專利名稱：治療和預(yù)防呼吸道病毒感染的藥物組合物及其制備與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于治療呼吸系統(tǒng)疾病的藥物組合物及其制備方法與用途，具體為源于中藥的具有治療和預(yù)防呼吸道病毒感染作用的藥物組合物及其可工業(yè)的制備方法與用途。
背景技術(shù)：
呼吸道病毒感染的臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱，頭痛、身痛，咽喉腫痛、咳喘、肺部感染等上、中、下呼吸道炎癥，因而理想的治療呼吸道病毒感染的藥物應(yīng)該具有解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、止咳的作用。然而發(fā)病的主要病因是肌體感染了病毒，所以，這種理性的治療呼吸道病毒感染的藥物必須具有抗病毒作用。呼吸道病毒感染的主要病毒為流感病毒、副流感病毒、合胞病毒、腺病毒。所以，評價抗呼吸道病毒感染藥物，不但要看它是否具有解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、止咳的作用及其作用的強弱，更重要的是看它是否具有抗流感病毒、副流感病毒、合胞病毒、腺病毒的抗病毒譜及其作用的強弱。
治療呼吸系統(tǒng)疾病、具有抗呼吸道病毒作用的專利(申請)已有多件。CN 03100188.2藥物沒有抗炎、鎮(zhèn)痛作用，其抗病毒譜較窄，只抗流感病毒甲、乙型。CN 03118301.8中僅提出具有“抗病毒”作用，沒有公開具體抗哪些病毒。CN 01129177.X僅具有解熱、抗炎作用。CN 00100617.7沒有具體的抗病毒藥理實驗依據(jù)，僅有幾例臨床治療病例，而且這些病例缺少支持所治病例，沒有病毒感染的診斷學(xué)依據(jù)；沒有實驗數(shù)據(jù)支持；所治病例，沒有統(tǒng)計學(xué)處理。CN 200410155101.2的組方不具有止咳作用。CN 02128077.0說明書中僅有組方、制法，沒有公開抗病毒藥效學(xué)數(shù)據(jù)，“中藥不傳之秘在于量”，量的規(guī)律是組方的基本規(guī)律之一，在不同的量變規(guī)律指導(dǎo)下，幾百味常用中藥，可以演變出數(shù)千萬首湯方。而該專利的申請說明中恰恰沒有提到組方的計量問題。CN 94115927.2主要用于風(fēng)寒感冒，未提到抗病毒的藥理作用。CN 03113857.8專利說明書第4頁“本發(fā)明顆粒劑對流感病毒感染的小鼠肺病變與肺指數(shù)沒有表現(xiàn)出明顯的作用，體外對呼吸系統(tǒng)10株致病菌作用不明顯”。CN 96110520.8說明書第3頁僅提及“長于抗流感病毒”，但未見具體的實驗數(shù)據(jù)支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是篩選研究治療和預(yù)防呼吸道病毒感染的藥物組合物，具體為同時具有確切的抗病毒、抗菌、解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛和止咳化痰作用的源于中藥的藥物組合物，其抗病毒譜和藥效作用強度應(yīng)優(yōu)于目前市場具有抗病毒優(yōu)勢的的雙黃連口服液。本發(fā)明包括研究該藥物組合物組方中起到核心和關(guān)鍵作用的“藥團”。本發(fā)明還要研究該處方的合理制備工藝與用途。
為解決上述問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案。
一種治療和預(yù)防呼吸道病毒感染的藥物組合物，其特征在于主要是由下列重量份計原料藥制成野菊花1-5份，柴胡1-10份，連翹1-10份。其優(yōu)選的原料藥用量按重量份計為野菊花5份，柴胡10份，連翹10份。
一種治療和預(yù)防呼吸道病毒感染的藥物組合物，其特征在于基本由下列重量份的原料藥制成野菊花1-5份，柴胡1-10份，連翹1-10份，黃芩5-10份，金銀花5-10份，苦杏仁4-8份。其優(yōu)選原料藥用量按重量份計為野菊花5-8份，柴胡6-10份，連翹6-10份，黃芩5-8份，金銀花5-8份，苦杏仁4-6份。其更優(yōu)選原料藥用量按重量份計為野菊花5份，柴胡10份，連翹10份，黃芩5份，金銀花5份，苦杏仁4份。
前述治療和預(yù)防呼吸道病毒感染的藥物組合物的制備方法，包括如下步驟1)稱取處方量原料藥野菊花、柴胡、連翹、黃芩、金銀花、苦杏仁，備用；2)取野菊花、柴胡、連翹、金銀花，用超臨界法或水蒸汽法提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油，備用；3)取步驟2)中提取揮發(fā)油后的藥渣和黃芩、苦杏仁，用水和/或C1-C5直鏈或支鏈醇提取，濃縮醇提取液后，得到醇提取物；4)取步驟2)中揮發(fā)油用飽和水溶液法、超聲波法、研磨法或者膠體磨法，使β-環(huán)糊精對精制揮發(fā)油進行包合，得揮發(fā)油包合物；5)取步驟4)中揮發(fā)油包合物、步驟3)中醇提取物與藥學(xué)上適用載體混合，制成本發(fā)明藥物組合物。
所述治療和預(yù)防呼吸道病毒感染和藥物組合物的制備方法中，步驟2)中野菊花、柴胡和連翹用超臨界法提取揮發(fā)油的條件為萃取壓力15-35MPa，萃取溫度30-60℃，分離罐I壓力2-25MPa，解析溫度30-60℃，分離罐II壓力2-25MPa，解析溫度30-60℃，萃取1-5小時；步驟2)中金銀花用CO2超臨界提取揮發(fā)油的條件為萃取壓力10-25MPa，萃取溫度30-60℃，分離罐I壓力2-25MPa，解析溫度30-55℃，分離罐II壓力2-25MPa，解析溫度30-60℃，用45-100％乙醇作為夾帶劑，萃取0.5-5小時；步驟2)中野菊花、柴胡和連翹用常規(guī)水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油時，藥材浸泡至少2小時，回流2-3小時后再蒸餾1～2小時；步驟3)中提取揮發(fā)油后的藥渣和黃芩、苦杏仁，用水和/或C1-C5直鏈或支鏈醇提取，C1-C5直鏈或支鏈醇選自乙醇、甲醇、正丁醇。
該制備方法中，優(yōu)選野菊花、柴胡和連翹用超臨界法提取揮發(fā)油的條件為萃取壓力25MPa，萃取溫度40℃，分離罐I壓力6MPa，解析溫度40℃，分離罐II壓力5MPa，解析溫度40℃，萃取2.5小時；金銀花用CO2超臨界提取揮發(fā)油的條件為萃取壓力20MPa，萃取溫度45℃，分離罐I壓力6MPa，解析溫度40℃，分離罐II壓力5MPa，解析溫度40℃，用95％乙醇作為夾帶劑，萃取1小時；所得超臨界萃取物干燥后，與硅藻土混合后，用揮發(fā)油提取器提取揮發(fā)油，得精制揮發(fā)油；用常規(guī)飽和水溶液法，使β-環(huán)糊精對精制揮發(fā)油進行包合，得揮發(fā)油包合物；提取揮發(fā)油后的藥渣和黃芩、苦杏仁，用55-95％乙醇提取。該制備方法中優(yōu)選提取揮發(fā)油后的藥渣和黃芩、苦杏仁，用65-70％乙醇提取，乙醇提取液濃縮后，得醇提物；將揮發(fā)油包合物、醇提物與常規(guī)口服藥用輔料混合。常規(guī)口服藥用輔料除可溶性淀粉、淀粉、β-環(huán)糊精外，還有崩解劑如羥丙纖維素，羧甲基淀粉鈉，交聯(lián)聚維酮，交聯(lián)羧甲基纖維素鈉；填充劑如乳糖，微晶纖維素，糊精，淀粉，磷酸鈣；粘合劑如預(yù)膠化淀粉，聚維酮，羧甲基纖維素鈉，羥丙甲纖維素；潤滑劑如滑石粉，硬脂酸鎂，微粉硅膠，氫化植物油；潤濕劑如十二烷基硫酸鈉，吐溫80；骨架材料如羥丙甲纖維素，乙基纖維素等。
本發(fā)明包括治療呼吸系統(tǒng)疾病藥物組合物在制備治療和預(yù)防呼吸道病毒感染、抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明藥物組合物同時具有確切的抗病毒、抗菌、解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛和止咳化痰作用，其抗病毒譜和藥效作用強度優(yōu)于目前市場具有抗病毒優(yōu)勢的的雙黃連口服液。抗病毒試驗表明，本發(fā)明藥物組合物和對照藥雙黃連口服液對流感病毒甲3型(A3)、副流感病毒1型(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)均顯示出有顯著的抑制作用，其中本發(fā)明藥物組合物對副流感病毒抑制作用較強，且對腺病毒3型(ADV3)有一定的抑制作用，雙黃連口服液對各病毒的抑制強度稍弱一些，對腺病毒3型(ADV3)無抑制作用。體內(nèi)試驗顯示，本發(fā)明藥物組合物大、中劑量組對流感病毒感染小鼠引起的肺炎均有明顯的抑制作用，肺指數(shù)值明顯降低、體重增加，病理檢查結(jié)果顯示，肺部病變明顯減輕。本發(fā)明藥物組合物在體外對所試的6種細菌56種菌株均有不同程度的抑制作用，對金黃色葡萄球菌和變形桿菌的抑制作用本發(fā)明藥物組合物強于雙黃連口服液，其余細菌的抑制作用強度基本相同。
