專利名稱：一種定向突變的基因工程巴曲酶及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因重組方法制備定向突變的巴曲酶——Batroxobin。其關(guān)鍵是巴曲酶基因的定向改造、合成、克隆、表達(dá)及產(chǎn)物的發(fā)酵表達(dá)和分離純化制備。突變的巴曲酶既可以作為止血藥的主要成份，也可以直接用作止血藥物。
背景技術(shù)：
自1963年奧地利學(xué)者Von Klobusitzky首次從巴西矛頭蝮蛇(Bothropsatrox)毒液中分離得到一種絲氨酸蛋白水解酶(類凝血酶)，也就是所說(shuō)的巴曲酶。至今已發(fā)現(xiàn)30多種蛇毒中含有類凝血酶組份，并有20多種先后得到分離和純化，它們都能作用于哺乳動(dòng)物血漿中纖維蛋白原A鏈中的Arg16-Gly17間的肽鍵，釋放出纖維蛋白肽A，從而快速地將血液中的纖維蛋原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，這些纖維蛋白就能聚集成疏松的栓子來(lái)封閉傷口，實(shí)現(xiàn)快速止血的效果。同時(shí)，在體內(nèi)它并不激活凝血因子XIII，由其水解產(chǎn)生的纖維蛋白凝塊的側(cè)鏈不能交聯(lián)，易被纖維蛋白溶酶降解，所以不會(huì)造成血液系統(tǒng)的栓塞。巴曲酶現(xiàn)已經(jīng)被成功地開發(fā)成止血藥——進(jìn)口的有立止血(Reptilase)，國(guó)產(chǎn)的有巴曲亭，在臨床上具有很好的止血效果。
成熟的巴曲酶分子是由231個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈蛋白，其氨基酸序列如下1VIGGDECDIN EHPFLAFMYY SPRYFCGMTL INQEWVLTAA51 HCNRRFMRIH LGKHAGSVAN YDEVVRYPKE KFICPNKKKN81 VITDKDIMLI RLDIPVKNSE HIAPLSTPSN PPSVGSVCRI
121 MGWGAITTSE DT PDVPHCA NINLFNNTVC REAYNGLPAK161 TLCAGVLQGG IDTCGGDSGG PLICNGQFQG ILSWGSDPCA201 EPRKPAFYTK VFDYLPWIQS 其DNA序列如下1 GTCATTGGAG GTGATGAATG TGACATAAAT GAACATCCTT TCCTTGCATT51 CATGTACTAC TCTCCCCGGT ATTTCTGTGG TATGACTTTG ATCAACCAGG101 AATGGGTGCT GACCGCTGCA CACTGTAACA GGAGATTTAT GCGCATACAC151 CTTGGTAAAC ATGCCGGAAG TGTAGCAAAT TATGATGAGG TGGTAAGATA201 CCCAAAGGAG AAGTTCATTT GTCCCAATAA GAAAAAAAAT GTCATAACGG251 ACAAGGACAT TATGTTGATC AGGCTGGACA GACCTGTCAA AAACAGTGAA301 CACATCGCGC CTCTCAGCTT GCCTTCCAAC CCTCCCAGTG TGGGCTCAGT351 TTGCCGTATT ATGGGATGGG GCGCAATCAC GACACTATC GATACGTATC401 CCGATGTCCC TCATTGTGCT AACATTAACC TGTTCAATAA TACGGTGTGT451 CGTGAAGCTT ACAATGGGTT GCCGGCGAAA ACATTGTGTG CAGGTGTCCT501 GCAAGGAGGC ATAGATACAT GTGGGGGTGA CTCTGGGGGA CCCCTCATCT551 GTAATGGACA ATTCCAGGGC ATTTTATCTT GGGGAAGTGA TCCCTGTGCC601 GAACCGCGTA AGCCTGCCTT CTACACCAAG GTCTTTGATT ATCTTCCCTG651 GATCCAGAGC ATTATTGCAG GAAATAAAAC TGCGACTTGC CCG理論計(jì)算出其分子量為25.5KD，等電點(diǎn)為7.39，國(guó)外從Bothrops atrox毒液中提取的巴曲酶，其實(shí)際分子量為42KD，這種分子量的偏差是由于糖基化修飾的緣故。