專利名稱：制備微晶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及包含一個或多個水溶性晶體的微米或亞微米的顆粒，其中所述晶體具有包含一個或多個生物活性分子的表面涂層，以及形成這些顆粒的有效方法和篩選形成這些顆粒的優(yōu)選條件的快速方法。所述顆粒適合于藥物制劑。
背景技術(shù)：
被結(jié)合到本文中作為參考的WO00/69887是本發(fā)明人以前的申請，其涉及蛋白質(zhì)包被的微晶(PCMCs)。在WO00/69887中公開的包被的晶體通常通過添加水可混溶溶劑從水性混合物中共沉淀出來，所述水性混合物包含共沉淀劑和生物活性分子的飽和溶液。然而，沒有關(guān)于使用未飽和溶液(less than saturated solution)是有利的公開內(nèi)容。
在WO00/69887中，描述了通過添加共沉淀劑和生物活性分子的飽和水溶液到過量溶劑中產(chǎn)生PCMCs。獲得有效混合的在WO00/69887中的優(yōu)選方法是將水溶液逐滴添加到過量有機可混溶溶劑中，同時劇烈混合。然而，這種間歇式方法具有許多缺陷a)因為溶劑的水含量在整個過程中不斷增加，沉淀條件持續(xù)變化。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同的起始的水含量導致晶體的不同大小和形狀以及生物活性的變化；b)在其中已經(jīng)包含不斷增加量的晶體的混懸液中進行沉淀。這將增加新生晶體融合到已經(jīng)形成的晶體上的可能性。
c)如果需要大規(guī)模的批量，難以用攪拌式間歇式反應器獲得無過分剪切力的高效攪拌。通常需要高效攪拌產(chǎn)生更小的晶體并阻止晶體“粘合”成團聚體。然若，高剪切力可以造成對生物活性分子的損害諸如蛋白質(zhì)變性或核酸的“切口形成”?？焖倩旌系膫溥x方法諸如霧化水性流入物以提供非常小的液滴也具有來自剪切力和界面的變性過程的潛在問題；d)生物活性分子和共沉淀劑需要作為混合物進行制備和貯存直到被添加到溶劑中。如果，例如生物分子在混合物或其它中是不穩(wěn)定的，其需要例如防止聚集，沉淀或化學改性的添加劑或穩(wěn)定劑的存在，這可能會導致問題。如果這些需要以閾值濃度以上的濃度存在，它們可能會干擾共沉淀過程；e)獲得確定進行共沉淀方法的最佳條件的自動篩選方法從而產(chǎn)生具有理想的物理性質(zhì)和優(yōu)化的生物活性的生物活性分子包被的微晶是困難的。這個問題的出現(xiàn)是因為一旦共沉淀劑和生物活性分子混合在一起，影響共沉淀過程的許多參數(shù)達到固定值并且不能相對于彼此變化。例如，在沒有首先制備其它的水性混合物的情況下，在顆粒中的水-溶劑比率，所用的共沉淀劑的濃度和生物活性分子負載不能相對于彼此來變化。這是耗時的，無效的并且可能引入誤差。此外，如果只能夠以低量獲得生物活性分子和/或生產(chǎn)它們花費巨大，那么制備許多不同的水溶液可能變得不可能或不經(jīng)濟。需要被篩選的相關(guān)物理性質(zhì)包括大小，形狀，結(jié)晶性，ζ電勢，空氣動力學性質(zhì)，溶解性和流動性。影響生物活性的因素包括在微晶上的生物活性分子的產(chǎn)量和負載，水含量和生物活性分子結(jié)構(gòu)、組成和聚集狀態(tài)的變化。大量可變參數(shù)意味著存在對于容許篩選產(chǎn)生顆粒的最佳條件的新的有效方法的明顯需要，所述顆粒理想的物理性質(zhì)，具有優(yōu)化的生物活性。例如，這將使藥物制劑更迅速地被優(yōu)化。
盡管已經(jīng)公開了使用超臨界流體制備干蛋白質(zhì)粉末的連續(xù)方法，這些方法沒有提供蛋白質(zhì)包被的微晶，并具有不利之處，即它們需要使用專用的高壓泵系統(tǒng)。此外，因為超臨界二氧化碳和水僅在窄范圍內(nèi)是可混溶的，必要的是應用第三溶劑，并使用能夠利用超臨界流體的低粘性和高擴散性的采用先進技術(shù)的混合裝置。一個另外的嚴重問題是，在存在水的時候，超臨界二氧化碳變成酸性，因此該方法不是很適合于處理對低pH敏感的許多生物活性分子。
因此顯而易見的是，存在對于開發(fā)制備蛋白質(zhì)粉末的備選連續(xù)方法的需要，其a)可以應用于更寬范圍的生物活性分子；b)可以應用于常用溶劑；c)操作更容易并且更廉價；和d)可以用于蛋白質(zhì)包被的微晶的產(chǎn)生。
本發(fā)明的至少一個方面的目的是消除或減少前述至少一個或多個不利之處。
發(fā)明簡述按照本發(fā)明的第一個方面，提供形成生物活性分子包被的微晶的連續(xù)方法，其包括下列步驟(a)提供包含共沉淀劑分子的第一水溶液；(b)提供包含生物活性分子的第二水溶液；(c)提供包含水可混溶溶劑的第三溶液；(d)基本上同時混合所述第一水溶液，所述第二水溶液和所述第三溶液；或?qū)⒌谝缓偷诙芤旱娜我环N與第三溶液混合并隨后混合以余下的第一水溶液和第二水溶液的任一種；從而使共沉淀劑和生物活性分子的共沉淀開始，導致所述微晶的形成；和(e)收集微晶的混懸液。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，提供包含共沉淀劑分子的第一水溶液，包含生物活性分子的第二水溶液，和包含水可混溶溶劑的第三溶液的分開的溶液是高度有利的。例如，作為兩個單獨的溶液提供共沉淀劑分子和生物活性分子有利地使這些成分能夠被貯存和被引入從包含不同添加劑和/或pH的溶液中的共沉淀過程，并且對于所述溶液能夠在不同的溫度和壓力上進行保存。
至于在本文中的連續(xù)法，意味著其中制備的溶液被連續(xù)混合的方法。所述溶液可以被持續(xù)混合，例如通過將分別的溶液泵送到混合裝置或混合裝置中?？梢詫⒅辽偃N單獨的溶液基本上同時在一個裝置中混合在一起。
備選地，連續(xù)的過程可以發(fā)生，其中可以在第一個步驟中，將包含共沉淀劑分子的第一水溶液加入包含水可混溶溶劑的第三溶液，并在隨后，在第二個步驟中，將包含生物活性分子的第二水溶液加入。在備選的實施例中，可以在第一個步驟中將包含生物活性分子的第二水溶液加入包含水可混溶溶劑的第三溶液，并在隨后在第二個步驟中加入包含共沉淀劑分子的第一水溶液。
可以同時將合并的混合物泵出混合裝置直到已經(jīng)形成足夠量的微晶。
在制備具有表面涂層的包含一個或多個生物活性分子的微晶的制劑的遞增過程中，使結(jié)合于載體晶體的生物活性分子的產(chǎn)量最大化可能是理想的。這是因為，制備和純化，例如治療性蛋白可能是非常昂貴的。因此，使在固定到載體晶體上的過程中損失的生物活性分子的量最少化可以是理想的。這種損失可能是來自仍存在于可混溶溶劑中的以亞微米顆粒形式存在的未結(jié)合的生物活性分子，或來自結(jié)合的生物活性分子的生物活性的損失。通過在固定的時期內(nèi)進行共沉淀過程，可以測試結(jié)合方法的效率，從而引入已知量的生物活性分子，接著通過過濾從沉淀的溶劑中分離形成的微晶，并測量結(jié)合在形成的微晶中的被引入的生物活性分子的百分比。典型地，將生物活性分子結(jié)合到載體晶體上的效率可以大于約20％，大于約50％，大于約80％，更優(yōu)選地大于約90％。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)生物活性分子諸如蛋白質(zhì)在共沉淀過程中的結(jié)合效率對于水溶液的pH和被引入的鹽或緩沖液可以是特別敏感的。在低鹽濃度諸如少于0.1M或優(yōu)選地少于0.01M，通?？梢园l(fā)現(xiàn)結(jié)合效率提高，如果用在共沉淀中的水溶液中的pH更接近于生物活性分子諸如蛋白質(zhì)的pI。不希望被理論所束縛，可能的是具有減少的總電荷的生物活性分子可以更能夠集簇成納米顆粒，并且這些還可以接著更好地包裝在一起來包被載體晶體的表面。
還發(fā)現(xiàn)pH還可以影響結(jié)合的生物活性分子的量，其可以成功地，例如，與抗體諸如IgG重構(gòu)。在這些情形中，優(yōu)化共沉淀pH也可以是理想的。
不幸的是，當使用在WO00/69887中描述的先前公開的兩管路連續(xù)法進行共沉淀過程時，那么改變水溶液的pH可存在難度，特別是如果所用的共沉淀劑具有緩沖能力-例如氨基酸。在這些情形中，可能必要的是，引入顯著量的pH控制劑諸如酸，堿或緩沖劑以將濃縮的共沉淀劑溶液調(diào)向接近于生物活性分子的pI的pH。這些高濃度的控制劑的存在可以干擾共沉淀過程并且可以導致減少量的載體物質(zhì)沉淀。在最終固體制劑中的大量控制劑的存在通常也可以是不需要的。例如，在重構(gòu)具有不理想張力的溶液后，可獲得超過可接受的調(diào)節(jié)限度的不利的滲透壓或離子強度從而使得它們不適合于腸胃外施用。因此清楚的是，盡管pH的變化可改善情況，在WO00/69887中所述的兩管路方法未提供對于高效制備具有包含一種或多種生物活性分子的表面涂層的微晶的商業(yè)需求的充分路徑。這對于具有遠離選擇的共沉淀劑的pI的pI的生物活性分子特別如此。
令人驚奇的是，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果可以將不同pH的共沉淀劑和生物活性分子溶液作為單獨的液流引入連續(xù)的混合裝置中并迅速混合以水可混溶溶劑，與獲得有效制備過程相關(guān)的困難可以被克服?？梢员环Q為三管路方法的這種方法可以用不同pH的水性共沉淀劑和生物活性分子溶液進行操作，與在無緩沖情況下操作的兩管路方法的應用相比，其可以顯著改善生物活性分子結(jié)合諸如蛋白質(zhì)結(jié)合的效率。所述方法還可以用于獲得更高水平的，例如可溶的抗體，而不需要緩沖共沉淀劑溶液。這三種液流的混合可以基本上同時進行，或可以首先將水性液流的一種或另一種與可混溶溶劑組合，接著將該混合物迅速與其它的水性液流進行組合。觀察到的這種提高的結(jié)合是令人驚奇的，因為預期在兩種水性液流中的成分之間的質(zhì)子的交換在混合后將是非常迅速的并且在所述液流之間的任何開始的差異將因此被迅速消除。
在本發(fā)明中，可以將包含共沉淀劑分子的第一水溶液以高于包含生物活性分子的第二水溶液的速率引入混合過程中，包含水可混溶溶劑的第三溶液可以以甚至更高的速率被引入。添加的相對速率可以按照需要改變以提供在形成的微晶的混懸液中的具體的最終組成和水含量。
可以選擇包含共沉淀劑分子的第一水溶液的pH以提供充分形成的共沉淀劑微晶的快速沉淀。在兩性離子化合物的情形中，最合適的pH可以通常大約是這樣的pH，其中全部是中性分子存在于溶液中。對于氨基酸而言，適合的pH可以方便地通過將純化合物的固體晶體溶解在水中制備約飽和濃度的濃縮溶液來獲得。
使用例如生理可接受的緩沖劑可以將包含生物活性分子的第二水溶液緩沖到不同于包含共沉淀劑分子的第一水溶液并更接近于生物活性分子的pI的pH。緩沖液濃度可以選自少于約0.1M，少于約0.05 M，和優(yōu)選地少于約0.02M中的任何?？梢詫H優(yōu)選地進行選擇從而使生物活性分子在水溶液中保持可溶，并在沉淀前的保存階段中仍舊保持生物活性分子的生物活性。為了使結(jié)合效率最大化，用于包含生物活性分子的第二水溶液的pH可以通常在其pI的4.5個pH單位，優(yōu)選地在其pI的3個pH單位，最優(yōu)選地在其pI的2個pH單位。當生物活性分子的濃度增加時，進一步離開pI以預防生物活性分子的沉淀或聚集可能是必要的。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言清楚的是，需要保持緩沖成分的量，例如在特定pH的治療性蛋白質(zhì)溶液的量將比緩沖更大體積的濃縮的共沉淀劑溶液所需的量少的多。這對于可電離的共沉淀劑，諸如，例如氨基酸而言是特別有利的。
因此，本發(fā)明提供增加共沉淀過程的效率，同時使被引入最終形成的微晶的緩沖化合物的比例最小化的方法。相似地，與在WO00/69887中所述的兩管路方法的被引入微晶的其它添加劑相比，從共沉淀劑溶液中分離生物活性分子溶液還可以降低被引入微晶的其它添加劑，諸如鹽、表面活性劑、穩(wěn)定劑和抗氧化劑的量。
在某些應用諸如對于沉淀后涂層，混合的共沉淀系統(tǒng)或交聯(lián)而言，可能必要的是通過另外的入口端或通過被連續(xù)地置于共沉淀裝置之前或之后的其它混合裝置，在另外的溶液中進行制備，泵送和混合。相似地，對于篩選應用，另外的水性組成液流可以有利地用于使共沉淀劑和生物活性分子的起始或最終濃度以系統(tǒng)方式變化。還應該理解的是，盡管大部分應用指三-液流混合過程，任何超過三的液流混合過程也在本發(fā)明應用范圍內(nèi)。例如，可以使用四-液流，五-液流，六-液流，七-液流，八-液流，九-液流或十液流方法。