呼吸道病毒感染的臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱，頭痛、身痛，咽喉腫痛、咳喘、肺部感染等上、中、下呼吸道炎癥，因而理想的治療呼吸道病毒感染的藥物應(yīng)該具有解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、止咳的作用。然而發(fā)病的主要病因是肌體感染了病毒，所以，這種理性的治療呼吸道病毒感染的藥物必須具有抗病毒作用。呼吸道病毒感染的主要病毒為流感病毒、副流感病毒、合胞病毒、腺病毒。所以，評價抗呼吸道病毒感染藥物，不但要看它是否具有解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、止咳的作用及其作用的強弱，更重要的是看它是否具有抗流感病毒、副流感病毒、合胞病毒、腺病毒的抗病毒譜及其作用的強弱。
本發(fā)明研發(fā)的藥物組合物(稱為“野柴翹清毒顆粒”)，在解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、止咳的作用及其作用的強度方面，優(yōu)于目前國內(nèi)臨床療效肯定的“雙黃連口服液”?！耙安衤N清毒顆粒”之所以具有治療呼吸道病毒感染的獨特藥效作用，是因為它有獨特的組方。它有獨特的組方體現(xiàn)在它的組方中有一個起到核心和關(guān)鍵作用的“藥團”，這個“藥團”就是“野柴翹”藥團。實驗證明打散“野柴翹”藥團、或者不以“野柴翹”藥團的一定比例量與方中的其它藥物配伍，在解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、止咳，抗流感病毒、副流感病毒、合胞病毒、腺病毒的抗病毒譜及其作用都劣于本發(fā)明的“野柴翹清毒顆粒”組方。由此，該藥物也被我們以它的獨特藥團命名為“野柴翹清毒顆粒”。
中藥組方用藥的時候，常常有兩味或者兩味以上藥物固定搭配使用的特點，用以增強組方的藥效，這種固定搭配使用的藥物被稱之為“藥對”。本發(fā)明在組方研究過程中發(fā)現(xiàn)，“野菊花-柴胡-連翹”在本組方中具有“藥對”的固定搭配使用特點，因為這一固定搭配是由三味藥物組成，故被稱之為“藥團”?！耙熬栈?柴胡-連翹”藥團(以下簡稱“野柴翹”藥團)的存在和變化是影響該組方抗病毒譜和抗病毒作用的的核心和關(guān)鍵。藥效學(xué)實驗顯示“野菊花-柴胡-連翹”對該組方的抗病毒譜和抗病毒作用影響較大。
本發(fā)明藥物組合物制備方法中，揮發(fā)油的提取可用常規(guī)水蒸汽蒸餾法或超臨界法提取，兩種方法各有優(yōu)勢。
本發(fā)明使用常規(guī)水蒸汽蒸餾法提取柴胡、連翹、野菊花和金銀花的揮發(fā)油，增長蒸餾時間會使提取罐中的水量減少，減少過多會使藥材糊化；浸泡時間越長越好。本發(fā)明采用提取工藝為浸泡至少2小時，回流3小時后再蒸餾1～2小時。
本發(fā)明藥物組合物制備過程中，提取揮發(fā)油后的柴胡、連翹、野菊花及金銀花的藥渣，加上黃芩、苦杏仁，用水和/或C1-C5直鏈或支鏈醇提取，濃縮得到提取物。C1-C5直鏈或支鏈醇可選乙醇、甲醇、正丁醇、……，優(yōu)選乙醇。提取揮發(fā)油后的藥渣和黃芩、苦杏仁，用水提取，下文簡稱水提法，用乙醇提取，下文簡稱醇提法。本發(fā)明對水提法和醇提法進行比較，以優(yōu)選研究中產(chǎn)生的各自最佳條件組合。
黃芩、苦杏仁，加入超臨界提過揮發(fā)油的藥渣，分別進行醇提和水提；黃芩、苦杏仁，加入水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油后的藥渣，分別進行醇提和水提。采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油過程中產(chǎn)生的藥液可以濃縮后加入總提液中備用。
醇提法65％的乙醇提取3次，分別均加入5倍量醇，提取時間每次都是1hr，藥材粉碎到黃豆粒大，提取前先浸泡過夜。
水提法每次分別用18倍量水、12倍量水，提取2次，提取時間分別為1hr，藥材粉碎至黃豆粒大或用原飲片均可，提取前先浸泡1小時。
各種實驗樣品液的制備(1)全方醇提組投藥200g(按處方比例取用各味藥材)，采用“醇提法”提取，定容為200m水溶液1。
(2)全方水提組投藥200g(按處方比例取用各味藥材)，采用“水提法”提取，定容為200ml水溶液。
(3)(醇提+水蒸餾油)組投藥154g(按處方比例取用連翹51.3g、柴胡51.3g、野菊花25.7g、金銀花25.7g)，水蒸汽蒸餾提取揮發(fā)油，得水油混合物約5ml；水母液濃縮后約得50ml；取用苦杏仁20.5g、黃芩25.7g，加入上四味藥物水蒸汽蒸餾后的藥渣，采用“醇提法”提取，得藥液約130ml；加入吐溫802ml(大約20滴)；將此四種液體合并，定容為200ml，超聲30分鐘即得。
(4)(水提+水蒸餾油)組藥154g(按處方比例取用連翹51.3g、柴胡51.3g、野菊花25.7g、金銀花25.7g)，水蒸汽蒸餾提取揮發(fā)油，得水油混合物約5ml；水母液濃縮后約得50ml；取用苦杏仁20.5g、黃芩25.7g，加入上四味藥物水蒸汽蒸餾后的藥渣，采用“水提法”提取，得藥液約130ml；加入吐溫802ml(大約20滴)；將此四種液體合并，定容為200ml，超聲30分鐘即得。
(5)(醇提+超全油)組藥154g(按處方比例取用連翹51.3g、柴胡51.3g、野菊花25.7g、金銀花25.7g)，用3.1.5確定的最佳超臨界萃取工藝提取揮發(fā)油，得萃取物(我們稱之為“超全油”)約5ml；取用苦杏仁20.5g、黃芩25.7g，加入上四味藥物超臨界萃取后的藥渣，采用“醇提法”提取，得藥液約130ml；加入吐溫802ml(大約20滴)；將此三種液體合并，定容為200ml，超聲30分鐘即得。
(6)(醇提+超精油)組藥154g(按處方比例取用連翹51.3g、柴胡51.3g、野菊花25.7g、金銀花25.7g)，用3.1.5確定的最佳超臨界萃取工藝提取揮發(fā)油，得萃取物(我們稱之為“超全油”)約5ml，將萃取物用硅藻土拌樣后按藥典法提取揮發(fā)油(我們稱之為“超精油”)約0.25ml；取用苦杏仁20.5g、黃芩25.7g，加入上四味藥物超臨界萃取后的藥渣，采用“醇提法”提取，得藥液約130ml；加入吐溫802ml(大約20滴)；將此超精油、藥液、吐溫80合并，定容為200ml，超聲30分鐘即得。
(7)(水提+超全油)組藥154g(按處方比例取用連翹51.3g、柴胡51.3g、野菊花25.7g、金銀花25.7g)，用3.1.5確定的最佳超臨界萃取工藝提取揮發(fā)油，得萃取物(我們稱之為“超全油”)約5ml；取用苦杏仁20.5g、黃芩25.7g，加入上四味藥物超臨界萃取后的藥渣，采用“水提法”提取，得藥液約130ml；加入吐溫802ml(大約20滴)；將此三種液體合并，定容為200ml，超聲30分鐘即得。
(8)(水提+超精油)組藥150g(按處方比例取用連翹51.3g、柴胡51.3g、野菊花25.7g、金銀花25.7g)，用3.1.5確定的最佳超臨界萃取工藝提取揮發(fā)油，得萃取物(我們稱之為“超全油”)約5ml，將萃取物用硅藻土拌樣后按藥典法提取揮發(fā)油(我們稱之為“超精油”)約0.25ml；取用苦杏仁20.5g、黃芩25.7g，加入上四味藥物超臨界萃取后的藥渣，采用“水提法”提取，得藥液約130ml；加入吐溫802ml(大約20滴)；將此超精油、藥液、吐溫80合并，定容為200ml，超聲30分鐘即得。
(9)(水+吐溫80)組水190ml，加入吐溫802ml(大約20滴)，定容為200ml，超聲30分鐘即得。
各組樣品的藥效實驗結(jié)果以抗炎作用(二甲苯致炎小鼠耳廓腫脹率)及解熱作用為指標(biāo)，實驗方法同上，以上制備的各組樣品進行比較研究，以篩選較優(yōu)與最佳提取方案，抗炎實驗各組的給藥劑量均為14g生藥/kg；解熱實驗各組的給藥劑量均為10g生藥/kg。本實驗工作安排表及實驗結(jié)果詳見表1。
表1、揮發(fā)油提取研究的實驗結(jié)果