從巴曲酶蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中可以發(fā)現(xiàn)，其分子內(nèi)有兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr228。此外，Bothropsatrox的其他亞種以及其他種類毒蛇的毒液中也能提取到具有巴曲酶活性的蛋白，不過其分子量從29.1KD到42KD不等，這可能是由于不同亞種之間氨基酸組成上差別或糖基化的程度不同所引起的。巴曲酶分子中有12個(gè)半胱氨酸，根據(jù)已知的絲氨酸蛋白酶類分子的研究結(jié)果，推測(cè)這12個(gè)半胱氨酸可能有Cys7-Cys139、Cys26-Cys42、Cys74-Cys230、Cys118-Cys184、Cys150-Cys168、Cys174-Cys199六個(gè)分子內(nèi)二硫鍵的形成(Itoh n.et al.The J.of BiologicalChemistry，262，3132，1987)。
考慮到從巴西進(jìn)口蛇毒原料成本較高，同時(shí)，巴西矛頭蝮蛇也是稀有的保護(hù)蛇種，蛇毒產(chǎn)量也有限，因此，我們?cè)O(shè)想采用基因工程的方法大量生產(chǎn)重組巴曲酶，以滿足研究和臨床應(yīng)用的需要。
巴曲酶蛋白雖然只有一條肽鏈，但是由于分子內(nèi)二硫鍵多，還有糖基化修飾等，所以采用基因工程手段生產(chǎn)這種蛋白有很大的技術(shù)難度。這也應(yīng)該是一直沒有重組產(chǎn)品問世的主要原因之一。
雖然研究者對(duì)天然巴曲酶的性質(zhì)有比較多的了解，但是，對(duì)其分子生物學(xué)方面的研究一直進(jìn)展緩慢，直到1987、1988年才由日本的研究者完成對(duì)巴曲酶基因的cDNA和基因組DNA測(cè)序工作(Nobuyuki Itoh etalJ.Biol.Chem.262(7)3132-3135，1987；J.Biol.Chem.，2637628-7631，1988)。Maeda M等采用基因重組方法，在E.coli中，采用融合表達(dá)系統(tǒng)，以包涵體(Inclusion Body)的形式表達(dá)出該成份，據(jù)報(bào)道得到了所謂有生物學(xué)活性巴曲酶(Maeda M.etal，J Biochem(Tokyo)，109(4)632-637，1991)，而且還為此申請(qǐng)了專利(Pat，No.JP2124092，1990)。但到目前為止，還沒有重組巴曲酶用于動(dòng)物試驗(yàn)和臨床研究工作的相關(guān)研究報(bào)導(dǎo)。
在E.coli中表達(dá)某些蛋白已經(jīng)是較為常規(guī)的生產(chǎn)藥用蛋白的基本手段，但是在對(duì)蛇毒類凝血酶實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)，在E.coli中表達(dá)蛇毒類凝血酶的量很少。潘華等采用RT-PCR法擴(kuò)增出蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒類凝血酶基因Pallas，以表達(dá)載體pET-24a(+)構(gòu)建T-7啟動(dòng)子控制下的表達(dá)質(zhì)粒pET-Pallas，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，并用0.4mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡分析表明有生物活性的Pallas表達(dá)(潘華等，蝮蛇類凝血酶基因的分析及表達(dá)研究，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1999，31，79)。Fan等采用PCR法擴(kuò)增出蝮蛇(Agkistrodon acutus)的蛇毒類凝血酶基因Acutin，克隆到表達(dá)載體pET-24a，在E.coli BL21DE(3)中表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡分析表明有生物活性的Acutin表達(dá)(Fan C.Y.等，Biochemistry and Molecular Biology International，1999，47，217)。但它們的表達(dá)效率普遍較低，沒有實(shí)際生產(chǎn)價(jià)值。