所述的連續(xù)法的優(yōu)選的特征是通過混合裝置的組合流速高從而使組合溶液在混合裝置中的停留時間非常少。還優(yōu)選的是確保在每個裝置中發(fā)生基本上完全的混合?？梢詫⑼Ａ魰r間計算為用每單位時間通過裝置泵送的溶液的總體積除以混合室的體積。典型地，停留時間少于約5秒，優(yōu)選地少于約1秒，最優(yōu)選地少于約0.2秒。連續(xù)法的這種特征使溶液快速并充分地混合，同時在混合室中存在最短的時間確保微晶形成的開始在整個過程中，在相同的環(huán)境中發(fā)生。連續(xù)的起始或成核作用條件，可以導致形成具有更均一大小和形狀的微晶，并且有助于使與微晶的融合最小化。具有更窄大小和形狀分布的顆粒通常更易于處理，并且，例如更適合于產(chǎn)生藥物制劑，因為其更易于制備單位劑量。
本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)使用高流速三-液流的連續(xù)的混合裝置進行共沉淀過程，將濃縮的共沉淀劑水溶液和生物活性分子溶液通過單獨連續(xù)的液流引入混合裝置是可能的。在混合流動裝置中，這些單獨的水性流入物混合以第三更多的水可混溶溶劑的流入物，并且共沉淀起始。混合物可以流出混合裝置，得到的顆粒的混懸液可以在收集容器中收集或通過例如，濃縮、過濾或離心，隨后干燥立即進行進一步的處理。
三液流方法的成功應用是令人驚訝的，因為以前顯示同時逐滴添加蛋白質(zhì)水溶液和單獨的濃縮的共沉淀劑溶液到包含過量溶劑的容器中，同時快速攪拌，沒有導致蛋白質(zhì)包被的微晶的形成。相反，其導致兩種單獨的成分，即蛋白質(zhì)團聚體和未包被的共沉淀劑晶體的沉淀。因此，認為兩種成分，蛋白質(zhì)和共沉淀劑需要在添加到水可混溶溶劑前緊密混合。不希望被理論所束縛，似乎可以在高流速沉淀器中獲得的三種流入物的有效混合導致接近穩(wěn)態(tài)的條件，從而使由生物活性分子導致的共沉淀劑晶體的成核作用與自成核作用競爭，導致包被的晶體的形成，而不是預期的相分離。
令人驚訝地，三液流過程可以在延長的時期內(nèi)進行操作，而不會象關(guān)于這樣的共沉淀過程所預期的那樣阻塞入口管。有利地，發(fā)現(xiàn)在整個操作周期中，通過所述方法產(chǎn)生的顆粒在大小，形狀和產(chǎn)量上是高度一致的，說明共沉淀條件保持不變。另一個優(yōu)點是所述流動系統(tǒng)可以自動運行許多小時，并且在這樣進行的時候，產(chǎn)生大量顆粒。
存在顯著的優(yōu)勢是因為，與其中需要引入預形成的水性混合物的兩液流裝置相比，可以將水溶液單獨引入在三液流混合裝置中的混合器中。這些優(yōu)勢中的一些與這樣的事實相關(guān)，即每種溶液可以在不同的條件下保存并且具有不同的組成。例如，生物活性分子溶液可以保存在低溫諸如少于10℃的溫度，并且可以包含以某種濃度存在的穩(wěn)定劑諸如表面活性劑或其它添加劑，所述濃度高于如果溶液組合時可能的濃度。當要求在微晶上的蛋白質(zhì)重量百分比負載低的時，這特別如此。在三-液流過程的這種情形中，需要將比共沉淀劑溶液少的多的生物活性分子溶液引入混合器中，從而使在共沉淀過程中和在最終的顆粒中存在的添加劑和穩(wěn)定劑的總量減少。
分離第一和第二水溶液具有這樣的優(yōu)勢，即其使對形成優(yōu)選形態(tài)的顆粒的最佳條件的篩選更為有效，并使需要的生物活性分子的量最少化。例如，彼此獨立地改變生物活性分子與共沉淀劑的比率和水-溶劑的比率是可能的。還發(fā)現(xiàn)所述三管路系統(tǒng)可以用于提供非常有效的析因試驗設計流程，其使優(yōu)化產(chǎn)生顆粒的系統(tǒng)所需的分離實驗和方案的數(shù)量最少化。因此，使用部分析因，有效篩選具有適合于特定應用的性質(zhì)的包被的微晶是可能的。此外，關(guān)于三液流方法，所用的生物活性分子溶液可以直接從，例如廠商或下游純化方法供應。這具有使在共沉淀和產(chǎn)生顆粒前的溶液操作的量最少化的優(yōu)勢。操作會通過，例如聚集或吸附到容器或過濾器而增加一些生物活性分子損失的風險。
因為全部系統(tǒng)可以被密封和滅菌并且三個液流的每個可以獨立地通過滅菌過濾器進行過濾，整個過程還可以按照藥物制劑生產(chǎn)的需要來進行滅菌。
典型地，包含共沉淀劑的第一水溶液可以作為基本上飽和的或高度濃縮的水溶液進行制備，其在制備的溫度上是30-250％的平衡的飽和濃度。如果需要，所述第一水溶液可以在不同的溫度或pH上貯存，并且可以包含不同的添加劑諸如來自包含生物活性分子的第二水溶液的溶劑。更高的溫度諸如介于約30℃和約95℃之間的溫度可以用于增加溶解在水溶液中的共沉淀劑的濃度并且溶劑的添加可以根據(jù)需要用于降低或增加溶解度。共沉淀劑的起始濃度影響可以在混合以其它溶液后獲得的過飽和的程度，并且這可以影響獲得的微晶的大小。對于可能，例如更好的適合于肺用制劑的更小的微晶而言，通常需要更高的起始濃度。使用約150％的室溫飽和局限的濃度可導致大于20％的顆粒大小的減少。這導致提高的空氣動力學性質(zhì)諸如微細顆粒級分。優(yōu)選地，應該對共沉淀劑進行選擇從而與在水溶液中比較，在包含水可混溶溶劑的第三溶液中顯示基本上更低的溶解度。
包含生物活性分子的第二水溶液可以通過從將溶解在水溶液中的固體制劑，例如作為粉末開始進行制備。備選地，所述生物活性分子或分子的混合物可以作為溶液或混懸液來提供。所述溶液還可以包含適合于在水溶液中穩(wěn)定生物活性分子的賦形劑。這些賦形劑是本領(lǐng)域眾所周知的并且可以包括表面活性劑，緩沖劑，抗氧化劑和穩(wěn)定劑。第二水溶液的pH可以不同于第一水溶液。例如，可以對pH進行選擇以比在第一溶液中更接近于生物活性分子的pI。制備后，溶液可以在這樣的條件下進行貯存，所述條件使在添加前的時期內(nèi)生物活性或完整性的損失最小。這可能需要溶液在這樣的溫度上貯存，所述溫度不同于用于其它溶液的那些諸如例如少于10℃或在約4℃。所述溶液還可以在無菌環(huán)境下，諸如氬氣、氮氣、氖氣和氦氣中以防止化學降解。
包含共沉淀劑分子的第一水溶液和包含生物活性分子的第二水溶液可以混合以基本上包含例如，水混溶性有機溶劑或水可混溶溶劑的混合物的第三溶液，優(yōu)選其中溶劑或溶劑混合物基本上與共沉淀劑溶液充分混溶的第三溶液。典型地，將水溶液添加到過量水混溶性有機溶劑中。過量的充分水混溶性有機溶劑是這樣的，其使溶劑/水溶液的最終水含量通常少于約30vol％，典型地少于約10-20vol％并方便地少于約8vol％。照這樣，所述有機溶劑可以優(yōu)選地開始包含少于約0.5-5vol％的水或基本上是無水的，但是其不必是完全無水的。
可以將不會對生物活性分子產(chǎn)生不利影響的任何水可混溶溶劑用于共沉淀。典型的水混溶性有機溶劑可以，例如是短鏈醇類諸如甲醇；乙醇；丙-1-醇；丙-2-醇；醛或酮類諸如丙酮，酯類諸如乳酸乙酯，醚類諸如四氫呋喃，二醇諸如2-甲基-2，4-戊二醇，1，5-戊二醇，和各種大小的聚乙二醇(PEGS)和多元醇；或其任何組合或其混合物。通常，對于藥物制劑的制備而言，溶劑應該是無毒的并且通常被視為是安全的(GRAS)諸如3類溶劑，但是對于其它應用而言，可以使用溶劑諸如乙腈。
在某些情形中，所述有機溶劑可以用生物活性分子和/或共沉淀劑來預飽和以確保在添加水溶液后，將兩種成分一起沉淀出來。這減少了溶劑的材料損失并且控制了每個顆粒的生物活性分子負載，因此使配劑更容易。溶劑的選擇可以導致具有不同大小或形狀的微晶。其還可以影響蛋白質(zhì)結(jié)合到晶體上的效率。
所述涂層還可以包含納米顆粒作為佐劑，或載體或改變生物活性分子的生物利用率。納米顆粒或它們的前體可以有利地包括在第一水溶液中和/或第三溶劑中以在共沉淀前從生物活性分子中將它們分離出來。制備自聚合物、生物分子和有機和無機材料的適合的納米顆粒是本領(lǐng)域已知的應該理解術(shù)語“混合”指一種方法的步驟，其中水混溶性有機溶劑和水溶液可以非常迅速地組合或攪拌在一起。優(yōu)選地，這應該提供接近均一的混合物，其在明顯的微晶生長可以發(fā)生前被排出混合室。因此，結(jié)晶非?？焖俚墓渤恋韯┎贿m合于用在三-液流的連續(xù)流動混合裝置中，因為晶體生長在混合室中可能是顯著的。這可能有利于共沉淀劑和生物活性分子的顆粒融合和/或分別沉淀。快速結(jié)晶共沉淀劑可以，例如是離子鹽。
典型地，包含共沉淀劑分子的第一水溶液和包含生物活性分子的第二水溶液的混合可以發(fā)生在這樣的過程中，其中生物活性分子和共沉淀劑的連續(xù)的水性液流與包含水混溶性有機溶劑的更大得多的體積的第三溶液混合在一起。從混合裝置中流出的合并的混合物典型地包含超過約75vol％的溶劑，優(yōu)選地超過約85vol％的溶劑，最優(yōu)選地介于約90和約99.5vol％的溶劑。水可混溶溶劑液流可以包含少于約5vol％的水和/或基本上用共沉淀劑飽和以協(xié)助共沉淀。
有利地，可以使用在各種壓力包括大氣壓下的收集容器收集作為在溶劑中的混懸液的微晶。
相對于形成用于藥物應用的顆粒的常規(guī)方法諸如噴干或超臨界流體處理，在接近于周圍環(huán)境的條件下進行連續(xù)法可以減少成本和操作費用。意欲可以以這種方式在工業(yè)規(guī)模上產(chǎn)生大量生物活性分子包被的顆粒。
在連續(xù)的共沉淀方法中，第一個泵可以連續(xù)遞送包含共沉淀劑分子的第一水溶液，第二個泵可以連續(xù)遞送包含生物活性分子的第二水溶液，第三個泵可以連續(xù)遞送包含水可混溶溶劑的第三溶液。如果需要引入另外的成分諸如涂布或交聯(lián)化合物或聚合物，可以使用另外的泵。可能必要的是通過連續(xù)地連接第一個的第二個混合裝置將這些溶液引入從而使微晶的形成不受干擾。管的長度可以改變以確保微晶的形成完成或中斷。涂布或交聯(lián)可以用于改變微晶顯示的溶解度，生物活性和生物利用率。備選地，生物活性分子溶液可以在第一混合裝置中混合以過量溶劑，并接著將該混合物泵送到第二混合裝置中并混合以共沉淀劑或共沉淀劑溶液可以在第一混合裝置中混合以過量溶劑并且接著將該混合物泵送到第二混合裝置中，并混合以生物活性分子溶液。這些備選的混合方式可以用于控制顆粒的大小和/或生物活性分子與形成的微晶的結(jié)合效率。所述泵可以是任何適合類型的，但是必須精確和準確地以限定的流速遞送溶液并與所用的生物活性分子相容。方便地，可以使用HPLC泵等因為對于在流速范圍內(nèi)遞送水溶液和水可混溶溶劑，這些是被優(yōu)化的。優(yōu)選地，所述泵顯示接近無脈沖(pulse-less)的操作以確保兩種水溶液的相對流速保持不變，因為這將影響負載。備選地，可以使用蠕動型或離心型泵，因為這些也可以用于精確地遞送水流和溶劑流并可以具有減少費用和容易清潔的優(yōu)勢。因為在流速上、清潔和溶劑相容性中的差異，使用不同類型的泵來遞送不同的進入流可能是有利的。
典型地，可以以介于約0.1ml/min和約1000ml/min之間的流速遞送水溶液。對于篩選應用而言，水溶液將優(yōu)選地以介于約0.2ml/min和約20ml/min之間的流速進行遞送，對于制備，水溶液將典型地以介于約2ml/min和約1000ml/min之間或優(yōu)選地介于約5ml/min和約1000ml/min之間的流速進行遞送。水泵的閘首和管路可以由抗生物活性分子污垢的材料制成。所述水可混溶溶劑的遞送通?？梢钥煊谒芤杭s4-100倍，并且要求更少的精確性，因此可能需要更有力/有效的泵諸如離心泵。典型地，所述溶劑的可以以在約2ml/min和約20,000ml/min之間的流速遞送，對于篩選應用，優(yōu)選地以介于約2ml/min和約200ml/min之間的流速進行遞送。對于制備，溶劑的遞送可以優(yōu)選地介于約20ml/min和約20,000ml/min之間，更優(yōu)選地介于約500ml/min和約20,000ml/min之間。
混合裝置可以提供將第一和第二水溶液的兩種連續(xù)的水流與包含水可混溶溶劑流的第三溶液的連續(xù)流快速和緊密混合從而使沉淀幾乎立即開始發(fā)生的方法。
混合裝置可以是獲得三種溶液的快速混合的任何裝置。因此，其可以，例如，是通過使進入的液體流型諸如通過同軸、T形、Y形或更復雜的幾何形狀成形/合并或碰撞操作的靜止裝置，或活躍地將三股流體流攪拌在一起或合并的動態(tài)裝置。在動態(tài)裝置中，可以通過使用許多種方法諸如攪拌，聲波振蕩，搖動或相似方法來攪動三流。攪拌方法包括漿式攪拌器，螺旋和磁力攪拌器。如果使用磁力攪拌，可以使用具有不同外形的攪拌棒諸如，例如單棒條或Maltese十字管。優(yōu)選地可以選擇排列在混合裝置內(nèi)部的材料從而防止生物活性分子或顆粒顯著結(jié)合在其上。適當?shù)牟牧峡梢园ㄡt(yī)用不銹鋼，鈦，玻璃，聚硅氧烷和特氟隆(已注冊的商標)。
