專利名稱：牛膝多糖硫酸酯的抗艾滋病和免疫調(diào)節(jié)新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及牛膝多糖硫酸酯在抗艾滋病病毒性疾病和免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
艾滋病自1981年發(fā)現(xiàn)以來，在全球范圍迅速蔓延成為人類嚴(yán)重的災(zāi)難。目前世界上雖有抗HIV的藥物20種，其中包括11種逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、8種蛋白酶抑制劑和1種融合抑制劑，應(yīng)用高效抗逆轉(zhuǎn)錄聯(lián)合療法，對艾滋病病人可成功地降低血漿病毒載量，升高CD4細(xì)胞，重建免疫功能，延長生命，但尚不能治愈病人，控制流行。由于病毒產(chǎn)生耐藥性和毒副作用，一些藥物對艾滋病人逐漸失效。聯(lián)合治療中增加免疫藥物如白介素2和干擾素等，可以增強(qiáng)療效，但毒性也增加，影響了效果。有些傳統(tǒng)中藥有免疫調(diào)節(jié)作用，在臨床試用可提高艾滋病人免疫功能，改善癥狀。但中藥多為復(fù)方或單味中藥制劑，成份復(fù)雜，至今尚未批準(zhǔn)上市。
早在20世紀(jì)80年代艾滋病病毒發(fā)現(xiàn)以來，不少學(xué)者注意到硫酸多糖對多種有膜病毒包括單純皰疹病毒(HSV)和艾滋病病毒(HIV)等有廣譜抗病毒作用。有關(guān)不少動、植物和微生物以及化學(xué)合成的硫酸多糖類物質(zhì)具有抗艾滋病、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，已有專利和文獻(xiàn)報導(dǎo)。如動物來源的肝素(heparin)，化學(xué)合成的硫酸化右旋糖苷(Sulfated dextran)，海藻來源的硫酸多糖角叉菜膠(Carrageenans)，真菌來源的香菇多糖和植物來源的硫酸酯化松塔多糖等數(shù)十種均有抑制艾滋病病毒的作用。1987年德國Bayer和Hoechst研制了木聚糖硫酸酯(Hoe/Bay946)，日本研制了Curdlan suldate CRDS，美國研制了DS2等免疫調(diào)節(jié)藥物，在臨床試驗治療艾滋病患者，取得了一定的療效。2004年中國青島海洋研究院研制的抗艾滋病病毒海藻多糖911，在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抑制艾滋病病毒，對猴艾滋病病毒感染猴也有效，2002年批準(zhǔn)進(jìn)入臨床I期實驗。但是，迄今為止未見牛膝多糖硫酸酯抗艾滋病病毒、免疫調(diào)節(jié)的有關(guān)報道和專利。
牛膝多糖是從中藥材牛膝(Achyranthes bidentata Blum)中分離的小分子多糖(分子量1476KDa)，毒性小，有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫和升白血球作用，但無抗病毒作用。中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)所先后于1988年、1993年申請專利，并分別于1992年、1999年授權(quán)，專利號88105524.7和93112588.X。本發(fā)明涉及的牛膝多糖硫酸酯(S-AbPS)，是中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所田庚元教授等對牛膝多糖(Abps)磺化后制成的，其結(jié)構(gòu)式如(I)所示 其中R＝SO3Na，R’＝R或 其中R＝SO3Na，MW＝3414KDa，含硫量約 為21.26％。
n＝1→9，含硫量為4-21％。其主要成份是由9糖組成的果聚糖硫酸酯，結(jié)構(gòu)式如(II)所示。
