專利名稱：來自于植物的β的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從蓮葉中制備的新型腎上腺素β3激動物質。
背景技術：
隨著生活習慣的現代化和西方化，肥胖人的比例在世界范圍內有增加的傾向。由于肥胖引起了所謂糖尿病、高血壓、動脈硬化癥的生活習慣病，使死亡率增高，因此肥胖的預防和治療是公眾衛(wèi)生上重要的課題。肥胖的治療基本上有食物療法和運動療法，但對于這些方法難以改善的病例往往采取利用藥物進行的治療。
肥胖為在脂肪細胞中積累有過剩中性脂肪(甘油三酸酯)的狀態(tài)。脂肪細胞中存在白色脂肪和褐色脂肪。白色脂肪細胞為廣泛分布于皮下、內臟周圍等全身的比較大型的細胞，細胞體的大部分被巨大的脂肪滴占據。另一方面，褐色脂肪細胞的存在部位限于肩胛間、腋下部分等，成為脂肪也分成多個小滴的多室結構，與其近鄰存在多個線粒體。白色脂肪和褐色脂肪的生理機能有很大不同，白色脂肪是儲存多余能量的場所，與此相對，褐色脂肪是通過氧化分解脂肪而將能量作為熱釋放的場所。積累于白色細胞的脂肪在能量不足時被分解而成為脂肪酸，釋放到血中并被全身消耗，但褐色脂肪通過刺激被分解為脂肪酸時，在褐色脂肪細胞內立即被氧化而變成熱(非專利文獻1/Saito M.，Sasaki N.實驗醫(yī)學Vol.14NO.16，1996)。
已知β3腎上腺素能受體與脂肪分解相關。β腎上腺素能受體分為β1、β2、β3亞型。任何一個都為由約400個氨基酸構成的7次跨膜型受體，β1、β2的氨基酸相同性僅為約50％。β1受體主要存在于心臟等中，β2受體主要存在于支氣管平滑肌等中，與此相對，β3受體除了主要存在于脂肪組織中，還存在于腸管、腦等組織中。
已知β3腎上腺素能受體激動劑(激動性物質)會促進脂肪細胞中的cAMP的積累(非專利文獻2/醫(yī)學進展Vol.192NO.52001.1.29)。β3腎上腺素能受體激動劑在促進白色脂肪細胞中的脂肪分解的同時，還活化褐色脂肪細胞。β3腎上腺素能受體的活化除了帶來熱產生的增加、褐色脂肪的活化、體脂肪的減少等減輕肥胖的效果，還產生胰島素抵抗性減輕的效果(非專利文獻3/J Clin Invest.1996 Jun 15；97(12)2898-904.，Life Sci.1994；54(7)491-8)。到目前為止，作為減肥藥和抗糖尿病藥已經開發(fā)了大日本制藥和武田藥品工業(yè)生產的“AJ-9677”等幾個β3腎上腺素能受體激動劑。
另一方面，作為蓮科多年草的蓮(Nelumbo nucifera)，除了其根可作為食用而被利用之外，種子和葉子等也被廣泛用于中藥處方和健康食品等中。已知蓮葉具有改善肥胖的效果(專利文獻1/日本特開平8-198769)，但目前還沒有關于蓮的對肥胖顯示效果的有效成分及其作用的詳細報道。
專利文獻1日本特開平8-198769非專利文獻1Saito M.，Sasaki N.實驗醫(yī)學Vol.14NO.16，1996非專利文獻2醫(yī)學進展Vol.192NO.5，2001.1.29非專利文獻3J Clin Invest.1996Jun 15；97(12)2898-904.，Life Sci.1994；54(7)491-8非專利文獻4Biochemical Pharmacology，Vol.47，No.3，pp521-529發(fā)明內容本發(fā)明鑒于此種情況而完成，其目的在于第一是明確蓮科植物的有效成分，第二是提供以該有效成分為基礎的新型物質、具體地說是提供β3腎上腺素能受體激動性物質。
為了達到上述目的，本發(fā)明人等制備蓮葉提取物，為了查明改善肥胖效果的有效成分，繼續(xù)進行了深入努力的研究，結果發(fā)現其有效成分之一為槲皮素。槲皮素為廣泛存在于植物中的黃酮類的一種，本申請發(fā)明人首次發(fā)現槲皮素存在于蓮中。作為目前關于槲皮素的知識，有報道指出由于使槲皮素作用于大鼠脂肪細胞的結果為cAMP累積，因此暗示槲皮素具有大鼠β腎上腺素能受體激動劑活性(BiochemicalPharmacology，Vol.47，No.3，pp521-529)，但并未證實其對人的β3腎上腺素能受體(β3AR)具有激動劑活性。本發(fā)明人等使槲皮素作用于人β3腎上腺素能受體表達細胞和糖尿病模型小鼠來評價其效果，結果具體發(fā)現槲皮素作為β3腎上腺素能受體激動劑發(fā)揮作用，由此可產生肥胖改善效果和抗糖尿病作用。本發(fā)明人等將含有槲皮素的蓮葉提取物投予給人糖尿病臨界型受試者，實際上確認了對人的體脂肪降低作用。即，本發(fā)明人等發(fā)現通過配合蓮葉制備物，可以開發(fā)出對肥胖改善、糖尿病改善具有效果的藥品、食品，進而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及從蓮葉中制備的新型β3腎上腺素能受體激動性物質，更詳細地說，涉及下述發(fā)明。