上述實驗結(jié)果表明吐溫80對藥效沒有影響；(1)-(8)的提取方法制備的藥物組合物均具有抗炎、解熱作用，其中可達到較好的提取方法是(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)組，其中最佳的提取方法是(5)、(6)組。
本發(fā)明提取的揮發(fā)油用β-CD(β-環(huán)糊精)制備包合物，制備方法可以選用飽和水溶液法、超聲波法、研磨法和膠體磨法，優(yōu)選飽和水溶液法。
具體實施例方式
所用原料均為市購且符合藥典標(biāo)準(zhǔn)的飲片。本發(fā)明所用黃芩(酒炙)、苦杏仁(炒)均從藥材公司直接購買。
實施例1、處方柴胡481g 連翹481g 黃芩(酒炙)240.5g 野菊花240.5g 金銀花240.5g 苦杏仁(炒)192.4g 可溶性淀粉454g 淀粉91g，β-環(huán)糊精適量。制成1000g顆粒劑(10g/袋)；服法一日3次，每次1～2袋，清熱解毒，主治風(fēng)熱感冒。
1、取金銀花、野菊花、連翹、黃芩、柴胡和苦杏仁飲片。
2.提取揮發(fā)油將粉碎過的連翹、柴胡和野菊花，按照處方比例量，置于HA220-40-48型超臨界的萃取裝置中，采用CO2超臨界提取揮發(fā)油，最佳萃取條件為萃取壓力25MPa，萃取溫度40℃，分離罐I壓力6MPa，解析溫度40℃，分離罐II壓力5MPa，解析溫度40℃，萃取2.5小時。取處方比例量的金銀花，置于超臨界萃取裝置中，采用CO2超臨界提取揮發(fā)油，最佳萃取條件為萃取壓力20MPa，萃取溫度45℃，分離罐I壓力6MPa，解析溫度40℃，分離罐II壓力5MPa，解析溫度40℃，待穩(wěn)定后吸入式加入95％乙醇(95％乙醇∶金銀花＝0.35∶1)作為夾帶劑進行萃取，萃取1小時。合并兩次萃取物(得率約為2.5％)，揮去乙醇。
3.超臨界萃取物的精制將干燥的超臨界萃取物用適量的硅藻土拌樣后轉(zhuǎn)移入圓底燒瓶中，用揮發(fā)油提取器提取揮發(fā)油(按照2000年版藥典附錄XD揮發(fā)油測定法項下進行)，得率約為4.3％。
4.揮發(fā)油的包合(按重量/重量比，即1克揮發(fā)油用8克β-環(huán)糊精)取揮發(fā)油8倍量的β-環(huán)糊精，加入到環(huán)糊精12倍量(按重量/重量比，即1克β-環(huán)糊精用12克水)的蒸餾水中，沸水浴加熱使溶解，置于40℃水浴中冷卻。在78HW-1型電動攪拌機(轉(zhuǎn)速100-200r/min)攪拌下，水浴條件下控制溫度為40℃，緩慢滴加揮發(fā)油，攪拌1小時，得大量沉淀?；旌衔镌诒渲?～5℃冷藏24小時，濾過，濾渣用石油醚分次洗滌，固形物40℃干燥，得揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物。得率為93.8％。
5.藥材的提取將提取過揮發(fā)油的金銀花、連翹、柴胡和野菊花藥材與處方量的黃芩及苦杏仁合并，置多功能提取罐中，加入5倍量65％乙醇，浸泡過夜，提取3次，每次加入5倍量65％乙醇，每次提取時間為1小時，提取液濾過，合并三次濾液，得提取液。
6.提取液的濃縮把提取液放入B-10單放濃縮器中，在65℃、0.08Mpa條件下回收乙醇，得浸膏，浸膏的相對密度為1.3(60℃測定)。
7.提取物的干燥將浸膏置于101型的真空干燥箱中，于80℃、0.08Mpa條件下干燥12小時，得干燥物。干燥提取物的得率為23.96％。用多功能型粉碎機粉碎成粉末(80目)。
8.顆粒的制備用多維混合機將β-環(huán)糊精包合物和藥材粉末均勻混合，再與可溶性淀粉、淀粉以1∶1∶0.2的比例混合，攪拌混合30分鐘。以85％乙醇作粘合劑，用制粒機制粒(10目)，制好的顆粒置于65℃、0.08Mpa條件下烘干。將干燥的顆粒按每袋10g的劑量裝入鋁塑復(fù)合膜材料制成的包裝袋中。本品為無糖型顆粒劑，為棕黃色的顆粒，色澤均勻，氣味微苦。
實施例2處方野菊花5g，柴胡10g，連翹10g。
稱取處方比例的柴胡(40目)、連翹(20目)和野菊花(20目)置于超臨界萃取裝置中，調(diào)整萃取壓力為20MPa和萃取溫度為40℃，待儀器穩(wěn)定后萃取2.5小時后，在出料口接收萃取物，稱量萃取物的重量，并與最佳萃取條件計算出的理論含量相比，得率為95.58％。
稱取β-CD(β-環(huán)糊精)2g，置于研缽內(nèi)，再量取8ml(4倍量)蒸餾水加入研缽中，充分混合研磨成糊狀；同時精密量取0.5ml揮發(fā)油(用無水乙醇溶解為2ml，混勻)，用滴管加入β-CD糊狀物中，邊滴邊研磨。研勻后置于40℃烘箱內(nèi)烘干部分水分，濾過，濾渣用15ml石油醚分三次洗滌沉淀；沉淀物再于40℃條件下干燥，即得包合物。在顯微鏡下觀察，明顯可見包合物與不含揮發(fā)油的包合物形狀不同，晶格排列發(fā)生變化，由此初步說明包合物已形成。
超臨界提過揮發(fā)油的藥渣，用65％乙醇提取。其余操作步驟同實施例1。用5％PVP醇水(50％)溶液作粘合劑，顆粒成形，外形較好。
實施例3處方野菊花10g，柴胡10g，連翹10g。
稱取處方比例的柴胡(40目)、連翹(20目)和野菊花(20目)用常規(guī)水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油2小時，提取揮發(fā)油過程中產(chǎn)生的藥液濃縮后加入總提液中備用。
稱取β-CD(β-環(huán)糊精)2.0039g，置于研缽內(nèi)，再量取4ml(2倍量)蒸餾水加入研缽中，充分混合研磨成糊狀；同時精密量取0.5ml揮發(fā)油(用無水乙醇溶解為2ml，混勻)，用滴管加入β-CD糊狀物中，邊滴邊研磨。研勻后置于40℃烘箱內(nèi)烘干部分水分，濾過，濾渣用15ml石油醚分三次洗滌沉淀；沉淀再于40℃下干燥4h，即得包合物，稱重為1.9841g。收得率為83.68％。包合率為62.5％。
水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油的藥渣，用95％乙醇提取。其余操作步驟同實施例1。用5％PVP醇水(50％)溶液作粘合劑，顆粒成形，外形較好。
實施例4處方野菊花5g，柴胡5g，連翹5g。
稱取處方比例的柴胡(40目)、連翹(20目)和野菊花(20目)置于超臨界萃取裝置中，調(diào)整萃取壓力為20MPa和萃取溫度為40℃，待儀器穩(wěn)定后萃取2.5小時后，在出料口接收萃取物，稱量萃取物的重量，并與最佳萃取條件計算出的理論含量相比，得率為95.58％。
稱取β-CD2.0011g，置于膠體磨內(nèi)，再量取8ml(4倍量)蒸餾水加入，研勻后加入精密量取的0.5ml揮發(fā)油(用無水乙醇溶解為2ml，混勻)，充分研磨至糊狀，濾過，濾渣用15ml石油醚分三次洗滌，沉淀于40℃下干燥4h即得包合物，稱重為1.9853g。收得率為83.70％。包合率為62.5％。
超臨界提過揮發(fā)油的藥渣，用75％乙醇提取。其余操作步驟同實施例1。用5％淀粉漿(煮漿法)作粘合劑，顆粒成形，外形較好。
實施例5處方野菊花5g，柴胡10g，連翹10g，黃芩(酒炙)10g，金銀花10g，苦杏仁(炒)8g。
稱取處方比例的柴胡(40目)、連翹(20目)和野菊花(20目)置于超臨界萃取裝置中，調(diào)整萃取壓力為20MPa和萃取溫度為40℃，待儀器穩(wěn)定后萃取2.5小時后，在出料口接收萃取物，稱量萃取物的重量，并與最佳萃取條件計算出的理論含量相比，得率為95.58％。
金銀花的超臨界萃取稱取40目金銀花藥材置于超臨界萃取裝置中，調(diào)整萃取壓力為20MPa和萃取溫度為45℃，待儀器穩(wěn)定后吸入式加入95％乙醇(95％乙醇∶藥材＝0.35∶1)作為夾帶劑，萃取1小時后，在出料口接收萃取物，自然揮去乙醇后，稱量干燥物的重量，并計算得率。
稱取β-CD(β-環(huán)糊精)2g，置于研缽內(nèi)，再量取8ml(4倍量)蒸餾水加入研缽中，充分混合研磨成糊狀；同時精密量取0.5ml揮發(fā)油(用無水乙醇溶解為2ml，混勻)，用滴管加入β-CD糊狀物中，邊滴邊研磨。研勻后置于40℃烘箱內(nèi)烘干部分水分，濾過，濾渣用15ml石油醚分三次洗滌沉淀；沉淀物再于40℃條件下干燥，即得包合物。在顯微鏡下觀察，明顯可見包合物與不含揮發(fā)油的包合物形狀不同，晶格排列發(fā)生變化，由此初步說明包合物已形成。
黃芩、苦杏仁，加入超臨界提過揮發(fā)油的藥渣，用75％乙醇提取。其余操作步驟同實施例1。用5％PVP醇水(50％)溶液作粘合劑，顆粒成形，外形較好。
實施例6處方野菊花10g，柴胡10g，連翹10g，黃芩(酒炙)50g，金銀花50g，苦杏仁(炒)40g。
稱取處方比例的柴胡(40目)、連翹(20目)、金銀花(40目)和野菊花(20目)置于超臨界萃取裝置中，調(diào)整萃取壓力為20MPa和萃取溫度為40℃，待儀器穩(wěn)定后萃取2.5小時后，在出料口接收萃取物，稱量萃取物的重量，并與最佳萃取條件計算出的理論含量相比，得率為78.31％。
稱取β-CD2.0002g，加蒸餾水40ml，沸水浴加熱使溶解，置40℃水浴冷卻。在電動攪拌機(轉(zhuǎn)速100-200r/min)攪拌下，控制溫度為40℃，滴加精密量取的揮發(fā)油0.5ml(用無水乙醇溶解為2ml，混勻)，攪拌1h，得大量沉淀。混合物在冰箱中3～5℃放置24h，濾過，濾渣用15ml石油醚分三次洗滌，固形物40℃干燥4h，得揮發(fā)油β-CD包合物1.9917。收得率為84.03％。包合率為75％。
黃芩、苦杏仁，加入超臨界提過揮發(fā)油的藥渣，用90％乙醇提取。其余操作步驟同實施例1。用85％乙醇作粘合劑，顆粒成形，外形較好，硬度合適。
實施例7處方野菊花5g，柴胡6g，連翹6g，黃芩(酒炙)5g，金銀花5g，苦杏仁(炒)4g。
稱取處方比例的柴胡(40目)、連翹(20目)、金銀花(40目)和野菊花(20目)常規(guī)進行水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油，加水量為藥材重量的5倍，先浸泡2小時，回流3小時后再蒸餾1小時。提取揮發(fā)油過程中產(chǎn)生的藥液濃縮后加入總提液中備用。
稱取β-CD1.9994g，加蒸餾水40ml，沸水浴加熱使溶解，置40℃水浴冷卻后滴加精密量取的揮發(fā)油0.5ml(用無水乙醇溶解為2ml，混勻)，搖勻，置超聲儀上超聲1h，得大量沉淀。混合物在冰箱中3～5℃放置24h，濾過，濾渣用15ml石油醚分三次洗滌，固形物40℃干燥4h，得揮發(fā)油β-CD包合物1.9912g。收得率為84.01％。包合率為70％。
黃芩、苦杏仁加入水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油后的藥渣，用70％乙醇提取。其余操作步驟同實施例1。用10％淀粉漿(沖漿法)作粘合劑，顆粒成形，外形較好，硬度合適。
實施例8處方野菊花8g，柴胡10g，連翹10g，黃芩8g，金銀花8g，苦杏仁6g。
稱取處方比例的柴胡(40目)、連翹(20目)、金銀花(40目)和野菊花(20目)置于超臨界萃取裝置中，調(diào)整萃取壓力為20MPa和萃取溫度為40℃，待儀器穩(wěn)定后萃取2.5小時后，在出料口接收萃取物，稱量萃取物的重量，并與最佳萃取條件計算出的理論含量相比，得率為78.31％。
稱取β-CD1.9994g，加蒸餾水40ml，沸水浴加熱使溶解，置40℃水浴冷卻后滴加精密量取的揮發(fā)油0.5ml(用無水乙醇溶解為2ml，混勻)，搖勻，置超聲儀上超聲1h，得大量沉淀?；旌衔镌诒渲?～5℃放置24h，濾過，濾渣用15ml石油醚分三次洗滌，固形物40℃干燥4h，得揮發(fā)油β-CD包合物1.9912g。收得率為84.01％。包合率為70％。
黃芩、苦杏仁，加入超臨界提過揮發(fā)油的藥渣，用80％乙醇提取。其余操作步驟同實施例1。用5％淀粉漿(煮漿法)作粘合劑，顆粒成形，外形較好，裝入膠囊。
實施例9處方野菊花50g 柴胡100g 連翹100g 黃芩(酒炙)50g 金銀花50g 苦杏仁(炒)40g
1、取處方量金銀花、野菊花、連翹、黃芩、柴胡和苦杏仁飲片。
2.將連翹、柴胡和野菊花，常規(guī)水蒸汽方法提取揮發(fā)油，加水量為藥材重量的5倍，先浸泡2小時，回流3小時后再蒸餾2小時。
3.揮發(fā)油的包合(按重量/重量比，即1克揮發(fā)油用8克β-環(huán)糊精)取揮發(fā)油8倍量的β-環(huán)糊精，加入到環(huán)糊精12倍量(按重量/重量比，即1克β-環(huán)糊精用12克水)的蒸餾水中，沸水浴加熱使溶解，置于40℃水浴中冷卻。在78HW-1型電動攪拌機(轉(zhuǎn)速100-200r/min)攪拌下，水浴條件下控制溫度為40℃，緩慢滴加揮發(fā)油，攪拌1小時，得大量沉淀。混合物在冰箱中3～5℃冷藏24小時，濾過，濾渣用石油醚分次洗滌，固形物40℃干燥，得揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物。得率為93.8％。
4.藥材的提取將提取過揮發(fā)油的金銀花、連翹、柴胡和野菊花藥材與處方量的黃芩及苦杏仁合并，置多功能提取罐中，加入5倍量65％乙醇，浸泡過夜，提取3次，每次加入5倍量65％乙醇，每次提取時間為1小時，提取液濾過，合并三次濾液，得提取液。
5.提取液的濃縮把提取液放入B-10單放濃縮器中，在65℃、0.08Mpa條件下回收乙醇，得浸膏，浸膏的相對密度為1.3(60℃測定)。
6.提取物的干燥將浸膏置于101型的真空干燥箱中，于80℃、0.08Mpa條件下干燥12小時，得干燥物。干燥提取物的得率為23.96％。用多功能型粉碎機粉碎成粉末(80目)。8.顆粒的制備用多維混合機將環(huán)糊精包合物和藥材粉末均勻混合，再與可溶性淀粉、淀粉以1∶1∶0.2的比例混合，攪拌混合30分鐘。以85％乙醇作粘合劑，用制粒機制粒(10目)，制好的顆粒置于65℃、0.08Mpa條件下烘干。將干燥顆粒裝入膠囊。日服3次，每次1袋；小兒酌減，癥重加倍。
實施例10藥效學(xué)研究表明，本發(fā)明藥物組合物不但具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱、止咳、祛痰的確切作用，而且具有明顯的體內(nèi)外抗病毒及體外抑菌作用。
一、實驗材料1.試藥按實驗例1制得的本發(fā)明藥物組合物，每袋10g。用法用量口服，一次2袋，一日3次。
2.陽性對照藥雙黃連口服液來源黑龍江圣泰制藥有限公司 批號030304 規(guī)格10ml×10支/盒 功能主治清熱解毒，祛痰止咳。用于上呼吸道感染。用法用量口服，一次2支，一日3次。
3.實驗動物昆明種小鼠體重18～22g，雌雄兼用，來源于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，合格證號黑動字第P00101006號。Wistar屬大鼠，體重180～220g，雄性，來源于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，合格證號黑動字第P00102004號。
二、實驗方法與步驟(一)抗炎試驗(1)對大鼠足跖腫脹的影響取140～160g雄性大鼠50只，隨機分為5組，分別是本發(fā)明藥物組合物高劑量組10.8g/kg，本發(fā)明藥物組合物中劑量組5.4g/kg，本發(fā)明藥物組合物低劑量組2.7g/kg，陽性對照組雙黃連口服液10.8ml/kg，空白對照組給予等容量生理鹽水。連續(xù)給藥7d，末次給藥0.5h后從右后足跖心向踝關(guān)節(jié)方向皮下注0.1ml蛋清。分別測定注射后0.5、1.0、2.0、3.0h和注射前右后足的體積。結(jié)果見表1。
表1、本發(fā)明藥物組合物、雙黃連口服液對大鼠足跖腫脹的影響(X±S)

