專利名稱：作為選擇性s1p4激動劑的吲哚丙氨酸衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有機化合物、它們的生產(chǎn)方法和包含它們的藥物組合物。
在一個方面，本發(fā)明提供了作為1-磷酸-鞘氨醇(S1P4)受體激動劑的化合物，其中的化合物對于S1P4受體擁有比對S1P1、S1P2、S1P3或S1P5受體中的一種或多種更高的選擇性。S1P受體被描述在如WO 03/061567中。優(yōu)選該化合物對于S1P4受體有超過上述的S1P受體的選擇性。該化合物優(yōu)選顯示對S1P4受體的選擇性是上述的一種或多種S1P受體的至少10倍、更優(yōu)選20倍、最優(yōu)選100倍。通過測定該化合物對S1P4受體的EC50與該化合物對S1P1、S1P2、S1P3或S1P5受體的EC50之間的比率而確定選擇性。EC50值可例如根據(jù)下述的GTPγ35S結(jié)合測定法或鈣動員測定法而獲得。在更優(yōu)選的實施方案中，該化合物在GTPγ35S結(jié)合測定法或鈣動員測定法中顯示對S1P4受體的EC50為1μM或更小。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及游離形式或鹽形式的式I化合物 其中R1為苯基或萘基，其中苯基被一個或兩個鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基或苯基C1-6烷基所取代；且R2為氫或C1-6烷基。
任何烷基部分可為直鏈或支鏈。C1-6烷基優(yōu)選是C1-4烷基。C1-6烷氧基優(yōu)選是C1-4烷氧基。
鹵素可為F、Cl、Br或I。
R1優(yōu)選是式Ia的基團
其中R3、R4和R5中的一個或兩個為氫；且R3、R4和R5中的一個或兩個為氫、C1-6烷基、C1-6烷氧基或苯基C1-6烷基；或者，R3及R4或R4及R5與它們所連接的碳原子共同形成苯環(huán)。
在式I和Ia中，獨立地、共同地或以任何組合或亞組合優(yōu)選下列意義a)R4或R5中的一個不為氫，更優(yōu)選R5不為氫且R4為氫；b)R4或R5為芐基、乙基、丁氧基、丙基、異丙基或氯，更優(yōu)選R5為上述基團中的一個且R4為氫；b)R3為氫或氯，更優(yōu)選氫；c)R2為氫或甲基。
式I化合物可形成無機或有機酸的酸加成鹽，所述的酸例如是鹽酸、氫溴酸或馬來酸。式I化合物也可形成衍生于羧基的陽離子鹽，更特別是堿金屬或堿土金屬鹽，如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽或鎂鹽，以及衍生于氨或有機胺的銨鹽。
式I化合物在連接伯氨基的碳原子上含有手性中心。所以式I化合物以兩種對映異構(gòu)體形式存在。應(yīng)該理解本發(fā)明包含式I的外消旋物和任何對映異構(gòu)體。
式I化合物也可以它們的水合物形式被得到。水合物也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明還提供了式I化合物的生產(chǎn)方法，其包含使式II化合物去保護， 其中R1和R2如上所定義，R6為C1-6烷基或芐基，
R7為氨基保護基，并且如有需要將式I化合物轉(zhuǎn)換成其鹽。
使用常規(guī)的方法進行該生產(chǎn)方法。適宜的氨基保護基團的實例如“有機合成中的保護基”(T.W.Greene，J.Wiley & Sons NY，第2版，第7章，1991)以及其中的參考文獻所公開，例如酰基如叔丁氧羰基、苯甲氧羰基、9-芴基甲氧羰基、三氟乙酰基、三甲基甲硅烷基乙磺?；鹊?。當(dāng)R7為苯甲氧羰基和R6為芐基時，可通過例如氫解而去保護。反應(yīng)可在室溫下在有機溶劑如四氫呋喃、二氯甲烷或二烷中進行，使用披鈀炭作為催化劑。如果R6為C1-6烷基，可用兩個步驟方便地實現(xiàn)該生產(chǎn)方法。在第一步，式II化合物的羧基基團可通過用如NaOH水溶液或在有機溶劑如四氫呋喃、二烷、甲醇或乙醇中的堿性離子交換樹脂的溫和水解而在室溫下去保護。在第二步，氨基基團用如在二氯甲烷中的碘代三甲硅烷而去保護。如果R7為苯甲氧羰基也可采用氫解反應(yīng)。當(dāng)R3至R5中的一個或兩個為鹵素時，適宜于采用兩個步驟的生產(chǎn)方法。
任選的鹽形成可按照常規(guī)方法進行。
式I化合物的外消旋混合物可用已知的方法拆分，例如使用旋光活性的酸作為拆分劑?；蛘?，通過使用旋光活性原料生產(chǎn)純的對映異構(gòu)形式。