楊青等報(bào)道了用甲醇酵母表達(dá)Gussurobin，獲得每升發(fā)酵液產(chǎn)10mg有活性的Gussurobin(楊青等，Biotechnology Letters，2002，24，135)；Weon-KyooYou等報(bào)道了用甲醇酵母表達(dá)Batroxobin，獲得了每升發(fā)酵液產(chǎn)13.16mg有活性的Batroxobin(Weon-Kyoo You等，F(xiàn)EBS Letters，2004，571，67)。
上海萬(wàn)興生物制藥有限公司申請(qǐng)了基因工程表達(dá)Batroxobin的專利(公開號(hào)CN1534093A，2004)，在大腸桿菌和甲醇酵母中均獲得表達(dá)，但在大腸桿菌中表達(dá)的Batroxobin均為無(wú)活性蛋白。在甲醇酵母中獲得一定量Batroxobin的表達(dá)，產(chǎn)量達(dá)每毫升發(fā)酵液20克氏單位(20KU/ml)，這一產(chǎn)量已初步具備生產(chǎn)意義。上述研究結(jié)果表明利用基因工程方法生產(chǎn)蛇毒類凝血酶是可行的，但要用真核表達(dá)系統(tǒng)。到目前為止，Batroxobin的基因工程產(chǎn)品還沒有被開發(fā)成功。
采用基因工程的手段生產(chǎn)富含多對(duì)二硫鍵的蛋白一直是一個(gè)技術(shù)難題，尤其是生產(chǎn)有六對(duì)二硫鍵的絲氨酸蛋白水解酶。這是因?yàn)槎蜴I配對(duì)錯(cuò)誤率很高，在原核中得到的幾乎全是包涵體，雖然對(duì)包涵體的變性復(fù)性能得到少量的有活性的目的蛋白，但是其成本決定了不具備實(shí)際生產(chǎn)意義。真核表達(dá)系統(tǒng)(酵母、CHO和昆蟲細(xì)胞等)能保證較高的二硫鍵配對(duì)正確率。另外，蛇毒類凝血酶分子中有不同含量的糖基化，原核細(xì)胞不能對(duì)所表達(dá)的外原蛋白進(jìn)行糖基化，而糖基對(duì)蛋白的空間結(jié)構(gòu)和酶活性都起穩(wěn)定作用。因此空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜、有糖鏈的蛋白本身就不適合用原核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。而真核表達(dá)系統(tǒng)除能保證較高的二硫鍵配對(duì)正確率外，還能對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行一定程度的糖基化，雖然糖基化的含量和種類與蛇毒中類凝血酶分子所含的糖基不同，但也很好地保證了表達(dá)產(chǎn)物的活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種定向突變的基因工程巴曲酶，它能夠通過以分泌表達(dá)的方式大量生產(chǎn)獲得，同時(shí)具有較高的生物活性。
本發(fā)明提供了一種定向突變的基因工程巴曲酶，能使含抗凝劑的動(dòng)物血漿凝固，其特征在于所述定向突變的基因工程巴曲酶氨基酸序列相對(duì)于天然的巴曲酶氨基酸序列的C-末端刪除了十個(gè)氨基酸，同時(shí)第133位的Tyr突變?yōu)镚lu，具體為1VIGGDECDIN EHPFLAFMYY SPRYFCGMTL INQEWVLTAA51 HCNRRFMRIH LGKHAGSVAN YDEVVRYPKE KFICPNKKKN81 VITDKDIMLI RLDIPVKNSE HIAPLSLPSN PPSVGSVCRI121 MGWGAITTSE DT PDVPHCA NINLFNNTVC REAYNGLPAK161 TLCAGVLQGG IDTCGGDSGG PLICNGQFQG ILSWGSDPCA201 EPRKPAFYTK VFDYLPWIQS I本發(fā)明具有生物活性的定向突變的基因工程巴曲酶，可以通過將人工合成的定向突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因在酵母菌中，或者在CHO細(xì)胞或其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，以分泌表達(dá)的方式大量產(chǎn)生獲得。