注各用藥組與空白對照組比較*P＜0.05**P＜0.01實驗結(jié)果本發(fā)明藥物組合物具有抗炎作用。
(2)對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響取25～30g健康雄性小鼠50只隨機分為5組，分別是本發(fā)明藥物組合物高劑量組15.6g/kg，本發(fā)明藥物組合物中劑量組7.8g/kg，本發(fā)明藥物組合物低劑量組3.9g/kg，陽性對照組雙黃連口服液15.6ml/kg，空白對照組給予等容量生理鹽水，連續(xù)給藥7d，末次給藥1h后于小鼠右耳廓兩面均勻涂布二甲苯0.02ml/只致炎，致炎3h后斷椎處死。結(jié)果見表2。
表2、本發(fā)明藥物組合物、雙黃連口服液對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響(X±S)

注各用藥組與空白對照組比較*P＜0.05**P＜0.01實驗結(jié)果 本發(fā)明藥物組合物具有抗炎作用。
(3)對腹腔注射醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增高的影響取體重18～22g健康雄性小鼠50只，分為5組，每組10只，分別是本發(fā)明藥物組合物高劑量組15.6g/kg，本發(fā)明藥物組合物中劑量組7.8g/kg，本發(fā)明藥物組合物低劑量組3.9g/kg，陽性對照組雙黃連口服液15.6ml/kg，空白對照組給予等容量生理鹽水。采用灌胃給藥，連續(xù)7d，末次給藥1h后各鼠均靜注0.5％伊文思藍生理鹽水溶液0.1ml/10g，隨即腹腔注射0.6％醋酸0.20ml/只，20min后斷椎處死，用6ml生理鹽水分三次洗滌腹腔，吸出洗滌液、合并后加入生理鹽水至10ml，3000轉(zhuǎn)離心15min，取上清夜于590nm比色測定光密度，以平均光密度值做t檢驗。結(jié)果見表3。
表3、藥物對腹腔注射醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增高的影響(X±S)