用作原料的式II化合物可通過式III化合物與式IV化合物的反應(yīng)而制得， 其中R6和R7如上所定義， 其中R1和R2如上所定義，并且X為離去基團。
可用常規(guī)的方法實現(xiàn)本反應(yīng)。例如，該反應(yīng)可在有機溶劑如二氯甲烷中在-15℃至25℃之間的溫度下進行。離去基團X為如鹵素且特別是氯或羥基。
適宜地存在酸結(jié)合劑，例如叔胺，如吡啶。
只要上述方法的原料的生產(chǎn)沒有進行具體的描述，那么它們可用與已知化合物類似的方法或本文所描述的方法進行生產(chǎn)。
在下列的實施例中，所有溫度以攝氏度給出并且未作校正。[α]D20值也未作校正。
實施例13-(4-(2-乙苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-D-丙氨酸a)4-(2-乙苯基)-吲哚-2-甲酸向0.28g 4-溴-吲哚-2-甲酸和0.069g四三苯膦鈀在11ml甲苯和2ml 2M碳酸鈉中的混合物中加入0.300g 2-乙基苯基硼酸在3ml乙醇中的溶液?；旌衔锘亓?6h，過濾，水相用2N HCl進行酸化，并用乙酸乙酯萃取。濃縮有機相，給出棕色粉末狀的產(chǎn)品，m.p.230-233℃，純度足以用于下一步。
b)3-(4-(2-乙苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-N(2)-Z-D-丙氨酸甲酯在2.11g 4-(2-乙苯基)-吲哚-2-甲酸在32ml吡啶中的溶液中加入1.41g羰二咪唑。在氣體揮發(fā)停止后，加入2.29g N(2)-Z-D-2，3-二氨基丙酸甲酯，混合物在室溫下攪拌4天。在蒸發(fā)溶劑后，殘留物用水/乙酸乙酯萃取，干燥有機相，濃縮，粗產(chǎn)品在硅膠中層析，流動相為乙酸異丙酯/甲苯4∶1，得到黃色無定形粉末狀的所需化合物。
c)3-(4-(2-乙苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-D-丙氨酸將2.03g 3-(4-(2-乙苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-N(2)-Z-D-丙氨酸甲酯、4.1ml 2N NaOH和10ml二烷的混合物在室溫下攪拌2小時。以常規(guī)方式處理后，將獲得的酸溶于22ml二氯甲烷并在0℃用1.03ml碘代三甲硅烷進行處理。在攪拌50分鐘后，混合物濃縮至于，并將殘留物用水吸收。粗品析出并用過濾法收集，用水洗滌，在通過加入0.2N NaOH調(diào)節(jié)pH至6的水/異丙醇中重結(jié)晶，產(chǎn)生白色粉末狀的標題化合物，m.p.258-265℃。
式I化合物，其中R1和R2如表1所定義，可通過上述方法之一而制備，但使用適宜的原料。
表1
本文所公開的作為選擇性S1P4受體激動劑的游離形式或可藥用鹽形式的化合物(下文稱為本發(fā)明的化合物)，例如式I化合物，呈現(xiàn)出有價值的藥理學(xué)性質(zhì)，例如淋巴細胞再循環(huán)調(diào)整性質(zhì)，這一點正如在體外和體內(nèi)實驗中顯示的那樣，所以適應(yīng)用于治療。特別地，本發(fā)明的化合物作為人S1P4(EDG6)受體的功能激動劑是有用的，這一點通過下列的測定而證實。
確定S1P4化合物體外藥理學(xué)的測定a)編碼人S1P受體的表達載體用于被融合于c-myc肽標記的C末端的人S1P4基因(HSEDG4；GenBank登錄號AJ000479)的表達載體如Van Brocklyn等人，2000，Blood95(8)，2624中所述獲得。用于S1P4-myc融合蛋白的編碼DNA在哺乳動物表達載體pRc/CMV(Invitrogen)中被克隆，該載體賦予G418抗性，用于篩選穩(wěn)定的哺乳動物細胞。在兩條鏈上確定S1P4插入片段的DNA序列。與HSEDG4的GenBank登錄條目比較，沒有發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致氨基酸變化的核苷酸差異。使用HindIII/Xbal將S1P4-myc cDNA插入pRc/CMV載體中。
使用下列載體。
