專利名稱：治療阿爾茨海默病的環(huán)孢菌素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)孢菌素的新用途，特別是非免疫抑制的親環(huán)蛋白結(jié)合環(huán)孢菌素的新的藥物用途。
背景技術(shù)：
環(huán)孢菌素A(CsA)與抑免蛋白例如親環(huán)蛋白(CyP)結(jié)合，而同為抑免蛋白結(jié)合化合物的FK506和雷帕霉素與FK506結(jié)合蛋白質(zhì)(FKBP)結(jié)合。盡管抑免蛋白結(jié)合是必需的，但其對(duì)這些藥物的免疫抑制活性是不足的。觀察到藥物/抑免蛋白復(fù)合物與第三效應(yīng)物蛋白質(zhì)相互作用時(shí)的生物效應(yīng)。例如，CyP-CsA和FKBP-FK506復(fù)合物抑制鈣調(diào)磷酸酶的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性，由此阻斷細(xì)胞因子如白介素-2、4的產(chǎn)生。另一方面，F(xiàn)KBP-雷帕霉素復(fù)合物抑制稱為FRAP(也稱為RAFT或mTOR)5的激酶，該激酶參與白介素-2受體介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖。
已從鏈霉菌屬物種(Streptomyces sp.)A92-308110中分離出被稱為sanglifehrin的新一類化合物。在目前分離的20種不同的sanglifehrin中，sanglifehrin A(SFA)是最為豐富的化合物，并顯示出有效的免疫抑制活性。SFA代表作用方式與所有其它已知的抑免蛋白結(jié)合化合物(即CsA、FK506和雷帕霉素)均不同的新型免疫抑制劑。已顯示SFA在線粒體轉(zhuǎn)換孔道(MTP)復(fù)合物中以與另一抑免--蛋白親環(huán)蛋白A(CpA)不同的結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合抑免蛋白--親環(huán)蛋白D(CyD)并抑制MTP開放。
在歐洲專利no.484281中描述了非免疫抑制的親環(huán)蛋白結(jié)合環(huán)孢菌素及其治療和預(yù)防AIDS和AIDS相關(guān)紊亂的用途，其中包括對(duì)環(huán)孢菌素類化合物、它們的命名法和作用方式的一般描述。將EP 0,484,281 B的公開內(nèi)容，特別是上文涉及的一般描述和下文涉及的其它部分的描述包括在本申請(qǐng)的說(shuō)明中作為參考。
令人驚奇的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)與親環(huán)蛋白結(jié)合但沒(méi)有免疫抑制性的環(huán)孢菌素可作為神經(jīng)保護(hù)劑用于治療包括(但不僅限于)阿爾茨海默病(“AD”)的與Aβ產(chǎn)生和/或分泌相關(guān)的病理狀態(tài)。AD表征為腦中淀粉狀蛋白斑(主要由Aβ的40或42個(gè)氨基酸的肽組成)的胞外堆積。這些肽的細(xì)胞外堆積是該疾病的病理學(xué)標(biāo)志(Selkoe 1999)。這些Aβ肽通過(guò)內(nèi)切蛋白酶解切割廣泛表達(dá)的I型跨膜蛋白質(zhì)--淀粉樣前體蛋白(APP)產(chǎn)生(Selkoe 1999；Sisodia 2000)。在淀粉生成通路中切割A(yù)PP的兩種酶被稱為β-分泌酶和γ-分泌酶，其分別從N末端和C末端切割A(yù)PP。在該通路中，β-分泌酶(BACE1)是切割A(yù)PP的第一個(gè)酶，產(chǎn)生分泌的sAPPβ片段和結(jié)合膜的C末端片段(CTF，C99)(Vassar、Bennett等人1999)。C99片段是γ-分泌酶復(fù)合物(GACE)的底物，所述復(fù)合物切割C99產(chǎn)生Aβ和AICD(APP胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域)。AICD結(jié)合含有Tip60和Fe65的復(fù)合物，該復(fù)合物抑制NFκ-B通路中的基因KAI1(四跨膜蛋白(tetraspanin)細(xì)胞表面分子)(Baek、Ohgi等人，2002)。GACE復(fù)合物由四個(gè)基本組分早老蛋白1(PS1)、呆蛋白(NCSTN)、Aph1和Pen2(Edbauer、Winkler等人，2003；Kimberly、LaVoie等人2003)組成。PS1功能同系物--早老蛋白2(PS2)促成細(xì)胞中～20％的Aβ產(chǎn)生(Kimberly、Xia等人，2000)。盡管這四種組分是必需的并且足以重建GACE活性，有非GACE介導(dǎo)的APP切割引起Aβ產(chǎn)生的證據(jù)(Tesco、Koh等人2003)，(Nunan、Shearman等人2001)。

發(fā)明內(nèi)容
闡明APP通路涉及的新基因是確定該疾病的完整病因?qū)W以及更好理解促使Aβ產(chǎn)生的復(fù)雜機(jī)制的關(guān)鍵步驟。調(diào)節(jié)Aβ的新基因和通路的確定有助于開發(fā)治療該疾病進(jìn)展的新治療策略。若干遺傳連鎖和染色體區(qū)域與遲發(fā)性阿爾茨海默病(LOAD)(＞65歲發(fā)病)特異地關(guān)聯(lián)(Ertekin-Taner、Graff-Radford等人，2000)、(Bertram、Blacker等人，2000)、(Scott、Hauser等人，2003)。在共同未決的USSN 中描述了LOAD關(guān)聯(lián)基因的亞型和參與APP加工的新基因，其中包括對(duì)用來(lái)檢測(cè)cDNA克隆調(diào)節(jié)CHOK1細(xì)胞中Aβ產(chǎn)生能力的大規(guī)模功能性篩選的描述。將該USSN_的公開內(nèi)容，特別是鑒定修飾Aβ分泌的基因和后文所述的其它部分的描述包括在本申請(qǐng)的說(shuō)明中作為參考。
作為細(xì)胞中Aβ產(chǎn)生關(guān)鍵性調(diào)節(jié)物的抑免蛋白通路基因的發(fā)現(xiàn)提供了合適的阿爾茨海默病藥物靶標(biāo)。功能性篩選中發(fā)現(xiàn)的涉及抑免蛋白通路的一些cDNA包括Map激酶4、鈣調(diào)蛋白、酸性神經(jīng)酰胺酶和TOB3(一種AAA-腺苷三磷酸酶)。
促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，又稱胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，其磷酸化并正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)起始信號(hào)級(jí)聯(lián)放大事件的靶底物。ERK應(yīng)答廣泛的刺激將信號(hào)從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核并在調(diào)節(jié)基因表達(dá)、有絲分裂、增殖、運(yùn)動(dòng)性、代謝和細(xì)胞凋亡中起到重要作用(Wada和Penninger 2004)。MEK和ERK活性的抑制劑顯示抑制APP分解代謝。此外，MAPK可以激活JNK并引發(fā)細(xì)胞凋亡--已知提高Aβ產(chǎn)生的過(guò)程(Tesco、Koh等人，2003)。盡管不希望受到理論束縛，MAPK4cDNA可通過(guò)APP分解代謝或激活細(xì)胞凋亡起作用。
APP胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(AICD)片段還與連接MAP激酶通路與APP加工的cJun N末端激酶(JNK)相互作用(Scheinfeld、Roncarati等人2002)。MAPK4是激活JNK的ERK，因此過(guò)表達(dá)MAPK4可引起JNK的超活化，其可增加JNK-AICD相互作用引起增加Aβ產(chǎn)生。也可能JNK的激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?；蛘?，MAPK4可改變APP的磷酸化狀態(tài)，已顯示所述APP的磷酸化狀態(tài)通過(guò)影響APP運(yùn)輸和破壞PS1/β-聯(lián)蛋白相互作用影響其由β-分泌酶和α-分泌酶優(yōu)先的加工(Hung和Selkoe 1994)，(Walter、Capell等人，1997)。另外，還顯示細(xì)胞的磷酸化狀態(tài)對(duì)PS1活性是關(guān)鍵的(Seeger、Nordstedt等人1997)。JNK激活和蛋白質(zhì)磷酸化也是MAPK4能夠起作用以提高Aβ產(chǎn)生的若干其它通路。
