專利名稱：用羰基清除劑誘導(dǎo)細胞死亡的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過應(yīng)用羰基清除劑比如二羰基清除劑誘導(dǎo)細胞死亡的方法。
背景技術(shù)：
逐漸增加的皮膚病發(fā)病率，包括非黑素瘤疾病，以及黑素瘤皮膚癌，已經(jīng)有很多的文獻記載，同時對惡化前和惡性階段的皮膚癌一直都缺乏有效的治療方法。
Diegpen，et al.，Br.J.Dermatology1461-6(2002)已經(jīng)記載非黑素瘤皮膚癌，或者稱作“NMSC”，是影響高加索人種最常見的癌癥類型。接近80％的NMSC是基底細胞癌，20％是鱗狀細胞癌。已知的光化性角化病的狀態(tài)是一種癌前狀態(tài)，其可以發(fā)展成鱗狀細胞癌。發(fā)展成侵襲性、鱗狀細胞癌的速率的估計范圍高達每年20％。見May，J.，Am.Acad.Dermatol.428-10(2000)。
盡管在美國黑素瘤只占所有皮膚癌疾病的約5％，但是它占皮膚癌死亡的約80％。早期診斷經(jīng)外科切除導(dǎo)致很高的治愈率；然而，惡性黑素瘤有非常高的擴散和轉(zhuǎn)移的趨勢。黑素瘤細胞對化療、所有形式的治療性誘導(dǎo)細胞凋亡以及任何形式的治療有很高的抗性。
最近已經(jīng)觀察到細胞羰基脅迫涉及增殖性信號傳遞和人腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，細胞羰基脅迫由內(nèi)源性、活性羰基種，或稱作“RCS”介導(dǎo)，特別是二羰基化合物，包括乙二醛、甲基乙二醛和丙二醛，它們在糖酵解和脂質(zhì)過氧化期間形成。見，例如，Taguchi，et al.，Nature405(6784)354-60(2000)。
RCS-來源的蛋白質(zhì)表位，稱作“高級糖基化終產(chǎn)物”，或“AGE”，其通過RCS和組織蛋白間的反應(yīng)形成，其在黑素瘤中大量發(fā)現(xiàn)，并且AGE是非常有效的RAGE配體，其是參與黑素瘤增殖和轉(zhuǎn)移的膜受體。見，例如，Abe et al.，J.Invest.Dermatol.122(2)，461-467(2004)。
越來越多的證據(jù)支持這種觀點，即根本上源于腫瘤細胞糖酵解增加和線粒體脂質(zhì)過氧化的RCS是小分子的抗細胞凋亡調(diào)節(jié)因子，其通過共價修飾來抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的開放。見，例如，Speer，et al.，J.Biol.Chem.278(37)，34757-63。
Wondrak et al.，Biochem.Pharmacol.71051-13(2002)，已經(jīng)鑒定一系列非常有效的、無毒性羰基清除劑，它們可用于治療性干預(yù)細胞的羰基脅迫。這篇參考文獻經(jīng)引用并入本文，以及公告日為4/6/2004的美國專利No.6,716,635和公告日為7/9/2002的美國專利No.6,417,235。‘635專利特別給出了RCS和RAGE化合物、作用機制，它們?nèi)绾涡纬傻鹊脑敿氄f明。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些羰基清除劑對黑素瘤和其它癌細胞具有顯著的誘導(dǎo)凋亡作用，但是對正常細胞沒有這種作用。這是本發(fā)明的特征，正如在隨后的實例中所指出的。


圖1描述使用D-青霉胺對惡性黑素瘤細胞系、鼠(B16)和人(G-361、A-375、LOX)細胞系誘導(dǎo)凋亡的比較。在本圖中，“C”表示對照，“P”表示用D-青霉胺處理。
圖2總結(jié)對惡化前、永生化人角質(zhì)形成細胞暴露于D-青霉胺之后的試驗結(jié)果。
圖3顯示在惡性、人鱗狀細胞癌細胞系A(chǔ)431，暴露于D-青霉胺、以及D-青霉胺甲酯之后，細胞凋亡的誘導(dǎo)。
圖4顯示對上皮細胞癌細胞系使用D-青霉胺，N-乙酰-D-青霉胺和氨基胍的結(jié)果總結(jié)。
圖5比較在人黑素瘤細胞系A(chǔ)375和正常的成纖維細胞系CF3中誘導(dǎo)的細胞凋亡。所用的化合物是D-青霉胺的親脂衍生物、3-巰基亮氨酸。
圖6顯示對羰基清除劑活性存在結(jié)構(gòu)要求，其中測試了D-青霉胺、氨基胍、N-乙酰-D-青霉胺和青霉胺二硫化物。
圖7顯示根據(jù)本發(fā)明的化合物在正常和惡性細胞的混合物中選擇性消除惡性黑素瘤細胞的功效。
圖8顯示凋亡機制涉及線粒體跨膜電位的去極化。
具體實施例方式