在人S1P1和S1P3序列之前含有myc序列的人S1P1(GenBankTM登錄號M31210)和S1P3(GenBankTM登錄號X83864)cDNA被插入pcDNA3.1載體中。對載體進行完全測序以確認構(gòu)造正確。通過基于PCR的方法克隆人S1P2(GI4090955，TREMBL0195136)。獲得肺cDNA(marathon cDNA)(BD Biosciences Chontech，Palo Alto，CA 94303，美國)。下列低聚核苷酸被用于PCR反應(yīng)正向引物CAC CAT GGG CAG CTTGTA CTC GGA GTA CCT GAA CCC CAA CAA GGT CCA G(1至45，GenBankTM登錄號AF034780)和反向引物5‘-GAT TCA GAC CAC CGTGTT GCC CTC CAG(1062至1039，GenBankTM登錄號AF034780)，在翻譯的起始(ATG)和終止密碼子下面劃線。PCR在存在0.2-0.4μg cDNA、1×反應(yīng)緩沖液(10×PfuTurbo DNA聚合酶緩沖液，Stratagene，La Jolla，CA 92037，美國)、0.5μM引物、0.25mM dNTP’s和2.5單位PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene)的條件下進行，第一步在95℃進行2分鐘，經(jīng)歷30個周期(在95℃30秒，在60℃30秒，在72℃90秒)，最后一步在72℃進行10分鐘。通過標準的瓊脂糖凝膠電泳分析約1100bp的擴增產(chǎn)物。在克隆位于pcDNA 3.1 Topo V(Invitrogen Corporation)中的PCR產(chǎn)物后，對來自不同細菌菌落的DNA插入物進行測序。由在兩個方向測序的三個獨立的質(zhì)粒制備物裝配最終序列。
通過基于PCR的方法克隆出人S1P5(GI30171332或GenBankTM登錄號AY262689，TREMBLQ9H228)。從BD Biosciences Chlontech(BDBiosciences Chlontech，Palo Alto，CA 94303，USA)獲得肺和脾cDNA(marathon cDNA)；使用標準的方法從HeLa細胞中分離出基因組DNA。下列低聚核苷酸被用于PCR反應(yīng)正向引物CAC CATGGA GTC GGGGCT GCT GCG(-4至20，GenBankTM登錄號AY262689)和反向引物5‘-TCAGTC TGC AGC CGG TTC TGA TAC CAG AGT C(1197至1131，AY262689)，在翻譯的起始(ATG)和終止密碼子下面劃線。PCR在存在0.2-0.4μg cDNA、1x反應(yīng)緩沖液(10×PfuTurbo DNA聚合酶緩沖液，Stratagene，La Jolla，CA 92037，美國)、0.5μM引物、0.25mM dNTP’s和2.5單位PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene)的條件下進行，第一步在95℃進行2分鐘，經(jīng)歷30個周期(在95℃30秒，在60℃30秒，在72℃90秒)，最后一步在72℃進行10分鐘。通過標準的瓊脂糖凝膠電泳分析約1100bp的擴增產(chǎn)物。在克隆位于pcDNA 3.1 Topo V(Invitrogen Corporation)中的PCR產(chǎn)物后，對來自不同細菌菌落的DNA插入物進行測序。由在兩個方向測序的來自三個獨立的質(zhì)粒制備物裝配的最終序列。
b)穩(wěn)定表達S1P4的CHO-K1細胞系的開發(fā)為了開發(fā)表達c-myc標記的S1P4受體的穩(wěn)定細胞系，使用可切割質(zhì)粒一次的限制性核酸內(nèi)切酶Pvul切割5μg質(zhì)粒pRc/CMV myc-S1P4。然后使用最終濃度為0.3M醋酸鈉(pH5.0)和66％的乙醇將線性化的質(zhì)粒沉淀。在離心和洗滌后，將DNA沉淀物溶解于30μl水中。對于轉(zhuǎn)染，CHO-K1(ATCC號CCL-61)細胞在轉(zhuǎn)染前一天被鋪于含有10％FCS(胎牛血清)的MEMα介質(zhì)(極限必需培養(yǎng)基α改變型)中，細胞密度為在100mm細胞培養(yǎng)皿(Falcon)中1×106個細胞/孔，并在37℃、5％CO2環(huán)境下孵育24小時。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，向270μl RPMI培養(yǎng)基中加入5μg線性化pRC/CMVmyc-S1P4質(zhì)粒。