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一種抗病毒的藥物組合物及其制備方法

文檔序號(hào):966771閱讀:490來源:國(guó)知局
專利名稱:一種抗病毒的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種抗病毒的藥物組合物,特別是一種應(yīng)用于乙肝病毒和HIV病毒,來源于黃芩和紫花地丁的藥物組合物及其制備方法。
背景技術(shù)
黃芩為唇形科植物黃芩的根,具有清熱、瀉火、解毒、止血、安胎等作用,藥理作用廣泛。近年來,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了大量的研究,且達(dá)到了較高的水平,現(xiàn)代研究證明黃芩的主要有效成分為黃芩苷。黃芩苷為黃酮類化合物,它在清除體內(nèi)自由基,減輕組織缺血再灌注損傷,調(diào)節(jié)免疫功能,保肝利膽、抗感染、抗腫瘤等方面均有一定的作用,是多種中藥制劑的組成成分。
黃芩苷化學(xué)結(jié)構(gòu)式現(xiàn)代研究表明,黃芩苷可以抑制乙肝病毒和HIV病毒的復(fù)制。
紫花地丁為堇菜科植物紫花地丁Viola yedoensis Makino的干燥全草。春、秋二季采收,除去雜質(zhì),曬干。味苦、辛,性寒。歸心、肝經(jīng)。清熱解毒,涼血消腫。全草含多糖、皂苷、黃酮類、蠟、蠟酸及不飽和酸的酯類?,F(xiàn)代研究表明具有紫花地丁的多糖成分在細(xì)胞培養(yǎng)基上有抑制艾滋病毒的作用,同時(shí)其多糖成分可增強(qiáng)人體免疫力。
眾所周知,乙肝和艾滋病同樣都是威脅人類健康甚至是生命的疾病,目前用于抗病毒的藥物不是效果不明顯就是治療費(fèi)用太高,不適合我國(guó)國(guó)情。這就要求我們開發(fā)出療效確切、成本低廉的抗病毒藥物,中藥文化博大精深,清熱解毒的中藥品種眾多,從中開發(fā)治療疑難雜癥、危急重癥的特效藥物是我國(guó)中藥現(xiàn)代化的一個(gè)重要方向。黃芩和紫花地丁傳統(tǒng)就用于清熱解毒,我們通過大量的相互影響性實(shí)驗(yàn),意外的發(fā)現(xiàn)兩味藥材經(jīng)過提取純化所得的有效部位在抗病毒效果上有很好的協(xié)同作用,能達(dá)到增效減毒的目的,這不是普通技術(shù)人員不經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)就可以發(fā)現(xiàn)的。找到黃芩和紫花地丁中的有效成分也不是普通人員能想到的,并且二者混合使用的現(xiàn)象和是否能得到合適的制劑形式也不是顯而易見的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種抗病毒的藥物組合物,本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抗病毒藥物組合物的制備方法。
為了達(dá)到上述目的,本發(fā)明采取了如下的技術(shù)手段我們提供了一種抗病毒的藥物組合物,它是由來源于黃芩和紫花地丁兩種中藥材的抗病毒“有效部位群”以及藥學(xué)上可接受的藥用輔料組成,其中“有效部位”群為1)從按10∶1至1∶3比例(優(yōu)選4∶1至1∶2之間)混合的黃芩和紫花地丁兩味藥材中提取的總提取物;或2)黃芩與紫花地丁比例從10∶1至1∶3(優(yōu)選4∶1至1∶2之間)的兩味藥材分別提取的黃芩提取物和紫花地丁提取物再?gòu)?fù)合組成的混合物;或3)由黃芩苷和紫花地丁提取物按10∶1至1∶3的比例組成的混合物,優(yōu)選黃芩苷和紫花地丁的比例為2∶1。
我們所述的有效部位群所含黃芩苷含量不低于混合物重量的25%。經(jīng)過進(jìn)一步純化黃芩苷和紫花地丁多糖的含量可以達(dá)到混合物重量的80%以上,并且質(zhì)量更容易控制,療效更好。
以上所述紫花地丁提取物可以是提取的紫花地丁多糖部分。該紫花地丁多糖富含硫化多糖。
以上用于提取有效部位群的黃芩和紫花地丁的量比例還優(yōu)選3∶1至1∶1之間。最優(yōu)選用于提取有效部位群的黃芩與紫花地丁的量為2∶1。
