專(zhuān)利名稱(chēng):含有脂質(zhì)體細(xì)胞因子的生物降解材料的微球血管栓塞劑及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及生物降解材料的血管栓塞劑及其制備和應(yīng)用,特別涉及利用從天然植物海藻酸中提取的,具有良好生物降解特性和生物相容性的多聚糖鈉鹽或明膠包被采用脂質(zhì)體包裹的細(xì)胞因子,制成50μm-75μm,75μm-150μm,100μm-200μm,200μm-300μm,200μm-450μm,100μm-300μm,300μm-500μm,500μm-700μm,700μm-900μm的微球,用于腫瘤動(dòng)脈栓塞和局部靶向免疫化學(xué)治療。
背景技術(shù):
腫瘤動(dòng)脈栓塞療法是在支配癌組織的微動(dòng)脈內(nèi)注入栓塞物質(zhì),使該處微動(dòng)脈發(fā)生機(jī)械式栓塞,達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)目的的一種新療法。1981年Kato首先提出化療栓塞法,將化療藥物與栓塞物質(zhì)有效有機(jī)結(jié)合,對(duì)一些不能手術(shù)的惡性腫瘤提出新方法。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外應(yīng)用化療栓塞療法在臨床上可用于肝癌、腎癌、盆腔腫瘤及頭頸部腫瘤等治療,收到較好的療效。但栓塞后復(fù)發(fā)率較高。
微球制劑系藥物與適宜的輔料通過(guò)微型包裹技術(shù)制備的微球。栓塞微球的療效與其粒徑、骨架降解速率、載藥及其釋藥速度等因素有很大關(guān)系。用含藥物的微球制劑堵塞支配癌組織的微動(dòng)脈,栓塞部位可不斷定向癌靶區(qū)釋放抗癌藥物,殺傷癌細(xì)胞,使藥物具有靶向性和控釋作用,且改變了藥物在體內(nèi)分布及動(dòng)力學(xué),提高藥物的生物利用度,治療效果顯著,毒副作用降低。
腫瘤動(dòng)脈栓塞療法選用的微球類(lèi)制劑應(yīng)具有以下性質(zhì)栓塞力強(qiáng),有足夠的機(jī)械強(qiáng)度和理化穩(wěn)定性;藥物從載體上釋放緩慢而持久,能在靶區(qū)維持治療濃度;載體能被機(jī)體逐漸蝕解消失,具有生物相容性;無(wú)抗原性,長(zhǎng)時(shí)間滯留于靶區(qū)對(duì)機(jī)體無(wú)害等。
海藻酸鈉是從天然植物海藻中提取的多聚糖鈉鹽,可溶于水形成黏度膠體,在鈣離子作用下產(chǎn)生大分子鏈間交鏈固化,是一種生物衍生材料,具有良好的生物相容性和良好的生物降解特性。因此,可根據(jù)需要加工成不同規(guī)格的圓形的固態(tài)微球。在動(dòng)物血管內(nèi)磷酸緩沖液下的環(huán)境下,鈣離子漸漸析出,微球以分子鏈的形式5-10天或3-6個(gè)月降解消失,降解產(chǎn)物為甘露糖和古羅糖,不被人體吸收。其微球大小均勻和可控制,且進(jìn)入血管后可迅速溶脹,栓塞定位效果好。因此,利用其可降解的特性,根據(jù)設(shè)計(jì)要求,制備包載成抗腫瘤的微球或/和含脂質(zhì)體包裹的細(xì)胞因子的微球,注入靶器官后可逐步定時(shí)釋放靶藥,用于腫瘤的局部免疫化學(xué)治療。
免疫治療可清除殘余腫瘤細(xì)胞和小的微轉(zhuǎn)移灶及早期腫瘤,防止腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā),是腫瘤治療的特異療效的輔助療法。細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫及抗感染和抗腫瘤的重要因素。
IL-2可使靜止的前細(xì)胞毒T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒T細(xì)胞,維持LAK細(xì)胞、TIL細(xì)胞的生長(zhǎng),還可以通過(guò)活化的巨噬細(xì)胞提高非特異性腫瘤殺傷作用,并且在淋巴細(xì)胞因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)中產(chǎn)生,單獨(dú)或過(guò)繼輸入的殺傷細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用可減低腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。IFN-Γ是有一種活化的T細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞產(chǎn)生的,多對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抗增殖作用,同時(shí)還能夠增加腫瘤細(xì)胞的免疫源性和具有對(duì)細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用,包括刺激NK細(xì)胞和單核細(xì)胞的增殖作用,協(xié)助保持持續(xù)的TH1型細(xì)胞反應(yīng),并刺激IL-12的產(chǎn)生,因而形成了一種正反饋的循環(huán)。TNF具有多種功能,其中抗腫瘤的效應(yīng),主要表現(xiàn)為對(duì)某些類(lèi)型的細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用,可導(dǎo)致腫瘤新生血管壞死,也可增強(qiáng)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞凝血活性導(dǎo)致病理性凝血,阻斷瘤區(qū)血液供應(yīng)。另外,TNF也可通過(guò)活化某些水解酶而殺傷腫瘤細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)和臨床研究結(jié)果提示白介素-2(IL-2),干擾素(IFN-α,β和γ),腫瘤壞死因子(TNF)等細(xì)胞因子,具有抗腫瘤作用,且聯(lián)合應(yīng)用比單一使用更能發(fā)揮抗腫瘤作用。細(xì)胞因子與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用,具有協(xié)同或增強(qiáng)療效作用。研究還顯示TNF-α,IFNα,IFNγ及IL-2等,提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的反應(yīng)。