篩選中鑒定的另一基因?yàn)殁}調(diào)蛋白。鈣調(diào)蛋白是環(huán)-螺旋-環(huán)Ca2+結(jié)合蛋白質(zhì)，其通過(guò)與包括CaMKII、CaMKIV、鈣調(diào)磷酸酶、血影蛋白A2、p21和神經(jīng)元氧化氮合酶的特定的靶蛋白質(zhì)相互作用轉(zhuǎn)導(dǎo)Ca2+信號(hào)(Means1981)。當(dāng)Ca2+結(jié)合鈣調(diào)蛋白時(shí)，其經(jīng)歷構(gòu)象變化使其能夠與靶蛋白質(zhì)結(jié)合并刺激或抑制靶蛋白質(zhì)活性。在無(wú)細(xì)胞制劑和完整細(xì)胞中使用鈣調(diào)蛋白拮抗劑W-7和三氟拉嗪已顯示，鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)Aβ產(chǎn)生。這些已知的鈣調(diào)蛋白活性的抑制劑也可抑制Aβ產(chǎn)生(Desdouits、Buxbaum等人，1996)。因此，胞內(nèi)Ca2+濃度和/或鈣調(diào)蛋白的靶蛋白質(zhì)可影響APP加工。這一綜合數(shù)據(jù)驗(yàn)證了當(dāng)過(guò)表達(dá)鈣調(diào)蛋白時(shí)觀察到提高Aβ產(chǎn)生的事實(shí)。
Ca2+失調(diào)，特別是細(xì)胞質(zhì)中Ca2+水平的下降與PS1 FAD突變相關(guān)的Aβ產(chǎn)生的提高相伴發(fā)生(Yoo、Cheng等人，2000)。PS1 FAD突變可顯著消弱容量性鈣內(nèi)流(CCE)并儲(chǔ)存消耗激活的電流(depletion-activatedcurrents)，提示降低的CCE可提高Aβ產(chǎn)生(Yoo、Cheng等人，2000)。在篩選中發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白基因的過(guò)表達(dá)還可引起胞內(nèi)鈣水平的降低，并可預(yù)防足夠的CCE?？赡馨麅?nèi)Ca2+的減少可直接或間接提高PS1活性，引起從細(xì)胞分泌更多的Aβ。以下詳述的數(shù)據(jù)表明SFA有效地抑制Aβ40和Aβ42產(chǎn)生并抑制C99和刻缺蛋白切割，說(shuō)明γ分泌酶活性通過(guò)抑免蛋白CyD與Ca2+體內(nèi)穩(wěn)態(tài)相關(guān)。
另一基因--人酸性神經(jīng)酰胺酶催化神經(jīng)酰胺水解為鞘氨醇和脂肪酸(Ferlinz、Kopal等人，2001)。神經(jīng)酰胺作為大部分鞘脂的前體，并且是在大量不同細(xì)胞類型中(通常是通過(guò)胱天蛋白酶-3激活)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)分子。積累的神經(jīng)酰胺水平與阿爾茨海默病相關(guān)，并被認(rèn)為是老化的AD腦中氧化神經(jīng)毒性通路的一部分。過(guò)表達(dá)神經(jīng)酰胺提高Aβ產(chǎn)生使神經(jīng)酰胺酶切割與Aβ相關(guān)聯(lián)。由于神經(jīng)酰胺似乎通過(guò)細(xì)胞凋亡起作用，可能酸性神經(jīng)酰胺酶也促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
已顯示細(xì)胞的神經(jīng)酰胺狀況同時(shí)調(diào)節(jié)BACE的穩(wěn)定性和Aβ的生物發(fā)生(Puglielli、Ellis等人2003)。先前的研究證明高水平的神經(jīng)酰胺可以通過(guò)不依賴于細(xì)胞凋亡的方式增加Aβ分泌(Puglielli、Ellis等人2003)。過(guò)表達(dá)神經(jīng)酰胺酶將降低神經(jīng)酰胺水平，并且可能改變膜流動(dòng)性地提高鞘氨醇和游離脂肪酸(FFA)水平，是已知的改變?chǔ)拥鞍?tau)磷酸化和Aβ聚合作用的方法(Wilson和Binder 1997)。盡管機(jī)制尚不清楚，可能神經(jīng)酰胺酶能夠影響FFA水平引起改變的APP加工和更多Aβ產(chǎn)生和/或分泌。
TOB3是執(zhí)行分子伴侶樣功能的AAA-腺苷三磷酸酶，有助于包括蛋白質(zhì)分泌的蛋白質(zhì)復(fù)合物的裝配、操作或解裝配(Strausberg、Feingold等人，2002)。該類蛋白質(zhì)作為被組成型加工的蛋白質(zhì)幫助維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的完整性。在缺少AAA-腺苷三磷酸酶活性時(shí)，錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的過(guò)度累積引起ER膨脹和細(xì)胞死亡(Kobayashi、Tanaka等人，2002)。過(guò)表達(dá)TOB3提高Aβ分泌的最可能的解釋與其影響蛋白質(zhì)折疊和在ER中運(yùn)輸?shù)哪芰ο嚓P(guān)。如果刺激這一過(guò)程，如通過(guò)TOB3過(guò)表達(dá)，可能將提高APP加工。
我們的篩選數(shù)據(jù)已經(jīng)顯示過(guò)表達(dá)TOB3改變APP加工引起更多Aβ產(chǎn)生和更少的C99和C83 C末端片段。與HEK 293細(xì)胞相比，TOB3表達(dá)還在N2A細(xì)胞中更大程度降低APP和sAPPα水平(數(shù)據(jù)未顯示)。這提示TOB3影響APP加工機(jī)器中一個(gè)或多個(gè)組分，引起提高的APP和C99切割。由于TOB3參與蛋白質(zhì)的運(yùn)輸和加工，目前正在確定TOB3在APP加工中的確切機(jī)制和特異性。
功能性篩選中鑒定的另一cDNA--羧肽酶Z(CPZ)連同CPE和CPD一起是金屬羧肽酶基因家族的成員，認(rèn)為它們?cè)谏锘钚噪暮偷鞍踪|(zhì)分泌之前的胞內(nèi)加工中起作用。CPZ由于含有與Wnt和無(wú)翅蛋白質(zhì)結(jié)合的功能性N末端富含半胱氨酸卷曲結(jié)構(gòu)域，是獨(dú)特的羧肽酶，所述無(wú)翅蛋白質(zhì)是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵組分(Moeller、Swindell等人，2003)。
另一值得注意的cDNA為親環(huán)蛋白D(CyD，也被稱為CyF。命名法參考Current Medicinal Chemistry，2003，10，1485-1506 1485 Cyclophilin Das a Drug Target，Waldmeier等人)。發(fā)現(xiàn)CyD參與Aβ產(chǎn)生。親環(huán)蛋白如CyD是涉及蛋白質(zhì)運(yùn)輸和成熟的肽基脯氨酰異構(gòu)酶。除CyD獨(dú)自定位于線粒體基質(zhì)中之外，親環(huán)蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)中(Waldmeier、Zimmermann等人2003)。過(guò)表達(dá)CyD時(shí)，其能夠穩(wěn)定內(nèi)源PS1 N末端片段(NTF)。AD腦的普遍損傷是存在由異常磷酸化的τ蛋白--一種微管結(jié)合蛋白質(zhì)組成的胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(Johnson和Bailey 2002)。過(guò)表達(dá)APP時(shí)，CyD能夠提高胱天蛋白酶-3的活性，指示調(diào)節(jié)Aβ分泌的可能機(jī)制。這些結(jié)果提示當(dāng)過(guò)表達(dá)時(shí)，CyD是通過(guò)γ-分泌酶通路切割A(yù)PP和C99所必需的重要因子。
一方面，CyD是線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道的內(nèi)在組份，其被認(rèn)為與腺嘌呤核苷酸易位體結(jié)合并調(diào)節(jié)孔道開放(Waldmeier、Zimmermann等人，2003)。線粒體膜的通透性是引起消耗線粒體膜電位、釋放致凋亡蛋白質(zhì)和以凋亡細(xì)胞死亡告終的細(xì)胞應(yīng)激的結(jié)果(Waldmeier 2002)。