因其水溶性好，穩(wěn)定，具有抗單純皰疹病毒1型、柯薩奇病毒和乙型肝炎病毒等作用，于1999申請專利，2002授權(quán)，專利號99113444.3。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所1999年研究發(fā)現(xiàn)，牛膝多糖硫酸酯(S-AbPS)具有抗艾滋病病毒作用，對HIV-1復(fù)制酶有廣譜抑制作用不但抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶，也抑制整合酶和蛋白酶；在人淋巴細(xì)胞MT-4培養(yǎng)內(nèi)抑制細(xì)胞病變(MTT法)；在人外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)(PBMC)抑制HIV的P24抗原；對小鼠毒性小，口服后血清有升高抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，腹腔注射可升高淋巴細(xì)胞；對艾滋病病毒、皰疹病毒、柯薩奇病毒或乙型肝炎病毒等機(jī)會性感染以及腫瘤等疾病可提高治療效果，有望發(fā)展成為具廣泛用途的新型藥物。
本發(fā)明的目的在于提供牛膝多糖硫酸酯在抗艾滋病等病毒、提高免疫功能或消毒劑中的新用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明對牛膝多糖硫酸酯(S-AbPS)藥理活性和作用機(jī)制進(jìn)行了系列的實驗研究。研究結(jié)果表明S-AbPS能多途徑抑制艾滋病病毒感染和復(fù)制，抗HIV活性穩(wěn)定，口服和腹腔注射后鼠血清有抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，腹腔注射后能調(diào)節(jié)小鼠的免疫功能。
本發(fā)明的優(yōu)點與積極效果在于，所說的牛膝多糖硫酸酯(S-AbPS)具有多靶點多途徑抑制艾滋病病毒感染和復(fù)制的活性，若制備成藥物，與現(xiàn)有治療艾滋病的聯(lián)合療法有異曲同功之妙，且毒性低，抗病毒活性穩(wěn)定，同時還具有免疫調(diào)節(jié)活性，既可用于治療艾滋病病毒感染，也可用于預(yù)防艾滋病病毒感染，還可用以制備防治艾滋病病毒感染的消毒劑。
具體實施方案以下所舉的實施例，對本發(fā)明而言只是說明性的，而非限制性的。
實施例1S-AbPS對HIV-1整合酶(HIV-1IN)、逆轉(zhuǎn)錄酶(HIV-IRT)和蛋白酶(HIV-1PR)的抑制活性1.ELISA檢測方法測定藥物抑制HIV-1 IN的活性將供體底物包被試驗板，洗板后加入反應(yīng)緩沖液、不同濃度藥液和標(biāo)定濃度的基因工程HIV整合酶，37℃反應(yīng)1小時。加入靶底物，混合，37℃反應(yīng)1小時，洗板。加入BSA(牛血清蛋白)，室溫30分鐘，洗板。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素，室溫反應(yīng)1小時，洗板。加顯色底物顯色30分鐘，加0.1N NaOH終止顯色反應(yīng)。酶標(biāo)儀405nm測定OD值。同時設(shè)酶對照和空白對照，計算IC50，測定結(jié)果見表1。
2.3H標(biāo)記檢測方法測定藥物抑制HIV-1RT活性將標(biāo)定濃度的基因工程HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶(p66/51)、不同濃度的藥液、反應(yīng)緩沖液和3H-dTTP加入后，混合，37℃反應(yīng)30分鐘，0℃終止反應(yīng)。反應(yīng)液滴加于濾紙片上，冷三氯乙酸洗3次，乙醇脫水后烤干。液閃儀測定cpm值，同時設(shè)酶對照、空白對照和藥物對照，計算IC50活性，測定結(jié)果見表1。
3.ELISA檢測方法測定藥物抑制HIV-1PR活性微孔板加入反應(yīng)緩沖液和底物，加入適量基因工程HIV蛋白酶及不同濃度藥液，混勻，37℃反應(yīng)60分鐘。加DMSO終止反應(yīng)。加入碘乙酸鈉，混勻，37℃反應(yīng)45分鐘。加入Dig-NHS，混勻，37℃反應(yīng)50分鐘。加入甘氨酸中斷反應(yīng)。加入鏈親和素標(biāo)記的96孔板中，同時加入反應(yīng)緩沖液，混勻，室溫反應(yīng)60分鐘，將底物結(jié)合到酶標(biāo)板上，洗板。加阻斷劑室溫阻斷50分鐘。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體Fab片段，室溫1小時，洗板。加入底物pNPP顯色，酶標(biāo)儀405nm測OD值。同時設(shè)酶對照、空白對照和陽性藥對照，計算IC50?；钚詼y定結(jié)果見表1。
4.結(jié)果S-AbPS抑制HIV-1IN、HIV-1RT和HIV-1PR活性結(jié)果見表1。由表1可見，S-AbPS對HIV復(fù)制的三個關(guān)鍵酶即整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶均有一定的抑制作用。