注各用藥組與空白對照組比較*P＜0.05**P＜0.01實驗結(jié)果本發(fā)明藥物組合物具有抗炎作用。
(二)止痛試驗(1)熱板法取體重18～22g經(jīng)痛閾篩選合格(痛閾在5～30s)的雌性小鼠50只，隨機分為5組，分別是本發(fā)明藥物組合物高劑量組15.6g/kg，本發(fā)明藥物組合物中劑量組7.8g/kg，本發(fā)明藥物組合物低劑量組3.9g/kg，陽性對照組雙黃連口服液15.6ml/kg，空白對照組給予等容量生理鹽水，給藥前測定其自放在熱板上至出現(xiàn)舔后足所需時間作為該鼠正常痛閾值。結(jié)果見表4。
表4、本發(fā)明藥物組合物、雙黃連口服液對小鼠熱板痛閾值的影響(X±S)

注各用藥組與空白組比較*P＜0.05**P＜0.01實驗結(jié)果本發(fā)明藥物組合物具有鎮(zhèn)痛作用。
(2)醋酸扭體法取體重18～22g小鼠50只，隨機分為5組，每組10只。分別是本發(fā)明藥物組合物高劑量組15.6g/kg，本發(fā)明藥物組合物中劑量組7.8g/kg，本發(fā)明藥物組合物低劑量組3.9g/kg，陽性對照組雙黃連口服液15.6ml/kg，空白對照組給予等容量生理鹽水，采用灌胃給藥連續(xù)7d。末次給藥0.5h后腹腔注射0.6％醋酸0.2ml/只。觀察20min內(nèi)各鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)次數(shù)，結(jié)果見表5。
表5本發(fā)明藥物組合物、雙黃連口服液對小鼠醋酸反應(yīng)次數(shù)的影響(X±S)


注各用藥組與空白對照組比較*P＜0.05**P＜0.01實驗結(jié)果本發(fā)明藥物組合物具有鎮(zhèn)痛作用。
(三)解熱試驗(1)酵母法取體重150～200g，雌雄各半大鼠，用體溫計間隔1h測直腸體溫兩次，以平均值作為基礎(chǔ)體溫。選取體溫變化不超過0.3℃者50只，將其隨機分為5組，每組10只。即本發(fā)明藥物組合物高劑量組10.8g/kg，本發(fā)明藥物組合物中劑量組5.4g/kg，本發(fā)明藥物組合物低劑量組2.7g/kg，陽性對照組雙黃連口服液10.8ml/kg，空白對照組給予等容量生理鹽水。采用灌胃給藥，連續(xù)7d。末次給藥0.5h后各小鼠于背部皮下注射20％酵母混懸液10ml/kg。結(jié)果見表6。
表6 本發(fā)明藥物組合物、雙黃連口服液對酵母所致大鼠發(fā)熱的影響(X±S)

注各用藥組與空白對照組比較*P＜O.05**P＜0.01實驗結(jié)果本發(fā)明藥物組合物具有解熱作用。
(2)2，4-二硝基苯酚法取體重150～200g，雌雄性大鼠，用體溫計間隔1h測直腸體溫2次，以平均值作為基礎(chǔ)體溫。選取體溫變化不超過0.3℃者50只，將其隨機分為5組，每組10只。即本發(fā)明藥物組合物高劑量組10.8g/kg，本發(fā)明藥物組合物中劑量組5.4g/kg，本發(fā)明藥物組合物低劑量組2.7g/kg，陽性對照組雙黃連口服液10.8ml/kg，空白對照組給予等容量生理鹽水。采用灌胃給藥，連續(xù)7d。末次給藥0.5h后每鼠于背部皮下注射2，4-二硝基苯酚1ml/100g(15mg/kg)。結(jié)果見表7。
表7 本發(fā)明藥物組合物、雙黃連口服液對2，4-二硝基苯酚所致大鼠發(fā)熱的影響(X±S)

注各用藥組與生理鹽水組比較*P＜0.05**P＜0.01實驗結(jié)果本發(fā)明藥物組合物高劑量組從20min到180min都有降溫作用P＜0.01。
(四)止咳試驗取體重18～22g，健康小鼠50只，將其隨機分為5組，每組10只。即本發(fā)明藥物組合物高劑量組15.6g/kg，本發(fā)明藥物組合物中劑量組7.8g/kg，本發(fā)明藥物組合物低劑量組3.9g/kg，陽性對照組雙黃連口服液15.6ml/kg，空白對照組給予等容量生理鹽水。采用灌胃給藥，連續(xù)7d。末次給藥1h后每只小鼠于接受5秒鐘濃氨水噴霧，取出小鼠，觀察1min內(nèi)咳嗽次數(shù)。
表8、本發(fā)明藥物組合物、雙黃連口服液對濃氨水所致小鼠咳嗽的影響(X±S)

