專利名稱：一種新瓊四、六糖的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種瓊膠寡糖，特別是涉及一種新瓊四、六糖的制造方法。
一種新瓊四、六糖的制造方法，包括將瓊脂糖水解為不同大小的新瓊寡糖，并用色譜分離不同聚合度的新瓊寡糖，其特征在于所述的水解使用的瓊膠酶由大腸桿菌重組株DH5α-pET24-agaA表達(dá)。
本發(fā)明使用的瓊膠酶為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，可大量獲得，酶解產(chǎn)物85％-95％集中于聚合度為4、6的新瓊寡糖，作用時(shí)間短，條件溫和，成本低廉，適于大規(guī)模生產(chǎn)。
1 能高效表達(dá)瓊膠酶的大腸桿菌重組株DH5α-pET24-agaA的構(gòu)建根據(jù)瓊膠酶基因agaA全序列設(shè)計(jì)上游引物(5’GGAATTCCATATGAAAGGATTCACTAAG3’)和下游引物(5’CCGCTCGAGCTGGAATTTAAAACGTTG3’)，以假別單胞菌CY24的總DNA為模板，利用PCR擴(kuò)增得到瓊膠酶基因全序列。該P(yáng)CR的條件為94℃預(yù)變性3min，隨后以94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 60s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10min。瓊脂糖電泳顯示1.36kb處有一特異條帶，將其從瓊脂糖凝膠上切下回收后與將大腸桿菌表達(dá)載體pET-24a(+)連接，按照標(biāo)準(zhǔn)的氯化鈣法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli DH5α中，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子。用標(biāo)準(zhǔn)的堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)NdeI和XhoI酶切得到1.36kb和5.3kb兩個(gè)片段，分別與瓊膠酶基因agaA全長(zhǎng)片段與表達(dá)載體pET-24a(+)大小相同，證明瓊膠酶全長(zhǎng)序列已克隆到表達(dá)載體pET-24a(+)中，獲得了能高效表達(dá)瓊膠酶的大腸桿菌重組株DH5α-pET24-agaA。
2 瓊膠酶的制備挑取上述的大腸桿菌重組株DH5α-pET24-agaA單克隆接種在2ml含有濃度為30μg/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃ 200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按1∶50的體積比接種至100ml含有濃度為50μg/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃ 200r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-1.0，加入IPTG至終濃度為1mM，繼續(xù)培養(yǎng)3h，4℃ 5000×g離心30min收集上清液。于冰水浴中逐步加入飽和度為60％的固體硫酸銨粉末，并加轉(zhuǎn)子攪拌，加完后繼續(xù)攪拌1小時(shí)，于12000×g，4℃離心15min，收集沉淀用原發(fā)酵液十分之一體積的0.2M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)溶解即得瓊膠酶酶液，保存于-20℃。
3 新瓊四、六糖的制造將瓊脂糖用水配成重量百分濃度為0.1-0.5的溶膠，加入0.5％-2％(體積百分比)上述瓊膠酶酶液，于25℃-40℃溫育1-12小時(shí)，于4℃過(guò)夜后以10000×g，4℃離心10min，將上清液過(guò)孔徑為0.22μm或0.45μm微孔濾膜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后用0.2-0.5M碳酸氫氨水溶液溶解，在Bio-Gel-P2上進(jìn)行色譜分離，洗脫緩沖液為0.2-0.5M碳酸氫氨水溶液，得到不同聚合度的新瓊寡糖，經(jīng)分別脫鹽、凍干后，即為本發(fā)明的寡糖產(chǎn)品，其中新瓊四糖產(chǎn)率為30％，新瓊六糖產(chǎn)率為32％，純度均達(dá)95％以上。
權(quán)利要求
1.一種新瓊四、六糖的制造方法，包括將瓊脂糖水解為不同大小的新瓊寡糖，并用色譜分離不同聚合度的新瓊寡糖，其特征在于所述的水解使用的瓊膠酶由大腸桿菌重組株DH5α-pET24-agaA表達(dá)。
2.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征在于將所述的瓊脂糖配成0.1％-0.5％的溶膠，加入瓊膠酶酶液后于水浴中反應(yīng)。
3.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征在于所述的一瓊膠酶為轉(zhuǎn)基因瓊膠酶的初步純化產(chǎn)物，其用量為瓊脂糖溶膠體積的0.5％-2％。
4.如權(quán)利要求1所述的制造方法，所述的色譜分離以Bio-Gel-P2為填料，以碳酸氫氨為洗脫液。
5.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征是所述的酶解反應(yīng)溫度為25℃-40℃，反應(yīng)時(shí)間1-12小時(shí)。
全文摘要
一種新瓊四、六糖的制造方法，包括將瓊脂糖水解為不同大小的新瓊寡糖，并用色譜分離不同聚合度的新瓊寡糖，其特征在于所述的水解使用的瓊膠酶由大腸桿菌重組株DH5α－pET24－agaA表達(dá)。本發(fā)明使用的瓊膠酶為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，可大量獲得，酶解產(chǎn)物85％－95％集中于聚合度為4、6的新瓊寡糖，作用時(shí)間短，條件溫和，成本低廉，適于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P19/04GK1472328SQ03112579
公開(kāi)日2004年2月4日 申請(qǐng)日期2003年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月17日
發(fā)明者于文功, 李京寶, 褚艷, 韓峰, 路新枝, 宮倩紅 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)