優(yōu)選地，本發(fā)明定向突變的基因工程巴曲酶可以通過甲醇酵母菌以分泌表達(dá)的方式大量產(chǎn)生獲得。
在甲醇酵母菌中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)時(shí)，可以依據(jù)巴曲酶的天然氨基酸序列，選擇甲醇酵母菌比較偏好的密碼子，人工合成定向突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因序列，再將人工合成的定向突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因插入到甲醇酵母菌表達(dá)載體pPIC9K和pPICZα中。
其中人工合成定向突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因序列最好為1 GTTATTGGTG GTGATGAATG TGATATTAAC GAACATCCAT TTTTGGCTTT51 TATGTACTAC TCTCCAAGAT ACTTTTGTGG TATGACTTTG ATTAACCAAG101 AATGGGTTTT GACTGCTGCT CATTGTAACA GAAGATTTAT GAGAATTCAT151 TTGGGTAAGC ATGCTGGTTC TGTTGCTAAC TACGATGAAG TTGTTAGATA201 CCCAAAGGAA AAGTTTATTT GTCCAAACAA GAAGAAGAAC GTTATTACTG251 ATAAGGATAT TATGTTGATT AGATTGGATA GACCAGTTAA GAACTCTGAA301 CATATTGCTC CATTGTCTTT GCCATCTAAC CCACCATCTG TTGGTTCTGT351 TTGTAGAATT ATGGGTTGGG GTGCTATTAC TACTTCTGAA GATACTGAAC401 CAGATGTTCC ACATTGTGCT AACATTAACT TGTTTAACAA CACTGTTTGT451 AGAGAAGCTT ACAACGGTTT GCCAGCTAAG ACTTTGTGTG CTGGTGTTTT501 GCAAGGTGGT ATTGATACTT GTGGTGGTGA TTCTGGTGGT CCATTGATTT551 GTAACGGTCA ATTTCAAGGT ATTTTGTCTT GGGGTTCTGA TCCATGTGCT601 GAACCAAGAA AGCCAGCTTT TTACACTAAG GTTTTTGATT ACTTGCCATG651 GATTCAATCT ATT在甲醇酵母菌中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)時(shí)，可以利用酵母菌的α-信號(hào)肽，PHO1信號(hào)肽，或者利用巴曲酶的天然信號(hào)肽將巴曲酶移出細(xì)胞，其中在信號(hào)肽序列與巴曲酶蛋白序列之間插入KEX2蛋白酶識(shí)別序列。
本發(fā)明定向突變的基因工程巴曲酶，可作為止血藥的主要成份，也可以直接作為止血藥之用。
本發(fā)明對(duì)巴曲酶進(jìn)行定向改造。TSV-PA是Trimeresurus stejnegeri蛇毒中含有的單鏈凝血酶原激活劑，它是一種絲氨酸蛋白酶，功能、結(jié)構(gòu)、氨基酸序列均與蛇毒類凝血酶相似(61-73％)，而且在同類蛋白中，TSV-PA是唯一有三維結(jié)構(gòu)分析的蛋白。根據(jù)巴曲酶的結(jié)構(gòu)類似蛋白TSV-PA和底物—纖維蛋白原的空間結(jié)構(gòu)對(duì)巴曲酶進(jìn)行定向改造。用Modeller 8v1軟件包進(jìn)行巴曲酶的三維結(jié)構(gòu)的同源模建，在同源模建的過程中，用TSV-PA的1.65的x衍射結(jié)構(gòu)用作巴曲酶的三維結(jié)構(gòu)模型的模板，首先把結(jié)構(gòu)保守區(qū)(SCRs)的蛋白質(zhì)主鏈坐標(biāo)由模板蛋白質(zhì)復(fù)制到目標(biāo)蛋白質(zhì)上，然后再添加氨基酸側(cè)鏈；非結(jié)構(gòu)保守區(qū)(Loops)的空間坐標(biāo)需要進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，根據(jù)搜索結(jié)果的RMS(root-mean-square)值進(jìn)行選擇，然后將選定的搜索得到的片段的坐標(biāo)復(fù)制給目標(biāo)蛋白質(zhì)；然后把模建得到的初級(jí)模型用Gromacs3.21程序在溶劑化條件下，進(jìn)行常溫1ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，每隔0.2ps收集一個(gè)構(gòu)象。