表1S-AbPS抑制HIV-1IN、RT和PR活性

實施例2S-AbPS抑制HIV-1整合酶(HIV-1IN)活性的作用機(jī)制1.ELISA檢測方法測定藥物抑制HIV-1IN的總活性將供體底物包被試驗板，洗板后加入反應(yīng)緩沖液、不同濃度藥液和標(biāo)定濃度的基因工程HIV整合酶，37℃反應(yīng)1小時。加入靶底物，混合，37℃反應(yīng)1小時，洗板。加入BSA(牛血清蛋白)，室溫30分鐘，洗板。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素，室溫反應(yīng)1小時，洗板。加顯色底物顯色30分鐘，加0.1N NaOH終止顯色反應(yīng)。酶標(biāo)儀405nm測定OD值。同時設(shè)酶對照和空白對照，計算IC50，測定結(jié)果見表2。
2.抑制HIV-1IN 3′切割活性測定將包被了供體底物1的微孔板用PBS洗板2次，再用1×反應(yīng)緩沖液洗一次。分別加入2×反應(yīng)緩沖液、不同稀釋濃度藥液和基因工程HIV整合酶，混勻，37℃反應(yīng)1小時。PBS洗板，洗去未結(jié)合的酶及藥物。加入1×反應(yīng)緩沖液和靶底物，混勻，37℃水浴繼續(xù)反應(yīng)1小時。后續(xù)步驟同上，測定結(jié)果見表2。
3.抑制HIV-1IN鏈轉(zhuǎn)移活性測定將包被了供體底物2的微孔板用PBS洗板2次，再用1×反應(yīng)緩沖液洗一次。分別加入2×反應(yīng)緩沖液、水和基因工程HIV整合酶，混勻，37℃水浴反應(yīng)1小時。洗板，洗去未結(jié)合的酶。加入2×反應(yīng)緩沖液、水和不同濃度藥液，加入靶底物，混勻，37℃水浴繼續(xù)反應(yīng)1小時。后續(xù)步驟同上，測定結(jié)果見表2。
4.抑制HIV-1IN裝配活性測定將包被了供體底物2的微孔板用PBS洗板2次，再用1×反應(yīng)緩沖液洗一次，分別加入2×反應(yīng)緩沖液、不同濃度的藥液和基因工程HIV整合酶，混勻，37℃水浴反應(yīng)1小時。洗板，洗去未結(jié)合的酶及藥物，加入1×反應(yīng)緩沖液和靶底物，混勻，37℃水浴繼續(xù)反應(yīng)1小時。后續(xù)步驟同上，測定結(jié)果見表2。
5.結(jié)果S-AbPS抑制HIV-1IN的作用機(jī)制見表2。由表2可知，S-AbPS對HIV-1IN的三個功能都有抑制作用，對HIV-1IN活性的主要抑制活性為抑制HIV-1IN鏈轉(zhuǎn)移活性，即抑制HIV基因整合于宿主細(xì)胞染色體內(nèi)的過程。
表2S-AbPS抑制HIV-1IN的作用機(jī)制

實施例3不同時間測定的S-AbPS的抗HIV-1IN的活性實驗方法同實施例1，結(jié)果見表3。從表3可見在不同時間內(nèi)測定的同批S-AbPS的抗HIV-1IN的活性沒有明顯變化，活性穩(wěn)定。
表3不同時間測定的S-AbPS的抗HIV-1IN的活性

實施例4S-AbPS在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抗HIV-1的效果1.MTT染色法測定S-AbPS對MT-4細(xì)胞培養(yǎng)的毒性將MT-4細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，同時分別加2倍稀釋的S-AbPS共8個濃度的藥液，每個稀釋度重復(fù)3孔，設(shè)細(xì)胞對照組。置37℃、5％CO2和飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變。加藥后第7天吸棄上清100μl，每孔加10μl5mg/mlMTT染色，37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4小時，每孔加入100μl50％DMF-17％Triton X-100脫色液，37℃過夜，在酶聯(lián)儀上測定波長為570nm的OD570nm值，計算藥物半數(shù)有毒濃度(TC50)，結(jié)果見表4。