我們還提供了一種制備來源于黃芩和紫花地丁兩種藥材的抗病毒的“有效部位群”的方法,包括以下步驟1)按10∶1至1∶3的比例取黃芩和紫花地丁藥材;2)黃芩藥材加8-12倍量水煎煮兩次,每次1-2小時(shí),過濾,濾液加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1-2,80℃保溫30-60min靜置,離心沉淀,沉淀加適量水?dāng)噭蚣?0%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至中性,加入等量乙醇,過濾,續(xù)濾液加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1-2,充分?jǐn)嚢?,加熱?0℃保溫30-60min靜置,離心沉淀,沉淀水洗,50%乙醇洗滌,再用95%乙醇重結(jié)晶,得黃芩提取物;3)紫花地丁加水煎煮兩次,合并兩次提取液濃縮至相對(duì)密度1.15-1.25(50℃),充分?jǐn)嚢柘录尤氲攘康囊掖检o置過夜,去除沉淀,回收乙醇至無(wú)醇味后用大孔吸附樹脂(可以是D101,ADS-7,SA-1,HPD-300,AB-8大孔吸附樹脂)去除酯溶性成分,流出液和水洗脫液合并,用截流分子量5000的超濾膜超濾,超濾液濃縮至盡烘干得紫花地丁提取物;4)將黃芩提取物和紫花地丁提取物均勻混合得所述的“有效部位群”,含有黃芩苷和紫花地丁多糖。
以上藥材質(zhì)量比優(yōu)選為3∶1至1∶1之間。更優(yōu)選黃芩和紫花地丁的藥材質(zhì)量為2∶1。大孔吸附樹脂優(yōu)選ADS-7樹脂。
我們還提供了該藥物組合物在制備抗乙肝病毒和艾滋病毒藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明創(chuàng)造性地將黃芩和紫花地丁聯(lián)合使用,通過大量的試驗(yàn)篩選出兩味藥材抗病毒有效部位并制成藥物組合物及其制劑。我們通過體外和體內(nèi)抑制病毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),本發(fā)明藥物組合物因?yàn)閰f(xié)同作用的存在產(chǎn)生了意想不到的好的病毒抑制效果(并且不同的配比效果也有較大的差別),尤其是對(duì)乙肝病毒和HIV病毒的復(fù)制有很好的抑制功能。我們提供的該藥物組合物制備方法工藝穩(wěn)定,重現(xiàn)性好。我們還通過現(xiàn)代分析手段和指紋圖譜技術(shù)確立了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),發(fā)現(xiàn)我們提供的藥物組合物質(zhì)量可控,穩(wěn)定性好,可以進(jìn)一步開發(fā)為新型的抗病毒藥物。
具體實(shí)施例實(shí)施例1黃芩和紫花地丁復(fù)方注射液的制備取黃芩藥材1000g,加10L去離子水煎煮兩次,每次1.5小時(shí),過濾,濾液加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1-2,80℃保溫45min靜置,離心沉淀,沉淀加適量水?dāng)噭蚣?0%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至中性,加入等量乙醇,過濾,續(xù)濾液加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1-2,充分?jǐn)嚢?,加熱?0℃保溫45min靜置,離心沉淀,沉淀水洗,50%乙醇洗滌,再用95%乙醇重結(jié)晶,得黃芩提取物;取500g紫花地丁加水煎煮兩次,每次5000ml煎煮兩個(gè)小時(shí),合并兩次提取液濃縮至相對(duì)密度1.20-1.25(50℃),充分?jǐn)嚢柘录尤氲攘康囊掖检o置過夜,去除沉淀,回收乙醇至無(wú)醇味后用大孔吸附樹脂(ADS-7大孔吸附樹脂)去除酯溶性成分,流出液和1倍床體積水洗脫液合并,用截流分子量5000的超濾膜超濾,超濾液濃縮至盡烘干得紫花地丁提取物;將黃芩提取物和紫花地丁提取物均勻混合,加入500ml注射用水充分溶解,冷藏過夜后過濾,續(xù)濾液加入9g的氯化鈉,充分溶解后補(bǔ)加注射用水至1000ml,調(diào)節(jié)pH值至6-7,加入活性炭除熱源后分裝于100ml輸液瓶中,滅菌。樣品編號(hào)HQZS-1實(shí)施例2注射用黃芩和紫花地丁凍干粉的制備取黃芩藥材1000g,加10L去離子水煎煮兩次,每次1.5小時(shí),過濾,濾液加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1-2,80℃保溫45min靜置,離心沉淀,沉淀加適量水?dāng)噭蚣?0%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至中性,加入等量乙醇,過濾,續(xù)濾液加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1-2,充分?jǐn)嚢?,加熱?0℃保溫45min靜置,離心沉淀,沉淀水洗,50%乙醇洗滌,再用95%乙醇重結(jié)晶,得黃芩提取物;取500g紫花地丁加水煎煮兩次,每次5000ml煎煮兩個(gè)小時(shí),合并兩次提取液濃縮至相對(duì)密度1.20-1.25(50℃),充分?jǐn)嚢柘录尤氲攘康囊掖检o置過夜,去除沉淀,回收乙醇至無(wú)醇味后用大孔吸附樹脂(ADS-7大孔吸附樹脂)去除酯溶性成分,流出液和1倍床體積水洗脫液合并,用截流分子量5000的超濾膜超濾,超濾液濃縮至盡烘干得紫花地丁提取物;將黃芩提取物和紫花地丁提取物均勻混合,加入250ml注射用水充分溶解,冷藏過夜后過濾,續(xù)濾液加入32g的,充分溶解后補(bǔ)加注射用水至400ml,調(diào)節(jié)pH值至6-7,加入活性炭除熱源后過0.22微米微孔濾膜,分裝于7ml西林瓶中,加塞,凍干,壓蓋即得。