專利名稱：組織工程化細胞外基質的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物材料的人工器官技術領域，具體涉及一種組織工程化細胞外基質的制備方法。
背景技術：
細胞外基質由細胞分泌合成，位于細胞外部，構成結締組織，不僅具有連接、支持、保水、抗壓及保護的物理作用，而且對細胞的生命活動發(fā)揮全方位的生物學作用，主要表現(xiàn)在(1)影響細胞的存活、生長與死亡；正常真核細胞，除成熟血細胞外，大多須粘附于細胞外基質上才能抑制凋亡而存活，上皮細胞及內皮細胞一旦脫離了細胞外基質則會發(fā)生程序性死亡。(2)決定細胞的形狀；這一作用是通過其受體影響細胞骨架的組裝而實現(xiàn)的。不同細胞具有不同的細胞外基質，介導的細胞骨架組裝的狀況不同，從而表現(xiàn)出不同的形狀。(3)控制細胞的分化；細胞通過與特定的細胞外基質成分作用而發(fā)生分化。例如，成肌細胞在纖維粘連蛋白上增殖并保持未分化的表型；而在層粘連蛋白上則停止增殖，進行分化，融合為肌管。(4)參與細胞的遷移；細胞外基質可以控制細胞遷移的速度與方向，并為細胞遷移提供“腳手架”。例如，纖維粘連蛋白可促進成纖維細胞及角膜上皮細胞的遷移；層粘連蛋白可促進多種腫瘤細胞的遷移。細胞的趨化性皆依賴于細胞外基質。一些基質細胞都可以合成和分泌膠原纖維、彈力纖維等許多細胞外基質(ECM)成分。如成纖維細胞就具有多種功能特性，同時在合成和調節(jié)細胞外基質成分中起著重要作用，有整合素等黏附分子的表達。
由于細胞外基質對細胞的形狀、結構、功能、存活、增殖、分化、遷移等一系列生命現(xiàn)象具有全面的影響，因而無論在胚胎發(fā)育的形態(tài)發(fā)生和器官形成過程中，或在維持成體結構與功能完善(包括免疫應答及創(chuàng)傷修復等)的一切生理活動中均具有不可忽視的重要作用。
目前臨床常用的細胞外基質產(chǎn)品主要來源于天然材料，最常用的是皮膚來源的脫細胞真皮，它作為一種天然的真皮替代物，主要由成纖維細胞所分泌合成的細胞外基質組成，在組織成分上與自體皮膚最相近，具有完整的膠原三維結構和高生物相容性。既可作為永久性真皮替代物用于皮膚創(chuàng)面修復，又可用作軟組織的替代物，廣泛應用于燒傷、整形外科、口腔、神經(jīng)外科、眼科、耳鼻喉科等學科領域。其可以阻止創(chuàng)面的收縮，提供皮膚的支持力和彈性，對皮膚移植物的穩(wěn)定性和皮膚創(chuàng)面的愈合具有非常重要的作用。其來源主要包括人源性(如美國的Alloderm)由于其來源于人體，與機體具有良好的生物相容性，然而由于存在來源有限和倫理問題而難以廣泛應用；而異種動物來源的細胞外基質(如豬的脫細胞真皮)由于種屬間的免疫排斥反應的存在，臨床效果不佳。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對上述問題，提出了一種組織工程化細胞外基質的制備方法，使所制備的組織工程化細胞外基質具有一定的強度、無明顯免疫排斥反應、保存方法簡便、保存期長，同時具有來源不受限制、不產(chǎn)生倫理道德問題的優(yōu)點，能在臨床研究和治療中發(fā)揮多方面的作用。
本發(fā)明組織工程化細胞外基質的制備方法包括有以下步驟1、培養(yǎng)液的配制(1)基礎培養(yǎng)基成份 最終濃度商用最低必需培養(yǎng)液DMEM 65-70％(v/v)商用培養(yǎng)液F1220-25％(v/v)胎牛血清 5-15％(v/v)胰島素 1～50ng/ml氫化可的松 10～500ng/ml腺嘌呤 0.2～0.25mM轉鐵蛋白 1～10mg/ml表皮生長因子 1～100ng/ml抗生素 10～200i.u/ml(2)培養(yǎng)液1基礎培養(yǎng)基+牛垂體提取物0.1～2％(V/V)(3)培養(yǎng)液2基礎培養(yǎng)基+維生素C 