(1)由槲皮素構成的β3腎上腺素能受體激動性物質。
(2)上述(1)的物質，其中槲皮素來自于植物。
(3)上述(2)的物質，其中植物為蓮科。
(4)用于糖尿病治療或預防的藥劑，其含有上述(1)～(3)任一項所述的物質。
(5)用于肥胖治療或預防的藥劑，其含有上述(1)～(3)任一項所述的物質，且具有脂肪代謝改善效果。
(6)用于糖尿病治療或預防的食品，其含有上述(1)～(3)任一項所述的物質。
(7)用于肥胖的治療或預防的食品，其含有上述(1)～(3)任一項所述的物質。
(8)由含有槲皮素的蓮制備物構成的β3腎上腺素能受體激動性物質。


圖1為表示由蓮葉提取物的添加產生的在CHO-K1細胞中cAMP的積累的圖。平均值±S.D.(n＝3)圖2為表示由槲皮素產生的在CHO-K1細胞中cAMP的積累的圖。平均值±S.D.(n＝3)圖3為表示由槲皮素和Q3GA(槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷酸)產生的在CHO-K1細胞中cAMP的積累的圖。平均值±S.D.(n＝3)圖4為表示由蓮葉提取物、槲皮素產生的甘油從3T3-L1細胞的釋放量的圖。平均值±S.D.(n＝3)圖5為表示對2型糖尿病模型小鼠投予蓮葉提取物時的血糖降低作用的圖。平均值±S.D.(n＝10)圖6為表示在投予蓮葉提取物開始后第25天的2型糖尿病模型小鼠的血糖值的圖。平均值±S.D.(n＝10)圖7為表示蓮葉提取物投予組(人)和對照組(人)的葡萄糖耐量試驗的結果的圖。將相對于葡萄糖負荷前血糖值的各經過時間后的血糖值作為葡萄糖相對值(％)。平均值±S.D.S組(無效對照)n＝30，T組(蓮葉提取干燥物1g/日)n＝34，R組(蓮葉提取干燥物2g/日)n＝31。
具體實施例方式
本發(fā)明提供由槲皮素構成的β3腎上腺素能受體激動性物質。本發(fā)明以下述發(fā)現為基礎即如上所述，發(fā)現蓮葉提取物中含有槲皮素作為有效成分，并且發(fā)現該槲皮素具有β3腎上腺素能受體激動活性。
槲皮素，正式地是稱為3，3’，4’，5，7-五羥基黃酮(3，3’，4’，5，7-pentahydoroxyflavone)，CAS號為117-39-5，是廣泛存在于植物界的黃酮類的一種。其性狀為黃色微細針狀晶體、熔點為316～317℃、且含有2分子結晶水。其不溶于冷水，稍可溶于熱水，易溶于熱醇和冰醋酸，難溶于冷醇和醚。由于3位、7位或兩個部位結合有多種糖，因此可見多個糖苷，在植物中槲皮素主要以糖苷形式存在(生化學辭典(第3版)東京化學同人、化學大辭典東京化學同人)。這樣，通常槲皮素是指未被糖苷化的狀態(tài)(苷元)，但本說明書中的“槲皮素”，只要作為β3腎上腺素能受體激動性物質發(fā)揮功能，則并不僅限于上述非糖苷(3，3’，4’，5，7-五羥基黃酮)，也可以包括槲皮素糖苷。作為糖苷的例子，可列舉出槲皮素-3-葡萄糖苷酸、槲皮素-3-葡萄糖苷(異槲皮苷)、槲皮苷、槲皮黃苷、蕓香苷等。其中，槲皮素-3-葡萄糖苷酸也標記為quercetin3-O-β-D-glucuronide、Q3GA，分子量為478，熔點為182～195℃，CASNo.22688-79-5。本發(fā)明人等實際上確認了作為槲皮素糖苷的Q3GA具有β3腎上腺素能受體激動活性。這種糖苷是否具有β3腎上腺素能受體激動活性，可根據刺激β3腎上腺素能受體時細胞內的cAMP積累促進來確認。更具體地說，作為β3腎上腺素能受體激動性物質的活性，如實施例所示，在可以使β3腎上腺素能受體表達的細胞中添加被測物質，通過測定cAMP的積累來確認。cAMP活性可通過EIA法、ELISA法、RIA法等本領域技術人員周知的免疫分析進行測定。還可以使用市售的試劑盒。
另外，只要是槲皮素，則不限定來源的植物種類、植物部位，都可制成本申請發(fā)明的由槲皮素構成的β3腎上腺素能受體激動性物質。本發(fā)明是從蓮葉提取物中發(fā)現的，但只要具有β3腎上腺素能受體激動活性，則可以包括從蓮以外的植物制備的槲皮素。例如，作為含有槲皮素的植物，現在已知有洋蔥、花椰菜、茶、銀杏葉、菠菜、羽衣甘藍、歐芹、旱芹、抱子甘藍、蘆筍、蘋果、梨、番石榴葉、豆類、青椒、Jew’s mellow、柑桔、草莓等。除此以外，還包含在蓮所屬的蓮科植物、近緣的睡蓮屬、芡屬、萍蓬草屬、莼菜屬中。另外，已知在蕎麥、番茄中存在蕓香苷。因此，作為β3腎上腺素能受體激動性物質的槲皮素可從這些植物中得到。作為從植物制備槲皮素的一例，可以列舉出后述實施例所示的從蓮葉中提取槲皮素的例子。
