專利名稱:巴曲酶基因的合成及其表達(dá)產(chǎn)物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)采用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的一種源于巴西矛頭蝮蛇毒液中的巴曲酶 (Batroxobin)蛋白，其關(guān)鍵是巴曲酶基因的合成、克隆、表達(dá)、定向改造以及產(chǎn)物的發(fā)酵表達(dá)與分離純化。重組表達(dá)的巴曲酶可以作為止血藥的主要成份。 背景技術(shù)：
巴曲酶(Batroxobin)最先是由奧地利維也納學(xué)者Von Klobusitzky于1936年從巴西矛頭蝮蛇(Bothrops atrox)蛇毒中分離、精制而得。它是一種單鏈糖蛋白，由17種氨基酸組成，總氨基酸數(shù)為231個(gè)，分子量39000 43000。至今，研究者從蝮蛇屬毒蛇的毒液中分離和純化出二十多種類凝血酶活性的絲氨酸蛋白酶類成份。這些絲氨酸蛋白酶類物質(zhì)特異切割哺乳動(dòng)物血漿中的纖維蛋白原，使之降解生成纖維蛋白I單體，進(jìn)而交聯(lián)聚合成難溶性纖維蛋白，促進(jìn)在出血部位的血栓形成和止血。
在克氏分離出巴曲酶后，研究者對(duì)其的理化性質(zhì)以及臨床應(yīng)用進(jìn)行了深入的研究。巴曲酶使纖維蛋白原(Fg)在Aa鏈上的Argl6-Glyl7鍵處降解，釋出纖維蛋白肽 A(FPA)而生成可溶性的纖維蛋白I單體(FIm)，在此酶的持續(xù)作用下，F(xiàn)Lii在血管破損口處聚合成纖維蛋白I多聚體(FIp)，F(xiàn)Ip能促進(jìn)血管破損處的血小板聚集、加速血小板止血栓的形成，從而促進(jìn)血管破損處的初期止血效應(yīng)。FIp在正常血管內(nèi)不會(huì)使血小板聚集，卻易被纖溶酶降解成不凝的纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)，F(xiàn)DP可迅速被體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬、代謝，因而巴曲酶的止血作用僅發(fā)生于血管破損的出血部位。瑞士素高公司開(kāi)發(fā)的立芷雪(注冊(cè)商品名R印tilase)，其主要成份為巴曲酶，經(jīng)過(guò)數(shù)十年的研究和臨床應(yīng)用，證明該藥具有很好的止血功效，適用于防治各種原因引起的出血，如外科手術(shù)出血，上消化道、肺、 腎、癌腫、肝病出血，鼻出血，視網(wǎng)膜出血，婦科出血，新生兒出血等均可使用，療效優(yōu)于傳統(tǒng)止血藥。
另外，在使用較大劑量的時(shí)候，巴曲酶通過(guò)降低血液中纖維蛋白原的濃度，改變血液流變學(xué)的降低血粘度、抑制紅細(xì)胞聚集、抑制紅細(xì)胞沉降、增強(qiáng)紅細(xì)胞的血管通透性及變形能力，使血液流動(dòng)性增強(qiáng)，防止血栓形成。由日本開(kāi)發(fā)的巴曲酶(東菱克栓酶)，在臨床降纖應(yīng)用方面顯示了較好的療效。
由深圳市健安醫(yī)藥公司總代理，瑞士素高公司生產(chǎn)的立芷雪(曾用名立止血， 注冊(cè)商品名R印tilase)，該藥為巴曲酶與少量凝血因子X(jué)激活物的混合物，其主要成份巴曲酶從巴西矛頭蛇毒液中提取，1992年被批準(zhǔn)進(jìn)入我國(guó)，1995年以INN名“巴曲酶 Batroxobin”列入我國(guó)基本藥物名錄第2版。
國(guó)內(nèi)巴曲酶產(chǎn)品主要有蓬萊諾康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的“巴曲亭”(注射用血凝酶)，與“立芷雪”的結(jié)構(gòu)和來(lái)源相同，于2001年上市銷(xiāo)售。目前，“巴曲亭”市場(chǎng)份額已占據(jù)國(guó)內(nèi)巴曲酶產(chǎn)品的頭把交椅。
成熟的巴曲酶分子是由231個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈蛋白，理論計(jì)算出其分子量為25. 5KD，等電點(diǎn)為7.39，國(guó)外從Bothrops atrox毒液中提取的巴曲酶，其實(shí)際分子量為42KD，這種分子量的偏差是由于糖基化修飾的緣故。巴曲酶蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，有兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)=Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr228 tl此夕卜，巴曲酶分子中含有 12個(gè)半胱氨酸，根據(jù)已知的絲氨酸蛋白酶類分子的研究結(jié)果，日本學(xué)者Itoh N等推測(cè)這 12 個(gè)半胱氨酸可能形成CyS7-CyS139、Cys26-Cys42, Cys74-Cys230, Cys118-Cys184, Cys150-Cys168, Cys174-Cys199六個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。