或者，混合裝置可以使第一或第二水溶液與第三溶液混合，隨后加入余下的第一和第二水溶液。
根據(jù)需要的生產(chǎn)規(guī)模，可以生產(chǎn)不同大小和幾何形狀的混合裝置。需要的混合室的大小是溶劑流的流速的函數(shù)。對于大約0.025-10ml/min的水溶液和約2.5-200ml/min的溶劑的流速，適合使用約0.2ml的混合室。對于更高的流速，成比例放大的混合室或裝置諸如約1.0-10.0ml可以是優(yōu)選的。
典型地，在連續(xù)法中，將生物活性分子和共沉淀劑溶液加入過量水混溶性有機溶劑中。這需要將較小體積的水溶液加入較大體積的過量有機溶劑中從而使來自生物活性分子/共沉淀劑溶液中的水快速稀釋到有機溶劑中，所述稀釋的發(fā)生伴隨生物活性分子的快速脫水和微晶的形成。
進行沉淀作用的溫度可以是變化的。例如，水溶液和溶劑可以被加熱或冷卻。當生物活性分子是脆性時，生物活性分子溶液和有機溶劑的冷卻可以是有效的?；蛘呷軇┖退曰旌衔锟梢栽诓煌臏囟取＠?，加熱共沉淀劑溶液從而可以獲得高共沉淀劑濃度同時將溶劑保持在室溫，將生物活性分子保持在減少的溫度諸如少于約10℃上可以是優(yōu)選的。如果必要，溶劑可以保持在低于水性混合物凝固點的溫度上。而且，壓力也可以是變化的，例如，更高的壓力可以用于減少溶劑的揮發(fā)性。
在將生物活性分子/共沉淀劑溶液與過量的水混溶性有機溶劑混合后，生物活性和共沉淀劑的共沉淀迅速發(fā)生。典型地，在約1-5分鐘的最初時期后，在合并三股液流少于約30秒，最典型地在少于約10秒后，從混合器中流出的混合物由于微晶的存在而變得輕度的不透明。如果必要，接種方法可以用于起動混合裝置。例如，流動可以暫時停止，接著重新開始。
如果需要，可以通過用新鮮有機溶劑漂洗來使沉淀的顆粒被進一步脫水，所述有機溶劑可以是無水或包含低量水的。優(yōu)選地，使用0.5-8％的水含量的溶劑。在該范圍內(nèi)，生物活性分子通常有利地保持更高的生物活性。漂洗可以用于去除在共沉淀劑中飽和的殘余溶劑。在干燥后，這種殘余的共沉淀劑可將顆粒粘合在一起，導致團聚體的形成。在干燥或貯存前，用賦形劑的溶液漂洗還可以用于將其它的賦形劑引入顆粒中。
已經(jīng)有利地發(fā)現(xiàn)可以將沉淀的微晶貯藏于有機溶劑中，并且生物活性分子在持續(xù)時間周期內(nèi)顯示極端良好的活性和穩(wěn)定性的保留。而且，貯藏在有機溶劑中的沉淀的生物活性分子將典型地耐受細菌的侵襲，因此增加了它們的貯藏期限。
隨時間推移，共沉淀物將會沉降下來，這使?jié)饪s的微晶混懸液的回收通過潷去過量的溶劑容易地進行。但是，所述共沉淀物可以經(jīng)過，例如，離心和/或過濾以更快速地回收沉淀的顆粒?？梢詫⒈绢I(lǐng)域已知的傳統(tǒng)干燥方法諸如風干，真空干燥或流化床干燥用于蒸發(fā)任何殘余溶劑以留下無溶劑的微晶。
或者，使用壓縮氣體諸如氫氟碳(hydrofluorocarbons)如HFA-134a或超臨界流體諸如超臨界CO2可以在干燥程序中將溶劑從微晶中去除溶劑。典型地，可以將在三液流連續(xù)法中制備的溶劑中的微晶裝載到高壓室中，伴隨壓縮氣體或超臨界流體諸如CO2流經(jīng)混懸液直到溶劑(或盡可能)已經(jīng)被去除。氫氟碳諸如HFA-134a或HFA-227的壓縮氣體將溶解在共沉淀劑溶劑中并且可以流通直到濃度已經(jīng)達到需要的水平。接著，可以釋放壓力以提供干粉或作為混懸液的在HFA中的顆粒。在氫氟碳中的生物活性包被的微晶的混懸液可以適合于多劑量的吸入器裝置(MDI)。這項技術(shù)實質(zhì)上從微晶中去除所有殘余溶劑。這對于藥物制劑有著特別的好處，因為殘余溶劑可能導致意外的生理影響?；鞈乙旱膲嚎s氣體或超臨界流體干燥的另一優(yōu)勢是其可以用于生產(chǎn)粉末和藥物制劑，所述粉末和藥物制劑與通過其它分離技術(shù)獲得的相比，具有更低的堆積密度。典型地，可以獲得低于約0.1g/ml的堆積密度。低堆積密度制劑在生物活性分子的肺傳遞中特別有效，因為它們通常包含更少的強結(jié)合團聚體?？梢栽诒绢I(lǐng)域已知的許多不同方法中進行臨界點干燥或壓縮氣體提取。
因此，建立連續(xù)共沉淀系統(tǒng)從而形成按照第一個方面的微晶和，事實上任何其它類型的顆粒，隨后使用壓縮氣體或超臨界流體如超臨界CO2干燥這些顆粒是可能的。
對于藥物應用，在使用前，可以將干燥的沉淀的顆粒(即，微晶)在滅菌條件下，典型地引入滅菌遞送裝置中或小瓶中?；蛘?，可以將顆粒在滅菌條件下作為溶劑中的混懸液轉(zhuǎn)移到滅菌遞送裝置或小瓶中。然后，可以使用例如HFA或超臨界CO2干燥對它們進行任選地原位干燥。
本文所述的方法還可以將水溶液中存在的有機可溶組分從生物活性分子中分離出來?？赡苄枰蝗コ牡湫偷慕M分包括緩沖劑，表面活性劑，疏水生物分子諸如脂質(zhì)或脂蛋白和變性劑。例如，可以將緩沖劑諸如Tris在沉淀過程中從生物活性分子中分離出來，所述Tris其游離堿形式在有機溶劑如乙醇中是可溶的。但是，通過將另一種有機可溶堿加入水溶液或有機溶劑中來將緩沖劑轉(zhuǎn)變成游離堿形式可能是必須的。因此，本發(fā)明還公開了從生物活性分子中去除不需要的組分從而使不需要的組分不與生物活性分子一起共沉淀，因此仍溶解在有機相中的有效連續(xù)方法。這可以通過在非-吸濕性包被的顆粒的生物活性分子沉淀之前將添加劑諸如酸，堿，離子配對和鰲合試劑包含在水性或有機溶劑中來實現(xiàn)。這些生物活性分子可以因此以高純形式被包被。
可以在許多劑量強度上典型地產(chǎn)生本發(fā)明所述的制劑。劑量可以通過將每顆粒的生物活性分子的百分重量從低于約0.1wt％變化到高達約50wt％來適宜地進行變化。使用三液流連續(xù)流動沉淀器的特別的優(yōu)勢是可能容易地改變生物活性分子的負載。這對于在正常緩沖水溶液中可具有高溶解度但是在存在共沉淀劑的情況下溶解度較差的生物活性分子，特別如此。例如，可能的是將共沉淀劑的濃縮溶液以比生物活性分子的速率更慢的速率引入混合器中，從而可獲得，與用混合物開始相比，更高的負載。載體溶解度可以提供產(chǎn)生在約50wt％到少于約1wt％或甚至少于約＜0.1wt％的負載上包含生物活性分子的可能性從而使藥物制劑的劑量強度可以適宜地進行變化。室溫下，載體在水溶液中的溶解度可以從約2到200mg/ml并且更優(yōu)選地在約10-150mg/ml的范圍內(nèi)。
高負載的生物活性分子包被的微晶提供濃縮生物活性分子的方便的方法。因此，用低溶解度共沉淀劑制備的微晶可以以高濃度以這樣的水平懸浮在水溶液中，從而使共沉淀劑的溶解度局限明顯被超越。在表面上的生物活性分子可以繼續(xù)溶解在水中以產(chǎn)生可以容易地從殘余的核心微晶中分離出來的濃縮的溶液。谷氨酰胺由于其在水溶液中的低溶解度成為對于該方法而言優(yōu)選的共沉淀劑。例如，如果使用5mg/ml的生物活性分子溶液制備約20wt％負載的谷氨酰胺微晶，那么約125mg的這些晶體在水溶液中的混懸液可以產(chǎn)生在飽和的谷氨酰胺溶液中的約25mg/ml的生物活性分子，相應于約5倍的濃縮步驟。使用這種類型的方法，可能的是獲得生物活性分子的濃度的約2-20倍的增加。與其它濃縮技術(shù)諸如超濾或凍干相比，這可以提供費用或時間優(yōu)勢。
用高流速混合器，可以將少于約160mg/ml或優(yōu)選地少于80mg/ml的共沉淀劑濃度有利地用于產(chǎn)生包含自由流動顆粒的藥物制劑。所述顆粒典型地具有平均顆粒大小少于約50微米的窄大小分布。可以在更高的溫度上使用更高的濃度。包含窄大小分布范圍的包被晶體的制劑提供改善的遞送再現(xiàn)性和因此更好的臨床表現(xiàn)。
通過將水溶液和有機溶液在混合進容納的(contained)滅菌環(huán)境之前經(jīng)過約0.2微米濾器進行預過濾來適宜地產(chǎn)生無菌形式的所述藥物制劑。藥物制劑應該基本沒有有害殘余溶劑，并且本發(fā)明在常規(guī)干燥程序后典型地提供包含少于約0.5wt％的3類溶劑的粉末。通過真空干燥或風干和通過使壓縮氣體或超臨界流體諸如CO2流經(jīng)微晶在無水水混溶性和CO2可混溶溶劑中的混懸液，可以獲得基本較低的溶劑水平。
使用比典型生物大分子小得多的水溶性生物活性化合物，還可以將本方法用于制備適合于藥物制劑的生物活性分子包被的微晶?？梢酝ㄟ^分批法或連續(xù)法來制備這些制劑，并且可以方便地使用非-吸濕性的載體，諸如D，L-纈氨酸?？梢允褂盟扇苄陨锘钚运幬锇ɑ诎被擒盏目股刂T如硫酸妥布霉素、丁胺卡那霉素、慶大霉素和kanomycin，或抗微生物肽諸如Novispirin，和plectasin。優(yōu)選地，生物活性分子可以是極性的并且包含一個或多個在用于共沉淀的pH上可以被離子化的官能團。該生物活性分子還優(yōu)選地具有最大的大小，其比由結(jié)晶體上的核心物質(zhì)形成的晶胞具有更大的尺寸。這將促使生物活性分子包被的微晶的形成，并且使生物活性分子包含在晶格中的可能性最小化。
從上述描述清楚的是，可以改變可能改變包被的微晶的物理性質(zhì)和生物活性分子的生物活性和生物利用率的許多不同的參數(shù)。
按照本發(fā)明的第二個方面，本發(fā)明提供包含顆粒的藥物制劑，其中所述顆粒包含一個或多個微晶，所述微晶包含(b)從共沉淀劑分子形成的基本非-吸濕性的內(nèi)部晶核；和(c)包含一個或多個生物活性分子的外涂層；其中通過基本上同時混合包含共沉淀劑分子的第一水溶液，包含生物活性分子的第二水溶液和包含水可混溶溶劑的第三溶液在單一連續(xù)法中形成包被的微晶；或?qū)⒌谝缓偷诙芤褐械娜我换旌弦缘谌芤?，隨后混合以余下的第一和第二水溶液中的任一種形成包被的微晶。
本文中的基本上非-吸濕性意為晶核不容易吸收和保留水分。典型地，在室溫下曝露于大于約50％的相對濕度，優(yōu)選地大于約80％相對濕度上時，所述顆粒將不會聚集，并且核心也不會在形態(tài)或結(jié)晶度上有顯著改變。
就晶核來說，其意為將組成分子或離子構(gòu)成重復對稱的固體3-維的晶格，所述晶格可以通過粉末X-射線衍射進行鑒定。典型地，在差示掃描量熱器(DSC)上加熱顆粒時可以觀察到清晰的熔化吸熱(即，非玻璃化轉(zhuǎn)變)。這是眾所周知的顯示結(jié)晶度的特性，并且還顯示晶核可以通?；旧嫌晒虘B(tài)相所組成，所述固態(tài)相在室溫和環(huán)境濕度條件下是熱力學穩(wěn)定的。
至于連續(xù)法，指提供晶核的分子和提供外涂層的生物活性分子一起直接以包被的顆粒的形式從溶液中沉淀出來。這明顯地不同于模板方法，在所述模板方法中預形成的晶體被處理，并接著暴露于包被物質(zhì)。所謂一步法，其意為不需要單獨的涂布或研磨步驟。還應該理解顆粒的形成不需要任何蒸發(fā)的方法諸如，例如噴霧干燥法或冷凍干燥法。其也不需要超臨界流體，其中顆粒的形成發(fā)生在具有基本上相似的密度的可充分混溶的常規(guī)溶劑的混合物中。
可以將顆粒用于醫(yī)學應用諸如治療或診斷方法中諸如以試劑盒形式從而檢測，例如，疾病的存在。疾病可以包括肺部的疾病諸如肺癌，肺炎，支氣管炎等，其中可以將所述顆粒遞送到肺部并且測試肺的容量/效率，或鑒定致病劑(disease causing agents)?？梢詫⑺鲱w粒用于獸醫(yī)應用中。
典型地，生物活性分子的包被可以是基本連續(xù)的?；蛘?，使藥物制劑包括具有生物活性分子的基本不連續(xù)涂層的顆粒可能是有利的。該涂層還可以在厚度上變化，并且可以在大約0.01-1000微米，大約1-100微米，大約5-50微米或大約10-20微米范圍內(nèi)變化。所述生物活性分子的涂層可以是連續(xù)的或不連續(xù)的。
所述藥物制劑可以理想地包括具有窄大小分布的顆粒。典型地，藥物制劑因此可以包括具有有效數(shù)目的顆粒的基本均一的系統(tǒng)，這些顆粒具有通常相同或相似的大小。
通過連續(xù)法產(chǎn)生的微晶和生物活性分子包被的微晶典型地顯示跨度少于2，優(yōu)選地少于1.8并且更優(yōu)選少于1.5的窄大小分布，如通過動態(tài)激光掃射所評估。通過共沉淀產(chǎn)生的生物活性分子包被的微晶典型地比通過純載體物質(zhì)沉淀產(chǎn)生的微晶要有利地更小。這與微晶表面上生物活性分子的涂層相一致。如下計算跨度值d(0.1)(μm)＝10％的顆粒尺寸低于該顆粒大小。
