或寄生性疾病引起的，或者來自霍亂病菌，沙門氏菌，志賀氏菌，大腸埃希氏菌，其它的特定的細(xì)菌導(dǎo)致的腸道感染，艱難梭菌，病毒性腸胃炎，傳染性結(jié)腸炎，腸炎和腸胃炎，感染性腹瀉，結(jié)核病，李氏桿菌病，巴斯德氏菌病，分支桿菌病，白喉，百日咳，腦膜炎球菌，鏈球菌敗血病，葡萄球菌敗血病，肺炎球菌敗血病，厭氧菌引起的敗血病，其它革蘭氏陰性生物體引起的敗血病，放線菌感染，氣性壞疽，中毒性休克綜合征，壞死性筋膜炎，弗里德蘭桿菌，流感桿菌，假單胞菌，AIDS/HIV感染，急性脊髓灰質(zhì)炎，克-雅氏病，亞急性全腦炎硬化，進(jìn)行性多病灶白質(zhì)腦病，未明確的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢病毒感染，柯薩奇病毒，未明確的病毒性腦膜炎，淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎，未明確的病毒性腦炎，水痘，帶狀皰疹，單純性皰疹，甲型病毒性肝炎，乙型病毒性肝炎，其它明確的病毒性肝炎，慢性肝炎，肝臟膿腫或急性壞死，傳染性單核細(xì)胞增多癥，傳染性單核細(xì)胞增多癥，巨大細(xì)胞包涵體病，衣原體，腺病毒，病毒感染，梅毒，念珠菌，未明確的組織胞漿菌病，曲霉病，隱球菌病，霉菌病，類圓線蟲病，腸道寄生蟲感染，弓形體病，肉狀瘤病，卡氏肺囊蟲，后脊髓灰質(zhì)炎癥，嗜血桿菌腦膜炎，肺炎球菌腦膜炎，鏈球菌性腦膜炎，葡萄球菌腦膜炎，腦炎，腺病毒引起的肺炎，呼吸道合胞病毒引起的肺炎，副流感病毒引起的肺炎，其它病毒引起的肺炎，病毒性肺炎，肺炎球菌性肺炎，肺炎克雷白菌引起的肺炎，假單胞菌引起的肺炎，流感嗜血桿菌引起的肺炎，鏈球菌引起的肺炎，葡萄球菌引起的肺炎，和細(xì)菌性肺炎。
35.如權(quán)利要求32所述的方法，其中的個(gè)體是包括人類的哺乳動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有多肽和多糖的組合物，所述組合物通?？捎糜诿庖哒{(diào)節(jié)。本發(fā)明還公開了使用在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的絲狀真菌生產(chǎn)這些組合物的方法。所述組合物可用于例如免疫受損疾病的治療。
文檔編號(hào)A61K36/06GK101018869SQ200580030988
公開日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2005年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月16日
發(fā)明者B·克里斯蒂安森 申請(qǐng)人:藥用菌類公司