目前，已上市的巴曲酶產(chǎn)品均是從蛇毒液中提取，受到蝮蛇蛇毒液來(lái)源的限制，存在蛇毒病原微生物和神經(jīng)毒劑污染的可能性，同時(shí)存在價(jià)格過(guò)高的缺點(diǎn)，因此我們?cè)O(shè)想采用基因工程的方法大量生產(chǎn)重組巴曲酶，以滿足臨床應(yīng)用的需要，為患者減輕經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
從克氏分離出巴曲酶至今，研究者對(duì)其有了比較深入的了解，但對(duì)其生物學(xué)方面的研究進(jìn)展緩慢。日本學(xué)者Itoh N等分別在1987和1988年完成了對(duì)巴曲酶(Batroxobin) cDNA 和基因組 DNA 測(cè)序工作(Itoh N et al J Biol Chem. 1987Mar 5 ；262 (7) :3132-5 ； J Biol Chem. 1988Jun5 ；263 (16) :76沘_31)。1991 年，日本科學(xué)家 Maeda 等首次利用重組 DNA 技術(shù)，在大腸桿菌中以融合表達(dá)的方式，獲得重組巴曲酶的包涵體形式(Maeda M et al. J Biochem. 1991Apr ； 109 (4) :632-7.)。上海萬(wàn)興公司在對(duì)巴曲酶蛋白的實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論采用融合(同GST，Trx或Nus融合)或是非融合表達(dá)(N端多一個(gè)蛋氨酸)巴曲酶蛋白， 所得到的都是不溶性、無(wú)活性的包涵體，雖然表達(dá)量可以達(dá)到比較高的水平(約占菌體總蛋白的20-30% )。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入Novagen公司新推出的適合表達(dá)多二硫鍵蛋白的宿主菌AD494和Origami中也無(wú)濟(jì)于事。這種包涵體經(jīng)變性-復(fù)性過(guò)程后，得到的可溶性蛋白并沒(méi)有檢測(cè)到任何活性(上海萬(wàn)興生物制藥公司，授權(quán)公開(kāi)號(hào)CN 100335622C)。
2002年，楊青等報(bào)道長(zhǎng)白山白眉蝮蛇類凝血酶Gussruobin和Gloshedobin在畢赤酵母中獲得表達(dá)(楊青等.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào).2002，34(1) :6-10)。2004年，You W K等人采用畢赤酵母表達(dá)B. atrox. moojuni來(lái)源的巴曲酶，具有與天然巴曲酶相同的生物學(xué)活性，純化后產(chǎn)量達(dá)到 6. 95 μ g/ml (You W K et al. FEBS Lett. 2004Jul 30 ；571 (1-3) 67-73.)。2004年，上海萬(wàn)興公司黃秀東等(授權(quán)公開(kāi)號(hào)CN 100335622C)采用畢赤酵母表達(dá)B. atrox. moojuni來(lái)源的巴曲酶，純化后產(chǎn)量達(dá)到20KU/ml。2007年，李招發(fā)等采用畢赤酵母表達(dá)巴曲酶，產(chǎn)量可達(dá)10mg/L (李招發(fā)等.生物工程學(xué)報(bào)，2007 ；23 (3) :483-486)。
采用基因工程的手段來(lái)生產(chǎn)富含多對(duì)二硫鍵和糖基化修飾的蛋白一直是一個(gè)技術(shù)難題，尤其是生產(chǎn)像巴曲酶這種含有六對(duì)二硫鍵的絲氨酸蛋白酶類分子。這是因?yàn)槎蜴I錯(cuò)配率較高，在原核表達(dá)系統(tǒng)中得到的大多是包涵體形式，活性較低或幾乎沒(méi)有活性，不具備實(shí)際生產(chǎn)意義。真核表達(dá)系統(tǒng)(酵母、CHO細(xì)胞等)能保證較高的二硫鍵配對(duì)正確，對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，保證表達(dá)產(chǎn)物的生物活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種定向突變的巴曲酶與專用編碼基因，它能夠通過(guò)分泌表達(dá)的方式進(jìn)行大量生產(chǎn)，且具有較高的生物學(xué)活性。