2.MTT染色法測定S-AbPS在MT-4細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對HIV-1IIIB的抑制作用將MT-4細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入HIV-1實驗室病毒株IIIB培養(yǎng)液，同時加最大無毒濃度以下稀釋的不同濃度S-AbPS或陽性對照藥AZT和NVP藥液，在37℃、5％CO2和飽和濕度下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變，于第7天吸棄上清100μl，每孔加10μl 5mg/mlMTT染色，37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4小時，每孔加入100μl 50％DMF-17％Triton X-100脫色液，37℃過夜，在酶聯(lián)儀上測定波長為570nm的OD570nm值，計算藥物半數(shù)有效濃度(EC50)，并計算治療指數(shù)(SI)，結(jié)果見表4。
3.外周血單核細(xì)胞(PBMC)的分離和培養(yǎng)取健康人新鮮靜脈血，用FiColl分離液分離人外周血單核細(xì)胞(PBMC)，以含PHA的培養(yǎng)液制備1.5×105細(xì)胞/ml懸液接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72小時。用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，配成106/ml。
4.3H-胸腺嘧啶摻入法測定S-AbPS對PBMC細(xì)胞培養(yǎng)的毒性將0.1ml的PBMC細(xì)胞及不同濃度的S-AbPS在96孔板中培養(yǎng)。4天后，用3H-胸腺嘧啶加進(jìn)每一孔，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時后收獲并檢測CPM值，計算TC50。結(jié)果見表4。
5.P24抗原測定法測定S-AbPS在PBMC細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV-1AZT耐藥株(HIV-1018c)的活性用AZT耐藥病毒株(HIV-1018c)100TCID50的病毒液感染細(xì)胞，吸附2小時。用無血清1640培養(yǎng)基洗去未吸附病毒，用培養(yǎng)液將感染病毒的細(xì)胞配成1×106/ml。種入96孔培養(yǎng)板，100μl/孔。同時分別加不同濃度的S-AbPS藥液100μl。設(shè)細(xì)胞對照和病毒感染細(xì)胞對照組組。37℃ 5％CO2培養(yǎng)第4天(96小時)，吸出上清，按試劑盒所給方法測定HIV-1P24抗原。計算藥物半數(shù)有效濃度(EC50)，并計算治療指數(shù)(SI)，結(jié)果見表4。
6.結(jié)果S-AbPS在MT-4細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)的毒性和抗HIV-1IIIB的作用效果及在PBMC細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)的毒性和抑制HIV-1018c的活性見表4。
表4S-AbPS在MT-4細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)的毒性和抗HIV-1IIIB的作用

細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)藥物試驗表明，S-AbPS在MT-4細(xì)胞培養(yǎng)有明顯的抑制HIV-1IIIB的作用，在PBMC細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)有明顯的抑制HIV-1018c的作用。
實施例5S-AbPS給藥后的鼠血清活性測定1.小鼠灌胃和腹腔注射后血清對HIV-1RT的抑制作用雄性昆明種小鼠18~20克(每組5只)，經(jīng)口服S-AbPS 1.25mmol/kg 1次，1小時后，或S-AbPS 25μmol/kg經(jīng)腹腔注射30分鐘后，眼眶取血，血清經(jīng)56℃ 30分鐘滅活并稀釋60倍后測定其抑制HIV-1RT的活性，結(jié)果見表5。
表5小鼠灌胃和腹腔注射藥物后血清抑制HIV活性

2.大鼠給藥后血清抑制HIV-1RT活性雄性SD大鼠190~210克(每組3只)，經(jīng)口服S-AbPS 1.25mmol/kg 1次，1小時后，或S-AbPS 25μmol/kg經(jīng)腹腔注射30分鐘后，眼眶取血，血清經(jīng)56℃ 30分鐘滅活并稀釋60倍后測定其抑制HIV-1RT的活性，結(jié)果見表6。