樣品編號(hào)HQDD-1實(shí)施例3注射用黃芩和紫花地丁凍干粉的制備按實(shí)施例2的方法,處方為黃芩10kg紫花地丁1kg制成1000支。樣品編號(hào)HQDD-2實(shí)施例4注射用黃芩和紫花地丁凍干粉的制備按實(shí)施例2的方法,處方為黃芩12kg
紫花地丁2kg制成1000支。樣品編號(hào)HQDD-3實(shí)施例5注射用黃芩和紫花地丁凍干粉的制備按實(shí)施例2的方法,處方為黃芩9kg紫花地丁3kg制成1000支。樣品編號(hào)HQDD-4實(shí)施例6注射用黃芩和紫花地丁凍干粉的制備按實(shí)施例2的方法,處方為黃芩3kg紫花地丁6kg制成1000支。樣品編號(hào)HQDD-5實(shí)施例7注射用黃芩和紫花地丁凍干粉的制備紫花地丁按實(shí)施例2的方法,黃芩苷直接投料。處方為黃芩苷40g紫花地丁提取物20g制成1000支。樣品編號(hào)HQDD-6實(shí)施例8注射用黃芩和紫花地丁凍干粉的制備黃芩苷30g紫花地丁提取物30g制成1000支。樣品編號(hào)HQDD-7實(shí)施例9黃芩和紫花地丁復(fù)方軟膠囊的制備分別制得黃芩提取物(或按處方直接投料黃芩苷)和紫花地丁提取物,均勻混合后,加入大豆油,蜂蠟,混勻,制成軟膠囊,即得。
實(shí)施例10黃芩和紫花地丁復(fù)方膠囊的制備分別制得黃芩提取物(或按處方直接投料黃芩苷)和紫花地丁提取物,均勻混合后,加10%的糊精,制粒,制成膠囊,即得。
實(shí)施例11黃芩和紫花地丁復(fù)方片劑的制備分別制得黃芩提取物(或按處方直接投料黃芩苷)和紫花地丁提取物,均勻混合后加入微晶纖維素,交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮,粉碎,乙醇軟化,過60目篩后制粒,50℃干燥,過60目篩整粒,加入羧甲基淀粉鈉,阿斯帕坦,硬脂酸鎂均勻混合,壓制,即得。
實(shí)施例12HQDD藥物體外抗HBV影響實(shí)驗(yàn)藥物HQDD-2,HQDD-1,HQDD-6粉針(廣東中科制備見實(shí)施例,按生藥量調(diào)節(jié)用量)DMEM培養(yǎng)液,胎牛血清,青霉素,鏈霉素,谷氨酰氨,胰蛋白酶,MTT,DMSO。
生理鹽水實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞2.2.15細(xì)胞株。
實(shí)驗(yàn)方法2.2.15細(xì)胞株是用共轉(zhuǎn)染法將克隆的HBV-DNA和抗6418質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)入人肝癌細(xì)胞株HepG2而建立,能長(zhǎng)期穩(wěn)定地分泌HbsAg、HBcAg和完整的Dane顆粒,是目前體外抗HBV藥物篩選和評(píng)價(jià)較好的細(xì)胞模型。2.2.15細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)液添加10%胎牛血清,100U/ml青霉素,100U/ml鏈霉素,80ug/ml G418,0.03%谷氨酰氨,用0.238%Hepes調(diào)pH至6.8。用0.06%胰蛋白酶將2.2.15細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液,按3×104細(xì)胞/0.1ml/孔分種于96孔板,2d后換用含藥培養(yǎng)液,每個(gè)濃度加四孔,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,3組HQDD粉針用細(xì)胞維持液分別稀釋成8個(gè)濃10g/ml,5mg/ml,2.50mg/ml,1.25g/ml,0.625mg/ml,0.312mg/ml,0.156mg/ml,0.078mg/ml,并設(shè)空白對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照組。與細(xì)胞作用11d后,吸上清液以ELISA法測(cè)定HBsAg和HBeAg,余下細(xì)胞用MTT法測(cè)定藥物細(xì)胞毒性。MTT法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的半數(shù)毒性濃度,向細(xì)胞加入400ug/ml MTT 0.1ml/孔,37℃5%CO2孵育4h,可見黃黑色甲攢顆粒,棄去MTT液,加入100%DMSO 0.1ml/孔,待甲攢顆粒完全溶解(約10min)后,用酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值,空白對(duì)照設(shè)四孔,加100%DMSO 0.1ml/孔。按下式計(jì)算半數(shù)毒性濃度(TC50)。