包括以下幾個(gè)步驟
(1)巴曲酶基因的合成根據(jù)Genebank中公開(kāi)的巴西矛頭蝮蛇毒液中的巴曲酶的核酸序列(X12747)(序列表序列1，簡(jiǎn)稱SEQ-1)和氨基酸序列(序列表序列2，簡(jiǎn)稱SEQ-2)， 選擇畢赤酵母偏好的密碼子，人工合成巴曲酶的基因序列3 (序列表序列3，簡(jiǎn)稱SEQ-3)；同時(shí)，將SEQ-3中編碼的第41位的His和第178位的Ser突變?yōu)镚lu，人工合成巴曲酶基因序列4 (簡(jiǎn)稱SEQ-4)，編碼的氨基酸序列為序列表中序列5 (簡(jiǎn)稱SEQ-5)。[0017](2)表達(dá)載體的構(gòu)建在巴曲酶基因序列SEQ-3和SEQ-4的5’端加入Bio I位點(diǎn)，在Β ο I位點(diǎn)和巴曲酶基因序列間加入KEX2蛋白酶酶切位點(diǎn)Lys-Arg對(duì)應(yīng)的密碼子 AAAAGA，確保巴曲酶蛋白分泌到發(fā)酵液中時(shí)能夠切除α-信號(hào)肽，在3’端加入TGA終止密碼子以及Xba I位點(diǎn)，將DNA片段和pPICZ α A載體經(jīng)Xho I與Xba I雙酶切、電泳回收、連接，構(gòu)建表達(dá)載體pPICZ α A-bat (插入序列對(duì)應(yīng)SEQD和pPICZ α A-bat_m(插入序列對(duì)應(yīng) SEQ-4)。
(3)巴曲酶表達(dá)菌株用Sac I或BstX I線性化pPICZ α A-bat和 pPICZ α A-bat-m,電轉(zhuǎn)至X-33或GSl 15感受態(tài)中，根據(jù)hvitrogen手冊(cè)進(jìn)行單克隆的鑒定和高表達(dá)菌株的篩選。
(4)巴曲酶工程菌的發(fā)酵所述編碼基因電轉(zhuǎn)至畢赤酵母菌發(fā)酵表達(dá)的優(yōu)選方法為16L發(fā)酵罐體系中，30°C，pH4. 0_6. 0，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中用葡萄糖代替甘油發(fā)酵16-1 后，按0. 6ml/min流加20%甘油約100ml，饑餓0. 5_lh，加入IOg玉米蛋白粉或蕎麥蛋白， 按lml/min加入含有體積PTMl的甲醇誘導(dǎo)90_%h ；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為葡萄糖45g/L， K2SO417. 5g/L, MgS0414g/L, KOH 3. 2g/L, CaSO4O. 8g/L, PTMl 3ml/L。
(5)巴曲酶蛋白的表達(dá)純化發(fā)酵上清經(jīng)PALL CentramateTM超濾系統(tǒng)，膜包選擇為漲，超濾系統(tǒng)進(jìn)口壓力、出口壓力分別為10psi、5psi，流速為180ml/min。對(duì)發(fā)酵上清液采用等體積超濾，即超濾至原來(lái)體積1/4-1/5時(shí)，補(bǔ)加0. 1-0. 3M NaCl緩沖液，pH5. 0。預(yù)處理的巴曲酶上清液，先進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析(Capto S)，再經(jīng)過(guò)陰離子交換層析(Capto Q)， 最后再進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析(S^hacryl S-100)制備出巴曲酶純品。
本發(fā)明選擇畢赤酵母偏好密碼子，人工合成了巴曲酶全長(zhǎng)基因序列，將該基因構(gòu)建到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ α A上進(jìn)行分泌表達(dá)，成功的表達(dá)出具有較高生物學(xué)活性的巴西矛頭蝮蛇巴曲酶。通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程中的一系列條件，如先期基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入葡萄糖作為碳源，再補(bǔ)加甘油進(jìn)行饑餓，同時(shí)加入一定量的玉米或蕎麥蛋白，充當(dāng)酶解底物，減少巴曲酶在發(fā)酵上清中的降解。通過(guò)優(yōu)化純化參數(shù)與選擇最適的介質(zhì)材料，純化后巴曲酶產(chǎn)量達(dá)到18mg/ml，超過(guò)了其他已發(fā)表和報(bào)道的表達(dá)水平，適合規(guī)?；a(chǎn)。突變后的基因表達(dá)量未見(jiàn)提高，但比活性由1800KU/mg上升到2700KU/mg，比活提高了 50%。