d(0.5)(μm)＝50％的顆粒尺寸高于和低于該顆粒大小。
d(0.9)(μm)＝90％的顆粒尺寸低于該顆粒大小。
跨度＝d(0.9)-d(0.1)/d(0.5)。
顆?？梢跃哂猩儆诩s80μm，優(yōu)選地少于約50μm或更優(yōu)選地少于約20μm的最大截面尺寸。最大截面尺寸是指在直徑上相對的點之間可以測量的最大距離。
組成晶核的分子可以典型地每個都具有少于約2kDa的分子量。優(yōu)選地，組成晶核的分子可以典型地每個都具有少于約1kDa的分子量。更優(yōu)選地，組成晶核的分子可以典型地每個都具有少于500道爾頓的分子量。優(yōu)選的分子是可以快速被核化從而在經(jīng)過沉淀作用后形成晶體的那些。提供基本由非晶狀的團聚體或玻璃組成的顆粒的分子因此通常不適合作為核心物質(zhì)。
典型地，在室溫，形成晶核的分子在水中的溶解度少于約150mg/ml，優(yōu)選地少于約80mg/ml。意外地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)溶解度低于這些值的分子傾向于產(chǎn)生具有改善的流動特性的晶體。通常優(yōu)選自由流動的顆粒用在許多藥物制備方法中，因為它們，例如有利于用精確劑量填充膠囊并且可以方便地用于進一步的操作諸如包被中。通常自由流動的顆粒具有規(guī)則的大小和尺寸，以及低靜電荷。具有高長寬比的針狀晶體通常是，例如不自由流動的并且因此在某些制劑中不是優(yōu)選的。
組成晶核的分子可以，例如，是氨基酸，兩性離子，肽，糖，緩沖成分，水溶性藥物，有機和無機鹽，形成強氫鍵晶格的化合物或它們的衍生物或任何組合。典型地，選擇這些分子從而將在向受者使用后的不利生理反應減到最小。
適合于形成晶核的氨基酸是天然或非天然的，并可以以純的對映異構(gòu)體或消旋體形式存在。實例包括丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，甘氨酸，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，正亮氨酸，D-纈氨酸，L-纈氨酸，D，L-纈氨酸的混合物，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸和絲氨酸，?；撬峄蛉魏嗡鼈兊慕M合。特別地，優(yōu)選L-谷氨酰胺，L-組氨酸，L-絲氨酸，L-甲硫氨酸，L-異亮氨酸，?；撬?，L-纈氨酸或D，L-纈氨酸。對于其側(cè)鏈在共沉淀條件下基本電離的氨基酸來說，使用平衡離子是優(yōu)選的，所述平衡離子產(chǎn)生具有低溶解度并且是非吸濕性的結(jié)晶鹽。形成晶核的其它分子和鹽的實例可以包括，但不限于α-乳糖，β-乳糖，甘露糖醇，碳酸氫銨，谷氨酸鈉，磷酸精氨酸和甜菜堿。
典型地，形成晶核的分子在水中具有低溶解度，例如在約25℃，所述溶解度介于約12-150mg/ml之間和優(yōu)選地約20-80mg/ml之間。還可以將溶解度超過約150mg/ml的分子用于獲得自由流動的顆粒，條件是它們是從亞飽和的水溶液中共沉淀出來的。優(yōu)選地，它們在約150mg/ml或更低和更優(yōu)選地約80mg/ml或更低的濃度上共沉淀。對于在25℃具有高水溶解度的分子，使用較低共沉淀溫度諸如約10℃或約4℃從而使它們在150mg/ml或更低的濃度上更接近飽和可能也是有利的。類似地，可以將更高的溫度諸如35℃或50℃用于核心形成的分子的共沉淀，所述分子在25℃具有較差溶解度。
形成晶核的分子具有高于約90℃，諸如高于約120℃和優(yōu)選地高于約150℃的熔點。具有高熔點意味著形成的晶體具有高晶格能。高晶格能增加了形成的顆粒具有在表面包被生物活性分子的晶核的可能性并且將傾向于使所述顆粒的非晶形內(nèi)容物減到最少。當暴露于高濕度或溫度時，包含非晶形物質(zhì)的顆?？梢栽谖锢硖匦陨显獾讲幌Ｍ母淖儯⑶疫@可以導致在藥物制劑中不理想的生物活性和溶解度的變化。因此，利用會形成具有高熔點的顆粒的共沉淀劑是有利的，因為這些將傾向于形成更穩(wěn)定的藥物制劑。高熔點共沉淀劑通常還具有減少的水溶解度并且因此可以更適合于在優(yōu)選的濃度范圍內(nèi)進行共沉淀。
結(jié)晶非常迅速的共沉淀劑諸如例如無機鹽諸如硫酸鉀可能不適合于用在3管路方法中。
適宜地，在晶核上形成涂層的生物活性分子可以選自任何能產(chǎn)生治療效應諸如例如活性藥物成分(API)或診斷效應的分子。治療效應意為任何這樣的效應，其治愈，減輕，去除或減少人類或動物身體的任何疾病或功能失常的癥狀，或預防或減少人類或動物身體的感染任何疾病或功能失常的可能性，因此所述效應涵蓋預防效應。
生物活性分子的涂層還可以包括常用于藥物制劑中的賦形劑，諸如穩(wěn)定劑，表面活性劑，等滲改性劑和pH/緩沖劑。在疫苗的情形中，生物活性分子涂層還可以包括減少水溶解度和增加免疫應答的交聯(lián)劑分子和佐劑。
生物活性分子可以，例如，是任何藥物，肽，多肽，蛋白質(zhì)，核酸，糖，疫苗成分，或任何它們的衍生物或綴合物或任何產(chǎn)生治療效應的任何組合。
生物活性分子的實例包括，但不限于藥物諸如消炎藥，抗癌藥，抗精神病藥，抗細菌藥，抗真菌藥；天然或非天然肽；蛋白質(zhì)諸如胰島素，α1-抗胰蛋白酶，α-胰凝乳蛋白酶，白蛋白，干擾素，抗體，融合蛋白諸如Fc-融合蛋白，蛋白質(zhì)-藥物綴合物；核酸諸如天然來源的基因片段，質(zhì)粒，DNA，RNA或RNAi或合成的諸如寡核苷酸和反義核苷酸；糖諸如任何單糖，二糖或多糖；質(zhì)粒；蛋白質(zhì)/肽-藥物綴合物例如抗體片段(諸如Fc片段-藥物綴合物)。適合的藥物可以，例如是針對肺結(jié)核的活性劑諸如capreomcin。
本發(fā)明的生物活性分子還可以以蛋白質(zhì)-肽-藥物綴合物的形式存在，其中藥物或其它適合的活性生物分子通過適合的結(jié)合方式，諸如通過例如在蛋白質(zhì)/肽和藥物上的反應性基團的共價結(jié)合來綴合于蛋白質(zhì)/肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員將充分認識到本領(lǐng)域已知的合成這些綴合物的技術(shù)?？梢栽O計這些綴合物的蛋白質(zhì)/肽成分以有利于進入細胞并且所述綴合物的蛋白質(zhì)/肽成分可以是，例如本領(lǐng)域已知的TAT或charriot。其它有利于進入細胞的肽公開于例如WO01/41811，US5,807,746，和WO99/05302，將其并入本文作為參考。用于在肺的中心區(qū)域的促進活性吸收的特別優(yōu)選的肽可以基于抗體分子，尤其是IgG的Fc片段，或其它抗體片段，其已經(jīng)顯示在中央肺(central lung)的主動運輸。類似地，可以以類似方式使用綴合于納米顆粒的生物活性分子。
一旦被引入受體，核酸可以，例如能夠表達。因此核酸可以包括適合的調(diào)節(jié)控制元件(例如啟動子，增強子，終止子等)以控制核酸的表達。生物活性分子還可以是天然或合成治療試劑的化學修飾衍生物，諸如PEG-蛋白質(zhì)。
可以將核酸包括在載體諸如質(zhì)粒，噬菌?；虿《据d體中?？梢允褂萌魏伪绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的適合載體。
疫苗包被成分可以，例如包括病原體，例如細菌或病毒的抗原成分，諸如白喉類毒素和/或破傷風類毒素。這些疫苗制劑的特別優(yōu)勢是在暴露于高溫時，與常規(guī)液體制劑相比，它們通常顯示大大增加的穩(wěn)定性。按照本發(fā)明制備的這些制劑可以，例如，暴露于45℃以上的溫度達48個小時，并且體內(nèi)測試時保持它們激發(fā)(illicit)免疫應答的能力，而發(fā)現(xiàn)標準液體樣品通常徹底失活。顯示高溫穩(wěn)定性的疫苗不需要冷凍，因此特別是在發(fā)展中國家就貯藏和易于銷售來說提供了相當可觀的節(jié)省費用。疫苗在預防和/或治療由病原微生物造成的感染中是有效的，所述感染包括病毒的感染，真菌的感染，原生動物的感染，阿米巴感染和細菌的感染等。可以按照本發(fā)明制備的疫苗制劑的實例包括亞單位的，減毒或滅活的生物疫苗，其包括，但不限于，白喉，破傷風，瘟疫，炭疽，脊髓灰質(zhì)炎，百日咳(pertussus)和甲型、乙型和丙型肝炎，HIV，狂犬病和流行性感冒。
疫苗包被的微晶的制劑諸如白喉類毒素(taxoid)包被的D，L-纈氨酸或L-谷氨酰胺晶體可以在不同條件范圍下貯存，并且將其重構(gòu)和接種后，可以發(fā)現(xiàn)激發(fā)強烈的初次免疫應答反應和再次免疫應答反應?；蛘?，可以將疫苗包被的晶體配制為干粉以通過許多其它的路徑遞送到受者，所述路徑包括腸胃外的，肺的和鼻的施用。經(jīng)過肺的遞送對于非常年幼的兒童可以是特別有效的。
按照本發(fā)明的顆粒還可以應用在多糖連接的蛋白質(zhì)諸如HiB(haemopholisB型流行性感冒)和肺炎球菌疫苗和活病毒疫苗，諸如流行性腮腺炎，麻疹和風疹的施用中。還可以將按照本發(fā)明的顆粒與現(xiàn)代流感疫苗成分諸如MV A導向(vectored)流行性感冒疫苗一起進行制備。
此外，可以將疫苗成分包被的微晶用于疫苗的制劑，所述制劑針對癌癥，特別是人類癌癥開發(fā)，所述癌癥包括黑素瘤；皮膚癌；肺癌；乳腺癌；結(jié)腸癌和其它癌癥。如本文所述，肺用的制劑可以特別適合于肺癌的治療。應當指出，除了基于蛋白質(zhì)的疫苗(即蛋白質(zhì)/肽成分包被在內(nèi)部基本非-吸濕的晶核上)，還可以將基于核酸的疫苗制劑按照本發(fā)明進行制備，其中將核酸分子包被在內(nèi)部基本非-吸濕性的晶核上。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的具有有利特性的非-吸濕包被的顆粒的實例包括那些具有如下的顆粒具有D，L-纈氨酸晶核和胰島素涂層；L-甘氨酸晶核和抗胰蛋白酶涂層；谷氨酸鈉晶核和胰島素涂層；L-甲硫氨酸晶核和胰島素涂層；L-丙氨酸晶核和胰島素涂層；L-纈氨酸晶核和胰島素涂層；L-組氨酸晶核和胰島素涂層；L-甘氨酸晶核和α-抗胰蛋白酶涂層；L-谷氨酰胺晶核和白蛋白涂層；D，L-纈氨酸晶核和寡核苷酸DQA-HEX涂層；D，L-纈氨酸晶核和具有另外的N-乙?；腚装彼岬目寡趸瘎┩馔繉拥摩?-抗胰蛋白酶涂層；D，L-纈氨酸晶核和卵清蛋白涂層；L-谷氨酰胺的晶核和卵清蛋白涂層，D，L-纈氨酸晶核和白喉類毒素(diptheria taxoid)涂層；L-谷氨酰胺的晶核和白喉類毒素涂層；D，L-纈氨酸晶核和白喉類毒素涂層；L-谷氨酰胺的晶核和破傷風類毒素涂層；D，L-纈氨酸晶核和白喉類毒素和破傷風類毒素混合物涂層；L-谷氨酰胺晶核和白喉類毒素和破傷風類毒素混合物涂層。
典型地，在微細控制條件下形成的一批顆粒由基本都顯示相同形態(tài)或晶體形狀的并具有窄大小分布的單獨微晶組成。這可以方便地在SEM圖像中觀察到，并通過顆粒大小測量進行證實。按照本發(fā)明的微晶典型地具有最大截面尺寸，并且最大尺寸少于約80微米。它們具有優(yōu)選地少于約40微米的，更優(yōu)選地少于20微米的最大截面尺寸。最優(yōu)選最大截面尺寸介于約0.5和約20微米之間的顆粒?；蛘撸梢孕纬上嗨拼笮〉奈⒕У那蛐螆F聚體的自由流動的粉末，所述微晶的最大截面尺寸少于約50微米并且優(yōu)選地少于約20微米。形成的具有優(yōu)選共沉淀劑的顆粒的顯著方面是在暴露于高濕度諸如高達80％RH時，它們的大小和形態(tài)基本保持不變。此外，在再干燥后，它們的自由流動特性和空氣動力學特性可以保持。
通過在共沉淀前改變起始水溶液中生物活性分子和核心分子的比率，可以方便地改變包被在每個顆粒上的生物活性分子的數(shù)量。典型地，生物活性分子將組成介于約0.1wt％和約50wt％之間的每個包被的微晶體。更優(yōu)選地，生物活性分子在顆粒中的負載將介于約1wt％和約40wt％之間。
典型地，至少一些生物活性分子，甚至在暴露于高濕度后仍舊保持高水平的活性。
典型地，在暴露于升高的溫度時，非-吸濕性包被的顆粒是穩(wěn)定的(即，基本保持它們的生物學活性)并且在高達約60℃可以保持穩(wěn)定超過1個星期。這有助于儲藏并且顯示甚至在非-冷凍條件下，由非-吸濕性包被的顆粒形成的藥物制劑可以期望具有延長的貯存期限。
典型地，非吸濕性包被的顆粒的核心物質(zhì)在高達約80％的相對濕度上，將吸收少于約5wt％，優(yōu)選地少于約0.5wt％的水。根據(jù)負載，包括生物活性分子的顆粒將典型地吸收更多數(shù)量wt％的水。