注各用藥組與空白對照組比較*P＜0.05**P＜0.01實驗結(jié)果本發(fā)明藥物組合物具有止咳作用。
(五)祛痰試驗取健康小鼠，體重18～22g，雌雄各半，將其隨機分為5組，每組10只。即本發(fā)明藥物組合物高劑量組15.6g/kg，本發(fā)明藥物組合物中劑量組7.8g/kg，本發(fā)明藥物組合物低劑量組3.9g/kg，陽性對照組雙黃連口服液15.6ml/kg，空白對照組給予等容量生理鹽水。采用灌胃給藥，連續(xù)7d。末次給藥0.5h后每只鼠腹腔注射酚紅0.1ml(5mg)/10g體重，注射酚紅后0.5h處死動物，剝離氣管周圍組織，剪下自甲狀軟骨至氣管分支處的一段氣管，放入盛有2ml生理鹽水的試管中，再加0.1ml氫氧化鈉，用722型分光光度計，波長546nm測OD值，以平均光密度值做t檢驗。結(jié)果見表9。
表9、本發(fā)明藥物組合物、雙黃連口服液對小鼠氣管段酚紅排泌的影響(X±S)

注各用藥組與空白對照組比較*P＜0.05**P＜0.0l實驗結(jié)果本發(fā)明藥物組合物具有祛痰作用。
(六)本發(fā)明藥物組合物體內(nèi)外抗病毒及體外抑菌作用實驗材料受試藥物 實施例l制備的本發(fā)明藥物組合物，1.87g生藥/g制劑，，以三蒸水配制成1g生藥/ml，隔水煮沸20分鐘滅菌，用于體外抗病毒和抑菌試驗。配制成29.2、14.6、7.3g生藥/kg，用于體內(nèi)抗病毒試驗。
對照藥 雙黃連口服液，1.5g生藥/ml，哈藥集團三精制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號03012912，以三蒸水配制成1g生藥/ml，隔水煮沸20分鐘滅菌，用于體外抗病毒和抑菌試驗。體內(nèi)試驗劑量設(shè)計雙黃連口服液臨床日用量為90g生藥/天，按60公斤體重計算為1.5g生藥/kg，按動物與人公斤等效劑量折算，小鼠用16.5g生藥/kg相當(dāng)于臨床等效劑量，選用臨床等效劑量的2倍量33.Og生藥/kg進行體內(nèi)抗病毒試驗。
病毒唑(三氮唑核苷Ribavirin)原料藥，湖北省醫(yī)藥工業(yè)研究所產(chǎn)品，批號020606，配成4mg/ml過濾除菌，用于體外抗病毒試驗。
病毒 流感病毒甲3型(A3)、副流感病毒1型(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒3型(ADV3)、腺病毒7型(ADV7)、單純皰疹病毒1型(HSV-1)，用于體外試驗流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1，用于體內(nèi)試驗。均購自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所，本實驗室傳代后保存于-60℃冰箱備用。
動物 ICR小鼠，體重13～15g，雌雄各半，用于體內(nèi)抗病毒試驗，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號為SCXK(京)2002-0003。
細菌 標(biāo)準(zhǔn)株金黃色葡萄球菌26112(ATCC25923)、大腸桿菌4413(ATCC25922)、綠膿假單胞菌10211(ATCC27853)、變形桿菌49027、乙型溶血性鏈球菌32210各1株。
臨床分離株金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌各9株、B族鏈球菌7株，肺炎克雷伯桿菌8株，分別由北京市積水潭醫(yī)院和北京大學(xué)第一醫(yī)院細菌室分離鑒定并提供。
細胞 人喉癌傳代細胞Hep-2株，購自衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所。細胞培養(yǎng)液 含10％小牛血清、0.29mg谷氨酰胺/ml、100u/ml青、鏈霉素的Eagle’s MEM(日本日水制藥株式會社出品)。細胞維持液 除所含小牛血清為2％外，其他含量均同培養(yǎng)液。細菌培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，批號030324，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，批號020918，均由中國藥品生物制品檢定所監(jiān)制。儀器 CO2培養(yǎng)箱，日本Yamato科學(xué)株式會社生產(chǎn)。倒置顯微鏡，OLYMPUS牌。
試驗方法[參考文獻賀玉琢、高英杰、富杭育.正柴胡飲的抗病毒作用的實驗研究 中國實驗方劑學(xué)雜志 1996；2(1)12；中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局，新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編(藥學(xué) 藥理學(xué) 毒理學(xué))，163頁，1993.7；盧長安，中西醫(yī)結(jié)合病毒學(xué)研究技術(shù)與方法，孟慶云主編，中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)理論研究方法與實驗技術(shù)，第一版，390～420頁，北京中國古籍出版社，1999.3。]一、體外抗病毒試驗1、對Hep-2培養(yǎng)細胞的毒性試驗試驗方法 按常規(guī)試驗操作，將瓶中Hep-2細胞消化下來，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，長成單層細胞后，進行試驗將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液傾去，將試藥以維持液連續(xù)2倍稀釋11個濃度，加入板中200μl/孔，每稀釋度加4孔，第12列不加藥液作正常細胞對照。將培養(yǎng)板置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，每日用倒置顯微鏡觀察藥液對細胞的影響。
表示藥物對細胞的毒性程度分級“-”表示細胞生長基本正常，未出現(xiàn)中毒現(xiàn)象；“1”表示中毒細胞發(fā)生率在25％以下；“2”表示中毒細胞發(fā)生率在25％～50％之間；“3”表示中毒細胞發(fā)生率在50％～75％之間；“4”表示中毒細胞已在75％以上。若毒性為“1”及其以下“-”，則視為陰性，可認為此濃度藥樣對細胞無中毒現(xiàn)象，其余的“2”及其以上各級，均視為陽性，即所試藥樣在此濃度對細胞有中毒作用。
按上述方法取得試驗結(jié)果利用Reed-Muench法計算50％毒性濃度(TC50)如下本發(fā)明藥物組合物的TC50＝2.82mg生藥/ml，TC0＝1.95生藥/ml，雙黃連口服液的TC50＝5.62mg生藥/ml，TC0＝3.91mg/ml，病毒唑Ribavirin的TC50＝0.714mg/ml，TC0＝0.5mg/ml。
選擇對細胞生長無影響的最大無毒濃度TC0及其以下濃度作抗病毒驗。
2、各病毒滴度(TCID50)的測定按常規(guī)試驗操作，將瓶中Hep-2細胞消化下來，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，長成單層細胞后，進行病毒毒力滴定試驗，測定出各病毒的滴度(TCID50)。具體操作為將各病毒以細胞維持液作10倍連續(xù)稀釋7個濃度，倒去細胞板中培養(yǎng)液，加入維持液100μl/孔，再將每稀釋度病毒液加入板中4孔，每孔100μl，留1行不加病毒液改加維持液作為正常細胞對照。置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日開始觀察細胞病變(CPE)3天，以最后1日的CPE為準(zhǔn)(判斷標(biāo)準(zhǔn)同下)，以Reed-Muench法計算各病毒的TCID50。
按上述方法滴定結(jié)果如下表10、病毒滴度(TCID50)的測定

3、對病毒致細胞病變作用的影響取已長成單層細胞的培養(yǎng)板，倒掉培養(yǎng)液，接種100TCID50的不同病毒液100μl于細胞孔，每一塊細胞板接種二種病毒(各加6列)，留第8行不接種病毒作正常細胞對照。置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中吸附2小時，倒掉病毒液，用不含小牛血清的Eagle’s維持液洗細胞面1次后，加入從最大無毒濃度TC0起倍比稀釋5個濃度的藥液(1～5行)200μl/孔，各濃度加3孔。第6行加1/4TC50(0.714/4＝0.197mg/ml)Ribavirin，第7行不加藥液作病毒對照，第8行為未感染未加藥的正常細胞對照。置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，每日在倒置顯微鏡下鏡檢CPE進展。細胞病變程度的判斷“-”細胞生長正常，無病變出現(xiàn)；“1”細胞病變約占整個單層細胞的＜25％；“2”細胞病變約占整個單層細胞的25％～50％；“3”細胞病變約占整個單層細胞的50％～75％；“4”細胞病變約占整個單層細胞的75％～100％。
根據(jù)以上細胞病變五級標(biāo)準(zhǔn)判斷，利用Reed-Mueneh法計算50％有效濃度(EC50)，并求出治療指數(shù)(TI＝TC50/EC50)，TI值越高，表明藥效作用越強。
按上述方法通過兩次試驗結(jié)果表明，本發(fā)明藥物組合物對流感病毒甲3型(A3)、副流感病毒1型(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)均顯示出顯著的抑制作用，其中本發(fā)明藥物組合物對副流感病毒抑制作用顯著，且對腺病毒3型(ADV3)有明顯的抑制作用。雙黃連口服液對各病毒的抑制強度相對較弱，對腺病毒3型(ADV3)無抑制作用。詳見下表11。
表11、本發(fā)明藥物組合物對常見呼吸道感染有關(guān)病毒的作用