已提示線粒體衰竭在唐氏綜合征患者的AD神經(jīng)病理學(xué)發(fā)展中通過(guò)促進(jìn)異常的β-APP加工和Aβ的細(xì)胞內(nèi)積累起到顯著的作用(Busciglio 2002)。還顯示細(xì)胞內(nèi)鈣水平的提高引起細(xì)胞內(nèi)Aβ的積累(LaFerla 2002)。令人驚奇地，全長(zhǎng)APP不僅沿分泌途徑運(yùn)輸，而且在轉(zhuǎn)基因小鼠AD模型的腦中靶向培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的線粒體。β-APP在線粒體膜上的不完全易位和累積能夠引起線粒體機(jī)能障礙，還能夠在AD的發(fā)病機(jī)理中起重要作用(Anandatheerthavarada、Biswas等人2003)。已知過(guò)表達(dá)線粒體蛋白質(zhì)能夠引起基質(zhì)中形成不溶聚集物(例如解偶聯(lián)蛋白質(zhì)-3，UCP3)。這些聚集物能夠擾亂線粒體的正常功能并提高內(nèi)膜的被動(dòng)通透性。CyD可在線粒體處理過(guò)量APP或C末端片段的加工中起到重要作用。
CyD是免疫抑制劑藥物例如環(huán)孢菌素的已知靶標(biāo)。這些化合物封閉線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)并預(yù)防細(xì)胞凋亡(Samantha J.Clarke 2002；Waldmeier 2002)。還已知FK506化合物與抑免蛋白結(jié)合但不與CyD結(jié)合(Uchino 2003)。
如果環(huán)孢菌素與人重組親環(huán)蛋白的結(jié)合在由Quesniaux于Eur.J.Immuno1.1987，17，1359-1365中所述的競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定中至少占環(huán)孢素(又稱為環(huán)孢菌素A)結(jié)合的1/5，則認(rèn)為其與親環(huán)蛋白結(jié)合。該測(cè)試中，在親環(huán)蛋白與包被的BSA-環(huán)孢菌素的孵育期間添加待測(cè)環(huán)孢菌素，并計(jì)算不含競(jìng)爭(zhēng)劑的對(duì)照反應(yīng)產(chǎn)生50％抑制所需的濃度(IC50)。結(jié)果表達(dá)為結(jié)合比(BR)，是測(cè)試化合物的IC50和在類似測(cè)試中使用環(huán)孢素代替測(cè)試的環(huán)孢菌素的IC50比值的以10為底的對(duì)數(shù)。因此1.0的BR指測(cè)試化合物與親環(huán)蛋白質(zhì)的結(jié)合是環(huán)孢菌素的十分之一強(qiáng)度，負(fù)值表示比環(huán)孢菌素結(jié)合更強(qiáng)。
作為神經(jīng)保護(hù)劑起作用的環(huán)孢菌素具有低于0.7的BR(由于log105＝約0.7)，優(yōu)選地等于或低于零。
當(dāng)環(huán)孢菌素在混和淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)中的活性少于環(huán)孢菌素活性的5％，優(yōu)選少于2％時(shí)，認(rèn)為其是非免疫抑制的?；旌土馨图?xì)胞反應(yīng)由T.Meo描述于《(Immunological Methods)》，L.Lefkovits和B.Peris編輯，AcademicPress，N.Y.227-239頁(yè)(1979)。將來(lái)自Balb/c小鼠(雌性，8-10周)的脾細(xì)胞(0.5×106)與來(lái)自CBA小鼠(雌性，8-10周)的0.5×106輻射(2000拉德)或絲裂霉素C處理的脾細(xì)胞共孵育5天。被輻射的同種異型細(xì)胞在Balb/c脾細(xì)胞中誘導(dǎo)增殖應(yīng)答，所述應(yīng)答可以通過(guò)將標(biāo)記的前體參入DNA得到測(cè)量。由于刺激物細(xì)胞是被輻射的(或絲裂霉素C處理的)，它們不以增殖應(yīng)答B(yǎng)alb/c細(xì)胞而是保持它們的抗原性。將MLR中測(cè)試化合物建立的IC50與平行實(shí)驗(yàn)中環(huán)孢素建立的IC50相比較。
已發(fā)現(xiàn)在上述MLR中判斷為非免疫抑制的化合物在IL-2報(bào)道基因測(cè)定中常常是無(wú)活性的，因此可使用IL-2報(bào)道基因測(cè)定，如作為初級(jí)篩選，選擇本發(fā)明使用的非免疫抑制的親環(huán)蛋白結(jié)合化合物。
作為治療與Aβ分泌相關(guān)病理狀態(tài)的活性物質(zhì)(例如作為AD中淀粉樣蛋白斑細(xì)胞外積累的抑制劑)起作用的非免疫抑制的親環(huán)蛋白結(jié)合環(huán)孢菌素化合物在下文中被稱為“活性化合物”。
因此活性化合物可用于治療任何與Aβ肽分泌、內(nèi)源PS1 N末端片段表達(dá)(NTF)或提高的γ-分泌酶活性相關(guān)的臨床病癥。活性化合物還可用于治療與提高Aβ分泌的細(xì)胞凋亡相關(guān)的病癥。Aβ肽形成和隨后的聚集不僅是AD的標(biāo)志，而且是其它神經(jīng)學(xué)疾病如帕金森病、亨廷頓病和其它系統(tǒng)性淀粉樣變性的必需部分(Selkoe 1989；Price、Borchelt等人1993；Citron、Vigo-Pelfrey等人1994)。這些結(jié)果清楚表明細(xì)胞凋亡與Aβ產(chǎn)生是固有相聯(lián)系的。
活性化合物還能夠調(diào)節(jié)不在腦中表達(dá)的“外周Aβ調(diào)節(jié)物”。外周淀粉樣變性能夠引起諸如心和皮膚淀粉樣變性這樣的表型(Yamaguchi、Yamazaki等人1992)、(Selkoe 1989)。如果發(fā)現(xiàn)外周Aβ的調(diào)節(jié)物，還可能得出新的療法例如阻止穿透血腦屏障需要的靶標(biāo)。降低外周Aβ水平顯示降低轉(zhuǎn)基因小鼠腦中Aβ水平，引起更少的空斑形成(Bohrmann、Tjernberg等人1999；DeMattos、Bales等人2002)。
發(fā)現(xiàn)許多活性化合物，特別是在4和/或5位，具有與環(huán)孢素不同的結(jié)構(gòu)?？赡芘c環(huán)孢素不同的活性化合物的其它位置為6和7位。
一組活性化合物是其中4位的MeLeu基團(tuán)被不同的N-甲基化氨基酸，例如y-羥基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、MeAla、MeTyr或MeTyr(O-PO(OH)2)或Pro取代的環(huán)孢菌素。除MeIle和MeThr外，也可使用異型MeaIle和MeaThr。異型中，β-位的立體化學(xué)具有與天然氨基酸相反的構(gòu)象，從而普通形式和異型形成一對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體。
另一組活性化合物是其中5位的Val被N-烷基氨基酸，優(yōu)選N-甲基氨基酸取代。優(yōu)選的N-烷基化的氨基酸為Val或Leu。優(yōu)選[Val]5亞氨基的氫被非支鏈C1-6烷基，優(yōu)選甲基、乙基或正丙基，特別是甲基取代。后一組優(yōu)選的活性化合物是全新的。
額外地或可選地，某些活性化合物可以在1、2、3和/或6位上與環(huán)孢素不同。
用于本發(fā)明的活性化合物的具體類型為式A的環(huán)孢素衍生物及其可藥用鹽 其中B為式B的氨基酸殘基
其中a表示連接位置2的αAbu殘基的鍵；b表示連接位置4的C殘基的鍵；Alk代表含有2到6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈亞烷基或含有3到6個(gè)碳原子的環(huán)亞烷基，且R代表羧基或烷氧基羰基；-NR1R2基，其中R1和R2是相同或不同的并且代表氫、烷基、C2-4鏈烯基、C3-6環(huán)烷基、苯基(任選地由鹵素、烷氧基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基或二烷基氨基取代)或苯甲基或含有5或6個(gè)環(huán)原子及1到3個(gè)雜原子的飽和或不飽和雜環(huán)基，或其中R1和R2與它們所連接的氮原子一起形成飽和或不飽和的雜環(huán)，所述雜環(huán)含有4到6個(gè)環(huán)原子和任選地含有選自氮、氧或硫的其它雜原子并任選地由烷基、苯基或苯甲基取代；下式的原子團(tuán) 其中R1和R2如上定義，R3代表氫或烷基且n為從2到4的整數(shù)，且其中烷基表示含有1到4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基；C為MeLeu或4-羥基-MeLeu。
在公開的國(guó)際專利申請(qǐng)WO 98/28328、WO 98/28329和WO 9828330中進(jìn)一步描述該類環(huán)孢素衍生物。特別優(yōu)選的此類化合物為式A的化合物，