在DNA溶液中加入60μl SuperFect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen)并混合10秒鐘后，孵育樣品10分鐘以便形成復(fù)合物。DNA-SuperFect復(fù)合物與另外的3ml RPMI/10％FCS混合，然后轉(zhuǎn)移至細胞單層。在孵育3小時后，移去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，細胞用PBS洗滌。加入補充有10％FCS的新鮮RPMI培養(yǎng)基，在37℃和5％CO2的條件下孵育細胞72小時。在加入500μg/ml G418(Lifetechnologies)后進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化克隆的選擇。在約12-14天后，使用FACStar Plus細胞分類器(BectonDickinson)，根據(jù)它們向前和向側(cè)面散開進入96孔細胞培養(yǎng)板的單個孔中的特性進行單個細胞分類，獲得細胞克隆。在分類和選擇步驟后生長的單個克隆被擴大，以TaqMan定量PCR分析確定的S1P4mRNA水平為基礎(chǔ)最終選定一個克隆。
c)細胞培養(yǎng)的維持親代CHO-K1細胞在補充有10％FBS和10μg/ml慶大霉素(Lifetechnologies)的RPMI培養(yǎng)基(Life technologies)中維持。S1P4/myc轉(zhuǎn)染的CHO-K1細胞，包括最終選定的克隆，在MEMα培養(yǎng)基中維持，該培養(yǎng)基補充有10％FBS、10μg/ml慶大霉素和0.5mg/ml G418(Lifetechnologies)。
d)在CHO穩(wěn)定的克隆中S1P4轉(zhuǎn)錄水平的確定借助于RNeasy Mini kit(Qiagen)，從細胞中分離總RNA。在培養(yǎng)皿(對于35mm培養(yǎng)皿，使用350μl根據(jù)Qiagen的方案制備的緩沖液)中直接破裂細胞(以單層生長)后，移取裂解物至qiashredder旋轉(zhuǎn)柱中并在21’000×g下離心2分鐘。向液流中加入350μl 70％乙醇，充分混合，加至RNeasy小柱中，在10’000×g下離心15秒。棄去液流，向RNeasy柱中加入700μl緩沖液RW1(Qiagen)并離心15秒以漂洗該柱。該柱進一步通過兩次加入500μl緩沖液RPE(Qiagen)并在10000xg離心15秒而洗滌。通過直接在RNeasy柱上加入不合RNAse的30-50μl水并在10’000xg下離心1分鐘而洗脫RNA。
用Qiagen的Omniscript試劑盒(Qiagen)逆轉(zhuǎn)錄RNA。約2μg RNA與2μl 10x緩沖液、2μl dNTP Mix、1μl RNase抑制劑(10單位/μl)、0.5μg隨機六聚體、1μl Omniscript逆轉(zhuǎn)錄酶和不含RNase的水混合至最終體積為20μl，并在37℃孵育60分鐘，另外在42℃培養(yǎng)30分鐘。在93℃使該反應(yīng)物滅活5分鐘，在冰上冷卻，在-20℃儲藏備用。
為了確定S1P4 mRNA在所選擇的克隆中的相對轉(zhuǎn)錄水平，進行實時PCR(聚合酶鏈反應(yīng))分析。采用包含質(zhì)粒的人S1P4作為模板，如PE(Perkin/Elmer)Biosystems提供的“用戶公告”所述，確定引物和探針的最佳濃度。用于實時PCR的人S1P4低聚核苷酸以及它們的最佳濃度如下(基于HSEDG4；GenBank登錄號AJ000479)
cDNA的第一條鏈然后被用于在ABI7700TaqMan機(PE Biosystems)上的定量PCR。作為各樣品中存在的RNA量的內(nèi)部對照，采用TaqMan核糖體RNA對照試劑(PE Biosystems，P/N4308310，VIC-標記探針)，通過用核糖體RNA PCR在同一試管中使S1P4 PCR反應(yīng)倍增(multiplex)，使用18S核糖體RNA。雖然沒有在形式上確定S1P4和核糖體RNA的兩種獨立擴增的類似有效性，但是在不同細胞克隆中的S1P4轉(zhuǎn)錄水平的半定量測定足以選擇細胞克隆，以進一步在功能測定中表征。