干擾素除誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化外,還具有對(duì)阿霉素(ADM),5-FU,順鉑,長(zhǎng)春花鹼,烷化劑等藥物的增敏作用。在免疫治療過(guò)程中,IFN-α常和IL-2聯(lián)合使用,優(yōu)于IFN-α或IL-2單獨(dú)使用,是1+1>2的組合。另外IFN-α常和IL-2和TNF-α三種聯(lián)合應(yīng)用也能較好地輔助化療藥物的作用。另外,細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)多藥耐藥基因(MDR1)的基因表達(dá),可增加MDR1相關(guān)藥物如阿霉素及長(zhǎng)春新堿的細(xì)胞毒性,且其作用呈時(shí)間依賴(lài)性和濃度依賴(lài)性。高濃度的細(xì)胞因子可引起MDR1的明顯逆轉(zhuǎn),增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性,改善腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境,增加機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答等多種途徑,達(dá)到抗腫瘤的目的。因此,細(xì)胞因子聯(lián)合化療可用于化療耐藥的腫瘤治療。
某些化療藥物CTX,MMC,ADM,DDP等可增強(qiáng)IL-2等細(xì)胞因子的抗腫瘤效果,不同化療藥物與細(xì)胞因子聯(lián)合時(shí),具有協(xié)同或增強(qiáng)療效作用。化療同時(shí)給予免疫治療,既可減輕化療產(chǎn)生的免疫抑制作用,又可發(fā)生協(xié)同作用,不僅降低化療的副作用,增強(qiáng)宿主的耐受力,又利于改善腫瘤的區(qū)域控制率,減少局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率。另一方面免疫治療也可增強(qiáng)化療的效果。因此,不同抗癌方法在一定條件下聯(lián)合應(yīng)用是合理的。免疫化學(xué)治療成為腫瘤治療的重要手段。
日本東京大學(xué)的谷口維紹教授等在最近Nature網(wǎng)絡(luò)雜志上發(fā)表其干擾素和抗癌劑合用研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾素可提高細(xì)胞內(nèi)P53蛋白的表達(dá),干擾素和放療和化療并用后,療效比單用化療和放療效果好,且減少抗癌藥物的劑量和藥物副作用。英國(guó)Windbichler GH等對(duì)148例IC--IV期經(jīng)腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的原發(fā)性卵巢腫瘤患者,進(jìn)行Γ-干擾素與CP方案化療聯(lián)合應(yīng)用的前瞻性研究(一種隨機(jī)的三期臨床試驗(yàn)),作者認(rèn)為在卵巢癌一線(xiàn)化療中加入Γ-干擾素具有延長(zhǎng)腫瘤無(wú)進(jìn)展生存周期的作用。
由于采用的細(xì)胞因子及其在體內(nèi)的應(yīng)用可產(chǎn)生許多不良反應(yīng),限制其臨床應(yīng)用。IL-2在體內(nèi)半衰期短,穩(wěn)定性差,臨床大劑量的應(yīng)用可導(dǎo)致肝腎功能損害和肺毛細(xì)血管滲漏綜合癥等全身副作用。TNF-α能被腎排泄和各種蛋白酶分解,在體內(nèi)不穩(wěn)定。半衰期短,在人體的耐受量底,副作用除發(fā)熱,惡心嘔吐,頭疼,部分出現(xiàn)嚴(yán)重的低血壓及休克等。
如何臨床合理使用細(xì)胞因子,具有重要的意義。目前采用措施有(1)多細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用(IFN,IL-2)或與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用降低其劑量,(2)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改變,以獲得低毒高效的細(xì)胞因子,如壞死因子衍生物。(3)采用脂質(zhì)體可明顯增加其穩(wěn)定性和體內(nèi)的生物利用度,體內(nèi)半衰期延長(zhǎng),以減少毒性,靶向性強(qiáng),生物活性提高,抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)效能。(4)改變給藥途徑和方法。
對(duì)體內(nèi)實(shí)質(zhì)性臟器,經(jīng)動(dòng)脈介入是一種重要局部途徑。經(jīng)動(dòng)脈栓塞進(jìn)行免疫治療的局部給藥可使藥物直接分布于癌組織,在腫瘤局部維持高濃度,激活效應(yīng)細(xì)胞功能,抗腫瘤作用更強(qiáng);同時(shí)區(qū)域免疫治療可克服腫瘤引起的免疫抑制;更容易產(chǎn)生對(duì)腫瘤抗原的免疫記憶和免疫應(yīng)答;且全身副作用很小,使用安全。IFN局部應(yīng)用可使局部較高的濃度藥物直接接觸腫瘤組織,可增加病灶及周?chē)木奘杉?xì)胞,淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn),對(duì)腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的破壞作用。對(duì)各種暴露性腫用IFN直接注入乳頭狀瘤,乳腺癌,宮頸癌等瘤體內(nèi),可取得滿(mǎn)意的近期療效,充分顯示其優(yōu)越性。
