專利名稱：納米粒子及其制備方法
本專利申請涉及納米粒子、納米粒子用于制備藥物的用途以及納米粒子的制備方法。
納米粒子作為藥物的載體體系自從70年代就是已知的。其能夠?qū)⒒钚晕镔|(zhì)理想地運(yùn)輸?shù)剿Ｍ纳眢w部位，在目的地才進(jìn)行釋放(所謂的遞藥系統(tǒng))。同時有效保護(hù)尚未釋放的活性物質(zhì)免受身體代謝作用的影響。因此，通過活性物質(zhì)分子占多數(shù)并且理想地到達(dá)其真正的作用位并使整個有機(jī)體較少負(fù)荷而可以使副作用最小化。
為了制備納米粒子，文獻(xiàn)中描述了大量合成性起始材料，例如聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚苯乙烯和氰基丙烯酸酯。不過，這些大分子關(guān)鍵的缺點(diǎn)在于其差的或缺少的生物降解性。
作為天然的、在身體內(nèi)可降解的載體材料，尤其公開了纖維結(jié)合素、多種不同多糖、清蛋白、膠原質(zhì)和明膠。
已知納米粒子的另一困難在于部分寬的尺寸分布，考慮到一致的釋放和運(yùn)輸行為，這是有不利的。雖然通過麻煩的離心和其它分離方法可以將這些納米粒子的尺寸分布窄化到一定范圍，但這也不會帶來滿意的結(jié)果。
因此，本申請的任務(wù)在于提供可生物降解的納米粒子，其保證一致的并且可定義的活性物質(zhì)運(yùn)輸。同時所述任務(wù)還在于提供一種制備該納米粒子的適當(dāng)方法。
對于文端所述類型的納米粒子，所述任務(wù)是如下實(shí)現(xiàn)的納米粒子主要由水性明膠凝膠形成，所述納米粒子的平均直徑最大為350nm，并且納米粒子的多分散性指數(shù)小于或等于0.15。
作為納米粒子的起始材料，明膠具有一系列優(yōu)點(diǎn)。其可以以確定的組成和純度提供，并且具有相對小的抗原潛在性。此外，明膠可以腸胃外使用，尤其是作為血漿容量擴(kuò)張劑。
此外，明膠的氨基酸側(cè)鏈提供簡便的可能性，可以化學(xué)改性納米粒子的表面，使明膠交聯(lián)，或者使活性物質(zhì)分子共價結(jié)合到粒子上。
術(shù)語″水性明膠凝膠″在本申請意義上作如下理解，在納米粒子中含有的明膠以水合形式，即作為水狀膠體存在。由于所述納米粒子在其制備和使用期間一直被水溶液包圍，納米粒子尺寸和多分散性的所有報告都是指該水合形式。用光子關(guān)聯(lián)能譜法(PCS)的標(biāo)準(zhǔn)方法確定這些參數(shù)，以下對其進(jìn)行詳細(xì)描述。
表述″主要由...形成″在本發(fā)明中這樣理解，所述納米粒子有95重量％或更多，優(yōu)選97重量％或更多，更優(yōu)選98重量％或更多，最優(yōu)選99重量％或更多由水性明膠凝膠組成。
多分散性指數(shù)是納米粒子尺寸分布的尺度，理論值可以在1(最大散布)和0(所有粒子的尺寸相同)之間。本發(fā)明納米粒子最大為0.15的低多分散性指數(shù)保證了理想并且可控制地運(yùn)輸活性物質(zhì)以及在最理想的目的地釋放該活性物質(zhì)，尤其是通過體細(xì)胞吸收該納米粒子時。
特別優(yōu)選多分散性指數(shù)小于或等于0.1的納米粒子。
納米粒子的尺寸是其使用性的關(guān)鍵因素，可以根據(jù)使用領(lǐng)域而變化。多數(shù)情況下優(yōu)選平均直徑最大為200nm的納米粒子。
本發(fā)明另一實(shí)施方式涉及平均直徑最大為150nm，優(yōu)選80～150nm的納米粒子。這可以在利用所謂EPR-作用(改善的滲透性和保持力)下進(jìn)行使用。該作用能夠針對地治療腫瘤細(xì)胞，其對所述尺寸范圍的納米粒子比健康細(xì)胞具有更高的吸收率。
納米粒子尺寸分布的另一參數(shù)是直徑的帶寬，其優(yōu)選最大在平均值以上20nm和以下20nm。同樣可以通過PCS確定帶寬。
本發(fā)明納米粒子的性質(zhì)還受所含明膠的分子量分布的影響。在該關(guān)系中重要的是低分子量明膠的含量，尤其是分子量小于65kDa的明膠的含量，基于在納米粒子含有的所有明膠計。該含量優(yōu)選小于40重量％。特別有利的是小于30重量％，優(yōu)選20重量％和更小的含量。