得到的優(yōu)勢(shì)構(gòu)象再依次用最陡下降法300步及共扼梯度法進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，直至RMS達(dá)到10-6kcal mol-1-1；最后，模型的精確性和有效性用PROCHEK程序運(yùn)行評(píng)估。根據(jù)上述運(yùn)算結(jié)果和美國(guó)Genebank中公開的巴曲酶(X12747)的核酸序列，定向刪除巴曲酶C末端的十個(gè)氨基酸外，還對(duì)酶活中心位點(diǎn)的第133位的Tyr突變?yōu)镚lu，增強(qiáng)活性中心的負(fù)電勢(shì)區(qū)域的負(fù)電勢(shì)，進(jìn)而增強(qiáng)酶與底物結(jié)合時(shí)的靜電相互作用。其它的核酸序列按酵母菌喜好的遺傳密碼子，人工合成巴曲酶的定向改造的結(jié)構(gòu)基因序列，除定向突變外均為同義突變，即并沒改變氨基酸種類。
本發(fā)明定向突變的意義就在于，通過定向突變，增強(qiáng)活性中心的負(fù)電勢(shì)區(qū)域的負(fù)電勢(shì)，進(jìn)而增強(qiáng)酶與底物結(jié)合時(shí)的靜電相互作用，提高巴曲酶與底物的親和力，從而提高酶活效率。在國(guó)內(nèi)外還未見對(duì)巴曲酶進(jìn)行定向改造的研究報(bào)道。
將人工合成定向改造的巴曲酶的結(jié)構(gòu)基因插入到酵母菌表達(dá)載體pPIC9K和pPICZα中，在酵母菌中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。確定了酵母菌發(fā)酵表達(dá)條件，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到了高活性的基因工程巴曲酶。結(jié)果表明，基因工程巴曲酶較天然巴曲酶的比活性提高了一倍多。產(chǎn)率達(dá)16mg/L發(fā)酵液。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1根據(jù)美國(guó)Genebank中公開的巴曲酶(X12747)的核酸序列，選擇酵母菌喜好的遺傳密碼子，人工合成巴曲酶的定向改造的結(jié)構(gòu)基因序列，定向刪除巴曲酶C末端的十個(gè)氨基酸外，還對(duì)酶活中心位點(diǎn)的第133位的Tyr突變?yōu)镚lu，增強(qiáng)活性中心的負(fù)電勢(shì)區(qū)域的負(fù)電勢(shì)，進(jìn)而增強(qiáng)酶與底物結(jié)合時(shí)的靜電相互作用。為使合成的目的基因插入到酵母菌分泌型表達(dá)載體pPIC9K和pPICZα中，在基因的5′端添加Xho I酶切位點(diǎn)、基因的3′端添加終止密碼子TAATGA及Not I酶切位點(diǎn)。另外，在Xho I酶切位點(diǎn)與巴曲酶蛋白N-端第一個(gè)氨基酸Val密碼子之間加入KEX2蛋白酶識(shí)別序列Lys-Arg對(duì)應(yīng)的密碼子AAAAGA，這就確保目的蛋白在分泌到發(fā)酵液中時(shí)能夠順利地切除α-信號(hào)肽。
將合成的目的基因及pPIC9K和pPICZα載體經(jīng)Xho I和Not I雙酶切，電泳、回收，將目的基因分別插入到pPIC9K和pPICZα中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10F’中，分別進(jìn)行篩選。1、轉(zhuǎn)化有pPIC9K的大腸桿菌Top10F’在LB+Amp250ug/ml的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單菌落，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，Xho I-Not I雙酶切檢測(cè)或進(jìn)行α-factor priming和3’AOX1priming PCR檢測(cè)，說(shuō)明pPIC9K中含有目的基因，可以用來(lái)轉(zhuǎn)化Pichiapastoris GS115(his4)或KM71(arg4 his4aoxl::ARG4)宿主菌。