高建等采用干擾素(IFN-α1b)聯(lián)合肝動(dòng)脈化療栓塞治療(TACE)對(duì)HBSAg陽(yáng)性的62例肝癌患者進(jìn)行療效和預(yù)后觀察,結(jié)果顯示IFN+TACE聯(lián)合應(yīng)用,可抑制乙型肝炎病毒復(fù)制,減輕介入化療后肝臟損害,降低肝內(nèi)復(fù)發(fā)率,提高患者生存率,且不良反應(yīng)少。潘鐵軍等采用TNF和IL-2化療栓塞治療腎惡性腫瘤,并與單純腎動(dòng)脈栓塞患者進(jìn)行比較結(jié)果細(xì)胞因子組腫瘤組織中有較多的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),且腎靜脈殘端均為壞死的腫瘤細(xì)胞,包膜內(nèi)無(wú)存活的瘤細(xì)胞。提示TNF和IL-2聯(lián)合應(yīng)用一方面通過(guò)破壞腫瘤血供,致腫瘤組織缺血壞死,另一方面可激活巨噬細(xì)胞,被激活的細(xì)胞可識(shí)別和殺傷瘤細(xì)胞,且減少誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。曹澤毅等經(jīng)盆腔腹膜后間隙注入IL-2觀察TIL和NK活性,探討起進(jìn)行生物治療的可行性。結(jié)果顯示IL-2+5-FL組較5-FU組和IL-2組CD3,CD4,CD8,CD25和NK細(xì)胞差異有顯著性,提示IL-2經(jīng)盆腔腹膜后間隙可激活腫瘤組織TIL和NK的活性。
微球制劑系藥物與適宜的輔料通過(guò)微型包裹技術(shù)制的微球,藥物以微球形式給藥后,可使藥物具有靶向性和控釋作用,同時(shí)可改變藥物體內(nèi)動(dòng)力學(xué),提高其生物利用度,降低毒副作用。腫瘤動(dòng)脈栓塞微球?qū)δ[瘤細(xì)胞的殺傷機(jī)制是使含藥物微球聚集于腫瘤附近動(dòng)脈血管,在一定程度上阻斷組織供血,從而在腫瘤局部持續(xù),有效地誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡,最終導(dǎo)致癌細(xì)胞缺血,缺氧壞死。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種采用可降解生物材料包載脂質(zhì)體細(xì)胞因子(白介素-2,腫瘤壞死因子,干擾素)化療藥物的血管栓塞劑。
本發(fā)明的另一目的是提供上述包載脂質(zhì)體細(xì)胞因子(白介素-2,腫瘤壞死因子,干擾素)化療藥物的血管栓塞劑的制備方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是應(yīng)用制備的上述血管栓塞劑進(jìn)行荷人卵巢癌,肝癌,腎癌及宮頸癌裸鼠和晚期或復(fù)發(fā)的卵巢癌,肝癌,腎癌和宮頸癌局部治療,或?qū)m頸癌的新輔助化療。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案達(dá)到的一種含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞劑,其特征在于包括藥物載體和脂質(zhì)體細(xì)胞因子,所述藥物載體包裹所述脂質(zhì)體細(xì)胞因子。
所述藥物載體為海藻酸鈉或明膠。
所述脂質(zhì)體細(xì)胞因子是將細(xì)胞因子包封于脂質(zhì)雙分子層而形成的微型球狀體。其粒徑為25納米-5微米,一般為1微米左右。
所述脂質(zhì)體可以是磷脂膽堿(卵磷脂,PC)和牛腦中的磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇或二棕櫚酰-DL-α-磷脂酰膽堿。為了提高包封率,可加入硬脂胺磷酸脂(10%);為了使膜穩(wěn)定,可加入適當(dāng)?shù)哪懝檀?20-50%)。脂質(zhì)體的制備方法有薄膜分散法、超聲波制備法、乙醇注入法與醚注入法、逆相蒸發(fā)法、冷凍干燥法等。
所述海藻酸鈉或明膠與所述脂質(zhì)體細(xì)胞因子的重量比為1∶1~90∶1。
所述含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的海藻酸鈉或明膠微球血管栓塞劑可以是儲(chǔ)存在二價(jià)金屬陽(yáng)離子固化液當(dāng)中的微膠珠或微球。
所述含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的海藻酸鈉或明膠微球血管栓塞劑也可以是粉末狀微粒。
所述儲(chǔ)存在固化液中的微膠珠或微球的粒徑范圍在50~900μm。
所述粉末狀微粒的粒徑范圍在50~900μm。
一種含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的海藻酸鈉微球血管栓塞劑的制備方法,其步驟如下(1)將脂質(zhì)體細(xì)胞因子按比例稱(chēng)重,用溶劑溶解;得脂質(zhì)體細(xì)胞因子溶液;(1)將海藻酸鈉按比例稱(chēng)重,溶解,得海藻酸鈉溶液;(2)將氯化鈣或氯化鋇稱(chēng)重,配制成1~10%濃度的溶液,得固化液;(3)將所得脂質(zhì)體細(xì)胞因子溶液和海藻酸鈉溶液混合,并通過(guò)高壓靜電微球液滴發(fā)生裝置與所述固化液混合固化成圓形或類(lèi)圓形的微球或微膠珠,得含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的海藻酸鈉微球血管栓塞劑。
所述溶劑可以是水、乙醇、酸如乙酸、堿如苛性鈉等。
所述高壓靜電微球液滴發(fā)生裝置包括一靜電發(fā)生裝置,所述靜電發(fā)生裝置上有正負(fù)兩極,正極與微量注射裝置的針頭相連,負(fù)極與浸在所述固化液中的不銹鋼鋼絲相連接,注射裝置內(nèi)裝有脂質(zhì)體細(xì)胞因子和海藻酸鈉的混合溶液,滴入所述固化液中形成微球。