在現(xiàn)有技術(shù)中，與明膠相關(guān)所描述的大多納米粒子，還含有其它結(jié)構(gòu)聚合物(例如根據(jù)凝聚法制得的納米粒子，如在WO 01/47501A1中所述那樣)。迄今由純明膠制得的納米粒子或者是不穩(wěn)定的，或者不具有以上描述的、在粒子直徑和尺寸分布方面對于選擇性活性物質(zhì)運(yùn)輸有利的參數(shù)。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，在納米粒子中含有的明膠發(fā)生交聯(lián)。通過交聯(lián)，根本上提高了納米粒子的穩(wěn)定性，此外，還可以通過所選的交聯(lián)度而理想地調(diào)節(jié)納米粒子的降解行為。這是有利的，因為不同的使用領(lǐng)域通常要求納米粒子確定的降解時間。
交聯(lián)時尤其有意義的是，分子量小于65kDa的明膠的含量小于20重量％。
未交聯(lián)的納米粒子適于體外，尤其是診斷使用，其中，在明膠熔點(diǎn)以下例如在室溫下進(jìn)行處理。
相比之下，以上所述交聯(lián)的納米粒子尤其是適于治療使用。
明膠可以進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，例如通過甲醛、二醛、異氰酸酯、二異氰酸酯、碳二亞胺或烷基二鹵化物進(jìn)行。
或者還可以進(jìn)行酶促交聯(lián)，例如通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或漆酶進(jìn)行。
在另一實(shí)施方式中，對本發(fā)明的納米粒子進(jìn)行干燥，優(yōu)選干燥到水含量最大為15重量％。
本發(fā)明另一實(shí)施方式涉及在其表面上結(jié)合藥物活性物質(zhì)的納米粒子。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在活性物質(zhì)結(jié)合到納米粒子的表面上之前進(jìn)行化學(xué)改性，例如通過明膠的自由氨基或羧基進(jìn)行反應(yīng)而改性，從而形成帶電的側(cè)鏈或帶有新化學(xué)官能團(tuán)的側(cè)鏈。
藥物活性物質(zhì)結(jié)合到納米粒子或化學(xué)改性的納米粒子上可以通過吸附力、通過共價鍵或通過離子鍵進(jìn)行。例如納米粒子(其表面通過相應(yīng)的化學(xué)改性而帶正電)上可離子性鍵合DNA或RNA片段。
在另一實(shí)施方式中，活性物質(zhì)通過間隔臂結(jié)合到納米粒子上。
以上所述的納米粒子只要發(fā)生交聯(lián)，根據(jù)本發(fā)明就可以用于制備藥物。
特別有利的是，所述納米粒子用于細(xì)胞內(nèi)的遞藥系統(tǒng)，尤其是作為核酸或肽的載體。
含有本發(fā)明納米粒子的藥物優(yōu)選可以用于基因治療中。
本發(fā)明還涉及一種制備開頭所述領(lǐng)域的納米粒子的方法。
針對基于本發(fā)明的任務(wù)的方法的本發(fā)明是如下實(shí)現(xiàn)的，使用明膠作為起始材料用于該制備方法，分子量小于65kDa的明膠含量最大為40重量％，基于所有明膠計。
通過使用一種這樣的明膠，可以以簡單方式制得具有小多分散性和粒子直徑帶寬的納米粒子，尤其是多分散性指數(shù)小于或等于0.15的本發(fā)明納米粒子。
在本發(fā)明方法中，首先由一種這樣的明膠制備水溶液，然后將其pH值調(diào)節(jié)到小于7.0的值。通過向該溶液中加入合適的沉淀劑，溶解的明膠以納米粒子形式進(jìn)行去溶劑化，然后通過簡單的離心而從溶液中分離出來。不需要對該納米粒子例如通過梯度離心進(jìn)行分級，因為作為本發(fā)明制備方法的結(jié)果，該納米粒子的多分散性已經(jīng)在足夠低的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明方法范圍內(nèi)并不需要向該明膠水溶液中添加助劑，尤其是添加鹽或表面活性物質(zhì)如清潔劑。因此，本發(fā)明的納米粒子優(yōu)選基本上不含有所述添加劑。因此，本發(fā)明方法能夠制備基本上僅由水性明膠凝膠形成的納米粒子。