典型地，包被在晶核上的生物活性分子保持天然或近-天然的構(gòu)型，即生物活性分子在生產(chǎn)過程中不會發(fā)生不可逆的變性。還有利地發(fā)現(xiàn)，晶核上的生物活性分子上的涂層在環(huán)境溫度或升高的溫度下導致顆粒儲藏的穩(wěn)定性增加。例如，在重構(gòu)到水性介質(zhì)后，生物活性分子典型地可以保持它的大部分生物活性。優(yōu)選地，在25℃儲藏6個月后，生物活性分子將保持大于約50％的其起始生物活性。更優(yōu)選地，生物活性分子將保持超過約80％的其生物活性和最優(yōu)選地超過95％的生物活性。
所述的微細自由流動的顆粒或混懸液典型地不粘附于玻璃瓶的壁上。顆粒典型地快速且徹底地重新溶解于水，水溶液(包含緩沖劑和鹽諸如常用于重構(gòu)的那些)或生理流體中。干燥粉末或混懸液的充分重新溶解將通常發(fā)生在少于約2分鐘內(nèi)，優(yōu)選地在少于約60秒內(nèi)并且最優(yōu)選地在少于約30秒內(nèi)。在水性緩沖液中重構(gòu)的制劑典型地是低濁度，無色的溶液，其透明度好于約15FNU并且優(yōu)選地好于約6FNU(FNU＝Formazine濁度單位)?；蛘撸谀阁w共沉淀劑的飽和的水溶液中的微晶的混懸液可以用于減緩溶解速率。
當溶解于水溶液時，常見生物活性分子需要賦形劑或穩(wěn)定劑的存在，諸如緩沖化合物，鹽，糖，表面活性劑，抗聚集劑和抗氧化劑?？梢詫⑦@些包括進起始水溶液中并且在共沉淀過程中摻入顆粒中。然后，它們將存在于顆粒的重構(gòu)上，例如作為藥物制劑出現(xiàn)。典型地，在所有的成分共沉淀后，賦形劑將在顆粒的外表面上被濃縮并且將滲透到生物活性分子的涂層中。典型的抗氧化劑可以，例如，是半胱氨酸諸如以N-乙酰基半胱氨酸形式存在的，而典型的表面活性劑可以是吐溫。在共沉淀中，由于溶解在溶劑中，賦形劑和生物活性分子的相對比率可能變化。這可以通過預先將選擇的賦形劑添加到起始水溶液，共沉淀溶劑或漂洗溶劑中進行控制，從而在干燥時，在顆粒中獲得理想的比率。因此，例如，通過包含在漂洗溶劑中，可以將有機可溶的糖或聚合物包被在蛋白質(zhì)包被的顆粒表面，從而提供提高的儲藏穩(wěn)定性?；蛘?，可以將添加劑諸如鹽或納米顆粒包括在共沉淀或漂洗溶劑中并且包被在顆粒的外表面上從而提高顆粒的物理或治療性能。例如，發(fā)現(xiàn)在干燥前，通過用在2-丙醇中的異亮氨酸的溶液來漂洗形成的微晶從而提供異亮氨酸包被的胰島素-甘氨酸顆粒是有利的。與未包被的那些相比，這些顆粒具有改善的流動和空氣動力學特性。
按照本發(fā)明的第三個方面，提供用于肺遞送的藥物制劑，其包括按照第一個方面形成的微晶。
為了使用吸入法來將藥物分子施用到血流中，根據(jù)應用，必須將藥物制作成能被遞送到中樞呼吸道或深肺中的制劑。在深肺中，生物活性分子可以被被動運輸?shù)窖髦校⑶倚蕦τ谳^大的分子傾向于更低。在其中可以發(fā)生主動運輸?shù)姆螀^(qū)中，例如通過受體介導的運輸，那么更有效地將更大的生物活性分子遞送到血流中是可能的。對于具有大于約50kDa的分子量的生物活性分子，和更優(yōu)選地對于具有大于約100kDa的分子量的分子，可以優(yōu)選這種主動運輸路徑。例如，包含具有Fc-區(qū)的抗體諸如IgG或Fc-綴合物諸如Fc-融合蛋白或Fc-藥物的生物活性分子包被的微晶可以用于遞送到中樞呼吸道。這可以通過FcRn介導的運輸或通過其它受體進行，所述其它受體例如特定地運輸其它分子諸如白蛋白。在用于遞送到深肺中的干粉末的情況中，這通常需要物質(zhì)平均(mass median)尺寸在約1-5微米范圍內(nèi)的顆粒，雖然已經(jīng)證明可以使用具有特殊空氣動力學特性的更大顆粒。對于遞送到中樞呼吸道而言，優(yōu)選具有范圍在約3-30微米的物質(zhì)平均空氣動力學直徑的更大的顆粒。這些可以通過使用如下所述的實驗技術(shù)的設計，調(diào)整共沉淀條件來在3管路共沉淀過程中有利地產(chǎn)生。要認識到因為公開的顆粒通常是非球形的，物質(zhì)平均空氣動力學直徑可以小于物質(zhì)平均幾何直徑。按照本發(fā)明的顆粒的某些制劑可以適合于形成肺用的制劑，因為可以將它們用于產(chǎn)生微細自由流動的顆粒，其非常適合于通過吸入法進行遞送。如果生物活性分子在這些非-吸濕性包被的顆粒表面上，這些顆粒通常非預期地顯示低靜電荷，并且應直接進行處理并將其作為干粉末用在遞送裝置上?；蛘撸?，可以將它們用作在霧化器(nebulisor)中的混懸液。
特別地，適合于形成肺用的藥物制劑的生物活性分子可以包括但不局限于任何如下物質(zhì)治療用蛋白質(zhì)諸如胰島素，α1-抗胰蛋白酶，干擾素；抗體和抗體片段和衍生物；治療用肽和激素；合成性和天然DNA，其包括基于DNA的藥物；酶；疫苗成分；抗生素；止痛藥(pain-killers)；水溶性藥物；水敏感性藥物；脂質(zhì)和表面活性劑；多糖；或它們的任何組合或衍生物?？梢詫w粒的肺用的藥劑直接用在吸入器裝置上以提供高度發(fā)散的劑量和高度微細的顆粒部分。因此在MSLI(工作臺(stage)1-5)上測量發(fā)散劑量典型地大于約70％，且更優(yōu)選地大于約90％。在MSLI(工作臺3-5)上測量的微細顆粒級分典型地大于約20％，并且優(yōu)選地大于約40％，更優(yōu)選地大約約55％。通常將微細顆粒級分定義為在多-工作臺液體碰撞取樣器(Multi-Stage Liquid Impinger，MSLI)的下游工作臺收集的部分，并且其對應具有適合于通過吸入施用到深肺的空氣動力學特性，即少于約3.3微米的顆粒。還可以制備靶向中樞呼吸道的肺用制劑。這些也類似地具有高度發(fā)散的劑量，但是傾向于在具有低FPF的MLSI的工作臺1-2中收集。這些可以有利地用調(diào)控權(quán)利部門批準的賦形劑諸如乳糖進行制備。肺用的制劑可以不與任何另外的制劑一起在干燥粉末遞送裝置中使用，所述另外的制劑具有例如，更大的載體顆粒諸如乳糖。
對于靶向深肺的肺用的制劑，質(zhì)量中位數(shù)氣動粒徑(mass medianaerodynamic diameters)少于約10微米，更優(yōu)選地少于約5微米的顆粒是優(yōu)選的。對于遞送到中樞呼吸道中，優(yōu)選質(zhì)量中位數(shù)氣動粒徑在約4-20微米范圍內(nèi)并且更優(yōu)選地在約5-10微米范圍內(nèi)的顆粒。這些將典型地具有與它們的質(zhì)量中位數(shù)氣動粒徑相似的質(zhì)量中位數(shù)直徑。典型地優(yōu)選對于深肺，最大截面直徑在約1-5微米范圍內(nèi)或?qū)τ谥袠泻粑?，最大截面直徑?-10微米范圍內(nèi)的自由流動的、非吸濕性低靜電的顆粒。通過使用氨基酸諸如例如，L-谷氨酰胺來形成晶核可以獲得這些。但是，發(fā)明者已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，以高長寬比薄片形式存在的生物活性分子包被的微晶可以有利地具有比它們的最大截面直徑小的質(zhì)量中位數(shù)氣動粒徑。適合的形狀可以是，例如，葉狀的或瓦狀的。關(guān)于這些顆粒，對于深肺，最大截面直徑的優(yōu)選范圍可以大于約1-5微米并且可以例如是約1-10微米。類似地，具有超過約5-10微米諸如約5-30微米的最大截面直徑的顆?？梢杂糜谶f送到中樞呼吸道中。典型地形成這種形狀的生物活性分子包被的結(jié)晶顆粒的共沉淀劑包括組氨酸和D，L-纈氨酸。因此，對于干粉肺用制劑，還優(yōu)選用產(chǎn)生高長寬比薄片的共沉淀劑制備的顆粒。
特別地，可以對可吸入的或肺用的制劑優(yōu)選地進行選擇使其具有包括氨基酸的晶核，所述氨基酸諸如纈氨酸，組氨酸，異亮氨酸，甘氨酸或谷氨酰胺，并且其，例如，包括纈氨酸的晶核和治療用蛋白質(zhì)諸如胰島素的涂層；組氨酸的晶核和酶的涂層；纈氨酸的晶核和酶抑制劑諸如α-抗胰蛋白酶的涂層；纈氨酸的晶核和DNA的涂層；纈氨酸的晶核和疫苗涂層；谷氨酰胺的晶核和疫苗涂層；谷氨酰胺的晶核和白蛋白涂層。當形成用于制備制劑的顆粒時，優(yōu)選使用產(chǎn)生在暴露于高濕度時不會聚集的離散顆粒的共沉淀劑。此外，優(yōu)選共沉淀劑在施用后不會在患者口里留下令人不快的味道。因此，高度優(yōu)選谷氨酰胺因為其可以暴露于高濕度，并具有溫和的味道。
按照本發(fā)明的第四個方面，提供腸胃外的制劑，所述制劑包括按照第一個方面形成的微晶或微晶的混懸液。
這些制劑可以通過多種方法包括靜脈內(nèi)的，皮下的或肌內(nèi)的注射來進行遞送，或可以使用在持續(xù)釋放劑或緩釋劑中。可以以經(jīng)濟有效的方法來有利地生產(chǎn)這些微晶從而提供在環(huán)境溫度下顯示延長的貯存壽命的滅菌腸胃外制劑。可以優(yōu)選地將以粉末或混懸液形式存在的制劑在少于60秒內(nèi)重構(gòu)于水溶液中，從而提供適合于注射的低濁度溶液。當生物活性分子特別地有毒或烈性因此難于作為干粉形式進行制備或操作時，可以優(yōu)選混懸液的重構(gòu)?；蛘?，可以將在溶劑諸如，例如乙醇或氫氟碳中濃縮的微晶的混懸液不經(jīng)重構(gòu)直接用于腸胃外施用。這可以為需要以極高劑型遞送從而提供治療效果的生物活性分子提供便利。這些生物活性分子可以包括治療用抗體及其衍生物。在重構(gòu)后，這些可以聚集或可以形成難于施用的高度粘性的溶液。因此可以將包含高劑量生物活性分子的顆粒的濃縮混懸液用于提供遞送這些分子的備選的更方便的和在治療上有效的方法?；鞈乙嚎梢栽谌軇┲谢蚩梢栽谟糜谥苽湮⒕У墓渤恋韯┑娘柡退芤褐兄苽?。因為其低飽和濃度，谷氨酰胺是對于該應用優(yōu)選的共沉淀劑。生物活性分子包被的顆粒特別地適合于這種施用，因為在稀釋后，它們非?？焖俚刂貥?gòu)并且顯示生物活性分子的最小限度的聚集。團聚體的施用是不理想的，因為它可以起始不利免疫應答。
適合于通過腸胃外遞送施用的生物活性分子包括在本發(fā)明第三個方面所述的那些。此外，腸胃外施用可以用于遞送更大的生物分子諸如疫苗或抗體，所述疫苗或抗體因為較差的系統(tǒng)生物利用率而不適合于經(jīng)過肺施用到受試者的血流中。優(yōu)選的晶核物質(zhì)包括常用于腸胃外制劑的賦形劑諸如甘露糖醇和蔗糖。還優(yōu)選天然氨基酸諸如L-谷氨酰胺，它們可以用于形成快速重構(gòu)的顆粒，甚至在高溫時也是穩(wěn)定的，并且易于進行處理和操作。還優(yōu)選L-谷氨酰胺，因為已經(jīng)將它以高劑量向患者施用而沒有不利的副作用。
按照本發(fā)明的第五個方面，提供持續(xù)釋放或緩釋的藥物制劑(或長效制劑)，其包括按照第一個方面的微晶或微晶的混懸液。
對于某些施用，優(yōu)選產(chǎn)生在施用后，提供持續(xù)或延長治療效應的腸胃外制劑或肺用的制劑或其它制劑。這可以，例如，用于限制在受試者血流中獲得的生物活性分子的最大濃度或用于延長重復施用之間需要的周期。或者，可能需要改變微晶的表面特性或溶解度以改善生物利用率或增加或減少免疫原性。可以將生物活性分子包被的微晶方便地用于制備持續(xù)釋放或緩釋的制劑。這可以通過包被微晶或?qū)⑺鼈儞饺肓硪环N基質(zhì)物質(zhì)諸如凝膠或聚合物中或通過將它們固定在遞送裝置內(nèi)來實現(xiàn)。
例如，使用本領(lǐng)域已知技術(shù)，可以用改變微晶成分的釋放或遞送的物質(zhì)來對每個微晶進行均勻地包被。
可以用于包被微晶的物質(zhì)，可以例如，是難水溶性的可生物降解的聚合物諸如，例如，聚丙交酯或聚乙交酯及其共聚物；聚氨基酸；水凝膠；和其它本領(lǐng)域已知的物質(zhì)，所述物質(zhì)在響應對生理條件的暴露時改變它們的溶解性或交聯(lián)的程度。例如，通過使顆粒的混懸液與包被物質(zhì)的溶液接觸，然后干燥得到的顆粒，可以進行涂層的施用。如果需要，可以重復該過程以延長釋放模式。發(fā)現(xiàn)包被的微晶可以提供生物活性分子向溶液釋放的基本不變的速率?；蛘?，通過例如，粘合劑可以將多種顆粒結(jié)合入，例如，單片劑形式。粘合劑可以溶解在溶液中，隨后當將片劑結(jié)合在一起的粘合劑逐漸溶解時，顆?？梢猿掷m(xù)釋放到溶液中。
那些本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解使用上面教導的組合，可能提供其它藥物制劑諸如例如鼻用制劑，口服制劑和局部用制劑。鼻用制劑和口服制劑可以需要使用備選物質(zhì)來包被顆粒，所述備選物質(zhì)提供對例如黏膜的粘附。