所得含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的海藻酸鈉微球血管栓塞劑為儲(chǔ)存在固化液中的微球,稱(chēng)為濕球。其粒徑范圍可以是100~200μm。
將所得含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的海藻酸鈉微球血管栓塞劑傾析后,將下面的微球放入烘箱干燥,密閉保存,得粉末狀顆粒,稱(chēng)為干球。其粒徑范圍可以是100~200μm。
一種含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞劑的制備方法,其步驟如下(1)將脂質(zhì)體細(xì)胞因子按比例稱(chēng)重,用溶劑溶解;得脂質(zhì)體細(xì)胞因子溶液;(2)將明膠按比例稱(chēng)重,用水加熱溶解,得明膠溶液;(3)將所得脂質(zhì)體細(xì)胞因子溶液和明膠溶液混合,攪拌均勻,倒入55-60℃的礦物油中,攪拌,冷卻至5℃以下,得含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的濕明膠微球血管栓塞劑;(4)將上述明膠微粒濕球加入異丙醇或丙酮脫水,攪拌,分離微球,用異丙醇洗二次,待干;(5)取微球若干,加入10%甲醛異丙醇溶液,固化,過(guò)濾,干燥,得干明膠微球。
所述第(1)步中所用溶劑可以是水、乙醇、酸如乙酸、堿如苛性鈉等。
采用介入放射或介入超聲的方法,將導(dǎo)管插入靶器官供血?jiǎng)用},行動(dòng)脈造影,根據(jù)造影所見(jiàn),決定選用栓塞微球的直徑。盡量使用微導(dǎo)管進(jìn)行超選擇栓塞,使用時(shí)要無(wú)菌操作。將瓶蓋開(kāi)封,靜置沉淀后,用注射器將瓶中保養(yǎng)液(即固化液)抽掉加等量的生理鹽水沖洗微球三遍或?qū)⑵恐斜pB(yǎng)液(即固化液)抽掉加等量生理鹽水,連同生理鹽水及微球倒入無(wú)菌碗內(nèi),用50~60ml生理鹽水沖洗微球一遍棄掉沖洗液,再加入適量或稀釋后的造影劑混均(使微球充分懸浮于造影劑中),透視下經(jīng)導(dǎo)管視具體情況緩慢或緩慢多次注入(切忌過(guò)量栓塞),直到造影劑流速明顯減慢時(shí),即完成栓塞。再次行動(dòng)脈造影判定栓塞效果。
如果含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的海藻酸鈉微球血管栓塞劑是粉末狀顆粒,則先將保存在密閉容器中干球溶于在生理鹽水中溶脹(濕球),再加入適量或稀釋后的造影劑混合均勻(使微球充分懸浮于造影劑中),再在影像設(shè)備監(jiān)視下通過(guò)導(dǎo)管超選擇性栓塞在病變部位的血管內(nèi)緩慢或緩慢多次注入(切忌過(guò)量栓塞),直到造影劑流速明顯減慢時(shí),即完成栓塞。再次行動(dòng)脈造影判定栓塞效果。
本發(fā)明的海藻酸鈉藥物載體為天然提取物,是從天然植物褐藻中提取的β-D-甘露醇和α-L-古羅糖混合組成的多糖鈉鹽,是一種線(xiàn)性大分子,分子量50,000-100,000道爾頓,水合力強(qiáng),溶于水可形成粘稠膠體,在鈣離子作用下產(chǎn)生大分子鏈間交聯(lián)固化,可根據(jù)臨床需要加工成不同大小規(guī)格圓形或類(lèi)圓形的固態(tài)微球。此種微球具有良好的生物相容性,在生物機(jī)體內(nèi),鈣離子漸漸析出,微球以分子脫鏈的形式在3-6個(gè)月內(nèi)無(wú)毒降解。降解時(shí)不產(chǎn)生碎屑,并可造成靶器官血管的永久性栓塞(當(dāng)栓塞劑在血管內(nèi)長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月之久時(shí),病人血管內(nèi)的血栓形成而達(dá)到永久性栓塞的目的),而達(dá)到治療的目的。明膠也基本上起同樣的作用。
實(shí)際操作中,用這種“生物多功能微球”栓塞材料通過(guò)物理堵塞腫瘤或治療部位周?chē)男?dòng)脈血管,造成相應(yīng)的血管閉鎖,切斷對(duì)該部位組織的血供與營(yíng)養(yǎng),導(dǎo)致其因缺血缺氧而萎縮和壞死。同時(shí)也可通過(guò)減少靶器官的血供,為手術(shù)治療創(chuàng)造有利條件。將此種微球作為加入腫瘤治療用藥的載體,定時(shí)、定位、定向地對(duì)局部病灶組織緩慢釋放,從而大大提高療效,降低藥物的毒副作用,具有栓塞與藥物雙重治療作用。
本發(fā)明根據(jù)脂質(zhì)體細(xì)胞因子獨(dú)特的抗癌作用機(jī)制和臨床應(yīng)用情況,根據(jù)生物降解材料微球的半互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和可降解原理,結(jié)合以往生物降解材料微球栓塞劑應(yīng)用實(shí)際,從安全,無(wú)毒,無(wú)免疫原性,無(wú)遺傳毒性,無(wú)生殖毒性,無(wú)致癌性等方面考慮。選用生物降解材料作為載體加入抗腫瘤的靶藥,定時(shí)、定點(diǎn)、定向、定期的局部釋放靶藥,殺傷腫瘤細(xì)胞,達(dá)到治療目的。
免疫治療可清除殘余腫瘤細(xì)胞和微轉(zhuǎn)移灶,防止腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)。其中細(xì)胞因子作為免疫治療制劑中重要成分,可相互作用,誘導(dǎo)多種因子參與免疫網(wǎng)絡(luò)中調(diào)節(jié)。且局部給藥可使藥物直接分布于癌組織,在腫瘤局部維持高濃度,激活效應(yīng)細(xì)胞的功能,抗腫瘤作用更強(qiáng);區(qū)域免疫治療可克服腫瘤引起的免疫抑制;(3)使機(jī)體更容易產(chǎn)生對(duì)腫瘤抗原的免疫記憶和免疫應(yīng)答;(4)全身副作用減少,使用安全。