其中B為氨基酸殘基B’ 且C為氨基酸殘基4-羥基-MeLeu。
特別優(yōu)選的活性化合物組是由式I的化合物及其可藥用鹽組成 其中W為MeBmt、二氫-MeBmt或8’-羥基-MeBmt；X為αAbu、Val、Thr、Nva或O-甲基蘇氨酸(MeOThr)；R為Sar或(D)-MeAla；Y為MeLeu、γ-羥基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、MeAla、MeTyr、MeTyr(O-PO(OH)2)、MeaIle或MeaThr或Pro；Z為Val、Leu、N-Alk-Val或N-Alk-Leu，其中Alk代表Me或如下取代的Me由乙烯基取代的Me，所述乙烯基任選地由苯基或含有6個(gè)環(huán)原子數(shù)的N、S或O雜芳香基取代，或由苯基取代的Me，所述苯基任選地由鹵素取代；并且Q為MeLeu、γ-羥基-MeLeu或MeAla。
基團(tuán)W、X、Y、Z和Q獨(dú)立地具有如下優(yōu)選的含義優(yōu)選地，W為W’，其中W’為MeBmt或二氫-MeBmt；優(yōu)選地，X為X’，其中X’為αAbu或Nva，更優(yōu)選X”，其中X”為αAbu；優(yōu)選地，Y為Y’，其中Y’為γ-羥基-MeLeu、MeVal、MeThr、MeAla或MeTyr(O-PO(OH)2)；
優(yōu)選地，Z為Z’，其中Z’為Val或MeVal；和優(yōu)選地，Q為Q’，其中Q’為MeLeu。
一組特別優(yōu)選的活性化合物為式I的化合物，其中W為W’，X為X’，Y為Y’，Z為Z’且Q為Q’。
特別優(yōu)選的式I的活性化合物為a)[二氫-MeBmt]1-[γ-羥基-MeLeu]4-環(huán)孢素；b)[MeVal]4-環(huán)孢素；c)[MeIle]4-環(huán)孢素；d)[MeThr]4-環(huán)孢素；e)[γ-羥基-MeLeu]4-環(huán)孢素；f)[Nva]2-[γ-羥基-MeLeu]4-環(huán)孢素；g)[γ-羥基-MeLeu]4-[γ-羥基-MeLeu]6-環(huán)孢素；h)[MeVal]5-環(huán)孢素；i)[MeOThr]2-[(D)MeAla]3-[MeVal]5-環(huán)孢素，orj)[8’-羥基-MeBmt]1-環(huán)孢素.
m)[N-苯甲基-Val]5-環(huán)孢素，n)[N-5-氟-苯甲基-Val]5-環(huán)孢素，o)[N-烯丙基-Val]5-環(huán)孢素，p)[N-3-苯基-烯丙基-Val]5-環(huán)孢素，q)[Pro]4-環(huán)孢素特別優(yōu)選的活性化合物為[MeIle]4-環(huán)孢素和[γ-羥基-MeLeu]4-環(huán)孢素，最優(yōu)選[MeIle]4-環(huán)孢素。
除式I的化合物外，優(yōu)選的活性化合物還包括，例如r)[γ-羥基-MeLeu]9-環(huán)孢素。
可獲得活性化合物的方法包括1)發(fā)酵2)生物轉(zhuǎn)化3)衍生
4)半合成5)全合成。
這些方法被普遍地描述，并且在EP 0484281 B的實(shí)施例1到10中和美國(guó)專利No.5767069中更具體地描述了這些方法。在本申請(qǐng)中引入這些概述和這些實(shí)施例的教導(dǎo)作為參考。EP 0484281 B的實(shí)施例11描述了與環(huán)孢素有關(guān)的代表性活性化合物的免疫抑制和親環(huán)結(jié)合活性的測(cè)量，且該實(shí)施例的教導(dǎo)也被包括在本申請(qǐng)的公開內(nèi)容中。
因此本發(fā)明提供了非免疫抑制的親環(huán)蛋白結(jié)合環(huán)孢菌素在制備用于治療或預(yù)防與Aβ分泌相關(guān)病理狀態(tài)的藥物中的用途，所述病理狀態(tài)包括例如阿爾茨海默病、帕金森病、τ蛋白病(tauopathies)、朊病毒病、額顳型癡呆、紋狀體黑質(zhì)變性、盧伊體癡呆、亨廷頓病、皮克病、淀粉樣變和其它與過(guò)量Aβ產(chǎn)生相關(guān)的神經(jīng)變性病癥。
本發(fā)明還提供用于治療或預(yù)防與Aβ分泌相關(guān)病理狀態(tài)的方法，所述病理狀態(tài)包括例如阿爾茨海默病、帕金森病、τ蛋白病、朊病毒病、額顳型癡呆、紋狀體黑質(zhì)變性、盧伊體癡呆、亨廷頓病、皮克病、淀粉樣變和其它神經(jīng)變性病癥，所述方法包括對(duì)所述患者施用有效量的本發(fā)明的活性化合物。
可以通過(guò)任何常規(guī)途徑，特別是經(jīng)腸地，例如以飲用溶液、片劑或膠囊形式口服地；或非經(jīng)腸地，例如以注射液或懸液形式施用活性化合物。靜脈內(nèi)注射途徑的每日指示劑量可以是從1到20mg/kg，優(yōu)選從3到10mg/kg，而口服途徑的每日指示劑量為從1到50mg/kg，優(yōu)選從10到30mg/kg。
活性化合物的毒性被認(rèn)為低于環(huán)孢素。由于活性化合物是非免疫抑制的，避免了環(huán)孢素與免疫抑制相關(guān)的某些副作用。其它與環(huán)孢菌素相關(guān)的副作用，特別是長(zhǎng)期使用時(shí)的腎毒性和中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性均有利地低于環(huán)孢素。
用于活性化合物的優(yōu)選的蓋倫制劑包括那些基于如英國(guó)專利申請(qǐng)2222 770A中所述的微乳，其包括局部及口服的形式；還包括如英國(guó)專利申請(qǐng)2 209 671A所述從含有脂肪酸糖單酯(例如蔗糖單月桂酸酯)的固溶體獲得的口服和可注射的形式。適用于口服施用的單位劑型包括例如每劑從25到200mg活性化合物。
在這里引入EP 0484281 B的制劑實(shí)施例A、B、C和D作為參考在英國(guó)專利申請(qǐng)2 222 770中有這些制劑各自的成分以及它們的制備方法的詳盡描述，在這里引入其內(nèi)容作為參考。
可以在體內(nèi)或體外測(cè)試中證明活性化合物作為神經(jīng)保護(hù)劑的用途，例如可單獨(dú)提供本發(fā)明的活性化合物，或?qū)⑵渑c其它物質(zhì)組合或序貫聯(lián)合。例如，可以將本發(fā)明的活性化合物與抗炎劑，例如(但不僅限于)糖皮質(zhì)激素在中風(fēng)或脊髓損傷后聯(lián)合施用(作為阻斷進(jìn)一步神經(jīng)損傷并抑制軸突再生的手段)；還可以將本發(fā)明的活性化合物與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如NGF、BDNF或其它用于神經(jīng)變性疾病的藥物，如ExelonTM或左旋多巴聯(lián)合施用。如這里所用，當(dāng)同時(shí)施用兩種物質(zhì)或以使所述物質(zhì)在相同時(shí)間起作用的方式獨(dú)立施用兩種物質(zhì)時(shí)，稱兩種物質(zhì)為聯(lián)合施用。
由代碼、通用名或商品名定義的活性成分的結(jié)構(gòu)可以取自標(biāo)準(zhǔn)綱要“默克索引”的現(xiàn)行版本或來(lái)自數(shù)據(jù)庫(kù)，例如國(guó)際專利(例如IMS世界出版物)。在這里引入其相應(yīng)的內(nèi)容作為參考。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠鑒定所述活性成分并且基于這些參考同樣能夠制備和在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試模型中體外和體內(nèi)地測(cè)試其藥物適應(yīng)癥和特性。
對(duì)于上述適應(yīng)癥，適當(dāng)?shù)膭┝繉?dāng)然地依賴于，例如本發(fā)明所使用的具體分子、施用方式和治療病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重性而變化。
實(shí)施例實(shí)施下列方法以進(jìn)行以下公開的實(shí)施例轉(zhuǎn)染。在含有10％胎牛血清、5％青霉素/鏈霉素和22mg的左旋脯氨酸的DMEM(Sigma Chemical，St.Louis，MO)的平板中涂布CHO K1細(xì)胞(ATCC，Manassas，VA)。將平板置于37℃水壓CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。根據(jù)制造商說(shuō)明使用QiagenSuperFect試劑以1∶15的比例(cDNAAPPwt(695))用目的cDNA和全長(zhǎng)APP進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。將5×105細(xì)胞鋪在含有10％胎牛血清、5％青霉素/鏈霉素的DMEM(Sigma Chemical，St.Louis，MO)的六孔板中并培養(yǎng)24小時(shí)。SuperFect混合物由100μl無(wú)血清培養(yǎng)基(DMEM)、3μg的總DNA和20μl的SuperFect組成。從細(xì)胞移去培養(yǎng)基并添加1mL新鮮培養(yǎng)基。將全部SuperFect混合物添加至培養(yǎng)基中并在37℃孵育2小時(shí)。然后移去混合物并用3mL PBS洗滌細(xì)胞一次。向細(xì)胞中加入新鮮培養(yǎng)基并孵育24或48小時(shí)。