2、轉(zhuǎn)化有pPICZα的大腸桿菌Top10F’在LB+25ug/mg Zeocin的平板上的進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單菌落，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，Xho I-Not I雙酶切檢測(cè)或進(jìn)行α-factor priming和3’AOX1 priming PCR檢測(cè)，說(shuō)明pPICZα中含有目的基因，可以用來(lái)轉(zhuǎn)化Pichia pastoris X-33或GS115His+宿主菌。
實(shí)施例2用DNA限制性內(nèi)切酶SacI將pPIC9K-Bg線性化，按照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit Version F中的方法制備酵母宿主感受態(tài)并進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞鋪在RDB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，30℃培養(yǎng)，4-6天后可出現(xiàn)單菌落。在加有不同濃度Geneticin的YPD平板上檢測(cè)重組到酵母基因組中的拷貝數(shù)數(shù)量YPD+Geneticin(0-0.25mg/ml)用于檢測(cè)含有一個(gè)拷貝數(shù)的宿主菌；YPD+Geneticin(0.5-4mg/ml)用于檢測(cè)含有二個(gè)以上拷貝的宿主菌。30℃培養(yǎng)，2-5天后可出現(xiàn)單菌落，挑取單菌落劃線培養(yǎng)，保存菌種。
用DNA限制性內(nèi)切酶SacI將pPICZa-Bg線性化，按照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit Version B中的方法制備酵母宿主感受態(tài)并進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞鋪在YPD+500ug/ml Zeocin培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，30℃下放置3-4天可出現(xiàn)單菌落。挑選菌落大而飽滿的克隆進(jìn)行表達(dá)篩選。
實(shí)施例3
用在試管中篩選出的高表達(dá)的工程菌，接種到搖瓶中增殖作為種子液，再轉(zhuǎn)接至30L發(fā)酵罐，按甲醇酵母發(fā)酵的常規(guī)方法進(jìn)行中試規(guī)模的發(fā)酵。誘導(dǎo)50小時(shí)。將發(fā)酵液離心收集上清，或超濾濃縮脫鹽，采用疏水柱層析、離子交換柱層析、，親和柱層析、凝膠柱層析等生化分離技術(shù)，得到純度達(dá)97％以上的活性蛋白。
實(shí)施例4種子液在2L酵母氮原基礎(chǔ)培養(yǎng)基中30℃發(fā)酵24小時(shí)后轉(zhuǎn)到40L發(fā)酵液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)基H3PO4，27ml/L；CaSO4·2H2O，0.9g/L；K2SO418g/L；MgSO4·7H2O，15g/L；KOH，4.13g/L；甘油40g/L；4.4ml/L微量礦物質(zhì)溶液。
在發(fā)酵過程中，用12.5％(w/v)的NH4OH調(diào)pH值，使其維持在5.0。30℃通氧劇烈攪拌(1000rpm)發(fā)酵，添加消泡劑。發(fā)酵20小時(shí)后，加入含12ml/L微量礦物質(zhì)的50％甘油，溶氧濃度為40％，繼續(xù)培養(yǎng)10小時(shí)。當(dāng)碳原饑餓30分鐘后，加入甲醇誘導(dǎo)。剛開始的5小時(shí)加入甲醇的速率低，不提供氧量，以使酵母適應(yīng)甲醇，100％甲醇含12ml/L微量礦物質(zhì)溶液，其溶氧量在40％以上。繼續(xù)發(fā)酵72小時(shí)。