A=log>50%藥物濃度B=log<50%藥物濃度C=A-BHBsAg、HBeAg的檢測(cè),采用ELISA測(cè)定盒檢測(cè)。用酶標(biāo)儀450/630nm雙波長(zhǎng)測(cè)定每孔OD值,并計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度(IC50) A=log>50%藥物濃度B=log<50%藥物濃度C=A-B治療指數(shù)(TI)TI=TC50/IC50結(jié)果見表1。
表1 3組HQDD粉針對(duì)2.2.15細(xì)胞株作用評(píng)價(jià)

實(shí)施例13HQDD粉針體外抗HIV實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)藥物HQDD-2,HQDD-1,HQDD-6粉針,(廣東中科制備見實(shí)施例,按生藥量調(diào)節(jié)用量)AZT(疊氮胸苷)細(xì)胸和病毒HIV-1IIB病毒,MT4細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)方法HQDD粉針對(duì)MT4細(xì)胞的毒性測(cè)定將MT4細(xì)胞2×105個(gè)/ml接種于96孔板中,每孔0.1ml,加入3組HQDD粉針(以DMSO連續(xù)2倍稀釋成1000-7.8ug/ml),陽(yáng)性對(duì)照藥AZT(疊氮胸苷)2倍稀釋為1000-7.8ug/ml,每個(gè)濃度接種3孔,同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照,DMSO溶劑對(duì)照及空自MT4細(xì)胞對(duì)照(不加病毒),置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6d。MTT法測(cè)定細(xì)胞活性,記CC50值。
3組HQDD粉針對(duì)HIV誘導(dǎo)MT4細(xì)胞病變的抑制作用病毒毒力測(cè)定用10倍稀釋8個(gè)濃度HIV,在培養(yǎng)液RPMI-1640中觀察MT4細(xì)胞病變,計(jì)算TCID50為10-6,將MT4細(xì)胞2×105個(gè)/ml接種于96孔板中,每孔為0.1ml,分別加入1000TCID50的HIV病毒100ul,同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照,然后分別加入2倍稀釋5個(gè)濃度的3組HQDD粉針及AZT 100ul,每個(gè)樣品濃度均設(shè)3個(gè)平行孔,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),72h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)。CPF判定標(biāo)準(zhǔn)無(wú)合胞體形成“-,無(wú)合胞體形成但細(xì)胞不規(guī)則“±”,有無(wú)合胞體形成“+”。
EC50的判定(1)只1孔為“+”,另兩孔為“-”或“-”與“±”,此藥物濃度可視為EC50。
(2)3孔分別為“+”,“-,與“±”,此藥物濃度可視為EC50。
(3)3孔均為“±”此藥物濃度可視為EC50(4)3孔均為“+”,下一個(gè)濃度作用下的3孔均為“-”,兩個(gè)濃度的中間值可視為EC50。
選擇指數(shù)(SI)CC50/EC50。結(jié)果見表2。
表2 3組HQDD粉針對(duì)在HIV-1/MT4培養(yǎng)系對(duì)HIV-1誘導(dǎo)細(xì)胞病變作用評(píng)價(jià)

權(quán)利要求
1.一種抗病毒的藥物組合物,其特征在于它是由來源于黃芩和紫花地丁兩種中藥材的抗病毒“有效部位群”以及藥學(xué)上可接受的藥用輔料組成,其中“有效部位”群為(1)從按10∶1至1∶3比例混合的黃芩和紫花地丁兩味藥材中提取的總提取物;或(2)黃芩與紫花地丁比例從10∶1至1∶3的兩味藥材分別提取的黃芩提取物和紫花地丁提取物再?gòu)?fù)合組成的混合物;或(3)由黃芩苷和紫花地丁提取物按10∶1至1∶3的比例組成的混合物。所述的有效部位群所含黃芩苷含量不低于混合物重量的25%。