應(yīng)用可產(chǎn)生協(xié)同或增加效應(yīng),即具有化療和放療增敏作用,且多種細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用比單一使用更有效發(fā)揮作用。因此,區(qū)域免疫化療治療,既可減輕化療產(chǎn)生的免疫抑制作用,又可發(fā)生免疫及相互協(xié)同作用,結(jié)果降低化療的副作用,增強(qiáng)宿主的耐受力,又利于改善腫瘤的區(qū)域控制率,減少局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率。
經(jīng)動(dòng)脈進(jìn)行腫瘤局部免疫治療,具有重要的臨床意義。但目前尚缺乏細(xì)胞因子微球與抗腫瘤藥物微球,并聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行腫瘤的局部免疫化學(xué)治療。因此,本發(fā)明利用海藻酸鈉或明膠制備含脂質(zhì)體包裹的細(xì)胞因子的微粒,注入靶器官后可逐步定時(shí)釋放靶藥,用于腫瘤的局部免疫化學(xué)治療,可發(fā)揮對(duì)腫瘤的動(dòng)脈栓塞治療,化學(xué)治療和免疫治療多重作用,增強(qiáng)療效,減少?gòu)?fù)發(fā),尤其對(duì)肝癌,腎癌等。
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明,但不意味著對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
具體實(shí)施例方式
IL-2脂質(zhì)體細(xì)胞因子的制備1.材料與方法(逆相蒸發(fā)法)膜材大豆卵磷脂(SYPC)∶膽固醇=1∶1(摩爾比)有機(jī)相用乙醚配制。
水相IL-2 0.1M PBS.有機(jī)相∶水相=3∶1將膜材溶于乙醚30毫升中,加入IL-2溶液,冰浴間隙超聲震蕩2-3分鐘(0.5分鐘,間隙0.5分鐘),使成均勻的乳狀液,在20-25度旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚,得到白色均勻的脂質(zhì)體懸液。
2.包封率測(cè)定將制備的脂質(zhì)體懸液經(jīng)高速低溫離心(30000G,60分鐘4度)后吸收上清,沉淀用PBS沖洗,再離心,重復(fù)2次,將離心的下層脂質(zhì)體加入乙醚使其水相與脂相分離,按Lorry氏法測(cè)定出水相中IL-2的濃度,求得包封率。包封率為34.5+1.12%。此法共重復(fù)5次回收率試驗(yàn),回收率平均為95%。(分別采用紫外分光光度計(jì)法,BCA蛋白濃度測(cè)定法及Lowry法測(cè)定原液中蛋白濃度)。
3.電鏡觀察將脂質(zhì)體稀釋到一定倍數(shù)后,將其放置于銅網(wǎng)上,用濾紙片吸干,放置10分鐘,然后用5%磷鎢酸負(fù)染數(shù)分鐘,取出自然干燥后,進(jìn)行電鏡觀察。
制備的IL-2脂質(zhì)體呈懸浮液體,經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后,電鏡下多數(shù)脂質(zhì)體為大單層脂質(zhì)體,直徑在0.2μm。
4.穩(wěn)定性試驗(yàn)取脂質(zhì)體測(cè)其當(dāng)日包封量,然后保存于4℃,分別于2,4,6個(gè)月時(shí)取樣離心,測(cè)其包封量,再取1毫升脂質(zhì)體稀釋1倍保存于4℃,于4個(gè)月后時(shí)測(cè)定其包封量,然后計(jì)算滲漏率。
通過(guò)測(cè)定滲漏率發(fā)現(xiàn),未稀釋的脂質(zhì)體樣本在4℃保存6個(gè)月,其滲漏率無(wú)明顯變化,稀釋1倍后在4℃保存4個(gè)月,滲漏率明顯增加(23%)5.活性測(cè)定(ConA誘導(dǎo)T細(xì)胞微量測(cè)定法)(1).加包載的IL-2脂質(zhì)體于RPMI-1640培養(yǎng)CTLL的細(xì)胞培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞,250G,10分鐘,洗去殘存的IL-2。用1%臺(tái)盤(pán)藍(lán)染色法計(jì)數(shù)細(xì)胞,并決定細(xì)胞活力。用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞至1×105/ml,.96孔板中加0.1ml倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)IL-2或待測(cè)的樣品,每個(gè)稀釋度3個(gè)孔,8-10個(gè)稀釋度,陰性對(duì)照不加PBS。每孔加0.1ml的細(xì)胞懸浮液,在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí),每孔加10ul(1.85×104Bq)[H3]脫氧胸苷,繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。用多頭細(xì)胞收集器將細(xì)胞收集到玻璃纖維濾紙上,用3%的醋酸水溶液洗滌濾紙3次,洗去游離的[H3]脫氧胸苷。將濾紙放置液體閃爍瓶中,加入5ml閃爍液。在液體閃爍儀上進(jìn)行同位數(shù)活性計(jì)數(shù)。根據(jù)CPM值對(duì)樣品進(jìn)行作圖,計(jì)算待測(cè)樣品的IL-2濃度。