按照本發(fā)明第六個方面，提供包括微晶的吸入遞藥裝置，所述微晶按照第一個方面形成。
吸入可以通過肺或鼻進行。
肺遞藥裝置可以，例如是液體霧化器，基于氣溶膠的定量吸入器或干粉分散裝置。
按照本發(fā)明的第七個方面，提供確定制備生物活性分子包被的微晶的最佳條件的方法，其包括下列步驟制備第一批按照第一組變量參數(shù)的生物活性分子包被的微晶并量化所述生物活性分子包被的微晶的至少一個特性；通過改變至少一個變量參數(shù)制備第二批生物活性分子包被的微晶，并量化所述至少一個性質(zhì)從而能夠確定所述至少一個變化對于所述至少一個性質(zhì)具有有益還是有害的效果；任選地，可以將所述方法按照需要重復多次從而尋求獲得顯示優(yōu)化性質(zhì)的微晶。
該方法可以方便地用于篩選分批或連續(xù)法以發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)生物活性分子包被的微晶的最佳條件。發(fā)現(xiàn)三-液流連續(xù)流動沉淀器提供進行這樣的篩選過程的特別方便和有效的方法。篩選目標通常是提供對于具體應用最具吸引力的物理性質(zhì)，同時保持最大的生物活性的顆粒，但是其它的篩選也是可能的。
篩選過程可以基本上由下列步驟組成a)確定生物活性分子包被的微晶的哪些性質(zhì)對于特定應用是最理想的，并確保這些性質(zhì)可以通過一些類型的測量精確量化；b)確定預期對需要被優(yōu)化的性質(zhì)影響最大的那些參數(shù)并確保這些性質(zhì)可以被某種類型的測量準確量化；c)確定被鑒定的參數(shù)在那些范圍內(nèi)變化以及在實踐中獲得這些變化存在那些限制；d)確定有效篩選選擇的參數(shù)對需要的性質(zhì)的影響的實驗的矩陣；e)進行由實驗設計過程確定的共沉淀，并測量由產(chǎn)生的包被的微晶顯示的性質(zhì)；f)分析獲得的結(jié)果，并且如果必要，設計進一步的實驗來發(fā)現(xiàn)優(yōu)化的條件；g)任選地重復a)-f)直到制備符合確定目的的微晶。
可以被篩選的物理性質(zhì)的實例包括平均大小，平均形狀，大小分布，結(jié)晶度，溶解時間，平均空氣動力學直徑，總的發(fā)散劑量，微細顆粒級分和其它可與藥物制劑相關(guān)的可測量的參數(shù)。與生物活性的保留相關(guān)的性質(zhì)的實例包括保留在晶體上的生物活性分子的產(chǎn)率，生物活性分子的負載或劑量，濁度，聚集的程度，體外生物活性，無裂解產(chǎn)物，體外生物利用率，雜質(zhì)的水平，結(jié)構(gòu)的保留和其它可與治療應用相關(guān)的參數(shù)。可以在制備生物活性分子包被的微晶后或在貯存時期后，立即進行與需要的物理性質(zhì)或生物活性相關(guān)的測量，在所述貯存時期中，樣品可通過暴露于例如升高的溫度或濕度而受到有意(deliberately)的壓力。
令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)一般用三管路連續(xù)流動沉淀器可以最有效地進行篩選過程。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用具體的共沉淀劑/溶劑組合在連續(xù)法中成功地共沉淀生物活性分子包被的微晶取決于一些過程的參數(shù)，并且在大多數(shù)情形中，可能必要的是篩選和優(yōu)化這些因素。可以存在應該優(yōu)先進行篩選和優(yōu)化的至少三個主要的參數(shù)，這些可以是· 蛋白質(zhì)負載(％w/w)25·最終水含量(％v/v)·共沉淀劑濃度(mg/ml)發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)負載和最終水含量可影響顆粒大小和保留的生物活性的水平。發(fā)現(xiàn)起始的共沉淀劑的濃度影響可獲得的過飽和和成核作用模式，發(fā)現(xiàn)其又可以影響顆粒大小和形狀和顆粒聚集。因此，如果對于具體應用需要生物活性分子包被的微晶，發(fā)現(xiàn)這些參數(shù)的篩選可能能提供達到開始制劑的快速路徑。
發(fā)現(xiàn)也可以影響生物活性和/或顆粒特性的其它參數(shù)包括·pH·溫度(試劑溶液；混合室；產(chǎn)生的溶液)·添加劑/穩(wěn)定劑·混合效率使用這些參數(shù)進行的優(yōu)化可以例如在第二輪篩選過程中進行。該參數(shù)列表不是窮盡性的，而是舉例說明一些另外的可能被研究的參數(shù)。
研究這些參數(shù)的影響可以通過至少兩種方式來進行。首先，存在單獨篩選每個參數(shù)，保持所有其它的參數(shù)不變的簡單方法。這種反復的方法，盡管是可接受的，經(jīng)常在資金方面效率低下并且通常非常耗時。此外，長期研究可能易于發(fā)生系統(tǒng)和隨機誤差。
第二種方法使用更有效的統(tǒng)計手段，其中可以首先篩選大多數(shù)參數(shù)，隨后對最有影響的參數(shù)進行仔細優(yōu)化。通常將該方法稱為實驗設計(DoE)并發(fā)現(xiàn)其提供顯著的優(yōu)勢。在典型的研究中，可以鑒定5個參數(shù)。例如，如果需要具有特定特性的顆粒，使用目標生物活性分子/共沉淀劑/溶劑組合，那么第一個步驟可以針對以前確定的三個基本因素進行篩選，諸如例如蛋白質(zhì)負載，最終水含量和共沉淀劑濃度。此外，以前的知識可能顯示生物活性分子(例如，蛋白質(zhì))可能對pH和溫度是敏感的。因此，在開始的篩選中，可以研究5個參數(shù)。
對于每個參數(shù)，可以確定敏感的實驗范圍。這通常依賴于獲自以前類似研究的知識，但是其可能要求估計實際的可接受的水平。典型地，例如，用于測試制劑的合理的蛋白質(zhì)負載范圍可以是約0.25-10％w/w。類似地，典型的最終水含量范圍可以是約0.5-10％vv，并且典型的賦形劑濃度范圍可以是約75-90％的飽和濃度。例如，如果DL-纈氨酸在特定溫度具有約66mg/ml的飽和濃度，那么75％等價于50mg/ml；90％等價于60mg/ml。以相同的方式，可以選擇合理的pH和溫度范圍。可能優(yōu)選的是試驗和預期將給出可評估的反應變化范圍。通常，可能必要的是以相當寬的范圍諸如跨越數(shù)量級的范圍開始。此外，以前的知識將有助于該選擇過程。此外，選定的參數(shù)范圍需要在隨后的樣品分析中給出可測量的反應。因此，如果分析技術(shù)是非常敏感的，能夠報告樣品間的非常小的變化，那么可能可接受的是選擇窄的參數(shù)范圍。另一方面，如果分析技術(shù)不夠敏感或被高水平的噪聲所干擾，可以選擇寬的參數(shù)范圍。
在選擇參數(shù)和適合的范圍后，可能必須的是將選擇的因子輸入DoE軟件。最近，存在可獲得的DoE軟件的量的顯著增加，并且可在線獲得許多用于試驗目的。本發(fā)明人已經(jīng)回顧了一些實例，并得出結(jié)論對于簡單的參數(shù)研究，所有的都是可接受的。所有的軟件包具有類似的DoE輸入標準，其僅在實驗后數(shù)據(jù)分析中是多樣化的。
在本發(fā)明應用的范圍內(nèi)，使用由Umetrics提供的DoE軟件包MCDDE6。該軟件包因為其基本使用是非常簡單的而具有吸引力。實驗者可以被提示輸入選擇的實驗參數(shù)(在軟件中被稱為因子)，和被測量的分析量度(在軟件中被稱為反應)。其后，實驗者可能被提問目標研究是篩選研究還是優(yōu)化研究。根據(jù)作出的選擇，可以建議選擇可能的統(tǒng)計學研究，并且科學工作者可以被提示選擇最適合的那個。最終，可以產(chǎn)生實驗和分析的矩陣，提供工作的系統(tǒng)框架。
實驗者現(xiàn)在可以準備進行實驗，優(yōu)選地以隨機方式進行，因為這種方式可以使隨機誤差在最終的統(tǒng)計分析中的影響最小。
按照本發(fā)明的第八個方面，提供形成用于遞送到肺的特定區(qū)域的生物活性分子包被的微晶的可調(diào)節(jié)的方法，其包括(a)提供包含共沉淀劑分子的第一水溶液；(b)提供包含生物活性分子的第二水溶液；(c)提供包含水可混溶溶劑的第三溶液；(d)基本上同時混合所述第一水溶液，所述第二水溶液和所述第三溶液；或?qū)⒌谝凰芤汉偷诙芤旱娜我慌c第三溶液混合，隨后混合以余下的第一水溶液和第二水溶液的任一；從而使共沉淀劑和生物活性分子的共沉淀被起始，導致所述微晶的形成；(e)收集所述微晶的混懸液；和(f)檢測微晶的平均大小并確定這些微晶是否適合于遞送到肺的特定區(qū)域，如果微晶的平均顆粒大小不適合，改變在可調(diào)節(jié)方法中的變量參數(shù)。
可影響形成顆粒的大小的參數(shù)包括共沉淀劑的濃度，pH，溶劑，水含量，生物活性分子負載，溫度，添加劑濃度和混合效率。如果將第一和第二水溶液順序添加到溶劑中，溶液從第一混合器傳遞到第二混合器的時間也可以變化。在一些系統(tǒng)中，可能必須固定這些值中的一個或多個，但是可以將DoE用于進行余下的變量參數(shù)的有效篩選。其可以用于鑒定最影響大小和介于它們之間的任何相互作用的那些參數(shù)。可以接著將該信息用于通過反應表面建模進一步精選參數(shù)以產(chǎn)生在目標范圍內(nèi)的顆粒大小，同時還優(yōu)化生物活性和結(jié)合的效率。
按照本發(fā)明的第九個方面，提供接受形成按照任何前面的方面的生物活性分子包被的微晶的要求的方法，其包括(a)消費者限定對生物活性分子包被的微晶的要求，其包括生物活性、劑量、負載、大小、形狀和共沉淀劑的要求；(b)調(diào)節(jié)共沉淀條件以獲得如在部分(a)中限定的微晶；(c)精選共沉淀條件以獲得具有適合條件的微晶；和(d)確定適合的條件來形成需要的微晶。
典型地，可以從溶劑、pH、溫度、混合速率和濃度的任何中選擇可被改變的共沉淀條件。
在精選方法中，還可以在微晶的生物活性和完整性上進行穩(wěn)定性研究。
如果獲得的微晶不適合，可以重復步驟(b)和(c)。
按照本發(fā)明的第十個方面，提供這樣的方法，所述方法提供與形成按照任何前面的方面的生物活性分子包被的微晶的方法相關(guān)的服務，所述方法包括接受消費者形成這樣的生物活性分子包被的微晶的請求，所述生物活性分子包被的微晶符合特定的要求，包括對大小和生物活性的要求；確定形成所述生物活性分子包被的微晶的方法；和接受為向消費者提供形成生物活性分子包被的微晶的所述方法的服務的報酬。


現(xiàn)在參考附圖，僅通過實施例的方式描述本發(fā)明的實施方案，其中
圖1是這樣的圖表，其表示對于由生產(chǎn)商提供的新鮮胰蛋白酶和胰蛋白酶PCMCs的bicinchoninic acid(BCA)測試的結(jié)果，所述胰蛋白酶PCMCs通過兩管路連續(xù)的流動共沉淀器和三管路連續(xù)的流動共沉淀器產(chǎn)生；圖2是這樣的圖表，其顯示對于新鮮胰蛋白酶和胰蛋白酶PCMCs的N-p-甲苯磺?；?L-精氨酸甲酯(TAME)測定的結(jié)果，所述胰蛋白酶PCMCs通過兩管路連續(xù)的共沉淀器和三管路連續(xù)的共沉淀器產(chǎn)生；圖3是對于新鮮胰蛋白酶和PCMCs的BCA/TAME校正活性數(shù)據(jù)的圖表，所述PCMCs通過兩管路連續(xù)流動共沉淀器和三管路連續(xù)流動共沉淀器產(chǎn)生；圖4顯示獲自胰蛋白酶包被的和未包被的纈氨酸微晶的動態(tài)光散射(DLS)的顆粒大小，其通過兩管路連續(xù)流動共沉淀器和三管路連續(xù)流動共沉淀器產(chǎn)生；圖5是這樣的圖表，其顯示對于PCMCs和新鮮胰蛋白酶的范圍的bicinchoninic acid (BCA)蛋白質(zhì)負載分析的結(jié)果；圖6是顯示相對于新鮮胰蛋白酶，針對胰蛋白酶/DL-纈氨酸PCMCs的保留的酶活性的TAME結(jié)果的圖表；圖7是顯示對于胰蛋白酶/D，L-纈氨酸微晶的BCA校正保留活性的圖表；圖8顯示獲自胰蛋白酶包被的和未包被的纈氨酸微晶的動態(tài)光散射(DLS)的顆粒大小，其通過使用不同的共沉淀劑濃度獲得。
圖9是顯示在兩管路連續(xù)流動共沉淀器和三管路連續(xù)流動共沉淀器中形成的PCMCs的沉積的不同速率的圖示；圖10顯示在兩管路連續(xù)流動共沉淀器中形成的PCMCs的顆粒大小范圍；圖11顯示在三管路連續(xù)流動共沉淀器中形成的PCMCs的顆粒大小范圍；圖12是按照本發(fā)明形成的牛IgG包被的微晶的SEM圖像；和圖13是顯示肺的不同部分的圖像。