實施例1本實施例描述的試驗顯示3-巰基-D-纈氨酸(“D-青霉胺”)誘導(dǎo)惡性細胞系的凋亡。
使用鼠黑素瘤細胞系B16，以及三種人黑素瘤細胞系，即，G-361、A-375和LOX。細胞樣品持續(xù)24小時暴露于10mM D-青霉胺。使用標準測試測量細胞凋亡，即，使用膜聯(lián)蛋白V-FITC/碘化丙啶(PI)染色的流式細胞術(shù)。作為對照，使用正常的人皮膚成纖維細胞，即，“CF3”細胞。
圖1的結(jié)果顯示對照(沒有化合物)和處理(有化合物)，分別在頂部和底部。從這些附圖中可以明確在惡性細胞中誘導(dǎo)了細胞凋亡，然而在正常CF3細胞中沒有變化。
在沒有顯示于附圖的試驗中，3-巰基異亮氨酸產(chǎn)生了相似結(jié)果。
實施例2在這些試驗中，加入濃度為12.5mM的D-青霉胺到惡化前、永生化人角質(zhì)形成細胞，或“HaCaT”細胞中，持續(xù)暴露24小時。
在圖2中，對照(沒有化合物)列在左邊，測試化合物D-青霉胺的效果顯示在右邊。細胞凋亡也被指出。
實施例3這組試驗使用D-青霉胺和它的更親脂的衍生物，D-青霉胺甲酯。
為了制備這種衍生物，攪拌保存在-10℃的75ml MeOH中的18ml SOCl2，加入不同量的D-青霉胺(15g，100.5mmol)?；旌衔镞_到室溫時繼續(xù)攪拌?；旌衔锘亓?0小時，然后蒸發(fā)溶劑，留下粗產(chǎn)物(15.2g，93.3mmol)，將其溶解于甲醇中，然后加入乙醚進行結(jié)晶。收集結(jié)晶產(chǎn)物，在真空中干燥，得到7.6g純產(chǎn)物。它的結(jié)構(gòu)通過1H-NMR和質(zhì)譜分析確定。C6H14O2NS的計算m/z是164.1[M+H]+，觀察值是164.1。
在各種情況下，對人A431細胞使用10mM測試化合物持續(xù)24小時，并如前述測量細胞凋亡。
在圖3中，“D-P”表示D-青霉胺，“D-P-OCH3”是其甲酯。應(yīng)用該酯觀察到更強的細胞凋亡作用。
實施例4測定化合物對其他癌癥，特別是上皮癌，的功效。使用人HeLa宮頸腺癌細胞，并用10mM D-青霉胺和25mM氨基胍進行測試。這些細胞用N-乙酰-D-青霉胺測試，其不具有羰基清除劑的功能。
圖4表示對照(“C”)、D-青霉胺(“D-P”)、N-乙酰-D-青霉胺(“NAP”)和氨基胍(“AG”)的這些試驗的結(jié)果。已知作為羰基清除劑的D-青霉胺和氨基胍是凋亡誘導(dǎo)劑，而NAP不是。
實施例5與之前測試的那些比較，3-甲基-3-乙基-L-半胱氨酸(3-巰基異亮氨酸，或稱作“MEC”)是一種更加親脂的羰基清除劑。因為可以期望在局部給藥系統(tǒng)中增加親脂性，測試這個化合物是有意義的。
MEC被合成至95％純度，根據(jù)Leach，B.E.et al.“Synthesis of D，L-penicillaminefrom N-acetyl-D，L-penicillamine”in Clarke，H.T.ed.，The Chemistry of Penicillin，(Princeton University Press，1949)，Pg.466，并且通過1H-NMR確認其結(jié)構(gòu)。
用10mM MEC暴露24小時測試惡性人黑素瘤細胞A375和正常成纖維細胞(CF3)。
在惡性細胞中觀察到明顯的誘導(dǎo)凋亡，但是在正常細胞中卻沒有觀察到，正如在圖5中所見的。
實施例6這些試驗被設(shè)計用來確定是否有結(jié)構(gòu)/功能的關(guān)系。換句話說，希望確定是否作為羰基清除劑而不是作為抗氧化劑的活性對抗癌活性是重要的。
化合物D-青霉胺(D-P)、氨基胍(AG)、N-乙酰-D-青霉胺(NAP)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)和青霉胺二硫化物(PSS)被測試。D-P、NAC和NAP已知是抗氧化劑。D-P和氨基胍已知是羰基清除劑。
在對人黑素瘤細胞系G-361的測試中，只有D-P和AG誘導(dǎo)細胞凋亡。這些結(jié)果提示對于伯氨基和硫醇基取代基有結(jié)構(gòu)要求，并且抗氧化活性與致凋亡性并不相關(guān)。圖6總結(jié)了這些結(jié)果。
實施例7這些試驗顯示了羰基清除劑在治療癌癥方面的潛力。
制備皮膚黑素瘤重構(gòu)體，其中CF3成纖維細胞和A375黑素瘤細胞植入膠原蛋白基質(zhì)中。在“種植”入基質(zhì)中后72小時，黑素瘤細胞已經(jīng)廣泛增殖，如圖7中作為對照所示。然而，用12.5mM D-P處理消除了黑素瘤細胞并維持了成纖維細胞膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)完整性。