(2)取C57BL/6小鼠脾,研磨碎配成5×105個(gè)/ml單細(xì)胞懸液,加入ConA5ug/ml,置于在37℃ 5%CO2培養(yǎng)40-48小時(shí)。將培養(yǎng)液置于淋巴細(xì)胞分層液上,1700r/min,離心15min,取界面層細(xì)胞,將上述反應(yīng)反應(yīng)細(xì)胞配成1×105個(gè)/ml濃度的懸液。取96孔板中分成3組(空白組,對(duì)照組,待測(cè)組),每組10孔,每孔加0.1ml細(xì)胞懸液,空白組加同體積PBS,對(duì)照組每孔加0.1ml倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)IL-2,待測(cè)組每孔加0.1ml的IL-2脂質(zhì)體(IL-2 100單位)。37℃ 5%CO2培養(yǎng)40-48小時(shí),用多頭細(xì)胞收集器將細(xì)胞收集,液體閃爍儀上進(jìn)行同位數(shù)活性計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示空白組為3411+358,對(duì)照組16540+1987,待測(cè)組21003+1812。包裹的IL-2脂質(zhì)體較未包裹有提高。
二.IFN脂質(zhì)體細(xì)胞因子的制備1材料與方法卵磷脂(SYPC)∶膽固醇=2∶1(摩爾比),有機(jī)相用氯仿。水相IFN-α0.1MPBS。
2制備方法(逆相蒸發(fā)法)卵磷脂40mg,膽固醇20mg,,溶于氯仿4毫升,40度,水浴,100-150rpm,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿,加入乙醚4毫升中,并加入IFN-α溶液(0.5毫升PBS)中與之混合,二者經(jīng)超聲進(jìn)行乳化冰浴間隙超聲震蕩2-3分鐘(0.5分鐘,間隙0.5分鐘),使成均勻的乳狀液,在40度旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)100-150rpm除去乙醚,得到白色均勻的脂質(zhì)體懸液。最后通過(guò)凝膠柱層析方法除去未包的藥物。
3.粒徑測(cè)定取新制備的脂質(zhì)體IFN-α,NS稀釋?zhuān)瑢⑵浞胖糜阢~網(wǎng)上,用濾紙片吸干,放置10分鐘,然后用5%磷鎢酸負(fù)染數(shù)分鐘,取出自然干燥后,進(jìn)行電鏡觀察及粒徑測(cè)定。
4.包封率測(cè)定將制備的脂質(zhì)體懸液經(jīng)高速低溫離心(30000G,60分鐘4度)后吸收上清,沉淀用PBS沖洗,再離心,重復(fù)2次,將離心的下層脂質(zhì)體加入乙醚使其水相與脂相分離,按Lorry氏法測(cè)定出水相中IL-2的濃度,求得包封率。包封率為34.5+1.12%。此法共重復(fù)5次回收率試驗(yàn),回收率平均為95%。
5.穩(wěn)定性試驗(yàn)取脂質(zhì)體測(cè)其當(dāng)日包封量,然后保存于4℃,分別于2,4,6個(gè)月時(shí)取樣離心,測(cè)其包封量,再取1毫升脂質(zhì)體稀釋1倍保存于4℃,于4個(gè)月后時(shí)測(cè)定其包封量,然后計(jì)算滲漏率。
通過(guò)測(cè)定滲漏率發(fā)現(xiàn),未稀釋的脂質(zhì)體樣本在4℃保存6個(gè)月,其滲漏率無(wú)明顯變化,稀釋1倍后在4℃保存4個(gè)月,滲漏率明顯增加(23%)6.活性測(cè)定(以細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)效應(yīng)為基礎(chǔ)的結(jié)晶紫染色測(cè)定方法)用含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)液按1∶200稀釋VDV,并接種于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的單層Wish細(xì)胞中進(jìn)行增殖,孵育至細(xì)胞病變達(dá)75-100%時(shí)凍存于-20度以下,次日反復(fù)凍融2-3次,收集毒種存于液氮中。VSV的效價(jià)的滴定以24小時(shí)時(shí)微量板孔中半數(shù)出現(xiàn)細(xì)胞病變的現(xiàn)象的稀釋度為1個(gè)TCID50,此稀釋度的倒數(shù)乘以10倍作為病毒效價(jià)(TCID50/ml).微量CPE測(cè)定法中國(guó)生物制品規(guī)程中要求采用Wish細(xì)胞/VSV體系測(cè)定,根據(jù)干擾素對(duì)Wish細(xì)胞的保護(hù)性,即細(xì)胞病變程度按5級(jí)打分法記錄不同濃度時(shí)的保護(hù)性,用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(LOT03/94)為參考標(biāo)定其IU值。
結(jié)晶紫染色測(cè)定方法將生長(zhǎng)良好的單層Wish細(xì)胞用含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)液配細(xì)胞濃度約為5×105個(gè)/ml懸液,加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,100ul/孔,同時(shí)設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)照,體積與樣品相同,在含5%CO2,37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí),每孔加入4倍梯次稀釋于干擾素樣品100ul/孔,樣品稀釋用含7%小牛血清的MEM培養(yǎng)液,37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí),棄上清后用含3%小牛血清的MEM培養(yǎng)稀釋的VSV病毒(100TCID50/ml)攻擊,然后于5%CO2,37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。棄培養(yǎng)上清液,每孔加40ul的結(jié)晶紫染色液室溫30分鐘,棄染液,用蒸餾水沖洗殘余的染液,用濾紙吸干后每孔加入100ul的脫色液脫色,在SPECTRA 250型的自動(dòng)酶標(biāo)儀器于570nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的OD值。分別以干擾素-α國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品效價(jià)值在自動(dòng)酶標(biāo)儀上計(jì)算樣品的效價(jià)值。