作為用于得到槲皮素的植物部位的代表例，可以列舉出葉子，但只要是含有槲皮素的部位，則也可使用花、根、莖、果實、果皮、樹皮、根莖、塊莖、種子、柱頭、樹液、精油等其他部位。根據植物不同也可以使用不同部位。
另外，上述槲皮素可以利用本領域技術人員公知的方法從植物中有效地進行精制。例如，可將植物原樣或粉碎、切斷處理，在該植物(或植物處理物)中添加水或乙醇等溶劑進行提取，根據公知的槲皮素性狀，利用液相色譜法等本領域技術人員的技術常識，從該提取液中進行精制。作為從植物中的分離例，在Rangaswami et al.，Proc.IndianAcad.Sci.56A，239(1962)中報道了從Rhododendron cinnabarinum hook，Ericaceae中分離了槲皮素。從豆類中分離Q3GA的例子在Price KR et al.，J AgricFood Chem，46(12)，4898-4903(1998)中有所記載。另外，除了來自于植物的精制品以外，從植物以外的天然物等精制得到的物質、化學合成的物質、使用微生物進行生物學合成的物質等也可用作本申請發(fā)明的由槲皮素構成的β3腎上腺素能受體激動性物質。除了植物以外，已知槲皮素還存在于蜂膠和紅葡萄酒中。作為生物合成的例子，已知有Watkin et al，ibid.229；Grisebach，Biochem.J.85，3p(1962)；Patschke et al.，Z.Naturforsch.21b，201(1966).Synthesis；Shakhova et al.，Zh.Obshch.Khim.32，390(1962)，C.A.58，1426f(1963)。另外，Q3GA的合成例在Tetrahedron Letters，43(35)，6263-6266(2002)和Moon，Jae-Haka et al.，FreeRadical Biology & Medicine，30(11)，1274-1285(2001)中有報道。
由于槲皮苷對人、小鼠的受體的上述β3腎上腺素能受體激動活性可確認，因此可用作對這些人、包括小鼠等嚙齒類的哺乳動物的β3腎上腺素能受體的激動劑(激動性物質)。據報道β3腎上腺素能受體激動劑具有在促進白色脂肪細胞中脂肪分解促進的同時活化褐色脂肪細胞的作用、增加熱的產生、活化褐色脂肪、以減少體脂肪等為基礎的減肥、減輕胰島素抵抗性等的效果。因此，本發(fā)明的槲皮素可特別用作用于肥胖的治療或預防的藥劑、用于糖尿病的治療或預防的藥劑。另外，除此之外，也可以根據β3腎上腺素能受體激動性而用于疾病的治療。當將槲皮素用作上述β3腎上腺素能受體激動劑時，從上述植物中收集到的槲皮素可直接使用，并且在不損害作為β3腎上腺素能受體激動劑活性的范圍內，或者為了進一步有效利用該活性，還可在從植物等中收集后實施修飾。槲皮素沒有必要一定進行精制，只要含有槲皮素，就可將植物等的提取液、提取干燥物、以及將植物等制成粉末狀等的植物等制備物作為由槲皮素構成的β3腎上腺素能受體激動性物質。
本發(fā)明提供含有由槲皮素構成的β3腎上腺素能受體激動性物質且用于糖尿病治療或預防的藥劑和食品。糖尿病以胰島素作用不足導致的持續(xù)高血糖為特征，是發(fā)病與遺傳因素和環(huán)境因素相關的疾病群。其成因和病理并非單一，糖尿病根據發(fā)病原因或胰島素作用不足的程度而分類。根據發(fā)病原因分類為1型糖尿病、2型糖尿病、其他特定型和妊娠糖尿病。1型糖尿病以胰臟胰島β細胞的破壞作為發(fā)病的特征。2型糖尿病中，胰島素分泌下降和胰島素敏感性降低(胰島素抵抗性)兩者與發(fā)病有關。伴有其他疾病的類型等被分類為其他特定型。根據胰島素作用不足程度分類為胰島素依賴狀態(tài)、胰島素非依賴狀態(tài)。胰島素依賴狀態(tài)中1型占多數。胰島素非依賴型種2型占多數，并且，分類為對于高血糖改善而需要胰島素治療的狀態(tài)和不需要胰島素治療的狀態(tài)。如上所述，已知β3腎上腺素能受體的活化產生胰島素抵抗性減輕的效果，因此含有作為β3腎上腺素能受體激動性物質的槲皮素的藥劑可用于糖尿病的治療或預防。作為本發(fā)明的藥劑是有效的糖尿病，可列舉出2型糖尿病，但只要是含有由槲皮素構成的β3腎上腺素能受體激動性物質的藥劑、且以糖尿病的治療或預防為目的，則對其他型糖尿病有效的藥劑也包含在本發(fā)明中。
藥劑、食品是否對糖尿病有效，如本發(fā)明的實施例所示，可通過將藥劑投予給患有糖尿病的受試動物、并測定該受試動物的血糖值來了解。在藥劑投予組和對照組之間比較藥劑投予前后的隨時間變化的血糖值或空腹時血糖值，如果藥劑投予組的血糖值低于對照組，則該藥劑對糖尿病有效。作為受試動物，可以使用II型糖尿病自然發(fā)病模型動物(例如KK-Ay小鼠)、高脂肪食物負荷肥胖模型動物。另外，還可使用鏈脲佐菌素投予而引發(fā)的人為發(fā)病模型動物、I型糖尿病自然發(fā)病模型動物。