通過使用具有上述分子量分布的明膠，保證了形成較穩(wěn)定的納米粒子。低分子份額較高的明膠在該方法情況下導(dǎo)致增多地形成較大的團(tuán)聚體或不穩(wěn)定的粒子。
分子量小于65kDa的明膠含量優(yōu)選最大為30重量％，最優(yōu)選最大為20重量％。
在一種優(yōu)選的方法實(shí)施方式中，所調(diào)節(jié)的明膠溶液的pH值小于或等于3.0，優(yōu)選在1.5～3.0范圍內(nèi)。在該區(qū)間內(nèi)，可以通過pH值部分地影響平均粒度，在此，較低的pH值傾向于導(dǎo)致較小的納米粒子。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，作為沉淀劑，使用丙酮、醇如乙醇或者這些沉淀劑相互之間或與水形成的混合物，在此優(yōu)選丙酮作為沉淀劑。
通過使用這種揮發(fā)性沉淀劑，盡可能避免了所述沉淀劑份額并入和/或保留在納米粒子中，因此所述納米粒子基本上僅由水性明膠凝膠形成。
為了制備交聯(lián)的納米粒子，在加入沉淀劑之后和離心之前，加入交聯(lián)劑。在該實(shí)施方式中，分子量小于65kDa的明膠含量優(yōu)選為20重量％或更少，以便抵制交聯(lián)時發(fā)生粒子的團(tuán)聚。采用該方法可以制得非常一致的納米粒子，其帶寬最大為±20nm，并且其多分散性指數(shù)最大為0.1。
以下在參考附圖情況下通過實(shí)施例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。附圖分別為

圖1兩種明膠的凝膠滲透色譜(圖1A或1B)，還給出了每種明膠的分子量分布；圖2本發(fā)明納米粒子的電子顯微鏡照片；和圖3本發(fā)明制得的納米粒子的尺寸分布。
分子量分布的測定如上所述，通過明膠的分子量分布，可以影響由其制得的納米粒子的性質(zhì)。可以通過凝膠滲透色譜(GPC)確定分子量分布。
在帶有以下組件的HPLC-系統(tǒng)中進(jìn)行確定HPLC-泵 Pharmacia 2249UV-檢測儀LKW 2151分離柱 TFK 400SWXL，帶有前柱(Fa.Tosoh Biosep GmbH)移動相 1重量％ SDS，100mmol/l Na2SO4，10mmol/l NaH2PO4/NaOH pH5.3制備1重量％的明膠水溶液，通過30分鐘泡漲的明膠，然后在約60℃溶解而制備。通過0.2μl一次性過濾器過濾后，30μl明膠溶液與600μl移動相和30μl 0.01重量％苯甲酸溶液混合。用20μl該混合物在0.5ml/min流率和UV檢測下在214nm下進(jìn)行GPC。
通過用具有已知分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)明膠校準(zhǔn)該體系，來對洗脫體積和分子量進(jìn)行歸類。通過將色譜劃分為確定的區(qū)域，并對UV-檢測儀-信號進(jìn)行積分，可以計算出在每種分子量范圍內(nèi)的明膠含量。
在圖1中示例性表示兩種不同明膠的凝膠滲透色譜圖1A表示Bloom值為175的市售豬皮明膠(明膠類型A)的GPC。由于分子量小于65kDa的明膠含量較高，超過45重量％，所以這種明膠不適合用于制備納米粒子的本發(fā)明方法，導(dǎo)致具有太高多分散性的粒子，或者導(dǎo)致所述粒子發(fā)生團(tuán)聚。
圖1B表示B1oom值為310的豬皮明膠的GPC，分子量小于65kDa的明膠含量約為15重量％。這種明膠非常良好適合于本發(fā)明的制備方法。
平均粒子直徑和多分散性指數(shù)的確定光子關(guān)聯(lián)能譜能夠確定納米粒子的平均粒子直徑、多分散性指數(shù)和粒子直徑高于和低于平均值的帶寬。
用BI-200 SM Goniometer Version 2(Brookhaven InstrumentsCorp.，Holtsville，NY，USA)進(jìn)行測量。為此使用濃度為10～50μg/ml的納米粒子在去礦物質(zhì)水中的懸浮液。
實(shí)施例1該實(shí)施例描述由明膠形成的交聯(lián)納米粒子的制備，所述明膠的GPC表示在圖1B中(分子量小于65kDa的明膠含量約為15重量％)。