e)膜的制備從野生型CHO-K1和表達人S1P4的CHO細胞克隆制備膜蛋白。為了獲得10-30mg膜蛋白，將細胞在一個大的培養(yǎng)皿(500cm2)/細胞克隆中生長至80％和90％匯合。移去培養(yǎng)基，通過在20ml冷的10mM HEPES(pH7.5)中刮取，從培養(yǎng)皿上收集細胞，其中HEPES補充有0.1％不含脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA)和蛋白酶抑制劑合劑(每50ml一片，RocheDiagnostics，Rotkreuz)。細胞在4℃于750xg離心10分鐘，重新混懸在10ml冷的膜緩沖液(20mM HEPES，pH 7.4；100mM NaCl；10mM MgCl2；1mMEDTA；0.1％BSA和蛋白酶抑制劑合劑)中。將細胞混懸液在冰上采用Polytron勻漿器勻化，轉(zhuǎn)速為25000轉(zhuǎn)/分鐘，暫停三次，每次20秒。勻漿在4℃和26’900xg下離心30分鐘，膜蛋白沉淀物通過渦旋在2ml冷的膜緩沖液中重新混懸。使用Bio Rad Protein Assay確定蛋白質(zhì)濃度，使用人IgG作為標準品。調(diào)整膜蛋白混懸液的體積，使所得終濃度為2至3mg蛋白/ml。然后再次在冰上于25000轉(zhuǎn)/分鐘勻化20秒(Polytron)，然后將溶液等分入Eppendorf管，每管0.8-1ml。
f)表達hS1P4的細胞的活性測定f1)GTPγ35S結(jié)合測定在選擇將在GTPγS測定中被測試的克隆時以實時PCR測定為基礎(chǔ)。在這些實驗中使用表達大量人S1P4的CHO克隆。如上所述制備膜蛋白。所用的GTPγ35S結(jié)合測定的基本方案在近期出版物(Brinkmann等人，2002，J.Biol.Chem，277，21453)中有描述，進行如下所述的修改。為了表征來自表達S1P的CHO細胞的膜蛋白質(zhì)的GTPγ35S結(jié)合，使用WGA包被的PVT珠(SPA珠，Amersham Biosciences)。因為GTPγ35S的β射線顯著穿透水溶液，所以將板進行離心，以使得由未結(jié)合GTPγ35S造成的非特異性作用降至最低。在96孔Optiplates(Packard，目錄號6005190)中進行測定，終體積為225μl/孔。短暫勻化后，將膜蛋白以不同濃度(25至150μg/ml)重新懸浮在50mM HEPS、100mM NaCl、10mM MgCl2、20μg/ml皂草甙(Riedel-de-Haen目錄號16109)、0.1％不含脂肪的BSA(Sigma目錄號A0281)(pH7.4)中。將膜蛋白與1mg/孔的SPA珠、10μM GDP、不同濃度的激動劑混合，在室溫下孵育10-15分鐘。通過加入200pM GTPγ35S(Amersham，目錄號SJ1308，＞1000Ci/mmol)引發(fā)GTPγ35S結(jié)合反應(yīng)。將Optiplates密封，在持續(xù)振搖下于室溫孵育110-120分鐘。然后將板以2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，用TopCount儀器(Packard)計數(shù)。用Origin 7 RS2軟件包(Origin Lab Corporation，One Roundhouse Plaza，Northampton，MA 01060，美國)中可得的非線性回歸擬合程序計算EC50。
f2)鈣動員測定將CHO細胞鋪在黑色Costar板(96或384孔，分別為50’000或12500個細胞)上的含有FCS的αMEM中，在CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)20-24小時。移去培養(yǎng)基后，將細胞在含有2μM Fluo4AM(分子探針，目錄號F-1241；1mg/ml貯備于DMSO中)、5mM丙磺舒(probenicid)的HBSS培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)1小時，用HBSS緩沖液、2.5mM丙磺舒漂洗，并用相同培養(yǎng)基(96孔板用75μl，384孔板用50μl)覆蓋。將板轉(zhuǎn)移至FLIPR。測定基線40秒后，加入存在于HBSS中的激動劑，以2秒間隔測定熒光3至5分鐘。在某些情況下細胞用50ng/ml百日咳毒素(Sigma，目錄號P2980)預(yù)處理5小時。在測定前20-40分鐘，以50μM和/或150μM向細胞培養(yǎng)基中直接加入2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯(2-APB，Calbiochem，JuroSupply，Bleicherstr.11，Lucerne，瑞士，目錄號100065)，它是鈣從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的阻滯劑(Ascher-Landsberg等人，1999，Biochem.Biophys.Res.Commun.264，979)。用可從諾華獲得的Origin 7RS2軟件包(OriginLabCorporation)提供的非線性回歸擬合程序計算EC50。