實驗結(jié)果實施例1使用三管路連續(xù)流動共沉淀器(CFCP)，共沉淀蛋白質(zhì)包被的微晶(PCMCs)綜述在被并入本文作為參考的PCT/GB2004/000044中，使用利用兩管路系統(tǒng)的PCMCs的連續(xù)流動共沉淀，其中蛋白質(zhì)和賦形劑的水溶液連續(xù)與可混溶溶劑混合。在本發(fā)明中，PCMCs通過三管路系統(tǒng)產(chǎn)生，其中PCMCs的三種組分，即蛋白質(zhì)、共沉淀劑和可混溶溶劑每種獨立地進行遞送。泵A遞送蛋白質(zhì)的緩沖水溶液，泵B遞送共沉淀劑的水溶液，泵C遞送可混溶溶劑。
實驗方法和獲得的結(jié)果在下面進行描述。將實驗標記為JV714。
該實驗的目標是比較首先通過兩管路系統(tǒng)，第二通過三管路系統(tǒng)制備的在理論上相同的PCMCs。
對于兩管路系統(tǒng)，使用如前在PCT/GB2004/001J044中報道的CFCP。將所有的泵在使用前進行校準。對于三管路系統(tǒng)，對CFCP進行改進以包括另一個泵，所述泵通過另一個進入口到達混合室的底部。如在下面報道的，相應調(diào)節(jié)流速，但是所有其它的參數(shù)保持不變。
從前面的研究中可知，確定使用胰蛋白酶DL-纈氨酸PCMCs作為模型系統(tǒng)。制備理論上2.5％w/w負載的在DL-纈氨酸上的胰蛋白酶。將PCMCs的水含量固定在4.0％v/v。將總流速固定在100ml min-1上。胰蛋白酶(批號＞81K7653)和DL-纈氨酸(批號55H1252)獲自Sigma Aldrich Co.UK。丙-2-醇(批號K32707146347)和氯化鈣(批號9930948 389)獲自BDH，Poole，UK。發(fā)現(xiàn)氯化鈣提高了胰蛋白酶在PCMC晶體表面上的停留，因此包括在該實驗中。其可以通過水性或有機溶劑引入，但是在該實驗中被包含在水性共沉淀劑混合物中。
下面的表詳述所用的每個泵遞送的流速，蛋白質(zhì)和/或共沉淀劑的濃度。
表1

必要的是確保每單位時間，確切地相同量的PCMC成分進入混合室。
對于兩管路和三管路實驗而言，如下制備單批的可混溶溶劑。將過量的DL-纈氨酸加入約2升的丙-2-醇，并在室溫下攪拌該溶液約2小時。隨后，通過0.45μm的膜濾器立即對所述溶液進行過濾。將該溶液稱為溶液4。
對于兩管路實驗，如下制備胰蛋白酶-DL-纈氨酸溶液。制備在去離子水中的2.19mg/ml CaCl2的貯存溶液。使用該貯存溶液，制備包含60mg/ml的DL-纈氨酸的溶液。最終，將胰蛋白酶加入得到1.538mg/ml的濃度。將該溶液稱為溶液1。
對于三管路實驗，制備兩種溶液。制備在去離子水中的2.5mg/mlCaCl2的貯存溶液。使用該貯存溶液，制備包含68.571mg/ml DL-纈氨酸的溶液。將該溶液稱為溶液2。
此外，制備在去離子水中的胰蛋白酶溶液，濃度為12.304mg/ml。將該溶液稱為溶液3。
如下制備兩管路PCMCs。將溶液1分別在4和96ml min-1混合以溶液4。收集25ml的PCMC。在共沉淀后約5-10分鐘，立即將PCMCs通過0.45μm的膜濾器進行過濾，并將其在溫箱中于30℃干燥約1小時。
如下制備三管路PCMCs。將溶液2，3分別以0.5，3.5和96ml min-1的流速混合以溶液4。收集25ml的PCMC。在共沉淀后約5-10分鐘，立即將PCMCs通過0.45μm的膜濾器進行過濾，并將其在溫箱中于30℃干燥約1小時。
分析使用三項分析技術(shù)來分析制備的樣品。首先使用bicinchoninic acid(BOA)比色測定法來測量在DL-纈氨酸上的胰蛋白酶的蛋白質(zhì)負載。第二，使用已知的胰蛋白酶測定法-N-p-甲苯磺?；?L-精氨酸甲酯(TAME)鹽酸鹽水解測定法來確定活性。第三，使用動態(tài)光散射(DLS)分析儀，即MalvemMastersizer測量PCMC顆粒群。
BCA測定法將約5mg的干燥物質(zhì)精確稱重到25ml的小瓶中。在理論上，蛋白質(zhì)負載應該是2.5％w/w，因此稱重的重量增加2.5％w/w。得到的值表示胰蛋白酶在PCMC樣品中的胰蛋白酶的理論上的量。用0.015mg/ml(測試濃度)除該值得到需要的稀釋度(dilution)。將PCMCs溶解在測試緩沖液(0.046MTris；0.0115M CaCl2pH8.1@25℃)。接著，如下分析每種溶液。將0.5ml的蛋白質(zhì)標準加入1.5ml的Eppendorf管中。將0.5ml的BCA工作緩沖液加入到每個Eppendorf管中。(沉淀物可以形成)。在12,000rpm離心2分鐘。在60℃的加熱模塊中放置正好15分鐘。在12,000rpm離心2分鐘。
將0.75ml吸移到微型比色槽中，并立即在562nm讀數(shù)。
TAME測試將約5mg的干燥物質(zhì)精確稱重到25ml的小瓶中。在理論上，蛋白質(zhì)負載應該是2.5％w/w，因此稱重的重量乘以2.5％w/w。得到的值表示胰蛋白酶在PCMC樣品中的胰蛋白酶的理論上的量。用0.015mg/ml(測試濃度)除該值得到需要的稀釋度(dilution)。將PCMCs溶解在水中。如下分析每種溶液。向干凈的UV石英比色杯中加入1.3ml的測試緩沖液，和150μl的0.01MTAME溶液。在25℃溫育5-10分鐘。加入50μl的PCMC稀釋液，攪拌并在247nm測試10分鐘。
動態(tài)光散射分析(DLS)分析作為PCMC混懸液和干粉的樣品，所述干粉已經(jīng)在DL-纈氨酸飽和的抗-溶劑中進行重構(gòu)。首先將儀器用反溶劑調(diào)零(blank)。隨后，將約500μl的PCMC混懸液加入以得到約12％的激光遮蔽(obscuration)。對每個樣品進行5次重復測量。
BCA測試圖1是這樣的圖表，其顯示對于由生產(chǎn)商提供的新鮮胰蛋白酶和分別通過兩管路CFCP和三管路CFCP產(chǎn)生的胰蛋白酶PCMCs的BCA測試的結(jié)果。
圖1的BCA結(jié)果顯示，在實驗誤差內(nèi)，兩管路和三管路方法沒有明顯差異。
圖2是顯示對于由生長商提供的新鮮胰蛋白酶；分別通過兩管路CFCP和三管路CFCP產(chǎn)生的胰蛋白酶PCMCs的的TAME測試結(jié)果的圖表。
如前面的BCA測試，所述TAME結(jié)果還顯示，在實驗誤差中，兩管路和三管路系統(tǒng)沒有明顯差異。圖3顯示PCMCs的蛋白質(zhì)負載(如通過BCA測試所確定)校正PCMCs的活性(如通過TAME測試所確定)的作用。
動態(tài)光散射(DLS)圖4顯示動態(tài)光散射(DLS)結(jié)果，其顯示由三管路系統(tǒng)產(chǎn)生的微晶在大小和跨度上顯著更小。
結(jié)論胰蛋白酶-DL-纈氨酸PCMCs由兩管路和三管路共沉淀方法產(chǎn)生。保持所有其它的參數(shù)保持不變。測量PCMCs的蛋白質(zhì)負載，活性，大小和跨度。從獲得的生物活性結(jié)果，兩管路和三管路系統(tǒng)沒有顯著不同，但是發(fā)現(xiàn)獲得的顆粒更小。這對于藥物制劑可以是有利的。
實施例2在該實施例中，將三管路用于使用保存在不同溫度的共沉淀劑溶液沉淀胰蛋白酶/DL-纈氨酸PCMCs。理論蛋白質(zhì)負載是2.5％w/w；水含量是4.0％v/v；總流速是100ml/min。在一個實驗[JV790]中，加熱DL-纈氨酸水溶液，其濃度是90mg/ml，在另一個[JV675]中，將DL-纈氨酸溶液保持在室溫，濃度是68.571mg/ml。沒有將氯化鈣包含在這些實驗中。為了將90mg/ml DL-纈氨酸溶解在去離子水中，必要的是加熱溶液，并將其維持在～90℃。使用Techne Dri-Block DB-3加熱模塊加熱溶液。該裝置被恒溫控制，維持不變的溫度。
理論蛋白質(zhì)負載是2.5％w/w，賦形劑濃度是90mg/ml。在其中所有的管路保持在室溫的競爭性實驗中，理論蛋白質(zhì)負載是2.5％w/w，但是賦形劑濃度是60mg/ml。結(jié)果，必要的是調(diào)節(jié)溶液濃度，如在下表2中所顯示表2

表2詳細描述了使用三管路系統(tǒng)，產(chǎn)生胰蛋白酶/DL-纈氨酸PCMCs所需的胰蛋白酶和賦形劑的濃度。
*這些數(shù)字指在未混合的溶液中的共沉淀劑濃度。當三種溶液混合時，有效的水溶液濃度或[共沉淀劑]aq將取決于相對流速。溶液2和3的組成流量分別是3.5和0.5ml min-1。溶液2和3的總的水流速是4.0ml min-1。因此，在混合點，下面的計算給出[共沉淀劑]aq；

因此在JV675中，D，L-纈氨酸，[共沉淀劑]aq，的有效水性濃度是60mg/ml，并且在JV790中，其是78.75mg/ml。
因此，簡言之，這種另外的實驗研究了有效DL-纈氨酸的濃度從60mg/ml增加到78.75 mg/ml的作用。所有其它的參數(shù)保持不變，并且對所有的樣品進行關(guān)于如前所述的蛋白質(zhì)負載(BCA)，酶活性(TAME)和顆粒大小(DLS)的分析。
以與前面的三管路樣品類似的方式制備樣品，但是因為將賦形劑溶液在90℃進行恒溫控制，必須嘗試并維持該溫度直到混合點。在90℃用去離子水來預沖洗所述室，希望確保由在金屬活塞中的電導引起的溫度降低被最小化。在該實驗中，沒有經(jīng)歷泵的阻塞事件。
將樣品進行共沉淀，并將約10-15ml的混懸液通過微孔Durapore過濾器進行過濾。在過濾后，立即將樣品在溫室中干燥不少于16小時。樣品的制備和分析顯示在表3中。
表3

圖5是顯示對于包括由生產(chǎn)商提供的新鮮的胰蛋白酶的JV790/2，JV790/4的BCA蛋白質(zhì)負載分析的結(jié)果的圖表。在共沉淀過程中明顯有一些胰蛋白酶的損失，如當氯化鈣不存在時所預期的。
圖6是顯示包括由生產(chǎn)商提供的新鮮胰蛋白酶的JV790/2和JV790/4的酶活性的圖表。對于JV790/4保留的生物活性的損失主要是由于蛋白質(zhì)的損失。
圖7是在JV790中獲得的生物活性的圖表，其已經(jīng)關(guān)于使用BCA測定法測量的真實蛋白質(zhì)負載進行了校正?？梢杂^察到存在的胰蛋白酶具有高保留活性。
圖8是顯示Malvem Mastersizer分析的結(jié)果的圖表。對于JV675和JV790實驗，可以觀察到的是用胰蛋白酶制備的樣品比不用胰蛋白酶制備的樣品要小得多。比較JV675和JV790的結(jié)果，在JV790中增加的共沉淀劑的濃度導致了顆粒大小的減少。這在用存在的生物活性分子、胰蛋白酶制備的樣品中是最顯而易見的。與在更低濃度制備的那些(JV675)相比，在更高的共沉淀劑上制備的樣品(JV790)要25％更小。該結(jié)果證實從生物活性分子溶液中分離共沉淀劑水溶液的優(yōu)勢。在該情形中，D，L-纈氨酸溶液可以被加熱到90℃，而沒有使胰蛋白酶變性的危險。
結(jié)論通常，與使用可比較的室溫條件獲得的那些相比，在90℃的溫度下，使用90mg/ml的賦形劑濃度產(chǎn)生的胰蛋白酶/DL-纈氨酸PCMCs沒有改變蛋白質(zhì)負載和酶活性特性。這顯示在圖7中。實驗假設提議高共沉淀劑濃度將誘導更高的過飽和，和因此更小的PCMCs。當?shù)鞍踪|(zhì)存在時，發(fā)現(xiàn)情形如此，并且使用加熱的，更高濃度的共沉淀劑溶液觀察到顆粒大小的25％的大小減少。
實施例3比較用于胰蛋白酶/K2SO4在異丙醇中共沉淀的2管路或3管路CFCP系統(tǒng)[實驗JV818]。
設計該實施例來確定使用前面所述的3管路混合方法的優(yōu)勢是否也可以用已知共沉淀非常迅速的共沉淀劑來獲得。
K2SO4是無機鹽，其在添加到適合的反溶劑諸如丙-2-醇中后從濃縮的水溶液中沉淀。在文獻中可知無機鹽迅速沉淀，并且在許多情形中沉淀是這樣迅速，甚至使測量過程難以進行。以前，我們已經(jīng)證實可以使用分批系統(tǒng)或兩管路連續(xù)方法，用硫酸鉀制備生物活性分子包被的微晶。此外，一直發(fā)現(xiàn)(用K2SO4和許多其它的材料)該共沉淀過程導致形成這樣的晶體，所述晶體小于在缺乏蛋白質(zhì)時沉淀獲得的那些晶體。因此，顆粒大小提供方便的診斷工具來確定生物活性分子是否在共沉淀過程中對晶體的形成具有影響。
在實施例1中，顯示對于通過兩管路或3管路方法，與胰蛋白酶共沉淀的DL-纈氨酸，相對于純的DL-纈氨酸的沉淀，顆粒大小顯著減少。在該實施例中，將3管路混合系統(tǒng)用于生物活性分子胰蛋白酶與硫酸鉀(K2SO4)的共沉淀，晶體大小的變化用于確定是否產(chǎn)物不同于用兩管路系統(tǒng)獲得的產(chǎn)物。
實驗方法.