巴曲酶的三維結(jié)構(gòu)模型未見(jiàn)報(bào)道，在絲氨酸蛋白酶屬種研究者通過(guò)X晶體衍射得到了蛇毒纖溶酶原激活劑(TSV-PA)的三維結(jié)構(gòu)，其功能與巴曲酶類似，一級(jí)結(jié)構(gòu)與巴曲酶相似性達(dá)到75%。在對(duì)巴曲酶氨基酸序列進(jìn)行突變改造的過(guò)程中，我們用蛋白質(zhì)同源模建在線程序SWISS-MODEL和同源模建軟件Modeller 9V6，以TSV-PA的X衍射結(jié)構(gòu)作為巴曲酶的三維結(jié)構(gòu)模型的模板，預(yù)測(cè)巴曲酶的三維結(jié)構(gòu)。在巴曲酶同源建模所得三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，依據(jù)巴曲酶底物-纖維蛋白原的空間結(jié)構(gòu)，尋找底物結(jié)合可能的活性口袋，用計(jì)算機(jī)模擬其與底物纖維蛋白原的對(duì)接，預(yù)測(cè)巴曲酶在催化反應(yīng)過(guò)程的關(guān)鍵氨基酸殘基為第41 位的 His 和第 178 位的 kr，與 Itoh N 等報(bào)道一致(ItohN et al J Biol Chem. 1987Mar 5；262(7) :3132- 。酶的活性部位是它結(jié)合底物和將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的區(qū)域，通常是整個(gè)酶分子相當(dāng)小的一部分，它是由在線性多肽鏈中可能相隔很遠(yuǎn)的氨基酸殘基形成的三維實(shí)體?；钚圆课煌ǔＴ诿傅谋砻婵障痘蛄芽p處，形成促進(jìn)底物結(jié)合的優(yōu)越的非極性環(huán)境。在活性部位，底物被多重的弱的作用力結(jié)合(靜電相互作用、氫鍵、范德華力、疏水相互作用)， 將第41位的His和第178位的Ser突變?yōu)镚lu，增強(qiáng)活性中心的負(fù)電勢(shì)區(qū)域的負(fù)電勢(shì)，進(jìn)而增強(qiáng)巴曲酶與底物纖維蛋白原結(jié)合時(shí)的靜電相互作用，提高巴曲酶與底物的親和力，從而提高巴曲酶的酶活。


圖1 巴曲酶基因重疊PCR-酶切合成示意圖
圖2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基及部分條件優(yōu)化前后，牛纖維蛋白原凝結(jié)速率(1/凝結(jié)所需時(shí)間)對(duì)比。
圖3 巴曲酶蛋白的SDS-PAGE電泳圖
M.蛋白Markeranvitrogen) ；1.轉(zhuǎn)化的空載體誘導(dǎo)；2.轉(zhuǎn)入巴曲酶基因陽(yáng)性克隆誘導(dǎo)。 具體實(shí)施方式
一、重組巴曲酶表達(dá)載體pPICZ a A_bat和pPICZ α A-bat-m的構(gòu)建
1.重組巴曲酶基因的人工合成
根據(jù)Genebank中公開(kāi)的巴西矛頭蝮蛇毒液中的巴曲酶的核酸序列(X12747)和氨基酸序列，選擇畢赤酵母偏好的密碼子，人工合成巴曲酶的全長(zhǎng)基因序列(序列表中SEQ-3 的核苷酸序列)，用蛋白質(zhì)同源模建在線程序SWISS-MODEL和同源模建軟件Modeller 9V6, 以TSV-PA的X衍射結(jié)構(gòu)作為巴曲酶的三維結(jié)構(gòu)模型的模板，預(yù)測(cè)巴曲酶的三維結(jié)構(gòu)。在巴曲酶同源建模所得三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，依據(jù)巴曲酶底物-纖維蛋白原的空間結(jié)構(gòu)，尋找底物結(jié)合可能的活性口袋，用計(jì)算機(jī)模擬其與底物纖維蛋白原的對(duì)接，預(yù)測(cè)巴曲酶酶與催化反應(yīng)過(guò)程的關(guān)鍵氨基酸殘基為第41位的His和第178位的kr，并將二者突變?yōu)镚lu，基因序列為SEQ-4。