進而，本發(fā)明提供含有由槲皮素構成的β3腎上腺素能受體激動性物質且具有脂肪代謝改善效果的用于肥胖的治療或預防的藥劑和食品。如上所述，由于β3腎上腺素能受體激動性物質具有脂肪代謝效果，因此作為β3腎上腺素能受體激動性物質的槲皮素可用作用于人的肥胖的治療或預防的藥劑。如后述實施例所示，本發(fā)明人等實際上確認了含有槲皮素的蓮葉提取干燥物對人和小鼠具有脂肪代謝改善效果。含有槲皮素的蓮葉提取干燥物不僅對人，對于包括小鼠等嚙齒類在內的哺乳動物，作為肥胖治療或預防用藥劑和食品都是有用的。將含有槲皮素的蓮葉提取干燥物用于肥胖治療或預防來使用時，只要在可安全且有效攝取的范圍內，攝取量沒有限制。如果列舉出攝取量的例子，則在對象為人的情況下，攝取量可為0.01g/日～100g/日、優(yōu)選為0.1g/日～10g/日。如果表示為含有苷元和糖苷的槲皮素量，則優(yōu)選范圍的例子是攝取量為0.88mg/日～8.82g/日、優(yōu)選為8.82mg/日～0.88g/日。體外的脂肪代謝改善效果例如可通過在脂肪細胞中添加被測物質來測定作為脂肪分解物的甘油量進行評價。甘油量可如下得到通過甘油激酶等進行分解并最終測定吸光度，由此得到。如果由于被測物質導致細胞中甘油量增加，則可評價為被測物質存在脂肪代謝改善效果。另外，關于體內效果，對受試動物的一部分的組給予高脂肪食物和被測物質，在另一組不給予被測物質而僅給予高脂肪食物，在其他條件相同的情況下飼養(yǎng)兩動物組一定期間后，比較動物組的內臟脂肪量，由此進行評價。給予了被測物質的組的內臟脂肪量如果少于僅給予高脂肪食物的組，則可評價為被測物質存在脂肪代謝改善效果。
當將由槲皮素構成的β3腎上腺素能受體激動性物質制劑化而制成藥品時，可根據治療目的和給藥途徑等選擇劑型，例如可列舉出片劑、丸劑、散劑、液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、膠囊劑、注射劑、栓劑、西也劑、糖漿劑、浸劑和煎劑、酊劑等。并且，為了制劑化，根據需要可使用填充劑、增量劑、粘合劑、保濕劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑等稀釋劑或賦形劑。另外，在該醫(yī)藥制劑中還可以含有著色劑、保存劑、香料、調味劑、甜味劑等其他藥品。
作為含有由槲皮素構成的β3腎上腺素能受體激動性物質的食品形態(tài)，例如可列舉出茶、健康茶、健康食品、特定保健用食品、營養(yǎng)輔助食品、經腸營養(yǎng)食品等。適當添加并混合由槲皮素構成的β3腎上腺素能受體激動性物質和食品衛(wèi)生上允許的配合物、如穩(wěn)定劑、保存劑、著色劑、香料、維生素等配合物，根據常法可制成片劑、粒狀、顆粒狀、粉末狀、膠囊狀、液狀、膏狀、飲料等食品。蓮等含有槲皮素的植物可以優(yōu)選用作在制造這些藥品和食品時的含有由槲皮素構成的β3腎上腺素能受體激動性物質的原料。從植物中制備由槲皮素構成的β3腎上腺素能受體激動性物質的方法如上所述。詳細制備法的一例示于后述實施例。
另外，本發(fā)明中引用的所有現有技術文獻作為參考編入本說明書中。
實施例以下通過實施例更詳細的說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實施例的限制。
蓮葉提取物的制造法在1kg干燥蓮葉中加入10L水。將pH調整至6.0，室溫下靜置30分鐘。其后，在減壓、90℃下沸騰提取1小時。分離濾液(i)和殘渣，在殘渣中加入10倍量的水，在減壓、90℃下沸騰提取1小時。分離濾液(ii)和殘渣，合并濾液(i)和濾液(ii)。在減壓下通過加熱濃縮，濃縮至比重為1.1后，使用噴霧式干燥器得到約100g的干燥粉體。
槲皮素和槲皮素糖苷的鑒定和精制利用LC/MS分析蓮葉提取物。色譜柱使用Capcell Pak C18 UG120Φ2.0×150mm(資生堂)。流動相選擇A液(含有1％醋酸的5％乙腈水溶液)和B液(含有1％醋酸的乙腈)，在30分鐘內加以從A液到B液的直線濃度梯度，進行洗脫。反相HPLC條件為，柱溫40℃、進樣量5μL、洗脫速度200μL/min。離子化采用ESI法(陰性)進行。標準品使用市售槲皮素(和光純藥工業(yè)(株)槲皮素二水合物)、市售槲皮苷(槲皮素-3-鼠李糖苷)(東京化成工業(yè)(株))和市售異槲皮苷(槲皮素-3-葡糖苷)(EXTRASYNTHESE公司)，同樣進行分析。
RT16.4min，m/z301的峰與標準品的RT和m/z一致，因此確認在蓮葉提取物中存在槲皮素(分子量為302)。同樣，確認了在蓮葉提取物中槲皮苷(分子量為448)的存在(RT13.8min，m/z447)和異槲皮苷(分子量為464)的存在(RT12.9min，m/z463)。并且，推測RT13.2min，m/z477的峰為槲皮素-3-葡萄糖苷酸(Q3GA)(分子量為478)。