注1.表中EC50單位為mg生藥/ml。
2.表中“+”為有抑制作用，“-”為無抑制作用，EC50為50％有效濃度，TI為治療指數(shù)TI＝TC50/EC50。
二、體內(nèi)抗病毒試驗(小鼠流感病毒性肺炎)取13～15g健康小鼠，雌雄各半，按體重隨機分為6組，每組10只，分別灌胃給藥，本發(fā)明藥物組合物以29.2、14.6、7.3g生藥/kg三個劑量給予，雙黃連口服液以33g生藥/kg給予，對照組給予相同體積的蒸餾水。除正常對照組外，其余各組小鼠以乙醚輕度麻醉，用15LD50的流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1滴鼻感染小鼠，0.05ml/只。于感染前1d開始灌胃給藥，正常對照組和病毒感染對照組給予同體積蒸餾水，每日2次，連續(xù)5d。第6天后取稱小鼠體重后，固定，放血，解剖，摘取全肺稱重(10％甲醛固定，進行病理組織學(xué)檢查)。計算肺指數(shù)值，并求出肺指數(shù)抑制率。肺指數(shù)值大，表示肺部病變程度嚴(yán)重。將各組肺指數(shù)值進行t檢驗，比較組間差異性。
肺指數(shù)＝[肺重(g)/體重(g)]×100

病理組織學(xué)檢查肺部及細支氣管炎癥病變程度判斷標(biāo)準(zhǔn)“-”小鼠肺部及細支氣管正常結(jié)構(gòu)，間質(zhì)未見炎癥；“+”小鼠肺部及細支氣管有輕度炎癥，間質(zhì)充血；“++”小鼠肺部及細支氣管有炎癥浸潤，以淋巴為主，有少量單核等炎癥細胞；“+++”小鼠肺部及細支氣管均有炎癥浸潤，間質(zhì)大量炎癥細胞，以淋巴、單核為主，并有中性分葉核；“++++”小鼠肺部及細支氣管有彌漫性炎癥浸潤，以淋巴、單核為主，并有大量中性分葉核，肺泡融合，間質(zhì)瘀血。
病理檢查結(jié)果按秩和檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理。
表12、本發(fā)明藥物組合物對小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用

注與病毒對照組比較*P＜0.05。
表13、本發(fā)明藥物組合物對小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用

注與模型組相比*P＜0.05，**P＜0.01 H0.05＝78，H0.01＝71表12、13結(jié)果可見，感染病毒后小鼠體重明顯降低、肺指數(shù)值明顯提高、大量炎癥細胞浸潤。本發(fā)明藥物組合物高、中劑量組對流感病毒感染小鼠引起的肺炎均有顯著性的抑制作用，可使感染小鼠體重明顯增加，肺指數(shù)值明顯降低；肺病變程度明顯減輕(病理報告略去)。
三、體外抑菌試驗(瓊脂稀釋法)將試藥以1/8比例加入已融化的營養(yǎng)瓊脂中，并做系列倍比稀釋，傾注成含不同藥液濃度的平板培養(yǎng)基。另用比濁法，將增菌16h的各菌種比濁至麥?zhǔn)?號管(3億菌/ml)，再將各菌做適當(dāng)稀釋，各吸取5μl滴加于平板上，同時設(shè)細菌對照，陽性藥對照。將接種完的平皿置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后觀察結(jié)果，記錄各菌生長及最低抑菌濃度MIC。
本發(fā)明藥物組合物和雙黃連口服液在體外對所試的6種細菌56種菌株均有不同程度的抑制作用，對金黃色葡萄球菌和變形桿菌的抑制作用本發(fā)明藥物組合物強于雙黃連口服液，其余細菌的抑制作用強度基本相同，詳見表14。
表14、本發(fā)明藥物組合物對各種菌的平均最低抑菌濃度(MIC±SD mg生藥/ml)

注()內(nèi)的數(shù)字為菌株數(shù)，與雙黃連口服液比較*P＜0.05，**P＜0.01。
按上述方法通過兩次試驗結(jié)果表明，本發(fā)明藥物組合物對流感病毒甲3型(A3)、副流感病毒1型(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)均顯示出顯著的抑制作用，其中本發(fā)明藥物組合物對副流感病毒抑制作用顯著，且對腺病毒3型(ADV3)有明顯的抑制作用；雙黃連口服液對各病毒的抑制強度相對較弱，對腺病毒3型(ADV3)無抑制作用。體內(nèi)試驗顯示感染病毒后小鼠體重明顯降低、肺指數(shù)值明顯提高、大量炎癥細胞浸潤。本發(fā)明藥物組合物高、中劑量組對流感病毒感染小鼠引起的肺炎均有顯著性的抑制作用，可使感染小鼠體重明顯增加，肺指數(shù)值明顯降低；肺病變程度明顯減輕。本發(fā)明藥物組合物在體外對所試的6種細菌56種菌株均有不同程度的抑制作用，對金黃色葡萄球菌和變形桿菌的抑制作用本發(fā)明藥物組合物強于雙黃連口服液，其余細菌的抑制作用強度基本相同。
中藥研究所實驗動物病理檢查報告肉眼觀察正常對照組小鼠肺組織及支氣管周圍結(jié)構(gòu)正常，模型組大部分小鼠肺組織瘀血，暗褐色，表面有滲出，本發(fā)明藥物組合物大、中、小劑量組和雙黃連口服液組與模型對照組相比肺部炎癥均有不同程度的減輕。鏡下觀察正常對照組小鼠肺間質(zhì)及支氣管周圍未見有炎癥浸潤，結(jié)構(gòu)正常。
模型組大部分小鼠肺間質(zhì)可見大量炎癥細胞浸潤，以淋巴細胞為主，并有單核，中性及分葉核細胞，肺泡間質(zhì)融合，形成肺大泡，間質(zhì)大量瘀血，支氣管周圍大量炎癥細胞浸潤，少部分細支氣管腔內(nèi)有纖毛上皮及炎癥細胞脫落。本發(fā)明藥物組合物大、中劑量組和陽性藥組小鼠肺部病變程度與模型組相比均有明顯減輕。
表15、對小鼠肺部及細支氣管炎的影響

注與模型組相比*P＜0.05，**P＜0.01 H0.05＝78，H0.01＝71該批試驗給藥組小鼠肺間質(zhì)及細支氣管的炎癥與模型組相比，有不同程度的減輕，尤以本發(fā)明藥物組合物大、中劑量及陽性對照藥雙黃連口服液組的肺和細支氣管病變減輕明顯。
(七)急性毒性實驗本發(fā)明藥物組合物以67％濃度，一日內(nèi)一次灌胃給藥，每次0.8ml/20g，沒有測出LD50.。最大給藥量為53.6g/kg，相當(dāng)于臨床人用量的125倍。
所以在固定其它藥味和藥量(金銀花5g、黃芩5g、苦杏仁4g)不變的條件下，將野菊花、柴胡、連翹三味藥物作為三個因素，將其不同的用量作為不同水平進行篩選。
實施例11“野柴翹”藥團實驗研究實驗表明野菊花1-5g，柴胡1-10g，連翹1-10g范圍，“野柴翹”藥團的抗病毒效高、抗病毒譜廣，且解熱、抗炎作用顯著，優(yōu)選的配比為野菊花5g、柴胡10g、連翹10g。即本發(fā)明藥物組合物中的野菊花、柴胡和連翹組成的藥團與金銀花、黃芩、苦杏仁組配時，在抗病毒、解熱、抗炎方面其協(xié)同作用明顯。
表16、“野柴翹”藥團篩選因素水平表

表17、“野柴翹”藥團篩選實驗正交安排[L9(3)4]表


注TI為抗病毒指數(shù)，TI值越大表示藥物的抗病毒作用越強。TI＝TC50/EC50。
TC50為50％細胞毒性濃度，單位為mg生藥/ml。
EC50為50％有效濃度，單位為mg生藥/ml。
綜合上述抗病毒實驗結(jié)果顯示，最佳的藥團組合為A2C3B1，既野菊花5g、柴胡10g、連翹10g。但是，C3、B1均為邊緣水平，所以要進行補救實驗，固定A2(野菊花5g)，變B1為15g(柴胡15g)，變C3為15g(連翹15g)，以A2C增補B增補組成新的藥團(野菊花5g、柴胡15g、連翹15g)與篩選出的A2C3B1藥團(野菊花5g、柴胡10g、連翹10g)，分別加入固定藥物[黃芩5-10克，金銀花5-10克，苦杏仁4-8克(實驗方法相同、數(shù)據(jù)略)；優(yōu)選黃芩5-8克，金銀花5-8克，苦杏仁4-6克(實驗方法相同、數(shù)據(jù)略)]金銀花5g、黃芩5g、苦杏仁4g(實驗數(shù)據(jù)見表18、19))后進行比較實驗，兩組比較實驗的結(jié)果如下。
表18、篩選出的A2C3B1藥團與補作的A2C增補B增補組成新的藥團實驗結(jié)果比較