免疫細(xì)胞化學(xué)--如制造商(Life Technologies)所述，在OPTIMEM(不含血清培養(yǎng)基)中使用Lipofectamine用適當(dāng)?shù)臉?gòu)建體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。如Dev等人1999，Neuropharmacol.，(1999)38，635-644所述，對(duì)CHO細(xì)胞免疫染色并觀察免疫反應(yīng)性。使用抗-Flag M2單克隆小鼠抗體(Sigma)檢測(cè)Flag-蛋白質(zhì)表達(dá)，二抗為德克薩斯紅-X山羊抗兔IgG(Molecular Probes)。
胱天蛋白酶-3的流式細(xì)胞術(shù)分析。用CyD或CPZ與APPwt一起瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK細(xì)胞24小時(shí)。將細(xì)胞固定、透化處理并用來(lái)自BD Biosciences的胱天蛋白酶-3編程性細(xì)胞凋亡試劑盒(#550914)染色。從≥101門控FITC染色的細(xì)胞并將其作為胱天蛋白酶-3的陽(yáng)性細(xì)胞測(cè)量。同時(shí)檢查前散射和側(cè)散射以檢驗(yàn)細(xì)胞群的健康。
化合物處理。用環(huán)孢菌素A、Sangliferhin A、FK506(如Sedrani等人，J.Am.Chem.Soc.125，3849-3859頁(yè)(2003)所述，將其整體引入作為參考)和N-甲基-4-纈氨酸-環(huán)孢菌素濃縮物處理穩(wěn)定表達(dá)APPswe突變體的HEK293細(xì)胞24小時(shí)。使用來(lái)自Promega的CellTiter-Glo試劑盒(#G7573)測(cè)量細(xì)胞生存力。使用自制雙夾層酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(除使用Novartis發(fā)展的抗體代替Biosource抗體外，自制酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定與所述形式相同)測(cè)量細(xì)胞上清中Aβ40和Aβ42水平。使用穩(wěn)定表達(dá)5×Gal4應(yīng)答元件熒光素酶報(bào)道基因和C99-Gal4-VP16或刻缺蛋白-Gal4-VP16構(gòu)建體的細(xì)胞系測(cè)量C99或刻缺蛋白切割(如Maltese、Wilson等人2001所公開的)。Gal4-VP16在由γ-分泌酶切割后被釋放并結(jié)合到報(bào)道基因增加熒光素酶活性。用化合物處理穩(wěn)定細(xì)胞并測(cè)定IC50值。
Aβ酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。將可商購(gòu)的靶向Aβ肽NH2末端的小鼠單克隆抗體作為預(yù)包被96孔板的捕獲抗體(對(duì)于Aβ40為BiosourceCat#KBH3481/PPO81，對(duì)于Aβ42為Cat#KBH3441/PPO81)。從Biosource獲得多克隆檢測(cè)抗體(抗hAβ40抗體Cat#44-348和抗hAβ42抗體Cat#44-344)并周15mM疊氮化鈉以1/220稀釋。二抗(Aβ4為BiosourceCat#KBH3481，Aβ42為Cat#KBH3441)為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG。用3.3mM百里香酚按1/100稀釋二抗。使用前將抗體包被板用PBS-TE(1mM EDTA和0.05％吐溫20，洗滌緩沖液)在微量培養(yǎng)板洗滌器(Bioteck Instruments，Inc，Winooski，VT)上洗滌四次。取出100μl轉(zhuǎn)染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基并在含有1mM AEBSF(Biosource，Camarillo，CA)的樣品稀釋劑中以1∶2稀釋。將100μl該混合物加至洗過(guò)的抗體包被的96孔板中，用膠帶覆蓋并在4℃孵育過(guò)夜。移去樣品并用洗滌緩沖液洗滌平板四次。按100μl/孔添加抗體檢測(cè)溶液，并將平板在室溫?fù)u動(dòng)培養(yǎng)2小時(shí)。再用洗滌緩沖液洗滌平板四次并按100μl/孔添加二抗和搖動(dòng)孵育2小時(shí)。再用洗滌緩沖液洗滌平板5次并在紙巾上拍干。每孔添加100μl穩(wěn)定色原(四甲聯(lián)苯胺)并將平板在黑暗中孵育30分鐘。向平板中添加100μl終止液(1NH2S)以終止反應(yīng)。1小時(shí)內(nèi)在微量培養(yǎng)板讀取器(microplate reader)(Molecular Devices)于450nM讀取平板。
抗體和Western印跡分析。如先前所述將APP野生型和APP瑞典突變體的cDNA插入pCI質(zhì)粒表達(dá)載體巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子下游(Promega，Madison，WI)(Bodendorf，U.、Fischer，F(xiàn).、Bodian，D.、Multhaup，G.、Paganetti，P.2001 J.Biol.Chem.27612019 12023)。PS1 NTF抗體識(shí)別PS1的N末端(Thinakaran、Borchelt等人1996)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)后在含有蛋白酶抑制劑(CompleteRoche Molecular Biochemicals)的RIPA緩沖液(10mM Tris pH 7.5、150mM氯化鈉、1mM EDTA、1％Nonidet P-40、0.5％脫氧膽酸鈉、1％SDS)中提取培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞并在4℃以10000×g離心10分鐘。收集上清液并丟棄沉淀。隨后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞提取物，轉(zhuǎn)移至PVDF Immobilon-P膜(Millipore)并用指示的一抗探測(cè)。如先前所述(Manni，M.，等人，1998.FEBS.427367-370)用ECL檢測(cè)系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)進(jìn)行免疫檢測(cè)。
免疫細(xì)胞化學(xué)--如制造商(Life Technologies)所述，在OPTIMEM(無(wú)血清培養(yǎng)基)中使用Lipofectamine用適當(dāng)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。如Dev等人1999，Neuropharmacol.，(1999)38，635-644所述，對(duì)CHO細(xì)胞免疫染色并觀察免疫反應(yīng)性。使用抗-Flag M2單克隆小鼠抗體(Sigma)檢測(cè)Flag-蛋白質(zhì)表達(dá)。二抗為德克薩斯紅-X山羊抗兔IgG(Molecular Probes)。