S1P4激動劑的特異性和選擇性的體外測定測定本申請?zhí)峒暗幕衔锏奶禺愋裕缢鼈冊谟肧1P4 cDNA轉(zhuǎn)化之前在親代細胞系中具有的活性，以及測定它們對用S1P1、S1P2、S1P3和S1P5轉(zhuǎn)化的CHO細胞系的選擇性。其它S1P受體的穩(wěn)定細胞系的產(chǎn)生如S1P4中所述進行，使用如上所述的已發(fā)表的人cDNA序列。優(yōu)選選取的化合物擁有100x的選擇性和特異性。例如，S1P4特異性和選擇性化合物在S1P4中測定的EC50(表觀EC50)比在野生型CHO細胞或在表達其它四種S1P受體中任一種的細胞中測定的EC50低10倍，優(yōu)選100倍。例如，如果對S1P4而言測定的EC50為200nM，則在CHO細胞或表達S1P1、2、3、5的細胞中測定的EC50優(yōu)選≥20μM。實施例1的化合物在本測定中對S1P4的EC50為432nM。
實施例2的化合物在CHO細胞或表達多種S1P受體的CHO細胞中的EC50值(以μM為單位)如下表2所示表2
所以，本發(fā)明的化合物在治療和/或預(yù)防由淋巴細胞相互作用介導(dǎo)的疾病或紊亂中是有用的，例如移植，如細胞、組織或器官的同種異體或異種移植物的急性或慢性排斥或者延遲的移植物功能，移植物抗宿主病，自身免疫疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、橋本甲狀腺炎、多發(fā)硬化癥、重癥肌無力、I型或II型糖尿病以及與之有關(guān)的疾病、脈管炎、惡性貧血、舍格倫綜合征、眼色素層炎、牛皮癬、Graves眼病、斑形脫發(fā)和其它，過敏性疾病如過敏性哮喘、特應(yīng)性皮炎、過敏性鼻炎/結(jié)膜炎、過敏性接觸性皮炎，任選有潛在異常反應(yīng)的炎性疾病如炎性腸病、節(jié)段性回腸炎或潰瘍性結(jié)腸炎、內(nèi)因性哮喘、炎性肺損傷、炎性肝損傷、炎性腎小球損傷、動脈粥樣硬化、骨關(guān)節(jié)炎、刺激性接觸性皮炎和其它濕疹性皮炎、脂溢性皮炎、免疫介導(dǎo)疾病的皮膚表現(xiàn)、炎性眼病、角膜結(jié)膜炎、心肌炎或肝炎，缺血/再灌注損傷如心肌梗塞、中風(fēng)、消化道缺血、腎衰竭或出血性休克、創(chuàng)傷性休克，其它，癌癥如T細胞淋巴瘤或T細胞白血病，感染性疾病如中毒性休克(如超抗原誘導(dǎo)的)、敗血癥性休克、成人呼吸窘迫綜合征或病毒性感染如AIDS、病毒性肝炎或慢性細菌感染。細胞、組織或?qū)嶓w器官移植物包括如胰島、干細胞、骨髓、角膜組織、神經(jīng)元組織、心、肺、心肺聯(lián)合、腎、肝、腸、胰、氣管或食管。
對于上述的用途，所要求的劑量當(dāng)然取決于施用的方式、被治療的具體病癥以及預(yù)期作用而變化。通常，當(dāng)全身施用的日劑量為約0.03至2.5mg/kg體重時可獲得滿意的結(jié)果。在較大的哺乳動物如人類中，指示日劑量為約0.5mg至約100mg，例如以至多一日四次的分開劑量或以延緩釋放劑型方便地施用?？诜┯玫倪m宜單位劑型包含約1至50mg活性成分。
本發(fā)明的化合物可通過任何常規(guī)的途徑施用，尤其是經(jīng)腸途徑(例如口服，如以片劑或膠囊形式施用)，或者經(jīng)胃腸道外途徑(例如以可注射的溶液或混懸液形式)，局部途徑(如以洗劑、凝膠、軟膏或乳膏形式，或者是經(jīng)鼻或栓劑形式)。包含游離形式或可藥用鹽形式的本發(fā)明化合物以及至少一種可藥用載體或稀釋劑的藥物組合物可用常規(guī)方式通過與可藥用載體或稀釋劑混合而制造。
本發(fā)明化合物可以以游離形式或可藥用鹽形式施用，例如如上所述。這樣的鹽可用常規(guī)方式制備，并呈現(xiàn)與游離化合物相同級別的活性。