實(shí)施例5發(fā)酵液離心，收集上清液，加入(NH4)2SO4使其濃度達(dá)到2M，然后加到phenyl-Sepharose層析柱上，用(NH4)2SO4從2-0mol/L進(jìn)行梯度洗脫，收集活性峰，然后上親和柱benzamidine-SepharoseCL-6B，50mMTris/HCL，pH 8.2，洗脫液含0.5M NaCL，收集活性峰。接著上Sephadex G-50，流動(dòng)相50mMTris/HCL，pH8.2，含0.5M NaCL，收集活性峰。最后，Sephadex G-25脫鹽，收集活性峰。凍干，存于-20℃。SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度達(dá)97％以上。送樣品測(cè)定氨基酸序列，結(jié)果同理論設(shè)計(jì)的完全一致。見突變后的batroxobin氨基酸序列。
實(shí)施例6發(fā)酵液離心，收集上清液，用65％固體(NH4)2SO4使活性蛋白鹽析低溫過夜，離心，收集沉淀，溶于50mmol/L Tris-HCL，pH8.2，并透析，離心，取上清上親和柱benzamidine-SepharoseCL-4B，用含0.5mol/L NaCL的上述緩沖液進(jìn)行洗脫，收集活性峰。用50mmol/L Tris-HCL，pH8.2緩沖液稀釋，上陰離子交換柱Mono Q，用含0.5mol/L NaCL上述緩沖液進(jìn)行洗脫，收集活性峰，最后，上用相同緩沖液平衡好的Sephacryl S-200柱，收集活性峰。SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度達(dá)97％以上。凍干，存于-20℃。
實(shí)施例7采用同類產(chǎn)品活性的測(cè)定方法進(jìn)行體外凝血試驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)方法為取人一枸櫞酸抗凝血漿0.2ml，加入直徑1cm的試管中，置37℃水浴中保溫3分鐘，加入37℃預(yù)熱的樣品溶液0.2ml，立即混勻計(jì)時(shí)，于40秒開始，檢查血漿凝固情況，記錄初凝時(shí)間，同時(shí)測(cè)定3管，3管初凝時(shí)間誤差應(yīng)小于20秒。若初凝時(shí)間小于40秒，則適當(dāng)稀釋供試品溶液，記錄60±20秒內(nèi)凝固的供試品溶液濃度，在上述條件下，能使0.2ml人—枸櫞酸抗凝血漿在60秒凝固的酶量，定義為一個(gè)單位。
稱取天然巴曲酶和基因工程巴曲酶各0.1mg，溶于10ml水中，進(jìn)行適當(dāng)稀釋，按上述方法測(cè)定活性，陽(yáng)性對(duì)照為立止血(1單位)，結(jié)果見表1。
表1巴曲酶體外凝血活性測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，重組巴曲酶的比活性比天然巴曲酶比活性提高近一倍。
權(quán)利要求
1.一種定向突變的基因工程巴曲酶，能使含抗凝劑的動(dòng)物血漿凝固，其特征在于所述定向突變的基因工程巴曲酶氨基酸序列相對(duì)于天然的巴曲酶氨基酸序列的C-末端刪除了十個(gè)氨基酸，同時(shí)第133位的Tyr突變?yōu)镚lu，具體為1VIGGDECDIN EHPFLAFMYY SPRYFCGMTL INQEWVLTAA51 HCNRRFMRIH LGKHAGSVAN YDEVVRYPKE KFICPNKKKN81 VITDKDIMLI RLDIPVKNSE HIAPLSLPSN PPSVGSVCRI121 MGWGAITTSE DT PDVPHCA NINLFNNTVC REAYNGLPAK161 TLCAGVLQGG IDTCGGDSGG PLICNGQFQG ILSWGSDPCA201 EPRKPAFYTK VFDYLPWIQS I
2.按照權(quán)利要求1所述定向突變的基因工程巴曲酶，其特征在于所述具有生物活性的定向突變的基因工程巴曲酶，通過將人工合成的定向突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因在酵母菌中，或者在CHO細(xì)胞或其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，以分泌表達(dá)的方式大量產(chǎn)生獲得。
3.按照權(quán)利要求2所述定向突變的基因工程巴曲酶，其特征在于所述酵母菌為甲醇酵母菌。