基因序列的全合成采用重疊PCR的方法。利用DNAMAN分析序列SEQ-3和SEQ-4 的酶切位點(diǎn)，找到2個(gè)天然的酶切位點(diǎn)AclI (AA/CGTT) ,DraIII (CACNNN/GTG)將其分割為3 段，即BSl (254bp)、BS2 (187bp)、BS3 (287bp)。各大段再設(shè)計(jì)為數(shù)個(gè)60_68bp的寡核苷酸片段進(jìn)行合成，每段寡核苷酸片段相互有18_20bp的重疊堿基。對(duì)BS1、BS2、BS3分別設(shè)計(jì)一對(duì)接頭引物(引物兩端分別帶有上述的天然的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基)。BSl與BS2用AclI 酶切后連接，再用DraIII酶切與BS3連接得全長(zhǎng)基因片段(見(jiàn)圖1)。巴曲酶基因序列的 5’端帶有Β ο I位點(diǎn)和KEX2蛋白酶酶切位點(diǎn)Lys-Arg對(duì)應(yīng)的密碼子AAAAGA，3’端引物加入TGA終止密碼子以及Xba I位點(diǎn)。
在巴曲酶基因序列SEQ-3和SEQ-4的5，端添加限制性內(nèi)切酶Bio I位點(diǎn)，在Bio I位點(diǎn)和巴曲酶基因序列間加入KEX2蛋白酶酶切位點(diǎn)Lys-Arg對(duì)應(yīng)的密碼子AAAAGA，確保巴曲酶蛋白分泌到發(fā)酵液中時(shí)能夠切除α-信號(hào)肽，同時(shí)使工程菌表達(dá)的巴曲酶具有同蛇毒中提取的巴曲酶蛋白具有一樣的N-端氨基酸序列。在3’端加入TGA終止密碼子以及 Xba I位點(diǎn)，將DNA片段和pPICZ α A載體經(jīng)Bio I與)(ba I雙酶切、電泳回收、連接，構(gòu)建表達(dá)載體pPICZ α A-bat和pPICZ α A-bat-m。優(yōu)化的重組巴曲酶序列與Genebank Accession Number為X12747和其他合成的巴曲酶基因核苷酸序列均超過(guò)10%的差異。
將表達(dá)載體pPICZ α A_bat和pPICZ α A-bat-m分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌T0P10F，中，在含有25ng/ μ 1的LLB平板上進(jìn)行培養(yǎng)約16h，挑取單菌落，在含有25ng/ μ 1的LLB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，利用5’ AOXl與3’ AOXl引物進(jìn)行PCR鑒定，再提取質(zhì)粒，經(jīng)Xho I與)(ba I雙酶切出含有目的基因大小的片段，鑒定單菌落中為陽(yáng)性克隆，測(cè)序結(jié)果與目的基因序列一致。[0035]二、畢赤酵母GS115 Mab或X-33生產(chǎn)重組巴曲酶
1. pPICZa A_bat 和 pPICZ α A-bat-m 高表達(dá)菌株的篩選
將pPICZ α A-bat 和 pPICZ α A-bat-m 用 Sac I 或 BstX I 線性化，按照 hvitrogen 公司fes於elect Pichia Expression Kit中的方法制備酵母宿主菌感受態(tài)，并電轉(zhuǎn)至畢赤酵母宿主菌GSl 15 Mab或者X-33中，涂布于含有IOOng/μ 1 kocin抗生素的YPDS平板上，30°C下放置3-4天長(zhǎng)出單菌落。挑選大而飽滿的單菌落，用5’ AOXl與3’ AOXl引物進(jìn)行 PCR 鑒定。20 μ IPCR 反應(yīng)體系為5' AOXl (10 μ Μ)與 3，AOXl (10 μ Μ)引物各 0.5 μ 1， dNTP(各 2· 5Μπι)2μ 1，10*Taq buffer 2 μ 1，Taq DNA polymerase (2. 5U/ μ 1) 0. 5 μ 1, ddH20 14. 5 μ 1。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C，8min ；95°C、lmin，55°C、lmin，72°C、lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0根據(jù)hvitrogen手冊(cè)中，pPICZ α A等載體整合到酵母基因組的原理， 如果pPICZ α A-bat和pPICZ α A-bat-m插入到野生型GSl 15 Mab或者X-33自身醇氧化酶基因5，AOXl或3，AOXl中，會(huì)形成Mut+，即甲醇利用正常表型；如果pPICZ α A_bat和 pPICZ α A-bat-m替代野生型GSl 15 Mab或者X_33自身醇氧化酶基因，會(huì)形成Muts，即甲醇利用慢表型。2200bp條帶為野生型GS115 Mab或者X-33自身醇氧化酶基因的PCR產(chǎn)物，1300bp左右條帶為插入的載體的PCR產(chǎn)物，即Mut+有2200bp和1300bp左右的條帶， Muts僅有1300bp左右的條帶。