10～30μg/ml(4)培養(yǎng)液3基礎培養(yǎng)基+堿性成纖維細胞生長因子0.5ng～10ng/ml2、基質蛋白的提取其提取方法為，取新鮮動物皮膚剪碎，絞成肉泥，2.5倍Tris-HCl緩沖液攪拌8～12小時，離心棄上清，將沉淀物用3％(v/v)冰醋酸萃取24～48小時，離心取上清液，加入NaCl至終濃度1.0mol/L，鹽析20～40小時后離心棄上清，將沉淀物溶解于含1.7mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液中20～40小時，離心棄去沉淀，在上清液加入NaCl至終濃度2.5mol/L，鹽析20～40小時，離心棄上清，沉淀物用0.1％(v/v)冰醋酸溶解后透析純化，真空凍干并消毒，作為細胞外基質的制備原料。
3、細胞-基質蛋白培養(yǎng)物的制備在無菌條件下，將制備的基質蛋白和殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素按照8∶1∶0.5∶0.5的重量比混合，用0.1％的醋酸溶液配制成重量比為0.5％～10％的溶液，再按其體積的10％加入胎牛血清和10mg/ml的DMEM培養(yǎng)基，調節(jié)pH值為7.2～7.4；加入所需的細胞懸液，使終濃度為104-106個細胞/ml，再將其加至(器皿中的)支撐膜(如尼龍膜、硅膠膜、橡膠膜、高分子材料膜、生物衍生材料膜等)表面上，在37℃、5％CO2條件下固化30分鐘；加入培養(yǎng)液1，每天換液，37℃條件下培養(yǎng)2～4天，形成細胞—基質蛋白培養(yǎng)物。所述的細胞為成纖維細胞，或可向成纖維細胞分化的干細胞，包括胚胎干細胞和成體干細胞，如骨髓間充質干細胞，造血干細胞、皮膚干細胞、間充質干細胞、肌肉干細胞，肝臟干細胞、神經(jīng)干細胞中的一種或幾種。
4、細胞外基質的培養(yǎng)將上述的細胞—基質蛋白培養(yǎng)物置于培養(yǎng)器皿中的不銹鋼支架上，繼續(xù)加入培養(yǎng)液1每天換液，培養(yǎng)2～4天后更換為培養(yǎng)液2每天換液，培養(yǎng)6～8天后更換為培養(yǎng)液3，每天換液培養(yǎng)1～2天，組織工程化細胞外基質即培養(yǎng)完畢。上述各步驟的培養(yǎng)條件均為37℃，5％CO2環(huán)境，加入的培養(yǎng)液均淹沒細胞外基質表面。
5、去細胞處理無菌條件下將組織工程化細胞外基質用0.1％磷酸鹽緩沖液清洗后，浸泡于無菌的去離子水中清洗；再于-196℃～-80℃中30～80分鐘，確保組織工程化細胞外基質內外的溫度達到一致，將其取出后置于室溫下自然解凍，如此反復凍融2～5次，使細胞完全破裂崩解；最后將其置于冷凍干燥機內凍干，如此處理可徹底去除存活的細胞，而組織工程化細胞外基質的結構和蛋白質成分無破壞。
6、消毒后無菌封裝。在4℃條件下，可保存1～2年。
本發(fā)明所制備的組織工程化細胞外基質，是通過組織工程、細胞生物學的手段，將體外培養(yǎng)的人成纖維細胞與分離、提取的動物源性細胞外基質混合構成組織工程化細胞外基質結構，并進行共同培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，成纖維細胞仍然繼續(xù)增殖，吸收動物源性細胞外基質，合成并重新分泌細胞外基質成分。待細胞外基質改建完成后，破除成纖維細胞，保留對細胞生長代謝具有非常重要調節(jié)功能的細胞外基質成分。
本發(fā)明所制備的組織工程化細胞外基質具有一定的強度，而且去除細胞成分，不會引起明顯免疫排斥反應。在臨床治療中主要功能有(1)結合自體表皮移植修復深度皮膚缺損；(2)作為組織充填材料而使局部豐滿；(3)可用于顏面部凹陷畸形的修復，如顳部、頰部凹陷；(4)充當組織加強物，替代筋膜，修復膜性缺損，修復營養(yǎng)不良和感染創(chuàng)面；不穩(wěn)定瘢痕及難治性潰瘍病灶清除后，真皮移植可促進愈合，防止復發(fā)；(5)可做為生物支架材料用于其他組織工程器官的制備，如組織工程化角膜、組織工程化耳鼓膜、組織工程化肌腱、組織工程化牙周膜、組織工程化周圍神經(jīng)等。