CPZ構(gòu)建體--從購(gòu)自Life Technologies，Inc的純?nèi)薉RG的標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫(kù)(L0001)(LTI，商品號(hào)11315-017，批號(hào)81027-242)獲得野生型人羧肽酶(hCPZ)。將cDNA插入片段以5’到3’的方向克隆至Gateway-相容載體pCMV·SPORT6的EcoR V和Not I位點(diǎn)。使用引物通過(guò)位點(diǎn)定向的誘變完成對(duì)對(duì)應(yīng)于氨基酸42-161的卷曲(FZ)結(jié)構(gòu)域和氨基酸179-568的催化(Cat)結(jié)構(gòu)域的缺失、點(diǎn)突變(氨基酸E251A)以及在氨基酸29之后引入N-末端FLAG標(biāo)簽(DYKDDDDK Seq ID.No 1)，所述引物為5’CCTCCAGGCCTCCCCGAAGCTTCTCGGCGCTGTCTGCAGCTGGTGGCCTGTGG-3’(Seq Id No.2)和5’CCACAGGCCACCAGCTGCAGACAGCGCCGAGAAGCTTCGGGGAGGCCTGGAGG-3’(Seq Id No.3)用于卷曲結(jié)構(gòu)域的缺失，5’CCACACGGCCAGCCCTCTTCATCCGGGCCAGCCCTGAGGGCAGTGCCTCGTCAGC-3’(Seq Id No.4)和5’GCTGACGAGGCACTGCCCTCAGGGCTGGCCCGGATGAAGAGGGCTGGCCGTGTGG 3’(Seq Id No.5)用于催化結(jié)構(gòu)域的缺失，5’CATCTCCCGGCCCGCCACCGCGTTGCCATGAATGTTGC-3’(Seq Id No.6)和5’GCAACATTCATGGCAACGCGGTGGCGGGCCGGGAGAIGC-3’(SeqId No.7)用于點(diǎn)突變E251A，以及5’GGTGGCCTGTGGCATTCACCCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGGCGGGGTTCCGCTCAAACTCG-3’(Seq Id No.8)和5’CGAGTTTGAGCGGAACCCCGCCGACTACAAGGACGACGATGACAAGGGTGAATGCCACAGGCCACC-3’(Seq Id No.9)用于引入FLAG標(biāo)簽。使用Qiagen質(zhì)粒試劑盒從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中分離所有DNA。使用ABI Prism 3700 DNA分析儀系統(tǒng)通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證所有可讀框的序列。
原位雜交--使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)用5’側(cè)接SP6啟動(dòng)子和T7啟動(dòng)子識(shí)別序列的自身引導(dǎo)的寡核苷酸引物，可以不需要任何克隆步驟地從任何已知基因序列產(chǎn)生RNA探針模板。PCR反應(yīng)進(jìn)行如下95℃變性45秒，58℃退火階段30秒，70℃延伸階段1分鐘，共40個(gè)循環(huán)。在4％瓊脂糖凝膠上分離后，用QiAQuick純化試劑盒根據(jù)制造商說(shuō)明(Qiagen，Switzerland)純化PCR產(chǎn)物。使用含有地高辛-UTP的dNTP用T7-RNA聚合酶(反義)和SP6-RNA聚合酶(正義)于37℃2小時(shí)轉(zhuǎn)錄純化的PCR產(chǎn)物。除去未整合的核苷酸，用乙醇沉淀探針并將其溶于50μl水中然后儲(chǔ)存在-20℃。將DIG-探針和標(biāo)記的對(duì)照RNA(已知濃度)的梯度稀釋點(diǎn)在尼龍膜上。用與抗DIG抗體綴合的堿性磷酸酶孵育后，接著使用NBT/BCIP(溶在70％二甲基甲酰胺和30％水中的75mg/ml氮藍(lán)四唑和溶在100％二甲基甲酰胺中的50mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽)作為堿性磷酸酶底物進(jìn)行顯色步驟。通過(guò)與標(biāo)記的對(duì)照RNA點(diǎn)的強(qiáng)度比較估計(jì)CPZ探針濃度。使用原位雜交和免疫化學(xué)的全自動(dòng)儀器DiscoveryTM(Ventana MedicalSystems，Strasbourg)進(jìn)行ISH。在RNA分析實(shí)驗(yàn)室內(nèi)建立使用石蠟包埋的組織切片定位該基因的方法，且該方法如下所述，在無(wú)溶劑條件下使用EZprep溶液(Ventana Medical Systems SA，Strasbourg)于75℃8分鐘，繼之于42℃8分鐘對(duì)組織切片進(jìn)行去石蠟化和再水化。使用RiboMapTM試劑盒(Ventana Medical Systems SA，Strasbourg)根據(jù)制造商說(shuō)明并且使用酶消化作為一個(gè)附加的透化步驟完成所有的預(yù)處理步驟用12μg/ml的蛋白酶K于37℃消化16分鐘獲得最佳結(jié)果。用稀釋于RiboHybe溶液(Ventana Medical Systems SA，Strasbourg)的適量DIG-核糖核酸探針(CPZ探針＝5ng/載玻片)在45℃進(jìn)行CPZ探針雜交6小時(shí)。雜交后在高嚴(yán)格條件(0.1×SSC)下于50℃8分鐘洗滌3次。為了檢測(cè)DIG-標(biāo)記，用抗體稀釋劑以1/2000稀釋生物素綴合的小鼠抗地高辛抗體(JacksonImmunoresearch Inc.)之后，于37℃施加所述抗體30分鐘，繼之使用BlueMapTM試劑盒(Ventana Medical Systems SA，Strasbourg)根據(jù)制造商說(shuō)明進(jìn)行BCIP/NBT顯色檢測(cè)。具有最佳信/噪平衡的底物孵育時(shí)間為4小時(shí)。使用ISH核快紅(nuclear fast red)復(fù)染10分鐘。在石英蓋片(Crystalmount)中固定切片并使用Permount封片。
實(shí)施例1早老蛋白加工觀察到過(guò)表達(dá)cDNA提高C99底物的Aβ水平，提示GACE介導(dǎo)的APP切割提高。由于CPZ和CyD顯著提高C99的加工并提高Aβ42分泌，選擇它們進(jìn)一步研究。檢測(cè)了用CPZ或CyD轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中PS1 N末端片段(NTF)水平。在用PS1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，可容易地檢測(cè)到全長(zhǎng)PS1和NTF。相反，在未轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞中，內(nèi)源全長(zhǎng)PS1和NTF水平較低。在過(guò)表達(dá)CPZ或CyD的細(xì)胞中，PS1 NTF水平的顯著提高指示這些片段在以更高速率產(chǎn)生或者內(nèi)源NTF在48小時(shí)的轉(zhuǎn)染期間被穩(wěn)定化。
CPZ分析CPZ是羧肽酶(CP)基因家族的成員，屬于CPE亞家族，已知其加工生物活性神經(jīng)肽(Song和Fricker 1997)。CPE相關(guān)酶通常參與選擇性加工反應(yīng)，其從加工中間體的C末端選擇性去除堿性殘基。為了確定CPZ的催化活性、表達(dá)或亞細(xì)胞定位是否是誘導(dǎo)Aβ所必需的，產(chǎn)生三種CPZ突變構(gòu)建體。在第一種構(gòu)建體中，完全去除催化結(jié)構(gòu)域(Δcat)只剩下信號(hào)肽、卷曲結(jié)構(gòu)域和C末端。在第二種構(gòu)建體中缺失卷曲結(jié)構(gòu)域(Δfz)，而在第三種構(gòu)建體中，向催化結(jié)構(gòu)域中引入損傷CPZ催化活性的單個(gè)點(diǎn)突變(Glu251Ala)。將每種CPZ變體與APPwt或C99底物共轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293細(xì)胞。與野生型CPZ或flag標(biāo)記的CPZ相比，三個(gè)突變構(gòu)建體各自均不具有活性。使用APPwt和C99底物的結(jié)果是相似的。
對(duì)CPZ突變體活性缺失的可能的解釋為在細(xì)胞中缺少表達(dá)或該蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤定位。為了弄清該問(wèn)題，用flag標(biāo)記CPZ突變體并在CHO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。在透化處理的細(xì)胞中，CPZ野生型具有澄清的細(xì)胞質(zhì)膜或遲的分泌小泡定位。該結(jié)果與之前檢測(cè)CPZ胞內(nèi)分布的研究一致(Novikova、Reznik等人2000)。CPZ突變構(gòu)建體Δcat、Δfz和Glu251Ala的亞細(xì)胞定位保持不變。這些發(fā)現(xiàn)提示CPZ的催化活性而非其細(xì)胞內(nèi)定位或表達(dá)水平是在CHO細(xì)胞中誘導(dǎo)Aβ水平所必需的。