對(duì)單克隆菌株進(jìn)行蛋白表達(dá)酶活鑒定，是篩選高表達(dá)菌株最直接有效地方式。將 PCR驗(yàn)證含有pPICZ α A-bat或pPICZ α A-bat-m的陽(yáng)性克隆菌株分別在BMGY(1 % Yeast extract,2 % peptone,IOOmM potassium phosphate, pH 6.0,1.34 % YNB,4x 10-5 % biotin，4x 10-5% biotin) 30°C過(guò)夜培養(yǎng)，接種至含有50ml BMMY培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，0D600約為1-1. 2，30°C培養(yǎng)，每隔M小時(shí)，補(bǔ)加0. 75%體積的甲醇誘導(dǎo)90小時(shí)。巴曲酶上清的測(cè)活，參照從蛇毒液中提取的巴曲酶的測(cè)活方法，用加入了抗凝劑枸櫞酸鈉的人標(biāo)準(zhǔn)血漿對(duì)發(fā)酵上清中表達(dá)出的酶活性(表達(dá)量)進(jìn)行定性。因?yàn)榘颓傅淖饔玫孜餅槔w維蛋白原，可以用0.4%的牛纖維蛋白原(Tris-HCl pH7.4，0. 15M NaCl)進(jìn)行巴曲酶活性(表達(dá)量)的相對(duì)定量。具體方法為37°C下，將100μ1發(fā)酵上清加入到300μ1含 0. 4%的牛纖維蛋白原(Tris-HCl pH7. 4,0. 15MNaCl)溶液中，混勻后，觀察凝結(jié)所需要的時(shí)間。分別篩選了 500個(gè)pPICZ α A-bat或pPICZ α A-bat-m,巴曲酶活性(表達(dá)量)分別為 5mins_25mins,3mins_20minso
2.巴曲酶的發(fā)酵生產(chǎn)
因巴曲酶一級(jí)結(jié)構(gòu)中有多個(gè)堿性蛋白聚集區(qū)，畢赤酵母分泌的重組巴曲酶在發(fā)酵液上清中易發(fā)生降解。我們通過(guò)優(yōu)化了發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成份，前期以葡萄糖代替甘油，使菌株快速生長(zhǎng)約16-1 ,再用甘油進(jìn)行饑餓lh，以及在發(fā)酵過(guò)程中添加一些蛋白胨如玉米和蕎麥蛋白，但不局限于這些蛋白，充當(dāng)酶解底物，減少巴曲酶蛋白的降解。同時(shí)，在流加甲醇的過(guò)程中補(bǔ)加體積PTMl的甲醇誘導(dǎo)。與未優(yōu)化條件前相比，巴曲酶的產(chǎn)量有了較明顯的上升。
具體方法為以篩選到的含有pPICZ α A-bat-m酶活為!Bmins的陽(yáng)性克隆為例，上 16L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。種子液接種量為6%-10%，轉(zhuǎn)接至裝有10L基礎(chǔ)培養(yǎng)基(葡萄糖 45g/L, K2S0417. 5g/L,MgS0414g/L, KOH 3. 2g/L，CaSO4O. 8g/L，PTMl 3ml/L)的 16L 發(fā)酵罐中， 30°C，pH為5. 0，發(fā)酵16-1 ,待溶氧從接近0%上升到70-80%，按2ml/min加入20%甘油約100ml，饑餓30-60mins，流加含體積PTMl的甲醇lml/min誘導(dǎo)培養(yǎng)96h，中間加入約 IOg玉米蛋白粉或蕎麥蛋白，充當(dāng)酶解底物，每隔12h取發(fā)酵液測(cè)濕重和發(fā)酵上清，用0. 4% 的牛纖維蛋白原(Tris-HCl ρΗ7·4，0·15Μ NaCl)進(jìn)行巴曲酶活性(表達(dá)量)的相對(duì)定量。 具體方法為，37°C下，將100 μ 1發(fā)酵上清加入到300 μ 1含0.4%的牛纖維蛋白原(Tris-HCl ρΗ7.4，0. 15Μ NaCl)溶液中，混勻后，觀察凝結(jié)所需要的時(shí)間。