結(jié)論“野柴翹藥團”的最佳組合為A2C3B1，既野菊花5g、柴胡10g、連翹10g。
以上的實驗解決了“野柴翹藥團”比例量的優(yōu)選組合問題。為了考察“野柴翹藥團”是否可以打散的問題，我們?nèi)耘f以抗病毒實驗為指標(biāo)，設(shè)計以下個各實驗組，進行實驗考察。
各實驗組如下1組(有“藥團”組)“野柴翹藥團”+其它固定藥物(金銀花5g、黃芩5g、苦杏仁4g)；2組(無“藥團”組)0+其它固定藥物(金銀花5g、黃芩5g、苦杏仁4g)；3組(半藥團A組)野菊花5g+柴胡10g+其它固定藥物(金銀花5g、黃芩5g、苦杏仁4g)；4組(半藥團B組)野菊花5g+連翹10g+其它固定藥物(金銀花5g、黃芩5g、苦杏仁4g)；5組(半藥團C組)連翹10g+柴胡10g+其它固定藥物(金銀花5g、黃芩5g、苦杏仁4g)；6組(單野組)野菊花5g+其它固定藥物(金銀花5g、黃芩5g、苦杏仁4g)；7組(單柴組)柴胡10g+其它固定藥物(金銀花5g、黃芩5g、苦杏仁4g)；8組(單翹組)連翹10g+其它固定藥物(金銀花5g、黃芩5g、苦杏仁4g)；9組(“藥團”變量組野菊花10g+柴胡10g+連翹10g+其它固定藥物(金銀花5g、黃芩5g、苦杏仁4g)。
表19、“野柴翹藥團”發(fā)生不同變化后的組方抗病毒比較實驗結(jié)果

實驗表明組方中含有“野柴翹藥團”，抗病毒譜廣，抗病毒作用最強；組方中不含有“野柴翹藥團”時，無抗病毒作用；“野柴翹藥團”的用量比發(fā)生變化時，抗病毒作用相應(yīng)減弱；“野柴翹藥團”的組合藥物發(fā)生變化時，抗病毒譜變窄，抗病毒作用減弱。證明“野柴翹藥團”是該組方發(fā)揮抗病毒作用的核心和關(guān)鍵，本發(fā)明藥物組合物中該藥團的組成藥物和藥量均為優(yōu)選組合。
我們另以大鼠解熱和小鼠抗炎實驗為指標(biāo)考察“野柴翹藥團”存在的合理性，具體實驗結(jié)果見下表。
表20、組方篩選因素水平表

注野菊花、黃芩、金銀花各5g。
表21、工作安排表及實驗結(jié)果[L9(3)4]


結(jié)果顯示，野菊花1-5克、柴胡1-10克、連翹1-10克、黃芩5-10克、金銀花5-10克和苦杏仁4-8克的組方范圍較好，優(yōu)選野菊花5-8克、柴胡6-10克、連翹6-10克、黃芩5-8克、金銀花5-8克和苦杏仁4-6克。最優(yōu)選組方為柴胡10g、連翹10g、野菊花5g、黃芩5g、金銀花5g和苦杏仁4g?！耙安衤N藥團”即野菊花1-5克、柴胡1-10克和連翹1-10克是組方發(fā)揮藥效的核心，“野柴翹藥團”的優(yōu)選組合是野菊花5g、柴胡10g和連翹10g。
權(quán)利要求
1.一種治療和預(yù)防呼吸道病毒感染的藥物組合物，其特征在于主要是由下列重量份計原料藥制成野菊花1-5份，柴胡1-10份，連翹1-10份。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其原料藥用量按重量份計為野菊花5份，柴胡10份，連翹10份。
3.一種治療和預(yù)防呼吸道病毒感染的藥物組合物，其特征在于基本由下列重量份的原料藥制成野菊花1-5份，柴胡1-10份，連翹1-10份，黃芩5-10份，金銀花5-10份，苦杏仁4-8份。
4.權(quán)利要求3的藥物組合物，其原料藥用量按重量份計為野菊花5-8份，柴胡6-10份，連翹6-10份，黃芩5-8份，金銀花5-8份，苦杏仁4-6份。
5.權(quán)利要求4的藥物組合物，其原料藥用量按重量份計為野菊花5份，柴胡10份，連翹10份，黃芩5份，金銀花5份，苦杏仁4份。
6.權(quán)利要求3-5之一所述藥物組合物的制備方法，包括如下步驟1)稱取處方量原料藥野菊花、柴胡、連翹、黃芩、金銀花、苦杏仁，備用；2)取野菊花、柴胡、連翹、金銀花，用超臨界法或水蒸汽法提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油，備用；3)取步驟2)中提取揮發(fā)油后的藥渣和黃芩、苦杏仁，用水和/或C1-C5直鏈或支鏈醇提取，濃縮醇提取液后，得到醇提取物；6)取步驟2)中揮發(fā)油用飽和水溶液法、超聲波法、研磨法或者膠體磨法，使β-環(huán)糊精對精制揮發(fā)油進行包合，得揮發(fā)油包合物；7)取步驟4)中揮發(fā)油包合物、步驟3)中醇提取物與藥學(xué)上適用載體混合，制成本發(fā)明藥物組合物。
7.權(quán)利要求6所述藥物組合物的制備方法，步驟2)中野菊花、柴胡和連翹用超臨界法提取揮發(fā)油的條件為萃取壓力15-35MPa，萃取溫度30-60℃，分離罐I壓力2-25MPa，解析溫度30-60℃，分離罐II壓力2-25MPa，解析溫度30-60℃，萃取1-5小時；步驟2)中金銀花用CO2超臨界提取揮發(fā)油的條件為萃取壓力10-25MPa，萃取溫度30-60℃，分離罐I壓力2-25MPa，解析溫度30-55℃，分離罐II壓力2-25MPa，解析溫度30-60℃，用45-100％乙醇作為夾帶劑，萃取0.5-5小時；步驟2)中野菊花、柴胡和連翹用常規(guī)水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油時，藥材浸泡至少2小時，回流2-3小時后再蒸餾1～2小時；步驟3)中提取揮發(fā)油后的藥渣和黃芩、苦杏仁，用水和/或C1-C5直鏈或支鏈醇提取，C1-C5直鏈或支鏈醇選自乙醇、甲醇、正丁醇。
8.權(quán)利要求7所述藥物組合物的制備方法，其中野菊花、柴胡和連翹用超臨界法提取揮發(fā)油的條件為萃取壓力25MPa，萃取溫度40℃，分離罐I壓力6MPa，解析溫度40℃，分離罐II壓力5MPa，解析溫度40℃，萃取2.5小時；金銀花用CO2超臨界提取揮發(fā)油的條件為萃取壓力20MPa，萃取溫度45℃，分離罐I壓力6MPa，解析溫度40℃，分離罐II壓力5MPa，解析溫度40℃，用95％乙醇作為夾帶劑，萃取1小時；所得超臨界萃取物干燥后，與硅藻土混合后，用揮發(fā)油提取器提取揮發(fā)油，得精制揮發(fā)油；用常規(guī)飽和水溶液法，使β-環(huán)糊精對精制揮發(fā)油進行包合，得揮發(fā)油包合物；提取揮發(fā)油后的藥渣和黃芩、苦杏仁，用55-95％乙醇提取。
9.權(quán)利要求8所述藥物組合物的制備方法，提取揮發(fā)油后的藥渣和黃芩、苦杏仁，用65-70％乙醇提取，乙醇提取液濃縮后，得醇提物；將揮發(fā)油包合物、醇提物與常規(guī)口服藥用輔料混合。
10.權(quán)利要求3-5之一所述藥物組合物在制備治療和預(yù)防呼吸道病毒感染、抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種治療和預(yù)防呼吸道病毒感染的藥物組合物，由野菊花1－5份、柴胡1－10份、連翹1－10份、黃芩5－10份、金銀花5－10份和苦杏仁4－8份制成，具有確切的抗病毒、抗菌、解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛和止咳化痰作用，其抗病毒譜和藥效作用強度優(yōu)于雙黃連口服液。
文檔編號A61P11/00GK1733079SQ20051009421
公開日2006年2月15日 申請日期2005年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月5日
發(fā)明者石洪波 申請人:石洪波