4.按照權(quán)利要求3所述定向突變的基因工程巴曲酶，其特征在于在甲醇酵母菌中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)時(shí)，依據(jù)巴曲酶的天然氨基酸序列，選擇甲醇酵母菌比較偏好的密碼子，人工合成定向突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因序列。
5.按照權(quán)利要求4所述定向突變的基因工程巴曲酶，其特征在于在甲醇酵母菌中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)時(shí)，將人工合成的定向突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因插入到甲醇酵母菌表達(dá)載體pPIC9K或pPICZα中。
6.按照權(quán)利要求4或5所述定向突變的基因工程巴曲酶，其特征在于所述人工合成定向突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因序列為1GTTATTGGTG GTGATGAATG TGATATTAAC GAACATCCAT TTTTGGCTTT51 TATGTACTAC TCTCCAAGAT ACTTTTGTGG TATGACTTTG ATTAACCAAG101 AATGGGTTTT GACTGCTGCT CATTGTAACA GAAGATTTAT GAGAATTCAT151 TTGGGTAAGC ATGCTGGTTC TGTTGCTAAC TACGATGAAG TTGTTAGATA201 CCCAAAGGAA AAGTTTATTT GTCCAAACAA GAAGAAGAAC GTTATTACTG251 ATAAGGATAT TATGTTGATT AGATTGGATA GACCAGTTAA GAACTCTGAA301 CATATTGCTC CATTGTCTTT GCCATCTAAC CCACCATCTG TTGGTTCTGT351 TTGTAGAATT ATGGGTTGGG GTGCTATTAC TACTTCTGAA GATACT C401 CAGATGTTCC ACATTGTGCT AACATTAACT TGTTTAACAA CACTGTTTGT451 AGAGAAGCTT ACAACGGTTT GCCAGCTAAG ACTTTGTGTG CTGGTGTTTT501 GCAAGGTGGT ATTGATACTT GTGGTGGTGA TTCTGGTGGT CCATTGATTT551 GTAACGGTCA ATTTCAAGGT ATTTTGTCTT GGGGTTCTGA TCCATGTGCT601 GAACCAAGAA AGCCAGCTTT TTACACTAAG GTTTTTGATT ACTTGCCATG651 GATTCAATCT ATT
7.按照權(quán)利要求3所述定向突變的基因工程巴曲酶，其特征在于在甲醇酵母菌中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)時(shí)，利用酵母菌的α-信號(hào)肽，PHO1信號(hào)肽，或者利用巴曲酶的天然信號(hào)肽將巴曲酶移出細(xì)胞，其中在信號(hào)肽序列與巴曲酶蛋白序列之間插入KEX2蛋白酶識(shí)別序列。
8.權(quán)利要求1～7之一所述定向突變的基因工程巴曲酶在制造止血藥物方面的用途。
全文摘要
一種定向突變的基因工程巴曲酶，能使含抗凝劑的動(dòng)物血漿凝固，其特征在于所述定向突變的基因工程巴曲酶氨基酸序列相對(duì)于天然的巴曲酶氨基酸序列的C－末端刪除了十個(gè)氨基酸，同時(shí)第133位的Tyr突變?yōu)镚lu。本發(fā)明能夠通過以分泌表達(dá)的方式大量生產(chǎn)獲得，同時(shí)具有較高的生物活性。
文檔編號(hào)A61K38/43GK1940065SQ20051004733
公開日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2005年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月30日
發(fā)明者薛百忠, 薛雁, 王宏英, 徐梅, 沈文彧, 蘇珊 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)守正生物技術(shù)有限公司