計(jì)算牛纖維蛋白原凝結(jié)速率(1/凝結(jié)所需時(shí)間)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示基礎(chǔ)培養(yǎng)基中更換碳源，補(bǔ)加甘油進(jìn)行饑餓，流加甲醇的過(guò)程中補(bǔ)加體積PTMl的甲醇誘導(dǎo)，以及在發(fā)酵過(guò)程中添加一些蛋白胨如玉米和蕎麥蛋白，在這種優(yōu)化條件下牛纖維蛋白原凝結(jié)速率最高。PTMl微量元素的流加使酵母的代謝較為旺盛，表達(dá)的巴曲酶在量和活性方面均有所提高，同時(shí)，補(bǔ)加的蛋白胨充當(dāng)了酶解底物，減少了巴曲酶蛋白的降解。以篩選到的含有pPICZaA-bat-m酶活為;3mins的陽(yáng)性克隆為例，上16L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。種子液接種量為6% -10%，轉(zhuǎn)接至裝有IOL基礎(chǔ)培養(yǎng)基(葡萄糖40g/L，K2S04 18g/L，MgS04 15g/L， K0H4. 13g/L, CaS04 0. 9g/L, PTMl 30ml)的 16L 發(fā)酵罐中，30°C，pH 為 5. 0，發(fā)酵 16_18h，待溶氧從接近0%上升到70-80%，按anl/min加入20%甘油約100ml，饑餓30_60mins，流加含體積PTMl的甲醇lml/min誘導(dǎo)培養(yǎng)96h，中間加入約IOg玉米蛋白粉或蕎麥蛋白， 0D600約為400，按所述方法測(cè)得的酶活(表達(dá)量)為20secs。
三、巴曲酶的純化與活性鑒定
0D600約為400發(fā)酵上清經(jīng)PALL CentramateTM超濾系統(tǒng)，膜包選擇為漲，超濾系統(tǒng)進(jìn)口壓力、出口壓力分別為10psi、5psi，流速為ISOml/min。對(duì)發(fā)酵上清液采用等體積超濾，即超濾至原來(lái)體積1/4-1/5時(shí)，補(bǔ)加0. 1-0. 3M Nacl緩沖液，pH5. O。預(yù)處理的巴曲酶上清液，先經(jīng)過(guò)IOmM PBS (ρΗ5. 0)平衡過(guò)的陽(yáng)離子交換層析(Capto S)，用含0. 5-1. OM的 NaCl IOmMPBS (ρΗ5. 0)梯度洗脫，收集蛋白峰。將上步收集到的活性峰稀釋調(diào)節(jié)為50mM的 Tris-HCl緩沖，pH為9. 0，再上經(jīng)過(guò)50mM的Tris-HCl (ρΗ9. 0)緩沖平衡過(guò)的陰離子交換層析(CaptoQ)，采用Tris-HCl pH9. 0-4. O梯度洗脫的方式，最后使目的蛋白在IOmMTris-HCl PH 4. 5緩沖液中，收集活性峰，最后再進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析(S^hacryl S-100)，脫鹽，收集活性峰，得到的純度達(dá)98%以上。結(jié)果表明重組巴曲酶的產(chǎn)量達(dá)到18mg/L。凍干，_70°C保存。巴曲酶蛋白的SDS-PAGE電泳圖見(jiàn)圖3 :M.蛋白Marker (Invitrogen) ；1.轉(zhuǎn)化的空載體誘導(dǎo)；2.轉(zhuǎn)入巴曲酶基因陽(yáng)性克隆誘導(dǎo)。
用含抗凝劑枸櫞酸鈉的人標(biāo)準(zhǔn)血漿進(jìn)行巴曲酶活性檢測(cè)，具體方法為37°C下，將 100 μ 1的發(fā)酵上清加入到300μ 1的含抗凝劑枸櫞酸鈉的人標(biāo)準(zhǔn)血漿中，混勻后，觀察凝結(jié)所需的時(shí)間與相同條件下巴曲酶標(biāo)準(zhǔn)品相比較。1克氏單位(κυ，1個(gè)克氏單位指在37°C的試管內(nèi)，使Iml標(biāo)準(zhǔn)人血漿在60士20秒內(nèi)凝固的立止血數(shù)量)=0.04NIH凝血酶單位= 1/4巴曲酶單位(BU) = 0. 3國(guó)際單位(IU)的凝血酶。1巴曲酶單位(BU) = 0. 17NIH凝血酶單位(NIH Unit，INIH凝血酶單位定為在觀士 1. 0°C條件下，15士0. 5秒內(nèi)凝結(jié)Iml人標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白原溶液的凝血酶量)。
用牛纖維蛋白原進(jìn)行巴曲酶活性的檢測(cè)，具體方法為，37°C下，將ΙΟΟμ 1發(fā)酵上清加入到300μ 1含0. 4%的牛纖維蛋白原(Tris-HCl ρΗ7· 4,0. 15Μ NaCl)溶液中，混勻后， 觀察凝結(jié)所需要的時(shí)間。
用鹽酸苯酰-L-精氨酰-P-硝基苯胺(L-BAPA)進(jìn)行巴曲酶定性檢測(cè)，具體方法為取發(fā)酵上清液0. anl，加人鹽酸苯酰-L-精氨酰-P-硝基苯胺(L-BAPA)溶液0. 2ml, 37°C 加熱30分鐘，溶液呈黃色。
四、氨基酸突變對(duì)巴曲酶活性的影響