表6SD大鼠灌胃和腹腔注射藥物后血清抑制HIV活性

上述給藥后鼠血清抗HI-1RTV活性試驗顯示，S-AbPS經(jīng)口服或腹腔注射后，在大、小鼠血清中均可檢測出其抑制HIV-1的活性。
實施例6S-AbPS對小鼠免疫細(xì)胞的影響1.實驗方法選用18-20克BALB/C小鼠，實驗分5組，每組5只。腹腔注射給藥，給藥體積為0.2ml/20g。5組分別為生理鹽水對照組、環(huán)磷酰胺對照組、環(huán)磷酰胺+胸腺素陽性藥對照組、環(huán)磷酰胺+S-AbPS藥物組和S-AbPS藥物對照組。環(huán)磷酰胺第1天一次性腹腔注射80mg/kg、第7天40mg/kg加強(qiáng)一次；胸腺素500μg/kg為皮下注射，除環(huán)磷酰胺外，其它為每天1次，連續(xù)給藥12天，其中S-AbPS前7天劑量為4mg/kg，后5天改為8mg/kg。于第12天小鼠眼眶取血，EDTA-K3抗凝。標(biāo)記前先將抗凝血樣品用生理鹽水稀釋5倍。準(zhǔn)備兩組流式細(xì)胞測定管，第一組每管加入CD3、CD4、CD8熒光抗體各3μl，第二組每管加入CD3、CD19熒光抗體各3μl，然后加入100μl稀釋后的抗凝血樣品，避光標(biāo)記20分鐘。加入0.5ml Lysing Solution使紅細(xì)胞溶解，1500rpm離心5分鐘，PBS洗兩次，最后用0.4mlPBS懸浮細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀測定CD3(T細(xì)胞)，CD4，CD8以及CD19(B細(xì)胞)的相對數(shù)量。用SPSS10.0軟件進(jìn)行多因素方差分析。
2.實驗結(jié)果S-AbPS對小鼠免疫細(xì)胞的影響結(jié)果見表7。由表可見，與生理鹽水對照組小鼠各細(xì)胞百分比相比，給S-AbPS小鼠各細(xì)胞百分比沒有變化；給環(huán)磷酰胺小鼠B細(xì)胞(CD19)百分比顯著降低。與環(huán)磷酰胺組各細(xì)胞百分比相比，環(huán)磷酰胺+胸腺素小鼠CD3和CD4細(xì)胞百分顯著升高，而B細(xì)胞百分比顯著降低；環(huán)磷酰胺+S-AbPS小鼠CD3和CD4細(xì)胞百分顯著升高。由此可見S-AbPS對正常小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群百分比沒有影響，但可以增加環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的免疫低下(B細(xì)胞降低)小鼠的外周血T(CD3)細(xì)胞百分比，T細(xì)胞中CD4細(xì)胞百分比顯著增加，CD8細(xì)胞百分比不變，但對環(huán)磷酰胺降低B細(xì)胞百分比沒有逆轉(zhuǎn)作用，其結(jié)果與陽性藥胸腺素作用相同。
表7S-AbPS對小鼠外周血T、B細(xì)胞百分比的影響

權(quán)利要求
1.牛膝多糖硫酸酯在制備治療或預(yù)防艾滋病病毒感染藥物中的應(yīng)用。
2.牛膝多糖硫酸酯在制備調(diào)節(jié)免疫功能藥物中的應(yīng)用。
3.牛膝多糖硫酸酯在制備治療或預(yù)防艾滋病病毒感染消毒劑中的應(yīng)用。
4.牛膝多糖硫酸酯在制備治療或預(yù)防艾滋病病毒所致機(jī)會性感染藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牛膝多糖硫酸酯的新用途，其藥效學(xué)試驗證明，該化合物具有較好的抗艾滋病病毒和調(diào)節(jié)免疫的作用，可制備成治療或預(yù)防艾滋病病毒感染的藥物或消毒劑。
文檔編號A61K31/737GK1686159SQ20051005537
公開日2005年10月26日 申請日期2005年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月21日
發(fā)明者陳鴻珊, 田庚元, 呂剛, 彭宗根, 徐愿堅, 王學(xué)強(qiáng), 郭志敏, 張麗麗, 滕立 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所, 中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所, 浙江京新藥業(yè)股份有限公司