從蓮葉提取物中精制Q3GA和結構確定如下進行。
首先，使用500mL超純水(MilliQ水)溶解1g蓮葉提取物，用6N鹽酸將pH調整至3。用500mL乙酸乙酯提取3次，用無水硫酸鎂進行脫水。減壓下濃縮該乙酸乙酯層，得到酸性餾分(147mg、收率為14.7％)。接著，將上述酸性餾分分成30份、每份5mg，使用HPLC進行精制。HPLC的精制條件如下。精制用色譜柱使用Capcell Pak C18UG120Φ20×250mm(資生堂)。柱溫40℃、進樣量200μL。流動相使用含有1％醋酸的50％乙腈水溶液，以規(guī)定的洗脫速度(5mL/分)進行洗脫，在360nm下進行檢測。利用該條件得到含有Q3GA的餾分(63.1mg、收率為42.1％)。進一步使用Sephadex LH-20(Φ12×350mm、甲醇)精制上述餾分，得到推測為Q3GA的化合物(13.5mg)。
接著，利用NMR對所得化合物進行解析。測定1H-NMR、13C-NMR、DEPT、H-HCOSY、HMQC和HMBC，與文獻值(J.Agric.Food Chem.，46，pp.4898-4903(1998))比較，結果是由于測定值與Q3GA的文獻值一致，因此確認蓮葉提取物中存在Q3GA。
另外，計算如上制備的蓮葉提取干燥物中的槲皮素及其糖苷的濃度，苷元(槲皮素)及其糖苷整體為88.2mg/g。
人β3腎上腺素能受體表達重組體細胞的制作人β3腎上腺素能受體cDNA以來自于人小腸的cDNA文庫(寶酒生產)為模板、通過以如下所示的合成寡DNA為引物的PCR法來合成。
5’端寡引物ccgctagccaccatggctccgtggcctcacgagaag(序列號1)3’端寡引物ccgaattctacccgtcgagccgttggcaaag(序列號2)PCR合成的cDNA使用丙烯葡聚糖凝膠(Sephacryl)S-300脫鹽并將未反應的引物除去后，使用通過在引物設計時預先插入在末端的限制性酶位點NheI和EcoRI進行消化、進而通過SpeI和EcoRI限制性酶進行消化的動物表達遺傳媒介(vector)的pTracer-EF A(Invitrogen)和連接反應試劑盒(寶酒生產)進行連接反應。連接反應后的DNA用乙醇沉淀，混懸于適當量的10％甘油水溶液。使用該DNA溶液利用電穿孔法將大腸菌DH5α株進行轉化。操作后的細胞接種于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)一夜，得到轉化體的菌落。用Applied Biosystems公司的自動測序儀確認10個轉化體中的人β3腎上腺素能受體cDNA的堿基序列，從而選擇正確的人β3腎上腺素能受體cDNA插入至動物表達用遺傳媒介而形成的復合質粒。
上述人β3腎上腺素能受體表達用復合質粒通過利用大腸桿菌細胞的堿溶解法(Sambrook & Russell，Molecular Cloning，3rd Edition)進行提取、精制。精制的復合質粒轉染至作為中國倉鼠卵巢細胞的CHO-K1細胞中。轉染是通過使用了TransIT-LT1試劑(寶酒生產)的脂質體轉染法(lipofectin method)進行的。相對于在10cm的皿中以20～30％細胞密度增殖的細胞，加入與10μg復合質?；旌系腡ransIT-LT1，使其進入細胞中。轉染處理后，在添加了10％胎牛血清(以下略寫為FCS)的Dulbecco’s modified Eagle培養(yǎng)基(以下略寫為DMEM)(Sigma)中、37℃和5％CO2條件下培養(yǎng)細胞3天，其后換為以500μg/mL添加有Zeocin(invetrogen)的DMEM培養(yǎng)基，在同樣條件下進行培養(yǎng)。用胰蛋白酶將在Zeocin的存在下生成并形成了菌落的細胞剝離，進而用含有Zeocin和10％FCS的DMEM培養(yǎng)基使其增殖。
所得重組體細胞在96孔微板中進行培養(yǎng)，以使達到100％的細胞密度。除去培養(yǎng)基，用Dulbecco’s modified磷酸緩沖液(以下略寫為PBS)(寶酒生產)洗滌細胞一次，添加100μL含有10μM異丙腎上腺素的分析用緩沖液(DMEM、10％FCS、20mMHEPES(pH為7.2)、0.1mM異丁基甲基黃嘌呤)。此時的對照為不含異丙腎上腺素的分析用緩沖液。在37℃下培養(yǎng)20分鐘后用PBS洗滌細胞一次，供于使用了cAMP定量用EIA試劑盒(Amersham Bioscience)的細胞內cAMP的定量。其結果是選擇了通過作為β腎上腺素能受體激動劑的異丙腎上腺素的添加、細胞內cAMP量大大上升的重組體細胞。進一步培養(yǎng)所選的重組體細胞，利用胰蛋白酶剝離后用培養(yǎng)用的培養(yǎng)基稀釋，分注入96孔微板中，每孔1個細胞。進一步培養(yǎng)這些細胞，通過同樣的操作確認對異丙腎上腺素的反應性，由此進行反應性良好的重組體細胞的純化，最終得到1個人β3腎上腺素能受體表達重組體6H-4d3。