破壞CPZ催化活性阻止Aβ產(chǎn)生而不影響其表達(dá)或亞細(xì)胞定位。過(guò)表達(dá)CPZ能夠與Wnt競(jìng)爭(zhēng)與內(nèi)源卷曲受體的結(jié)合引起更少的β-聯(lián)蛋白激活(Tesco、Kim等人1998)。β-聯(lián)蛋白活性降低與提高的Aβ產(chǎn)生相關(guān)，認(rèn)為所述提高的Aβ產(chǎn)生是由PS1提高β-聯(lián)蛋白與GSK3β締合的能力介導(dǎo)的(Kang、Soriano等人1999)?？赡蹸PZ能夠通過(guò)經(jīng)由胱天蛋白酶-3激活PS1切割誘導(dǎo)Aβ產(chǎn)生，導(dǎo)致更少的PS1/β-聯(lián)蛋白復(fù)合物(Tesco、Kim等人1998)。如果PS1未與β-聯(lián)蛋白結(jié)合，則其能夠更容易地與GACE復(fù)合物締合。由于卷曲結(jié)構(gòu)域表征為蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域，可能CPZ的卷曲結(jié)構(gòu)域能夠與γ-分泌酶復(fù)合物的組分(即PS1或APP自身)相互作用。目前正在研究這些相互作用。
值得注意的是，認(rèn)為CPZ結(jié)構(gòu)域的C末端含有將CPZ從質(zhì)膜釋放至胞外環(huán)境的假定的弗林蛋白酶切割位點(diǎn)(Novikova、Reznik等人2000)。弗林蛋白酶還參與刻缺蛋白配體δ從細(xì)胞表面刻缺蛋白的釋放(Ikeuchi和Sisodia 200)。盡管尚未確認(rèn)CPZ上的弗林蛋白酶位點(diǎn)為弗林蛋白酶底物，已證明能夠從細(xì)胞分泌CPZ(Novikova、Reznik等人2000)。這提示CPZ可能位于與刻缺蛋白相同的加工通路上，但目前尚不清楚CPZ的刻缺蛋白切割如何涉及Aβ產(chǎn)生(Kim、Wang等人1999)。然而，觀察到，與CyD過(guò)表達(dá)相似，CPZ能夠使細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞凋亡，指示兩種蛋白質(zhì)存在影響Aβ產(chǎn)生的共同機(jī)制。
先前的發(fā)現(xiàn)(Novikova和Fricker 1999)提示，CPZ在大鼠腦柔腦脊膜細(xì)胞中表達(dá)，但尚未顯示CPZ在已知受阿爾茨海默病侵襲的腦區(qū)域中表達(dá)(Novikova和Fricker 1999)。為了確定CPZ在何處表達(dá)，通過(guò)原位雜交分析小鼠腦切片。在野生型C7BL-6小鼠(Jackson Laboratories)中，CPZ反義探針顯示在腦中有廣泛分布的結(jié)合，在小腦和額皮質(zhì)具有最高水平信號(hào)。在更進(jìn)一步的檢查中，還發(fā)現(xiàn)CPZ在靠近CA1和CA3區(qū)域的海馬中，最可能在錐體細(xì)胞中表達(dá)。在小腦中，CPZ在靠近Perkinje和顆粒細(xì)胞層的分子區(qū)域表達(dá)。CPZ在額皮質(zhì)中的分布未顯示位于特定細(xì)胞類型中，而是在該區(qū)域中平均地表達(dá)。CPZ在小鼠海馬、小腦和額皮質(zhì)中的定位說(shuō)明其在腦中已知受到人阿爾茨海默病侵襲的區(qū)域表達(dá)。
CyD的表征為了測(cè)定這些抑免蛋白結(jié)合化合物是否能夠調(diào)節(jié)APP加工，用一定濃度范圍的環(huán)孢菌素A、Sangliferhin A、FK506或N-甲基-4-纈氨酸-環(huán)孢菌素濃縮物處理HEK/APPswe穩(wěn)定細(xì)胞。按照制造商說(shuō)明(Promega Cat#G5421)對(duì)每個(gè)濃度通過(guò)MTS測(cè)定法測(cè)量生存力并用本文所述酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)量分泌的Aβ40和Aβ42。所有濃度的生存力IC50均＞40μM。環(huán)孢菌素A、Sangliferhin A對(duì)于Aβ40和Aβ42的抑制性IC50為＜3μM，說(shuō)明對(duì)Aβ分泌的強(qiáng)抑制。N-甲基-4-纈氨酸-環(huán)孢菌素對(duì)于Aβ40和Aβ42分泌的IC50為＜10μM，而FK506對(duì)于Aβ分泌沒(méi)有影響。相反，F(xiàn)K506處理引起Aβ42從3-20μM的劑量依賴性提高。
已證明免疫抑制劑如環(huán)孢菌素A能夠抑制若干動(dòng)物模型中神經(jīng)變性和細(xì)胞凋亡并抑制分離的小鼠線粒體中Aβ誘導(dǎo)的線粒體損傷(Kim 2002)。由于CyD是環(huán)孢菌素A的靶標(biāo)并定位于線粒體內(nèi)，其可能在該位點(diǎn)Aβ加工中起作用，提示CyD可能對(duì)人AD的發(fā)展是重要的。盡管尚未測(cè)試到其它同工型，CyD可能由于它是唯一已知定位于線粒體的親環(huán)蛋白同工型對(duì)Aβ加工具有獨(dú)特效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)在HEK細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CyD能夠提高胱天蛋白酶-3活性并穩(wěn)定PS1 NTF，提示其能夠直接修飾PS1活性。另外，能夠與CyD結(jié)合并抑制其活性的化合物強(qiáng)烈抑制Aβ分泌和C99切割。
具體的，3μM Sanglifehrin A強(qiáng)烈抑制Aβ并且在低于20μM之前對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性。已知Sanglifehrin A結(jié)合CyD并抑制其PPIase活性，而不影響CyD與腺嘌呤核苷酸易位體(ANT)的結(jié)合能力，并且不抑制如CsA(Samantha J.Clarke 2002)的鈣調(diào)磷酸酶的活性?？梢砸匀舾煞绞浇忉孲anglifehrin A急劇升降的劑量應(yīng)答(steep dose response)。只有當(dāng)Sanglifehrin A與相當(dāng)多部分的CyD結(jié)合，足以破壞其在MPT的活性時(shí)，Sanglifehrin A才可抑制孔道開放(Clarke 2002)。由于ANT以二聚體存在，很可能CyD必需以多于一個(gè)分子與ANT結(jié)合以誘導(dǎo)構(gòu)象變化。由于Sanglifehrin A必需結(jié)合多個(gè)CyD分子以抑制MPT復(fù)合物活性，這將解釋在3μM閾值時(shí)對(duì)Aβ分泌的快速抑制。一旦達(dá)到該閾值，MPT復(fù)合物可被完全抑制并阻止孔道開放。該MPT抑制的閾值還似乎是Aβ加工和/或分泌的重要調(diào)節(jié)物?；蛘?，Sanglifehrin A可以具有與CyD不同或除CyD之外還有多個(gè)靶標(biāo)。尚不清楚CyD是直接通過(guò)其PPIase活性還是通過(guò)MPT構(gòu)象變化調(diào)節(jié)MPT化合物。無(wú)論如何，這里所給出的數(shù)據(jù)與由其它研究給出的數(shù)據(jù)一致說(shuō)明CyD和MPT孔道在Aβ加工中起關(guān)鍵作用。
盡管這些化合物能夠顯著降低Aβ分泌并抑制C99切割，它們還抑制刻缺蛋白切割?？紤]到數(shù)據(jù)顯示CyD和CPZ過(guò)表達(dá)影響GACE活性，這一結(jié)果并不令人驚訝。這一數(shù)據(jù)首次說(shuō)明抑免化合物能夠抑制GACE活性并定義了細(xì)胞中能夠影響Aβ和刻缺蛋白加工的新通路。
值得注意的是，F(xiàn)K506處理以劑量依賴的形式顯著地提高Aβ42分泌。已知FK506結(jié)合抑免蛋白而非CyD。Aβ42的特異性提高提示FK506靶蛋白質(zhì)可能調(diào)節(jié)Aβ42的代謝或產(chǎn)生。FK506和CsA都能抑制鈣調(diào)磷酸酶但它們對(duì)Aβ分泌具有不同影響，因此鈣調(diào)磷酸酶可能不影響Aβ水平。FK506的這一獨(dú)特影響進(jìn)一步支持抑免蛋白通路調(diào)節(jié)Aβ加工。