重組巴曲酶表達(dá)載體pPICZ α A_bat和pPICZ α A-bat-m的構(gòu)建見(jiàn)具體實(shí)施一，區(qū)別在于pPICZ α A-bat插入的目的基因序列編碼的第41位的為His和第178位的為Ser， pPICZ α A-bat-m插入的目的基因序列編碼的第41位第178位均為Glu。兩者具體的發(fā)酵生產(chǎn)、純化與活性鑒定均見(jiàn)具體實(shí)施方式
。
采用從蛇毒中提取巴曲酶活性檢測(cè)方法進(jìn)行重組巴曲酶體外凝血試驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)方法為稱取巴曲酶標(biāo)準(zhǔn)品(英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所，NIBSC)、未突變氨基酸的基因工程巴曲酶(rBat)、突變氨基酸的基因工程巴曲酶(rBat-m)各0. lmg，溶于20ml水中，37°C下， 將100 μ 1上述配制的巴曲酶溶液加入到300 μ 1的含抗凝劑枸櫞酸鈉的人標(biāo)準(zhǔn)血漿中，每種巴曲酶溶液測(cè)定3管，混勻后，于Imin后觀察凝結(jié)所需的時(shí)間，每種巴曲酶溶液的3管初凝時(shí)間誤差應(yīng)小于20秒。若初凝時(shí)間小于40秒，則適當(dāng)稀釋發(fā)酵液上清，減少因凝結(jié)快速而帶來(lái)的誤差過(guò)高，與相同條件下巴曲酶標(biāo)準(zhǔn)品相比較。
結(jié)果見(jiàn)表1:
表1巴曲酶體外凝血活性測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種制備巴曲酶的專用基因，其序列為序列表中序列3。
2.一種制備巴曲酶的專用基因，其序列為序列表中序列4。
3.權(quán)利要求
1或2所述的基因在構(gòu)建表達(dá)菌株中的應(yīng)用，其特征在于構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)在5’端加入Bio I位點(diǎn)，在Β ο I位點(diǎn)和巴曲酶基因序列間加入KEX2蛋白酶酶切位點(diǎn) Lys-Arg,對(duì)應(yīng)的密碼子為AAAAGA，在3，端加入TGA終止密碼子以及Xba I位點(diǎn)，將DNA片段和PPICZaA載體經(jīng)B10 I與)(ba I雙酶切、電泳回收、連接、電轉(zhuǎn)至宿主菌，所述宿主菌為畢赤酵母。
4.一種發(fā)酵制備巴曲酶的方法，其特征在于將權(quán)利要求
1或2所述編碼基因按照權(quán)利要求
3所述應(yīng)用方法電轉(zhuǎn)至畢赤酵母菌中并發(fā)酵表達(dá)，發(fā)酵表達(dá)方法為16L發(fā)酵罐體系中，30°C，pH4. 0-6. 0，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中用葡萄糖代替甘油發(fā)酵16-1 后，按0. 6ml/min流加20%甘油約100ml，饑餓0. 5-lh，加入IOg玉米蛋白粉或蕎麥蛋白，按lml/min加入含有 1 %體積PTMl的甲醇誘導(dǎo)90-%h ；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為葡萄糖45g/L，K2SO4 17. 5g/L，MgSO4 14g/L, KOH 3. 2g/L, CaSO4 0. 8g/L, PTMl 3ml/L。
專利摘要
本發(fā)明是有關(guān)采用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的一種源于巴西矛頭蝮蛇毒液中的巴曲酶(Batroxobin)蛋白。該巴曲酶蛋白的編碼基因，具有下述的核苷酸序列之一1)序列表中序列3；2)序列表中序列4，具編碼的巴曲酶氨基酸序列相對(duì)于天然的巴曲酶氨基酸序列，第41位的His和第178位的Ser突變?yōu)镚lu。利用本發(fā)明優(yōu)化后的發(fā)酵與純化方法，以分泌表達(dá)的方式成功地表達(dá)出高生物活性的巴曲酶蛋白。重組表達(dá)的巴曲酶可以作為止血藥的主要成份。
文檔編號(hào)C12N9/64GKCN101705240 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200910089534
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2009年7月23日
發(fā)明者唐先兵, 張同 申請(qǐng)人:揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3),