2.如權(quán)力要求1所述的抗病毒藥物組合物,其特征是所述的有效部位群所含的黃芩苷含量不低于混合物重量的80%。
3.如權(quán)力要求1或2所述的抗病毒藥物組合物,其特征是所述的紫花地丁提取物為提取的紫花地丁多糖。
4.如權(quán)力要求1所述的抗病毒的藥物組合物,其特征是用于提取有效部位群(1)或(2)的黃芩和紫花地丁的量比例在4∶1至1∶2之間。
5.如權(quán)力要求4所述的抗病毒的藥物組合物,其特征是用于提取有效部位群的黃芩和紫花地丁的量比例在3∶1至1∶1之間。
6.如權(quán)力要求5所述的抗病毒的藥物組合物,其特征是用于提取有效部位群的黃芩與紫花地丁的量為2∶1。
7.如權(quán)力要求1所述的抗病毒藥物組合物,其特征為是按黃芩苷與紫花地丁提取物的質(zhì)量比2∶1混合。
8.如權(quán)力要求7所述的抗病毒藥物組合物,其特征是紫花地丁提取物是指富含硫化多糖的紫花地丁多糖。
9.如權(quán)力要求1-8中的任一項(xiàng)的藥物組合物,可以以藥學(xué)上任意一種劑型存在,包括注射用凍干粉、水針、輸液、片劑、膠囊劑、軟膠囊、口服液。
10.如權(quán)力要求9所述的藥物組合物,其特征是劑型為注射液或注射用凍干粉。
11.一種制備來源于黃芩和紫花地丁兩種藥材的抗病毒的“有效部位群”的方法,其特征是包括以下步驟1)按10∶1至1∶3的比例的取黃芩和紫花地丁藥材;2)黃芩藥材加8-12倍量水煎煮兩次,每次1-2小時(shí),過濾,濾液加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1-2,80℃保溫30-60min靜置,離心沉淀,沉淀加適量水?dāng)噭蚣?0%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至中性,加入等量乙醇,過濾,續(xù)濾液加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1-2,充分?jǐn)嚢瑁訜嶂?0℃保溫30-60min靜置,離心沉淀,沉淀水洗,50%乙醇洗滌,再用95%乙醇重結(jié)晶,得黃芩提取物;3)紫花地丁加水煎煮兩次,合并兩次提取液濃縮至相對(duì)密度1.15-1.25(50℃),充分?jǐn)嚢柘录尤氲攘康囊掖检o置過夜,去除沉淀,回收乙醇至無(wú)醇味后用大孔吸附樹脂去除酯溶性成分,流出液和水洗脫液合并,用截流分子量5000的超濾膜超濾,超濾液濃縮至盡烘干得紫花地丁提取物;4)將黃芩提取物和紫花地丁提取物均勻混合得所述的“有效部位群”,含有黃芩苷和紫花地丁多糖。
12.如權(quán)力要求11所述的方法,其特征是黃芩和紫花地丁的藥材質(zhì)量比為3∶1至1∶1之間。
13.如權(quán)力要求12所述的方法,其特征是黃芩和紫花地丁的藥材質(zhì)量為2∶1。
14.如權(quán)力要求11所述的方法,其特征是紫花地丁去除酯溶性成分時(shí)可以是D101,ADS-7,SA-1,HPD-300,AB-8大孔吸附樹脂。
15.如權(quán)力要求14所述的方法,其特征是使用的是ADS-7樹脂。
16.如權(quán)力要求1所述的藥物組合物在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用,包括抗乙肝病毒或抗艾滋病毒中的應(yīng)用。
全文摘要
一種抗病毒的藥物組合物,其特征在于它是由來源于黃芩和紫花地丁兩種中藥材的抗病毒“有效部位群”以及藥學(xué)上可接受的藥用輔料組成。本發(fā)明創(chuàng)造性地將黃芩和紫花地丁聯(lián)合使用,通過大量的試驗(yàn)篩選出兩味藥材抗病毒有效部位并制成藥物組合物及其制劑。我們提供的該藥物組合物制備方法工藝穩(wěn)定,重現(xiàn)性好。我們還通過現(xiàn)代分析手段和指紋圖譜技術(shù)確立了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),發(fā)現(xiàn)我們提供的藥物組合物質(zhì)量可控,穩(wěn)定性好,可以進(jìn)一步開發(fā)為新型的抗病毒藥物。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1824080SQ20051012113
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2005年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月27日
發(fā)明者王偉, 劉二偉 申請(qǐng)人:廣東大光藥業(yè)有限公司
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