本發(fā)明組織工程化細胞外基質的制備方法以及按其方法獲得的組織工程化細胞外基質與現(xiàn)有方法和產(chǎn)品相比，具有以下優(yōu)點1)本發(fā)明的制備方法具有成本低、方法簡便、易于操作、使用方便、來源廣泛和易于貯存的特點，對各種普通軟組織創(chuàng)傷有良好的治療效果，是一種較好的創(chuàng)傷修復材料。
2)本發(fā)明制備的細胞外基質，經(jīng)凍干處理為白色或粉紅色，具有海綿狀網(wǎng)孔結構(

圖1，2)，可覆蓋創(chuàng)面、充填軟組織缺損、促進創(chuàng)周細胞的生長和增殖，植入體內可逐漸被機體自身細胞所改建、吸收，最終完成創(chuàng)面修復功能。
3)本發(fā)明所制備的組織工程化細胞外基質破除了活細胞(圖3)，避免了異體細胞所導致的免疫排斥反應；同時降低了保存難度，延長了保存周期。
4)本發(fā)明的制備方法具有原料來源不受限制，不產(chǎn)生倫理道德問題。
5)本發(fā)明所制備的組織工程化細胞外基質具有一定的彈性和韌性，其形狀大小和厚度易于改變，便于臨床縫合固定。
6)本發(fā)明由于在制備過程中主要使用物理方法來去除抗原成分，與現(xiàn)有脫細胞技術工藝相比避免了化學物質的使用，減少了化學物質殘留，提高了所獲得產(chǎn)品的生物相容性，利于被機體接受。
附圖及其說明附圖1為本發(fā)明所制備組織工程化細胞外基質的外觀照片，為白色或粉紅色海綿狀結構。
附圖2為附圖1的局部放大照片，可見海綿狀網(wǎng)孔結構。
附圖3為本發(fā)明所制備組織工程化細胞外基質縱切面的顯微放大照片，可見組織工程化細胞外基質內未有細胞核，具有網(wǎng)狀結構。
附圖4為豬背部皮膚燙傷治療前的大體照片，可見皮膚損傷處直徑約3cm，表面部分脫落呈蒼白色，邊緣見一條紅色充血帶。
附圖5為豬背部皮膚燙傷后使用本發(fā)明制備的組織工程化細胞外基質修復2周后的大體照片，可見皮膚缺損已修復，疤痕不明顯，顏色接近正常膚色。
具體實施例方式
實施例1現(xiàn)結合實驗將本發(fā)明制備方法做進一步的詳細說明1、培養(yǎng)液的配制(1)基礎培養(yǎng)基成份 最終濃度商用最低必需培養(yǎng)液DMEM 67.5％(v/v)商用培養(yǎng)液F12 22.5％(v/v)胎牛血清 10％(v/v)胰島素 10ng/ml氫化可的松 30ng/ml腺嘌呤 0.22mM轉鐵蛋白 6mg/ml表皮生長因子 80ng/ml抗生素 180i.u/ml(2)培養(yǎng)液1基礎培養(yǎng)基+牛垂體提取物0.5％(V/V)(3)培養(yǎng)液2基礎培養(yǎng)基+維生素C 20μg/ml(4)培養(yǎng)液3基礎培養(yǎng)基+堿性成纖維細胞生長因子5ng/ml2、基質蛋白的提取本發(fā)明采用哺乳動物(可以是牛、兔、豬等)皮膚中提取的基質蛋白混合物，其中包含有I、II、III、IV型膠原、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白等成分，與人體真皮成分接近。其提取方法為取新鮮胎牛皮膚剪碎，絞成肉泥，2.5倍Tris-HCl緩沖液攪拌10小時，離心棄上清，將沉淀物用3％(v/v)冰醋酸萃取25小時，離心取上清液，加入NaCl至終濃度為1.0mol/L，鹽析24小時后離心棄上清，將沉淀物溶解于含1.7mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液中26小時，離心棄沉淀，在上清液加入NaCl至終濃度為2.5mol/L，鹽析40小時，離心棄上清，沉淀物用0.1％(v/v)冰醋酸溶解后透析純化，真空凍干并消毒，作為組織工程化細胞外基質的生產(chǎn)原料。