三.海藻酸鈉包載細(xì)胞因子脂質(zhì)體微球制備
1.材料與方法2.包封率3.穩(wěn)定性4.釋放量四、肝癌模型建立及應(yīng)用(1)驗(yàn)對(duì)象純種、清潔新兩蘭大白兔50只(由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),雌雄不均,3~4月齡,體質(zhì)量2~3kg。
(2)實(shí)驗(yàn)材料皮下Vx2移植瘤種兔由北京醫(yī)科大學(xué)超聲生物工程研究所提供。bcl2、bax免疫組化染色試劑盒購(gòu)自博士德公司,VEGF免疫組化染色試劑盒購(gòu)自Neo Marker公司。DAB顯色試劑盒、粘片劑購(gòu)自邁新公司。肝動(dòng)脈插管購(gòu)自BD公司。
(3)實(shí)驗(yàn)方法將靠近Vx2移植瘤種兔腫塊邊緣生長(zhǎng)旺盛的魚(yú)肉樣組織切成1~2mm3瘤塊,將腫瘤塊植入肝左前葉內(nèi)。兩周后肝臟上形成一直徑約1cm浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的腫瘤。肝臟移植瘤術(shù)后的第2周末,在肝動(dòng)脈根部穿刺置管并固定。數(shù)字表法隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均分成5組(每組10只動(dòng)物)陰性對(duì)照組(生理鹽水)、陽(yáng)性對(duì)照組(順鉑1.28mg·kg-1·d-1)、實(shí)驗(yàn)組1(As2O3 0.6mg·kg-1·d-1)、實(shí)驗(yàn)組2(As2O3 1.2mg·kg-1·d-1)、實(shí)驗(yàn)組3(As2O3 1.96mg·kg-1·d-1)。每天經(jīng)肝動(dòng)脈插管灌注實(shí)驗(yàn)用藥,連續(xù)治療7d。肝臟移植瘤術(shù)后第5周末后,切取鄰近(15cm)腫瘤相同部位正常肝組織和全部肝癌組織。稱(chēng)瘤重,取腫瘤及肝組織光鏡、電鏡標(biāo)本各1份。
(4)觀察指標(biāo)陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的腫瘤重量及其平均瘤重抑制率平均瘤重抑制率=(1-給藥組的平均瘤重陰性對(duì)照組的平均瘤重)×100%。
透射電鏡觀察瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞的細(xì)胞體積、核形態(tài)及核染色質(zhì)變化。
檢測(cè)bcl2bax基因表達(dá)及VEGF表達(dá)其中染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)bcl2bax基因表達(dá)以胞漿或和胞膜著色呈棕黃色的瘤細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為(-),5%~15%為(+),15%~50%為(++),>50%為(+++)。VEGF表達(dá)為新生毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及部分腫瘤細(xì)胞胞漿和或胞膜著色呈棕色為陽(yáng)性細(xì)胞。染色明顯者為VEGF陽(yáng)性,染色弱或不染色為VEGF陰性。
(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示,用SAS 8.1統(tǒng)計(jì)軟件行q檢驗(yàn)、Fisher′s精確檢驗(yàn)。免疫化療微球經(jīng)動(dòng)脈栓塞進(jìn)行荷人宮頸癌的裸鼠的治療。
五、建立小鼠U14宮頸癌移植瘤模型將U14宮頸癌細(xì)胞稀釋成7×106個(gè)/ml,將平均體重18-22g的NIH小鼠34只小鼠右前肢腋窩區(qū)消毒后,皮下注射上述瘤細(xì)胞懸液0.1ml/只(細(xì)胞數(shù)7×105個(gè)/只)。生長(zhǎng)3-4周后,將移植腫瘤取下,切成1mm×1mm×1mm大小的瘤塊,再次接種于小鼠的肝左葉被膜下。
2.荷人宮頸癌的裸鼠的治療瘤塊注藥接種10天后,再次取原切口,在手術(shù)顯微鏡下測(cè)種植瘤結(jié)節(jié)的最大經(jīng)和最小經(jīng),并行肝動(dòng)脈插管注藥。其中動(dòng)物隨機(jī)分為A生理鹽水組;B IL-2組;C IL-2脂質(zhì)體組;D單純化療組;E IL-2+化療組;F IL-2脂質(zhì)體組+化療組。
2周后每組取6只,再次測(cè)量種植瘤結(jié)節(jié)的最大經(jīng)和最小經(jīng),計(jì)算腫瘤體積,比較腫瘤生長(zhǎng)率。(其中腫瘤體積生長(zhǎng)率為治療后體積除以治療前體積),行HE染色觀察腫瘤壞死程度(輕0-30%,中30-70%,重71-100%)及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況,治療后荷瘤大鼠自然存活時(shí)間。
六.大鼠肝癌動(dòng)脈栓塞a)大鼠移植瘤肝癌模型建立取接種Walker-256瘤細(xì)胞3-5天后Wistar大鼠癌性腹水0.5-1ml,無(wú)均條件下注射至健康大鼠皮下,7-10天可以長(zhǎng)直徑約1-2cm腫瘤,切取新鮮魚(yú)肉樣瘤組織剪成1m3組織塊,接種到大鼠肝左外葉,1周后復(fù)制成直徑為0.5-1cm的肝癌模型。取肝癌模型大鼠30只。用PE-50管在手術(shù)顯微鏡下經(jīng)胃十二指腸動(dòng)脈逆行插入肝固有動(dòng)脈注入栓塞劑,進(jìn)行肝動(dòng)脈栓塞,注藥的同時(shí)暫時(shí)阻斷肝總動(dòng)脈及肝右動(dòng)脈。注藥結(jié)束后結(jié)束后胃十二腸動(dòng)脈,關(guān)腹,歸籠飼養(yǎng)。