將300mg所述明膠在50℃下溶于水中。用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.5后，通過滴力45ml丙酮而使該明膠去溶劑化。攪拌10分鐘后，加入40μl的8％戊二醛水溶液，然后再攪拌30min。通過在10.000g離心10分鐘，將所交聯(lián)的納米粒子從溶液中分離出來，并通過三次再分散于丙酮/水(30/70)中而進(jìn)行純化。在最后一次再分散后，在50℃下蒸發(fā)掉丙酮。
這種簡便的方法使得無需對本發(fā)明的納米粒子進(jìn)行額外的分離步驟，對于所述的納米粒子，用以上所述的PCS-方法查明，在多分散性指數(shù)約為0.08情況下的平均粒子直徑約為160nm。納米粒子的尺寸等級分布圖示性表示在圖3中。
對非交聯(lián)的納米粒子進(jìn)行的對比實(shí)驗顯示，低分子量明膠在制得的納米粒子中的含量很大程度上相應(yīng)于在起始材料中的含量。
實(shí)施例2如實(shí)施例1所述制備交聯(lián)的納米粒子，在此，作為起始材料，使用Bloom值為270的豬皮明膠，分子量小于65kDa的明膠含量約為19重量％。
對于根據(jù)本發(fā)明可直接得到的納米粒子，用以上描述的PCS-方法查明在多分散性指數(shù)約為0.08情況下的平均粒子直徑約為173nm。其尺寸分布與根據(jù)實(shí)施例1制得的納米粒子是可比較的。
權(quán)利要求
1.主要由水性明膠凝膠形成的納米粒子，所述納米粒子的平均直徑最大為350nm，并且納米粒子的多分散性指數(shù)小于或等于0.15。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的納米粒子，所述納米粒子的多分散性指數(shù)小于或等于0.1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的納米粒子，所述納米粒子的平均直徑最大為200nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3之一的納米粒子，所述納米粒子的平均直徑最大為150nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4之一的納米粒子，所述納米粒子直徑的帶寬最大為平均值以上20nm和以下20nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5之一的納米粒子，分子量小于65kDa的明膠的含量最大為40重量％，基于在納米粒子中含有的所有明膠計。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～5之一的納米粒子，分子量小于65kDa的明膠的含量最大為30重量％，基于在納米粒子中含有的所有明膠計。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～5之一的納米粒子，分子量小于65kDa的明膠的含量最大為20重量％，基于在納米粒子中含有的所有明膠計。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～8之一的納米粒子，在納米粒子中含有的明膠發(fā)生交聯(lián)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的納米粒子，所述明膠通過甲醛、二醛、異氰酸酯、二異氰酸酯、碳二亞胺或烷基二鹵化物進(jìn)行交聯(lián)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的納米粒子，所述明膠進(jìn)行酶促交聯(lián)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的納米粒子，所述明膠通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或漆酶進(jìn)行交聯(lián)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1～12之一的納米粒子，所述納米粒子的水含量最大為15重量％。