3、細胞-基質蛋白培養(yǎng)物的制備在無菌條件下，將基質蛋白和殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素按8∶1∶0.5∶0.5的重量比混合，用0.1％的醋酸溶液配制成重量比為2％的溶液，再按其體積的10％加入胎牛血清和10mg/ml的DMEM培養(yǎng)基，調節(jié)pH值為7.2，加入成纖維細胞懸液，使終濃度為106個細胞/ml，再將其加至器皿中的尼龍膜表面上，在37℃、5％CO2條件下固化30分鐘；再將培養(yǎng)液1加至其中；每天換液，37℃條件下培養(yǎng)2天，形成細胞—基質蛋白培養(yǎng)物。
4、組織工程化細胞外基質的培養(yǎng)將上述制備的細胞—基質蛋白培養(yǎng)物放置于不銹鋼支架上，另置于培養(yǎng)器皿中，繼續(xù)加入培養(yǎng)液1每天換液，培養(yǎng)3天后更換為培養(yǎng)液2，每天換液，培養(yǎng)6天后更換為培養(yǎng)液3，每天換液，培養(yǎng)2天組織工程化細胞外基質即培養(yǎng)完畢。上述各步驟的培養(yǎng)條件均為37℃、5％CO2環(huán)境，加入的培養(yǎng)液均淹沒細胞外基質表面。
5、去細胞處理無菌條件下取出組織工程化細胞外基質，用0.1％磷酸鹽緩沖液清洗后浸泡于無菌的去離子水中清洗，再置于-196°的液氮中40分鐘，確保組織工程化細胞外基質內外的溫度達到一致；將其取出后室溫下自然解凍，如此反復凍融3次，使細胞完全破裂崩解；最后將其置于冷凍干燥機內凍干。
6、凍干后的組織工程化細胞外基質為便于臨床使用，在使用前可采用機械或物理方法在組織工程化細胞外基質上均勻地切或扎制若干個平行交錯的縫隙，縫隙長5-15mm，縫隙穿透皮膚，縫隙的平行間距和縱向間距均為2-10mm，貫穿組織工程化細胞外基質全層。
7、本發(fā)明可采用60Co或環(huán)氧乙烷消毒，無菌封裝。在4℃條件下，可保存2年。使用前揭去尼龍膜。
實施例2.燙傷創(chuàng)面修復試驗1)動物皮膚深II度燙傷模型制備約克豬50kg麻醉后背部備皮消毒鋪無菌巾。使用燙傷儀溫度100℃，壓力1kg，時間25s；制備燙傷創(chuàng)面(圖4)。
2)上述模型制備后24小時，麻醉動物，徹底去除所有創(chuàng)面壞死組織，修整創(chuàng)面后將本發(fā)明制備的組織工程化細胞外基質從無菌密封袋中取出，撕去尼龍膜，覆蓋于創(chuàng)面，打包包扎?？瞻讓φ战M采用常規(guī)凡士林油紗布覆蓋創(chuàng)面。術后5天首次打開創(chuàng)面，常規(guī)換藥，觀察創(chuàng)面并取創(chuàng)面組織行HE染色觀察、特異性染色觀察并計算創(chuàng)面平均愈合時間。結果

使用本發(fā)明制備的細胞外基質修復組2周后，可見皮膚缺損已修復，疤痕不明顯，顏色接近正常膚色(圖5)。
結論本發(fā)明制備的組織工程化細胞外基質可以明顯縮短燙傷創(chuàng)面的愈合時間。
權利要求
1.一種組織工程化細胞外基質的制備方法，其特征在于，制備步驟包括培養(yǎng)液配制、基質蛋白提取、細胞—基質蛋白培養(yǎng)物制備、細胞外基質的培養(yǎng)、凍融去細胞處理、消毒滅菌封裝。
2.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)液的配制方法為(1)基礎培養(yǎng)基成份最終濃度商用最低必需培養(yǎng)液DMEM 65-70％(v/v)商用培養(yǎng)液F12 20-25％(v/v)胎牛血清5-15％(v/v)胰島素 1～50ng/ml氫化可的松 10～500ng/ml腺嘌呤 0.2～0.25mM轉鐵蛋白1～10mg/ml表皮生長因子1～100ng/ml抗生素 10～200i.u/ml(2)培養(yǎng)液1基礎培養(yǎng)基+牛垂體提取物0.1～2％(3)培養(yǎng)液2基礎培養(yǎng)基+維生素C10～30μg/ml(4)培養(yǎng)液3基礎培養(yǎng)基+堿性成纖維細胞生長因子0.5ng～10ng/ml。