人β3腎上腺素能受體激動劑活性的測定人β3腎上腺素能受體表達重組體6H4-2d3在96孔微板中、利用含有10％FCS和500μg/mL Zeocin的DMEM培養(yǎng)基、于37℃下、5％CO2的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)2～3天，生長到約100％的細胞密度后，除去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞一次，將添加有要測定的檢體的分析用緩沖液(DMEM、10％FCS、20mMHEPES(pH為7.2)、0.1mM異丁基甲基黃嘌呤)以100μL/孔進行添加。在37℃下培養(yǎng)10分鐘后用PBS洗滌細胞一次，供于使用了cAMP定量用EIA試劑盒(Amersham Bioscience)的細胞內cAMP的定量。作為陰性對照，使用僅為分析用緩沖液、或用在分析用緩沖液中等量添加了溶解有檢體的溶劑的溶液處理過的6H4-2d3細胞；作為陽性對照，使用用異丙腎上腺素處理過的6H4-2d3細胞。另外，為了確認通過對人β3腎上腺素能受體的特異性反應是否引起了細胞內cAMP的上升，對作為6H4-2d3細胞的親本細胞的CHO-K1細胞也進行了完全相同的處理，確認了細胞內cAMP的變化。測定是對同一檢體進行3次測定，使用了平均值和標準偏差。
為了研究蓮葉提取干燥物的β3腎上腺素能受體激動劑活性，將蓮葉提取干燥物作為檢體，進行上述測定。即，以0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL的濃度在被測培養(yǎng)基中添加蓮葉提取干燥物，觀察對使人β3腎上腺素能受體表達的CHO-K1細胞和不表達的CHO-K1細胞的反應。另外，作為陽性對照，放有1μM異丙腎上腺素。其結果可知，通過蓮葉提取干燥物的添加，可見僅在使人β3腎上腺素能受體表達的CHO-K1細胞中cAMP顯著積累，表明具有β3腎上腺素能受體激動劑活性。結果示于圖1中。
另外，為了對槲皮素的人β3腎上腺素能受體激動劑活性也進行研究，將槲皮素作為檢體，同樣進行測定。以15μM、30μM、60μM的濃度在被測培養(yǎng)基中添加作為蓮葉提取干燥物主成分的槲皮素，觀察對使人β3腎上腺素能受體表達的CHO-K1細胞和不表達的CHO-K1細胞的反應。另外，作為陽性對照，放有2μM異丙腎上腺素。其結果可知，通過槲皮素的添加，可見僅在使人β3腎上腺素能受體表達的CHO-K1細胞中cAMP顯著積累，表明槲皮素具有β3腎上腺素能受體激動劑活性。結果示于圖2中。
對Q3GA也進行了關于β3腎上腺素能受體激動劑活性的研究。以1μM、10μM、100μM、1000μM的濃度在被測培養(yǎng)基中添加Q3GA，觀察對使人β3腎上腺素能受體表達的CHO-K1細胞的反應。為了比較，對槲皮素也進行了同樣操作。另外，作為陽性對照，使用了異丙腎上腺素。其結果可知，糖苷Q3GA的添加，具有與作為苷元的槲皮素同樣的β3腎上腺素能受體激動劑活性。結果示于圖3中。
使用了3T3-L1細胞的脂肪分解作用的測定將作為來自于小鼠的前體脂肪細胞的3T3-L1細胞(購自HumanScience Research Bank)以1×104/孔加入至96孔板中，在添加10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s modified Eagle培養(yǎng)基(D-MEM，GIBCO公司生產)中，在5％CO2存在下、37℃下培養(yǎng)。在細胞剛要融合前，換為添加了0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、2×10-7M地塞米松和0.8μM胰島素的含10％FCS的D-MEM，誘導向脂肪細胞的分化。2天后換為僅添加了0.8M胰島素的含10％FCS的D-MEM，之后每2～3天更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，使其向脂肪細胞分化。其后，換為含10％FCS的D-MEM培養(yǎng)2天。將在96孔板中培養(yǎng)的該細胞的培養(yǎng)液吸除，以100μL/孔添加含有被測物的含10％FCS的D-MEM，培養(yǎng)3天后，每孔各取80μL培養(yǎng)液，使用“F-試劑盒甘油”(Boehringer Mannheim公司生產)測定培養(yǎng)液中的甘油量。平均值的顯著性檢驗通過Student’s t-test進行，p＜0.05為有顯著性。