根據(jù)前述內(nèi)容，本發(fā)明還提供了1.1在需要該治療的受治療者中預(yù)防或治療由淋巴細胞介導(dǎo)的紊亂或疾病、例如如上所述的紊亂或疾病的方法，該方法包含給所述受治療者施用有效量的本發(fā)明化合物，如式I化合物，或其可藥用鹽；1.2在需要該治療的受治療者中預(yù)防或治療急性或慢性移植排斥或由T細胞介導(dǎo)的炎性或自身免疫性疾病的方法，該方法包含給所述受治療者施用有效量的本發(fā)明化合物，例如式I化合物，或其可藥用鹽；2.游離形式或可藥用鹽形式的本發(fā)明化合物，如式I化合物，用作藥物，例如在上文1.1和1.2中所述的任一方法中用作藥物；3.藥物組合物，例如用于上文1.1和1.2中的任一方法，包含游離形式或可藥用鹽形式的本發(fā)明化合物，如式I化合物，以及可藥用的稀釋劑或載體。
本發(fā)明的化合物，如式I化合物，可作為唯一的活性成分或如作為佐劑與其它藥物如免疫抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑或其它抗炎劑一起施用，例如用于治療或預(yù)防同種異體或異種移植物急性或慢性排斥或者炎性或自身免疫性疾病，或者與化療劑如惡性細胞抗增殖劑一起施用。例如，本發(fā)明的化合物可與下述藥物組合物使用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，如環(huán)孢菌素A或FK506；mTOR抑制劑，如雷帕霉素、40-O-(2-羥乙基)-雷帕霉素、CCI1779或ABT578；擁有免疫抑制性質(zhì)的子囊霉素，如ABT-281、ASM981等等；皮質(zhì)類固醇；環(huán)磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨蝶呤；來氟米特；咪唑立賓；麥考酚酸；麥考酚酸嗎乙酯；15-脫氧精胍菌素或其免疫抑制同系物、類似物或衍生物；免疫抑制單克隆抗體，如白細胞受體的單克隆抗體，如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86或它們的配體；其它免疫調(diào)節(jié)化合物，如具有CTLA4或其突變體的胞外域的至少一部分、如與非CTLA4蛋白序列結(jié)合的CTLA4或其突變體的至少胞外部分、如CTLA4Ig(例如所謂的ATCC 68629)或其突變體、如LEA29Y的重組結(jié)合分子；粘合分子抑制劑，如LFA-1拮抗劑、ICAM-1或-3拮抗劑、VCAM-4拮抗劑或VLA-4拮抗劑；或化療劑，如紫杉醇、吉西他濱、順鉑、阿霉素或5-氟尿嘧啶。
當(dāng)本發(fā)明的化合物，如式I化合物，與其它免疫抑制/免疫調(diào)節(jié)、抗炎或化療療法組合施用時，共同施用的免疫抑制、免疫調(diào)節(jié)、抗炎或化療化合物的劑量當(dāng)然取決于共同藥物的類型(例如它是類固醇還是鈣調(diào)磷酸酶抑制劑)、所用的具體藥物、被治療的病癥等等。根據(jù)前述，本發(fā)明另一方面還提供了4.如上所定義的方法，包含共同使用、例如并行或依次施用治療有效的無毒量的本發(fā)明化合物，如式I化合物，以及至少第二種藥物物質(zhì)，例如如上所示的免疫抑制藥物、免疫調(diào)節(jié)藥物、抗炎藥物、化療藥物。
5.藥物組合，如藥盒，包含a)第一種藥物，其為游離形式或可藥用鹽形式的本發(fā)明化合物，如本文所公開的式I化合物，和b)至少一種共同藥物，如免疫抑制藥物、免疫調(diào)節(jié)藥物、抗炎藥物或化療藥物，該藥盒可包含施用說明。
本文所用的術(shù)語“共同施用”或“組合施用”等表示囊括所選治療藥物對單一患者的施用，并意欲包括其中藥物不一定以相同施用途徑或在同一時間施用的治療方案。
本文所用的術(shù)語“藥物組合”表示將多于一種的活性成分混合或合并所得的產(chǎn)品，包括活性成分的固定和非固定組合。術(shù)語“固定組合”表示活性成分如本發(fā)明的化合物和共同藥物以單一實體或劑型同時施用于患者。術(shù)語“非固定組合”表示活性成分如本發(fā)明的化合物和共同藥物以單獨的實體無特定時間限制地同時、并行或依次施用于患者，其中這樣的施用在患者體內(nèi)提供了2種化合物的治療有效水平。后者還適用于組合療法，如3種或更多種成分的施用。
權(quán)利要求
1.游離形式或可藥用鹽形式的作為S1P4受體激動劑的化合物，其中所述的化合物對S1P4受體的選擇性是對S1P1、S1P2、S1P3或S1P5受體中的一種或多種的至少10倍，這一點通過測定該化合物對S1P4受體的EC50與該化合物對S1P1、S1P2、S1P3或S1P5受體的EC50之間的比率而得出。