14.根據(jù)權(quán)利要求1～13之一的納米粒子，在所述納米粒子的表面上結(jié)合藥物活性物質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的納米粒子，藥物活性物質(zhì)的結(jié)合是通過對納米粒子的表面進(jìn)行化學(xué)改性而引起的。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的納米粒子，所述藥物活性物質(zhì)吸附結(jié)合。
17.根據(jù)權(quán)利要求14或15的納米粒子，所述藥物活性物質(zhì)共價鍵合。
18.根據(jù)權(quán)利要求14或15的納米粒子，所述藥物活性物質(zhì)離子鍵合。
19.根據(jù)權(quán)利要求14～18之一的納米粒子，所述藥物活性物質(zhì)通過間隔基結(jié)合。
20.根據(jù)權(quán)利要求1～19之一的納米粒子作為生物可降解的載體用于制備藥物的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，所述納米粒子是細(xì)胞內(nèi)遞藥系統(tǒng)的一部分，尤其是作為核酸或肽的載體。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21的用途，所述藥物是用于基因治療的藥物。
23.一種制備主要由水性明膠凝膠形成的納米粒子的方法，包括以下步驟a)制備明膠水溶液，分子量小于65kDa的明膠含量最大為40重量％，基于所有明膠計；b)將明膠溶液的pH值調(diào)節(jié)到小于7.0的值；c)通過加入沉淀劑而使明膠沉淀；和d)通過離心分離納米粒子。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，在步驟a)中，分子量小于65kDa的明膠含量最大為30重量％，基于所有明膠計。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，在步驟a)中，分子量小于65kDa的明膠含量最大為20重量％，基于所有明膠計。
26.根據(jù)權(quán)利要求23～25之一的方法，在步驟b)中，將pH值調(diào)節(jié)到小于或等于3.0的值。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，在步驟b)中，將pH值調(diào)節(jié)到1.5～3.0的值。
28.根據(jù)權(quán)利要求23～27之一的方法，在步驟c)中，所述沉淀劑是丙酮、醇或者兩者的混合物，任選在水溶液中。
29.根據(jù)權(quán)利要求23～28之一的方法，在步驟c)和d)之間進(jìn)行步驟c′)向該明膠溶液中加入交聯(lián)劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，所述交聯(lián)劑選自甲醛、二醛、異氰酸酯、二異氰酸酯、碳二亞胺或烷基二鹵化物。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，所述交聯(lián)劑是酶。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，所述交聯(lián)劑是漆酶或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
全文摘要
提供可生物降解的納米粒子，其保證一致的并且可定義的活性物質(zhì)運(yùn)輸，同時提供一種制備該納米粒子的適當(dāng)方法，所述納米粒子主要由水性明膠凝膠形成，其中，該納米粒子的平均直徑最大為350nm，并且該納米粒子的多分散性指數(shù)小于或等于0.15，并且其中，使用明膠作為用于該制備方法的起始物質(zhì)，分子量小于65kDa的明膠含量最大為40重量％，基于所有明膠計。
文檔編號A61K9/14GK1988892SQ200580021379
公開日2007年6月27日 申請日期2005年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月20日
發(fā)明者M·阿勒斯, C·考斯特, K·茨維奧克, Z·茲雷斯 申請人:格利達(dá)股份公司