為了研究蓮葉提取干燥物和槲皮素的脂肪細胞中的脂肪分解作用，進行了上述測定。被測培養(yǎng)基中添加0.5～500μg/mL的蓮葉提取干燥物、0.5～500μM的槲皮素，作為陽性對照的10-8M～10-5M的異丙腎上腺素，蓄積在脂肪細胞3T3-L1中的脂肪被分解，測定釋放到培養(yǎng)基中的甘油量。其結果可知，加入500μg/mL的蓮葉提取干燥物、5μM～500μM的槲皮素會顯著促進脂肪分解。結果如圖4所示。
預備培養(yǎng)Wistar系雌性5周齡大鼠4天后，進行分組，以使大鼠的平均體重幾乎相同。分組為每組8只，分為以下4組一般食物攝取組、高脂肪食物組、高脂肪食物+蓮葉提取物0.01g/g攝取組(每1g高脂肪食物的蓮葉提取物為0.01g，以下相同)、高脂肪食物+蓮葉提取物0.05g/g攝取組。高脂肪食物組的飼料中添加了淀粉、蔗糖、豬油(10％)、玉米油(5％)、膽固醇(1％)。各組飼養(yǎng)2周后解剖。在解剖開始6小時前拿去飼料，使其絕食。摘出腹腔內脂肪，測定重量。每100g體重的腹腔內脂肪分別為一般食物攝取組2.2340±0.6427g、高脂肪食物攝取組3.9071±1.2562g、高脂肪食物+蓮葉提取物0.01g/g攝取組3.5564+0.8805g、高脂肪食物+蓮葉提取物0.05g/g攝取組2.7745+0.9099g。上述測定值均為平均值±S.D.。
蓮葉提取物對2型糖尿病模型小鼠KK-Ay小鼠的血糖降低作用對2型糖尿病模型小鼠雄性4周齡的KK-Ay小鼠進行3天的預備飼養(yǎng)后，根據體重以每組10只分為2組。分組后測定血糖值。溶劑對照組中飲用自來水，蓮葉提取物給水組中飲用以10mg/ml溶解有蓮葉提取干燥物的蓮葉提取物水。飲水自由攝取。另外，飼料(CRF-1)也自由攝取。每周進行血糖值的測定。血糖值的測定在6小時的絕食后進行。并且，也同時測定投予開始后第25天的非絕食下的血糖值。結果示于圖5、6。
蓮葉提取干燥物對高脂肪食物負荷肥胖小鼠的肥胖改善效果的研究8-(1)實驗材料及實驗方法對高脂肪食物負荷小鼠投予蓮葉提取干燥物作為被測物質，研究其影響。從日本CLEA株式會社購入雌性6周齡的ICR小鼠，在與試驗同樣的飼養(yǎng)環(huán)境下進行14天的檢疫和馴化飼養(yǎng)。將40只在投予開始日檢疫和馴化期間中體重增加正常、一般狀態(tài)中未見異常的動物用于試驗，通過以體重分層隨機取樣法為基準的方法進行分組。試驗組構成為下列4組，每組10只，A組基本飼料攝取組、B高脂肪食物攝取組、C組含2％蓮葉提取干燥物的高脂肪食物攝取組、D組含5％蓮葉提取干燥物的高脂肪食物攝取組。同組的小鼠每5只1個籠子，各組2個籠子進行飼養(yǎng)?；撅暳鲜褂梅勰╋暳螩E-2(日本CLEA株式會社)。關于其他飼料高脂肪食物、含蓮葉提取干燥物的高脂肪食物，示于表1。表中的數值表示制備1kg總量的混合飼料時的各混合量。
表1高脂肪食物的制備和被測物質的稱取量

所有組中，喂食方法為將飼料放在粉末喂食器中自由攝取。給水為將自來水放在給水瓶中，通過噴嘴自由攝取。在上述條件下將被測物質投予給小鼠，連續(xù)進行10周，對該小鼠進行一般狀態(tài)觀察、體重測定、攝食量測定、解剖學檢查，得到以下結果。以下結果所示的數據中，體重、攝食量和器官重量以平均±標準偏差(mean+S.D.)表示。基本飼料攝取組與高脂肪食物攝取組的顯著性差異檢驗和高脂肪食物攝取組與被測物質攝取組的顯著性差異檢驗通過Student’s t-test或多重比較檢驗(Dunnett’s test)進行。
8-(2)一般狀態(tài)觀察一般狀態(tài)觀察為1日1次對每個籠子進行。整個試驗期間中，各個體的一般癥狀中未見任何異常。
8-(3)體重體重是使用電子上皿天平，每周1次在被測物質剛要投予前和投予后進行測定。將各組的結果分別示于表2中。
表2小鼠高脂肪食物耐量試驗的體重(g)

各值表示平均±標準偏差(n＝10)。
*p＜0.05、**p＜0.01(基本飼料組vs高脂肪食物組Student’s t-test)#p＜0.05、##p＜0.01(高脂肪食物組vs高脂肪食物+蓮葉提取干燥物投予組Dunnett’s test)
為了研究高脂肪食物導致的影響，比較A組(基本飼料攝取組)和B組(高脂肪食物攝取組)，在試驗開始后兩組的體重都正常增加，但B組體重比A組體重增加較多。從試驗開始2周后至結束時，兩組的體重值有顯著性差異，試驗結束時在兩組之間產生平均為6.9g的差異(A組39.3±3.0g、B組46.2+5.6gp＜0.01)。