3.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的基質蛋白的提取方法為取新鮮動物皮膚剪碎，絞成肉泥，2.5倍Tris-HCl緩沖液攪拌8～12小時，離心棄上清，將沉淀物用3％冰醋酸萃取24～48小時，離心取上清液，加入NaCl至終濃度1.0mol/L，鹽析20～40小時后離心棄上清，將沉淀物溶解于含1.7mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液中20～40小時，離心棄去沉淀，在上清液加入NaCl至終濃度2.5mol/L，鹽析20～40小時，離心棄上清，沉淀物用0.1％冰醋酸溶解后透析純化，真空凍干并消毒，作為細胞外基質的原料。
4.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述細胞—基質蛋白培養(yǎng)物的制備方法為在無菌條件下，將基質蛋白和殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素按照8∶1∶0.5∶0.5的重量比混合，用0.1％的醋酸溶液配制成重量比為0.5％～10％的溶液，再按其體積的10％加入胎牛血清和10mg/ml的DMEM培養(yǎng)基，調節(jié)pH值為7.2～7.4；加入細胞懸液，使終濃度為104-106個細胞/ml，再將其加至支撐膜表面上，在37℃、5％CO2條件下固化30分鐘；加入培養(yǎng)液1，每天換液，37℃條件下培養(yǎng)2～4天，形成細胞—基質蛋白培養(yǎng)物。
5.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的細胞為成纖維細胞，或可向成纖維細胞分化的干細胞。
6.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述細胞外基質的培養(yǎng)方法為將細胞—基質蛋白培養(yǎng)物置于培養(yǎng)器皿中的不銹鋼支架上，加入培養(yǎng)液1每天換液，培養(yǎng)2～4天后更換為培養(yǎng)液2，每天換液，培養(yǎng)6～8天后更換為培養(yǎng)液3，每天換液培養(yǎng)1～2天，組織工程化細胞外基質即培養(yǎng)完畢。
7.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的凍融去細胞的處理方法為無菌條件下將組織工程化細胞外基質用0.1％磷酸鹽緩沖液清洗后，浸泡于無菌的去離子水中清洗；再于-196℃～-80℃中30～80分鐘，將其取出后置于室溫下自然解凍，如此反復凍融2～5次，最后將其置于冷凍干燥機內凍干。
8.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的消毒滅菌采用60Co或環(huán)氧乙烷完成。
全文摘要
一種組織工程化細胞外基質的制備方法，本發(fā)明的特點是采用動物基質蛋白和成纖維細胞為原料培養(yǎng)制備，包括培養(yǎng)液制備、基質蛋白提取、細胞一基質蛋白培養(yǎng)物制備、細胞外基質培養(yǎng)、凍融去細胞、消毒滅菌封裝的步驟。本發(fā)明所制備的組織工程化細胞外基質，具有一定的強度，無明顯免疫排斥反應、保存方法簡便，保存期長；不僅可用于皮膚創(chuàng)面修復和皮膚缺損的充填材料，而且可作為生物支架材料用于其他組織工程器官的制備，在臨床研究和治療中可發(fā)揮多方面的作用。
文檔編號A61F2/02GK1800372SQ20051009646
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月2日 優(yōu)先權日2005年12月2日
發(fā)明者王平安 申請人:王平安