實施例8些試驗顯示羰基清除劑處理誘導(dǎo)的優(yōu)先凋亡的發(fā)生伴隨有線粒體跨膜電位“Δψm”的去極化。根據(jù)Reers，et al.，Biochemistry30(18)4480-6(1991)，使用電勢測定染料JC-1。向培養(yǎng)基加入10mM D-青霉胺后24小時，給予染料。RCS預(yù)處理包括使用5mM苯甲酰甲醛15分鐘，然后用PBS清洗并加入新鮮培養(yǎng)基。
圖8非常清楚的顯示，當(dāng)細胞用羰基清除劑處理時，線粒體跨膜電位喪失；當(dāng)細胞用苯甲酰甲醛進行預(yù)處理后再用羰基清除劑處理時，線粒體跨膜電位保持。
前述公開的內(nèi)容列出了本發(fā)明的特征，其是通過向?qū)ο笫┯敏驶宄齽﹣碚T導(dǎo)細胞死亡的方法，其中所施用羰基清除劑的量和施用方式足以誘導(dǎo)細胞死亡。
在實踐中，向期望增強細胞死亡的對象施用羰基清除劑。非癌、癌前和癌性過度增殖性細胞障礙包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，如觀察到不適當(dāng)?shù)暮?或異常的細胞增加的狀況，例如炎性過度增殖狀態(tài)、良性前列腺增生、巴瑞特氏食管(Barrett’s esophagus)、病毒誘導(dǎo)的腳底疣和生殖道疣、光化性角化病、非黑素瘤和黑素瘤皮膚癌。以上所列證據(jù)顯示清除劑僅對異常細胞發(fā)揮細胞死亡誘導(dǎo)劑功能。因此，在引起正常細胞的過早或不適當(dāng)死亡方面沒有問題。
所使用的羰基清除劑可以是任何前面討論和舉例的那些試劑?？梢澡b定并使用其它羰基清除劑。前述美國專利No.6,716,635經(jīng)引用并入本文，其教導(dǎo)如何鑒定這些化合物。
可以改變施用模式。局部應(yīng)用，例如以洗液(lotion)、乳液(crème)、洗劑(wash)、滾搽(roll-on)、皂等方式，是一種優(yōu)選的施用方式，還包括皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、口服、舌下等。遞送方式將根據(jù)所治療的病況而改變。
本發(fā)明的其他方面對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是清楚的，并不需要在此重申。
已使用的術(shù)語和表述僅用于描述，而非限制，使用這些術(shù)語和表述并不意味著排除在此顯示和說明的特征或其部分的任何等同物，應(yīng)該認識到在本發(fā)明范圍內(nèi)可以進行多種修改。
權(quán)利要求
1.在異常細胞中誘導(dǎo)或加速細胞死亡的方法，包括向所述異常細胞施用足以誘導(dǎo)或加速所述異常細胞死亡的量的羰基清除劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述羰基清除劑是二羰基清除劑。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述異常細胞是皮膚細胞。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述異常細胞是癌細胞，或癌前細胞。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述癌細胞是鱗狀癌細胞、上皮癌細胞、黑素瘤細胞或腺癌細胞。
6.權(quán)利要求1的方法，包括局部施用所述羰基清除劑。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述癌前細胞是角質(zhì)形成細胞。
8.權(quán)利要求1的方法，進一步包括向人施用所述羰基清除劑。
全文摘要
羰基清除劑，其已知具有與活性羰基種反應(yīng)的能力，已經(jīng)暗示其能夠作為加速或誘導(dǎo)異常細胞死亡、而對正常細胞沒有平行作用的藥劑。同樣，當(dāng)期望加速或誘導(dǎo)細胞死亡時，比如在正常凋亡途徑已被破壞并發(fā)生過度增殖性細胞增長的細胞中，它們是有用的治療劑。
文檔編號A61K31/155GK1964710SQ200580006550
公開日2007年5月16日 申請日期2005年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月2日
發(fā)明者喬治·T·翁德拉克, 伊萊恩·L·雅各布森, 邁倫·K·雅各布森 申請人:代表亞利桑那大學(xué)的亞利桑那校董會