2.游離、水合物或鹽形式的式I化合物， 其中R1為苯基或萘基，其中苯基被一個或兩個鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基或苯基C1-6烷基所取代；且R2為氫或C1-6烷基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的化合物，其選自3-(4-(2-乙苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸、3-(4-(2-芐基-苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸、3-(4-(萘-2-基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸、3-(4-(萘-1-基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸、3-(4-(2-丁氧基-苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸、3-(4-(2-丙基-苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸、3-(4-(2-異丙基-苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸和3-(4-(2，4-二氯-苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸，或它們的可藥用鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的化合物，為3-(4-(2-乙苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-D-丙氨酸，為游離形式或可藥用鹽形式。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的化合物，為游離形式或可藥用鹽形式，用作藥物。
6.藥物組合物，包含如權(quán)利要求1至4中任一項所定義的游離形式或可藥用鹽形式的化合物以及可藥用的稀釋劑或載體。
7.權(quán)利要求1至4中任一項的游離形式或可藥用鹽形式的化合物或者權(quán)利要求4的藥物組合物在制造藥物中的用途，所述的藥物用于治療或預(yù)防由淋巴細胞介導(dǎo)的紊亂或疾病、急性或慢性移植物排斥、T細胞介導(dǎo)的炎性或自身免疫性疾病、糖尿病、過敏性疾病、心肌炎、肝炎、缺血/再灌注損傷、腎衰竭、出血性休克、創(chuàng)傷性休克、癌癥或感染性疾病。
8.藥物組合，包含權(quán)利要求1至4中任一項的游離形式或可藥用鹽形式的化合物以及選自免疫抑制、免疫調(diào)節(jié)、抗炎和化療藥物的其它藥物。
9.權(quán)利要求2的化合物的生產(chǎn)方法，該方法包含使式II化合物去保護， 其中R1和R2如權(quán)利要求2所定義，R6為C1-6烷基或芐基，R7為氨基保護基，并且任選將所得的游離形式的式I化合物轉(zhuǎn)換成鹽形式，或反之亦然。
10.在需要該治療的受治療者中治療或預(yù)防由淋巴細胞介導(dǎo)的紊亂或疾病、急性或慢性移植物排斥、T細胞介導(dǎo)的炎性或自身免疫性疾病、糖尿病、過敏性疾病、心肌炎、肝炎、缺血/再灌注損傷、腎衰竭、出血性休克、創(chuàng)傷性休克、癌癥或感染性疾病的方法，該方法包含給所述受治療者施用有效量的權(quán)利要求1至4中任一項的化合物或其可藥用鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及S1P4受體的激動劑，其對S1P4受體的選擇性是對S1P1、S1P2、S1P3或S1P5受體中一種或多種的至少10倍，特別是新的具有結(jié)構(gòu)(I)的吲哚－丙氨酸衍生物，為游離或鹽形式，以及它們的生產(chǎn)方法、它們的用途且特別是在移植中的用途，以及包含它們的藥物組合物，其中R
文檔編號A61K31/404GK1910148SQ200580002685
公開日2007年2月7日 申請日期2005年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月21日
發(fā)明者K·阿扎奧伊, R·鮑赫拉爾, P·比爾邁耶, D·古爾里尼, M·科洛 申請人:諾瓦提斯公司