b)肝動(dòng)脈栓塞治療將動(dòng)物隨機(jī)分為A生理鹽水組;B IL-2組;C IL-2脂質(zhì)體組;D單純化療組;E IL-2+化療組;F IL-2脂質(zhì)體組+化療組。
權(quán)利要求
1.一種含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞劑,其特征在于包括藥物載體和脂質(zhì)體細(xì)胞因子,所述藥物載體包裹所述脂質(zhì)體細(xì)胞因子。
2.按權(quán)利要求1所述的含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞劑,其特征在于所述藥物載體為海藻酸鈉或明膠。
3.按權(quán)利要求1所述的含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞劑,其特征在于所述脂質(zhì)體細(xì)胞因子為脂質(zhì)體包裹所述細(xì)胞因子。
4.按權(quán)利要求1所述的含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞劑,其特征在于所述脂質(zhì)體是磷脂膽堿或牛腦中的磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇或二棕櫚酰-DL-α-磷脂酰膽堿。
5.按權(quán)利要求1所述的含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞劑,其特征在于所述細(xì)胞因子為白介素-2,干擾素或腫瘤壞死因子。
6.按權(quán)利要求1所述的含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞劑,其特征在于所述藥物載體與所述脂質(zhì)體細(xì)胞因子的重量比為1∶1~90∶1。
7.按權(quán)利要求1所述的含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞劑,其特征在于所述含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞劑是儲(chǔ)存在二價(jià)金屬陽(yáng)離子固化液當(dāng)中的微膠珠或微球。
8.按權(quán)利要求1所述的含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞劑,其特征在于所述儲(chǔ)存在二價(jià)金屬陽(yáng)離子溶液中的微膠珠或微球的粒徑范圍為50~1000μm。
9.一種含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的海藻酸鈉微球血管栓塞劑的制備方法,其步驟如下(1)將脂質(zhì)體細(xì)胞因子按比例稱(chēng)重,用溶劑溶解;得脂質(zhì)體細(xì)胞因子溶液;(2)將海藻酸鈉按比例稱(chēng)重,溶解,得海藻酸鈉溶液;(3)將氯化鈣或氯化鋇稱(chēng)重,配制成1~10%濃度的溶液,得固化液;(4)將所得脂質(zhì)體細(xì)胞因子溶液和海藻酸鈉溶液混合,并通過(guò)高壓靜電微球液滴發(fā)生裝置與所述固化液混合固化成圓形或類(lèi)圓形的微球或微膠珠,得含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的海藻酸鈉微球血管栓塞劑。
10.按權(quán)利要求9所述的含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞劑的制備方法,其特征在于所述高壓靜電微球液滴發(fā)生裝置包括一靜電發(fā)生裝置,所述靜電發(fā)生裝置上有正負(fù)兩極,正極與微量注射裝置的針頭相連,負(fù)極與浸在所述固化液中的不銹鋼鋼絲相連接,注射裝置內(nèi)裝有脂質(zhì)體細(xì)胞因子和海藻酸鈉溶液,滴入所述固化液中形成微球。
11.按權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的含脂質(zhì)體細(xì)胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞劑在制備治療荷人肝癌,宮頸癌等動(dòng)物體內(nèi)或用于晚期或復(fù)發(fā)肝癌,腎癌,膀胱癌,結(jié)直腸癌等各種惡性腫瘤的藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了含免疫細(xì)胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞劑及其制備和應(yīng)用。其主要技術(shù)特征是利用從天然植物海藻酸中提取的、具有良好生物降解特性和生物相容性的多聚糖鈉鹽或明膠,包被采用脂質(zhì)體包裹的免疫細(xì)胞因子如白介素-2,腫瘤壞死因子,干擾素等,制成50μm-75μm,75μm-150μm,100μm-200μm,200μm-300μm,200μm-450μm,100μm-300μm,300μm-500μm,500μm-700μm,700μm-900μm,等不同的脂質(zhì)體細(xì)胞因子微球。用于荷人肝癌、宮頸癌等動(dòng)物體內(nèi)或用于晚期或復(fù)發(fā)肝癌,腎癌,膀胱癌,結(jié)直腸癌等各種惡性腫瘤的動(dòng)脈栓塞和局部靶向免疫化學(xué)治療。
文檔編號(hào)A61K38/20GK1876177SQ20051007492
公開(kāi)日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2005年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月6日
發(fā)明者李小平, 崔恒, 魏麗惠, 馮捷, 洪宏, 李新建, 齊憲榮 申請(qǐng)人:北京圣醫(yī)耀科技發(fā)展有限責(zé)任公司