實(shí)施例2C99和刻缺蛋白切割如Maltrese、Wilson等人2001所述，使用帶有信號(hào)肽、TGN保留序列和插入在Q56/Y57處的GAL4-NLS-VP16序列的修飾的C99或刻缺蛋白跨膜序列產(chǎn)生HEK 293穩(wěn)定細(xì)胞系。所述細(xì)胞還穩(wěn)定表達(dá)5×GAL4RE-熒光素酶報(bào)道基因構(gòu)建體(RD-2002-01437和RD-2001-02419)。當(dāng)切割C99轉(zhuǎn)基因從而激活Gal4熒光素酶報(bào)道基因時(shí)，測(cè)量到這些細(xì)胞的GACE活性。用環(huán)孢菌素A、Sangliferhin A、FK506或N-甲基-4-纈氨酸-環(huán)孢菌素處理這些HEK穩(wěn)定細(xì)胞并確定C99切割的IC50。GALVP可單獨(dú)作為陰性對(duì)照。環(huán)孢菌素A、N-甲基-4-纈氨酸-環(huán)孢菌素、Sangliferhin A和FK506的GALVP IC50分別為6.9、9.9、＞20和＞20μM，由于這些化合物在＞40μM之前并無(wú)毒性，表明C99切割的抑制與細(xì)胞生存力間存在明顯聯(lián)系。然而，環(huán)孢菌素A、N-甲基-4-纈氨酸-環(huán)孢菌素、Sangliferhin A分別在0.71、0.87和0.85μM都抑制C99切割，并分別在1.7、2.7和3.2μM抑制刻缺蛋白切割。FK506對(duì)C99或刻缺蛋白切割沒(méi)有影響。因此能夠與CyD結(jié)合的配體強(qiáng)烈抑制C99和刻缺蛋白切割表明GACE活性被抑制。
實(shí)施例3胱天蛋白酶-3激活近期研究提示激活胱天蛋白酶-3能夠引起Aβ分泌提高并穩(wěn)定GACE復(fù)合物中的蛋白質(zhì)(Tesco、Koh等人2003)。由于CyD和CPZ都提高Aβ分泌并穩(wěn)定PS1 NTF，在CyD和CPZ過(guò)表達(dá)細(xì)胞中分析胱天蛋白酶-3激活的水平。用CyD和CPZ與APPwt一起瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞24小時(shí)，皂苷透化處理、固定并用針對(duì)活性胱天蛋白酶-3的FITC綴合的單克隆抗體探測(cè)。陰性對(duì)照細(xì)胞用空載體和APPwt轉(zhuǎn)染，而陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞在分析前用1μM星形孢菌素處理6小時(shí)。在表達(dá)CyD的細(xì)胞中，52％檢測(cè)的細(xì)胞是活性胱天蛋白酶-3陽(yáng)性的，而在表達(dá)CPZ的細(xì)胞中，48％的細(xì)胞是胱天蛋白酶-3陽(yáng)性的。這些結(jié)果表明這些蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)胱天蛋白酶-3的激活，提示這是穩(wěn)定化PS1 NTF和提高Aβ分泌的可能機(jī)制。
權(quán)利要求
1.非免疫抑制的親環(huán)蛋白結(jié)合環(huán)孢菌素在制備用于治療或預(yù)防與Aβ產(chǎn)生和/或分泌相關(guān)病理狀態(tài)的藥物中的用途，所述病理狀態(tài)例如阿爾茨海默病、帕金森病、τ蛋白病、朊病毒病、額顳型癡呆、紋狀體黑質(zhì)變性、盧伊體癡呆、亨廷頓病、皮克病、淀粉樣變和其它與過(guò)量Aβ產(chǎn)生相關(guān)的神經(jīng)變性病癥。
2.用于治療或預(yù)防與Aβ產(chǎn)生和/或分泌相關(guān)的病理狀態(tài)的方法，其包括對(duì)所述患者施用有效量的非免疫抑制的親環(huán)蛋白結(jié)合環(huán)孢菌素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的用途或根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中非免疫抑制的親環(huán)蛋白結(jié)合環(huán)孢菌素為式A的化合物及其可藥用鹽 其中B為式B的氨基酸殘基 其中a表示連接位置2的αAbu殘基的鍵；b表示連接位置4的C殘基的鍵；Alk代表含有2到6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈亞烷基或含有3到6個(gè)碳原子的環(huán)亞烷基，且R代表羧基或烷氧基羰基；-NR1R2基，其中R1和R2是相同或不同的并且代表氫、烷基、C2-4鏈烯基、C3-6環(huán)烷基、苯基(任選地由鹵素、烷氧基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基或二烷基氨基取代)或苯甲基或含有5或6個(gè)環(huán)原子及1到3個(gè)雜原子的飽和或不飽和雜環(huán)基；或其中R1和R2與它們所連接的氮原子一起形成飽和或不飽和的雜環(huán)，所述雜環(huán)含有4到6個(gè)環(huán)原子，任選地含有選自氮、氧或硫的其它雜原子，并任選地由烷基、苯基或苯甲基取代；下式的原子團(tuán) 其中R1和R2如上定義，R3代表氫或烷基且n為從2到4的整數(shù)，且其中烷基表示含有從1到4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基；C為MeLeu或4-羥基-MeLeu。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的用途或根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中非免疫抑制的親環(huán)蛋白結(jié)合環(huán)孢菌素為式I的化合物 其中W為MeBmt、二氫-MeBmt或8′-羥基-MeBmt；X為αAbu、Val、Thr、Nva或O-甲基蘇氨酸(MeOThr)；R為Sar或(D)-MeAla；Y為MeLeu、γ-羥基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、MeAla、Me Tyr、MeTyr(O-PO(OH)2)、MeaIle或MeaThr或Pro；Z為Val、Leu、N-Alk-Val或N-Alk-Leu，其中Alk代表Me或如下取代的Me由乙烯基取代的Me，所述乙烯基任選地由苯基或含有6元環(huán)的N、S或O雜芳香基取代，或由苯基取代的Me，所述苯基任選地由鹵素取代；Q為MeLeu、γ-羥基-MeLeu或MeAla。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的用途或根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中非免疫抑制的親環(huán)蛋白結(jié)合環(huán)孢菌素為選自以下的化合物a)[二氫-MeBmt]1-[γ-羥基-MeLeu]4-環(huán)孢素；b)[MeVal]4-環(huán)孢素；c)[MeIle]4-環(huán)孢素；d)[MeThr]4-環(huán)孢素；e)[γ-羥基-MeLeu]4-環(huán)孢素；f)[Nva]2-[γ-羥基-MeLeu]4-環(huán)孢素；g)[γ-羥基-MeLeu]4-[γ-羥基-MeLeu]6-環(huán)孢素；h)[MeVal]5-環(huán)孢素；i)[MeOThr]2-[(D)MeAla]3-[MeVal]5-環(huán)孢素，orj)[8’-羥基-MeBmt]1-環(huán)孢素.m)[N-苯甲基-Val]5-環(huán)孢素，n)[N-5-氟-苯甲基-Val]5-環(huán)孢素，o)[N-烯丙基-Val]5-環(huán)孢素，p)[N-3-苯基-烯丙基-Val]5-環(huán)孢素，q)[Pro]4-環(huán)孢素，或r)[γ-羥基-MeLeu]9-環(huán)孢素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的用途或根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中非免疫抑制的親環(huán)蛋白結(jié)合環(huán)孢素為[MeVal]4-環(huán)孢素。
全文摘要
非免疫抑制的親環(huán)蛋白結(jié)合環(huán)孢菌素可以，例如在與Aβ分泌和/或產(chǎn)生有關(guān)的病理狀態(tài)的預(yù)防或治療中用作神經(jīng)保護(hù)劑。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1984670SQ200580023721
公開日2007年6月20日 申請(qǐng)日期2005年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月13日
發(fā)明者D·科恩, L·A·該賽 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司