制備下列系列的樣品，如表4中所顯示。
表4

對于該實驗，必要的是計算必需的流速和需要的試劑，如在表5中所顯示。
表5


選擇2.5％w/w的理論蛋白質(zhì)負載。將PCMC混懸液的水含量固定在4.0％v/v。將總流速固定在100ml min-1。胰蛋白酶(批號121K7692)和K2SO4(批號121K0043)獲自Sigma Aldrich Co.UK。丙-2-醇(批號K32883646)獲自BDH，Poole，UK。
如在前面的實驗中，必要的是制備對于3管路系統(tǒng)的胰蛋白酶和K2SO4的更濃縮的溶液以確保在每個單位時間相同量的物質(zhì)進入流動室。還對流速進行改變以確保水含量固定在4％v/v。攪拌速度固定在1500rpm。
在共沉淀進行之前，校準CFCP系統(tǒng)。對每個泵進行獨立地校準，發(fā)現(xiàn)所述泵是令人滿意地精確。
將樣品1-4進行共沉淀并立即轉(zhuǎn)移到電冰箱中進行貯存。
結(jié)果在共沉淀后幾乎立即發(fā)現(xiàn)在2管路和3管路系統(tǒng)之間存在可觀察到的差異。比較樣品2和4，觀察到隨著沉淀的速率明顯不同，樣品2中的顆粒顯著小于樣品4的顆粒。事實上，樣品4基本類似于不包含胰蛋白酶的樣品1&3。圖9顯示，在共沉淀后約10分鐘沉淀的程度。
顯而易見的是，樣品3明顯不同于其它的，這顯示只有在樣品2中，具有與K2SO4的相互作用以產(chǎn)生PCMCs。
在共沉淀后約4小時，使用Malvern Mastersizer分析所有的混懸液樣品，所述Malvern Mastersizer使用激光衍射技術(shù)來確定產(chǎn)生的顆粒的大小和跨度。將結(jié)果顯示在表6中。
表6

基本上，樣品1，3和4在實驗誤差內(nèi)是相同。然而，樣品2主要由明顯更小的顆粒組成，這與所述樣品需要更長的時間來沉淀的觀察是一致的。圖10和11分別顯示對于樣品2和4的Mastersizer結(jié)果。
圖10證實在提供應用適合的混合方案的條件下，具有亞微米大小的生物活性分子包被的微晶是可獲得的。圖11顯示盡管在3管路系統(tǒng)中混合太慢而不能在起始沉淀過程中提供蛋白質(zhì)的相互作用，但所有的顆粒都具有類似大小。可能的是在pI為9時，胰蛋白酶與具有負的ζ電勢的沉淀的K2SO4晶體靜電結(jié)合。這提供獲得具有窄大小分布的更大的包被顆粒的途徑，所述顆粒可以用于產(chǎn)生緩慢釋放的制劑。
結(jié)論這些結(jié)果清楚顯示對于與K2SO4共沉淀的胰蛋白酶，在三管路系統(tǒng)中獲得的顆粒在大小上與通過純的K2SO4沉淀獲得的顆粒相同。另一方面，在2管路系統(tǒng)中，在蛋白質(zhì)不存在時獲得小得多的顆粒。在本文獲得的結(jié)果和用DL-纈氨酸獲得的結(jié)果之間的差異是顯著的并且可與沉淀的相對速率相關(guān)。在沉淀發(fā)生之前，在3管路系統(tǒng)中用纈氨酸可獲得接近完全的混合。這使生物活性分子干預了顆粒的成核作用的過程。在該情形中，在3管路系統(tǒng)中制備的顆粒比在2管路系統(tǒng)中獲得的那些顯著更小并且比在無蛋白質(zhì)情況下獲得的那些顯著更小。
在用K2SO4的情況中，沉淀非?？?，因此如果將兩股水流單獨引入，那么顆粒形成發(fā)生在徹底混合發(fā)生前，而且蛋白質(zhì)的添加沒有作用。這證實生物活性分子在控制顆粒的大小上具有重要活性作用。其還證實要能夠在保持兩種水性成分分離的情況下，獲得3管路系統(tǒng)的優(yōu)勢，必要的是選擇共沉淀劑諸如氨基酸或糖，其在與獲得優(yōu)質(zhì)混合所需要的時間范圍相比更慢的時間范圍共沉淀。
實施例4通過2管路和3管路方法制備抗體包被的微晶使用在實施例1中所述的設備和在表7中所述的條件，通過2管路和3管路方法制備牛IgG-包被的纈氨酸微晶。在0.01M磷酸鈉，0.15M NaCl(PBS)，pH 7.4(防腐劑0.1％的疊氮化鈉)中的10mg/ml的牛IgG(批號052742366)的供應商是Lampire Biologicals，PO Box 270，Pipersville，PA 18947。對于2管路和3管路實驗，設計實驗條件來在沉淀過程中產(chǎn)生7.5wt％的相同的制劑中的理論蛋白質(zhì)負載，4％v/v的混懸液中的最終水含量，和相同的纈氨酸的過飽和。在兩個實驗之間的關(guān)鍵差異是在3管路實驗中，將蛋白質(zhì)引入在pH 7.4的PBS緩沖液中共沉淀，而在兩管路實驗中，其混合以纈氨酸共沉淀劑，并且在約6.2的pH。
表7


表8顯示在于室溫作為干粉貯存1天和6天后，可以從制劑中回收的可溶性蛋白的量之間的差異。清楚的是所述3管路方法提供在蛋白質(zhì)完整性保留方面的明顯的優(yōu)勢-在處理后沒有可檢測到的蛋白質(zhì)聚集并且所述制劑在室溫的貯存更穩(wěn)定。
表8

圖12顯示通過3管路系統(tǒng)制備的牛IgG包被的微晶的SEM圖像。觀察到的薄片具有5-15微米的直徑。在以前發(fā)現(xiàn)這種類型的薄片適合于通過干粉吸入器進行遞送并且顯示小于幾何學直徑的空氣動力學質(zhì)量中位數(shù)直徑(組合物專利)。因此，預期這些制劑將充分適合于將抗體和Fc-融合蛋白和Fc-藥物綴合物遞送到中樞呼吸道從而通過主動運輸進行全身性遞送。
實施例5使用在實施例1中所述的設備和廠商以及在表x中所述的條件，(胰蛋白酶(Sigma Cat#T1426，批號104K7575)，L-谷氨酰胺(Sigma Cat#G8540，批號072K03651)，通過2管路方法和3管路方法制備胰蛋白酶包被的谷氨酰胺微晶。
因此，包含蛋白質(zhì)的水溶液是在2管路系統(tǒng)中通過谷氨酰胺所設定的pH6.3，或在3管路系統(tǒng)中通過磷酸緩沖液設定的pH9.2。pH9.2接近于胰蛋白酶的pI。在3管路系統(tǒng)中，谷氨酰胺溶液的pH還是pH6.3。收集產(chǎn)生的晶體，用溶劑漂洗，干燥并使用在實施例1中所述的水解測定法來測定胰蛋白酶的生物活性。
將結(jié)果顯示于表9。
表9

相對于假設所有的蛋白質(zhì)被固定所預期的最大值來計算保留的生物活性的百分比。
如在表10中所顯示，與在2管路系統(tǒng)中的相比，通過3管路系統(tǒng)(用接近于胰蛋白酶的pI的蛋白質(zhì)的pH)制備的樣品導致顯著更高的生物活性胰蛋白酶的保留。RP-HPLC證實這種差異與在結(jié)合于微晶的蛋白質(zhì)的量的變化有關(guān)。因此3管路系統(tǒng)提供在引入更低量的緩沖劑到產(chǎn)物中的情況下，獲得提高的結(jié)合效率的方法。
表10

實施例6圖13是顯示具有區(qū)域1-6的肺的不同部分的圖像。
區(qū)域5和6已知是肺中的肺泡空間。還可以通過肺用裝置，將約1微米的顆粒大小的微晶遞送到區(qū)域6。可以通過肺用裝置將具有約1-5微米顆粒大小的微晶遞送到區(qū)域5。
已知區(qū)域3和4是肺中的大的有纖毛的呼吸道空間?？梢酝ㄟ^肺用裝置將具有約5-10微米的顆粒大小的微晶遞送到區(qū)域3和4。
已知區(qū)域1和2是上呼吸道，并且在大多數(shù)情形中，由于不吸收而不適合于在該區(qū)域中提供微晶。
通過采用制備生物活性分子包被的微晶的方法，可以對所述微晶進行改造從而使它們優(yōu)先結(jié)合在區(qū)域1-6中的任一個或其組合中，如在圖13中所顯示。
可以影響顆粒大小的參數(shù)包括共沉淀劑的濃度，pH，溶劑，水含量，生物活性分子負載，溫度，添加劑濃度和混合效率。如果將第一和第二水溶液順序添加到溶劑中，溶液從第一混合器傳遞到第二混合器的時間也可以變化。在一些系統(tǒng)中，可能必須將這些值中的一個或多個固定，但是可以用DoE來進行剩余變量參數(shù)的有效篩選。其可以用于鑒定最影響大小和它們之間任何相互作用的那些。接著，可以使用該信息來通過反應表面建模進一步精選參數(shù)從而產(chǎn)生具有目標范圍的顆粒大小，而同時還優(yōu)化生物活性和結(jié)合效率。
權(quán)利要求
1.一種形成生物活性分子包被的微晶的連續(xù)法，其包括下列步驟(a)提供包含共沉淀劑分子的第一水溶液；(b)提供包含生物活性分子的第二水溶液；(c)提供包含水可混溶溶劑的第三溶液；(d)基本上同時混合所述第一水溶液，所述第二水溶液和所述第三溶液；或?qū)⒌谝缓偷诙芤旱娜我环N與第三溶液混合并隨后混合以余下的第一水溶液和第二水溶液的任一種；從而使所述共沉淀劑和所述生物活性分子的共沉淀開始，導致所述微晶的形成；和(e)收集微晶的混懸液。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述水可混溶溶劑是短鏈醇類諸如甲醇；乙醇；丙-1-醇；丙-2-醇；醛或酮類諸如丙酮，酯類諸如乳酸乙酯，醚類諸如四氫呋喃，二醇類諸如2-甲基-2，4-戊二醇，1，5-戊二醇，和各種大小的聚乙二醇(PEGS)和多元醇類；或其任何組合或其混合物。
3.按照權(quán)利要求1或2的任一項的方法，其中第一個泵連續(xù)遞送包含共沉淀劑分子的第一水溶液，第二個泵連續(xù)遞送包含生物活性分子的第二水溶液，和第三個泵連續(xù)遞送包含水可混溶溶劑的第三溶液。
4.按照權(quán)利要求1或2的任一項的方法，其中第一個泵連續(xù)將第一和第二水溶液的任一種遞送到通過第二個泵連續(xù)遞送到第三溶液中，隨后第三個泵連續(xù)遞送余下的第一和第二水溶液中的任一種。
5.按照前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述水溶液以介于約0.2ml/min和約1000ml/min之間的流速進行遞送。
6.一種藥物制劑，其包含具有一個或多個微晶的顆粒，其中所述微晶包含(a)從共沉淀劑分子形成的基本非-吸濕性的內(nèi)部晶核；和(b)包含一個或多個生物活性分子的外涂層；其中所述包被的微晶通過如下方式在單一連續(xù)法中形成基本上混合包含共沉淀劑分子的第一水溶液，包含生物活性分子的第二溶液和包含水可混溶溶劑的第三溶液；或?qū)⑺龅谝缓偷诙芤褐械娜我换旌弦运龅谌芤?，隨后混合以余下的第一和第二水溶液中的任一種。
7.按照權(quán)利要求6的藥物制劑，其中所述外涂層的厚度的范圍在約0.01-1000微米，約1-100微米，約5-50微米或約10-20微米。
8.按照權(quán)利要求6或7中任一項的藥物制劑，其中所述顆粒具有少于約80μm，少于約50μm或少于約20μm的最大截面尺寸。
9.按照權(quán)利要求6-8中任一項的藥物制劑，其中組成所述晶核的分子具有少于約2kDa的分子量。
10.按照權(quán)利要求6-9中任一項的藥物制劑，其中組成所述晶核的所述分子選自下列各項氨基酸，兩性離子，肽，糖，緩沖成分，水溶性藥物，有機和無機鹽，形成強氫鍵晶格的化合物或其衍生物或任意組合。
11.按照權(quán)利要求6-10中任一項的藥物制劑，其包含藥物諸如消炎藥；抗癌藥；抗精神病藥；抗細菌藥；抗真菌藥；天然或非天然肽；蛋白質(zhì)諸如胰島素，α1-抗胰蛋白酶，α-胰凝乳蛋白酶，白蛋白；干擾素；抗體；融合蛋白諸如Fc-融合蛋白；蛋白質(zhì)-藥物綴合物；核酸諸如天然來源的基因片段，DNA，RNA或RNAi或合成的寡核苷酸和反義核苷酸；糖類諸如任何單糖，二糖或多糖；質(zhì)粒；和蛋白質(zhì)/肽-藥物綴合物。
12.按照權(quán)利要求6-11中任一項的藥物制劑，其中所述顆粒包括那些下面的顆粒具有D，L-纈氨酸晶核和胰島素涂層；具有L-甘氨酸晶核和抗胰蛋白酶涂層；具有谷氨酸鈉晶核和胰島素涂層；具有L-甲硫氨酸晶核和胰島素涂層；具有L-丙氨酸晶核和胰島素涂層；具有L-纈氨酸晶核和胰島素涂層；具有L-組氨酸晶核和胰島素涂層；具有L-甘氨酸晶核和α-抗胰蛋白酶涂層；具有L-谷氨酰胺晶核和白蛋白涂層；具有D，L-纈氨酸晶核和寡核苷酸DQA-HEX涂層；具有D，L-纈氨酸晶核和具有另外的N-乙?；腚装彼岬目寡趸瘎┩馔繉拥摩?-抗胰蛋白酶涂層；具有D，L-纈氨酸晶核和卵清蛋白涂層；具有L-谷氨酰胺的晶核和卵清蛋白涂層，具有D，L-纈氨酸晶核和白喉類毒素涂層；具有L-谷氨酰胺的晶核和白喉類毒素涂層；具有D，L-纈氨酸晶核和白喉類毒素涂層；具有L-谷氨酰胺的晶核和破傷風類毒素涂層；具有L-纈氨酸晶核和白喉類毒素和破傷風類毒素混合物涂層；具有L-谷氨酰胺晶核和白喉類毒素和破傷風類毒素混合物涂層。
13.一種用于肺遞送的藥物制劑，其包含按照權(quán)利要求1-5中任一項形成的微晶。
14.按照權(quán)利要求13的藥物制劑，其中用于形成肺用藥物制劑的生物活性分子選自下列各項中的任一項治療用蛋白質(zhì)諸如胰島素，α1-抗胰蛋白酶，干擾素；抗體和抗體片段和衍生物；治療用肽和激素；合成性和天然DNA，其包括基于DNA的藥物；酶；疫苗成分；抗生素；止痛藥；水溶性藥物；水敏感性藥物；脂質(zhì)和表面活性劑；多糖；或其任何組合或衍生物。
15.按照權(quán)利要求13或14任一項的藥物制劑，其中所述肺用制劑包含質(zhì)量中位數(shù)氣動粒徑少于約10微米或少于約5微米的顆粒。
16.按照權(quán)利要求13-15中任一項的藥物制劑，其中所述肺用制劑具有包含氨基酸諸如纈氨酸，組氨酸，異亮氨酸，甘氨酸或谷氨酰胺的晶核，并且其例如，包括纈氨酸的晶核和治療用蛋白質(zhì)諸如胰島素的涂層；組氨酸的晶核和酶的涂層；纈氨酸的晶核和酶抑制劑諸如α-抗胰蛋白酶的涂層；纈氨酸的晶核和DNA的涂層；纈氨酸的晶核和疫苗涂層；谷氨酰胺的晶核和疫苗涂層；谷氨酰胺的晶核和白蛋白涂層。
17.一種腸胃外制劑，其包含按照權(quán)利要求1-5中任一項形成的微晶或微晶的混懸液。
18.一種持續(xù)釋放或緩釋的藥物制劑(或長效制劑(depot))，其包括按照權(quán)利要求1-5中任一項形成的微晶或微晶的混懸液
19.一種用于吸入的藥物遞送裝置，其包含按照權(quán)利要求1-5中任一項形成的微晶。
20.一種確定制備生物活性分子包被的微晶的最佳條件的方法，所述方法包括下列步驟制備第一批按照第一組變量參數(shù)的生物活性分子包被的微晶并量化所述生物活性分子包被的微晶的至少一個性質(zhì)；通過改變至少一個所述的變量參數(shù)制備第二批生物活性分子包被的微晶，并量化所述至少一個性質(zhì)從而能夠確定所述至少一個變化對于所述至少一個性質(zhì)具有有益還是有害的效果。
21.一種接受請求形成按照權(quán)利要求1-5中任一項形成的生物活性分子包被的微晶的方法，其包括(a)消費者限定對生物活性分子包被的微晶的要求，其包括對生物活性、劑量、負載、大小、形狀和共沉淀劑的要求；(b)調(diào)節(jié)所述共沉淀條件以獲得如在部分(a)中限定的微晶；(c)精選所述共沉淀條件以獲得具有適合條件的微晶；和(d)確定適合的條件來形成所述需要的微晶。
22.一種提供與形成按照權(quán)利要求1-5中任一項的生物活性分子包被的微晶的方法相關(guān)的服務的方法，所述方法包括接受消費者形成具有特定要求的生物活性分子包被的微晶的請求，所述要求包括對大小和生物活性的要求；確定形成所述生物活性分子包被的微晶的方法；和接受為向消費者提供形成生物活性分子包被的微晶的所述方法的服務的報酬。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及包含一個或多個水溶性晶體的微米或亞微米顆粒，其中所述晶體具有包含一個或多個生物活性分子的表面涂層，以及形成這些顆粒的方法和快速篩選形成這些顆粒的優(yōu)選條件的方法。所述顆?？蛇m合用于藥物制劑。
文檔編號A61K9/14GK101018544SQ200580025180
公開日2007年8月15日 申請日期2005年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月27日
發(fā)明者B·D·穆爾, J·沃斯 申請人:斯特拉斯克萊德大學