為了研究蓮葉提取干燥物導致的影響，比較B組和C組(含有2％蓮葉提取干燥物的高脂肪食物攝取組)、D組(含有5％蓮葉提取干燥物的高脂肪食物攝取組)，任何組在試驗開始后體重增加都正常，但C組和D組的體重增加量有少于B組的傾向。特別是在D組中，在試驗開始5、7、8和9周后的時間點與B組之間有顯著性差異，確認了蓮葉提取干燥物的體重增加抑制作用。
8-(4)攝食量攝食量在被測物質投予后1周2次、即每3天或4天進行測定。使用電子上皿天平測定每個籠子包括喂食器的重量，從喂食量中減掉剩余食量進行計算。
每個籠子求出的每只每日平均攝食量示于表3。各籠子n＝5、各組n＝10。
表3各飼養(yǎng)籠每只的平均攝食量


A組的每只每日平均攝食量為5.2～7.9g/日，B組的每只每日平均攝食量為3.0～6.8g/日，C組的每只每日平均攝食量為2.7～6.1g/日，D組的每只每日平均攝食量為3.1～5.6g/日。很明顯，A組的攝食量多于其它組。B～D組有試驗開始前半段(第二周左右)的攝食量多、后半段(第6周后)的攝食量少的傾向，但未見B～D各組的特異性變化。
8-(5)器官重量從試驗開始至10周后的觀察期間結束時，解剖小鼠，測定器官重量(肝、腎、脂肪濕重量)。結果示于表4。各組n＝10。
表4小鼠的高脂肪食物耐量試驗在試驗結束時的器官重量

各值表示平均±標準偏差。
*p＜0.05、**p＜0.01(基本飼料組vs高脂肪食物組Student’s t-test or Aspin-Welch’s t-test)#p＜0.05、##p＜0.01(高脂肪食物組vs高脂肪食物+蓮葉提取干燥物投予組Dunnett’s test)為了研究高脂肪食物導致的影響，比較A組和B組，肝臟重量未見有顯著性差異，但腎臟重量在B組中顯著地輕、脂肪重量在B組中顯著地重。
為了研究蓮葉提取干燥物導致的影響，比較B組和C組、D組，肝臟和腎臟重量未見顯著性差異，但脂肪重量在C組和D組都顯示低值。特別是可見D組與B組之間的顯著性差異，可見脂肪減少作用。
8-(6)總結如上所述，在2％蓮葉提取干燥物攝取組中可見體重增加抑制傾向，但不是顯著的作用，另一方面，在5％蓮葉提取干燥物攝取組中可見顯著的體重增加抑制。但是，由于攝食量存在一些差異，因此有必要研究體重減少是由攝食量導致的效果、還是由蓮葉提取干燥物導致的效果。所以，當從各組在試驗結束時的體重增加量和試驗中的總攝食量求出用于增加1g體重所需的飼料的量時，高脂肪食物攝取組為19.1g、2％蓮葉提取干燥物攝取組(高脂肪食物+2％蓮葉提取干燥物)為20.2g、5％蓮葉提取干燥攝取組(高脂肪食物+5％蓮葉提取干燥物)為22.7g，確認有依賴于用量而增加的傾向。因此，可得出以下結論在本實施例中所觀察的體重增加抑制是由蓮葉提取干燥物導致的效果。另外，解剖時的脂肪重量在2％蓮葉提取干燥物攝取組中有減少的傾向、在5％蓮葉提取干燥物攝取組中有顯著的脂肪重量減少，這是可支持上述結論的結果。
蓮葉提取干燥物對人的糖代謝和脂質代謝的作用9-(1)實驗材料和實驗方法本實施例的目的在于研究蓮葉提取干燥物對人的糖代謝和脂質代謝的影響。每次進行上述目的研究時，人受試者必須滿足一定條件。本實施例的受試者所應滿足的條件如下所示。
(1)是所謂的臨界型，即空腹時血糖值為110～126mg/dl或75g葡萄糖耐量試驗(OGTT)的2小時血糖值為140～200mg/dl。由于空腹時血糖值在126mg/dl或以上或75g OGTT 2小時值為200mg/dl或以上即變?yōu)樘悄虿⌒?，因此從本實施例的受試者中去除?br> (2)BMI(Body Mass Index)為22或以上。BMI也被稱為體格指數，是指體重(kg)除以身高(m)的平方而得到的數值。BMI＝體重(kg)÷身高(m)2。
(3)沒有糖尿病的藥物治療經驗。
(4)未患有嚴重的肝功能障礙、腎功能障礙、心血管功能障礙、食物過敏疾病。
(5)年齡為男性40～58歲、女性40～55歲、且進行與健康人同樣的日常生活。
(6)一日的茶飲料在2L或以下。
在滿足以上6條件的人中實施調查等來選擇受試者。在調查和問診表中，對A.一日卡路里攝取量、B.飲食的嗜好、C.以往病史、家族史、工作及生活環(huán)境、運動習慣、吸煙和飲酒進行詢問。
選拔了滿足上述受試者條件的95名受試者。使所選受試者分組為蓮葉提取干燥物攝取組2組(T組、R組)、無效對照攝取組(S組)的3組，以使在年齡、性別、空腹時血糖值上沒有差別。作為對照組，將攝取不含蓮葉提取物的基礎茶飲料(200ml/瓶)的組作為S組，作為被測物質攝取組，將攝取含有0.5g/200ml蓮葉提取干燥粉末的茶飲料的組作為T組、將攝取含有1.0g/200ml蓮葉提取干燥粉末的茶飲料的組作為R組。各組的構成和平均年齡示于表5。S組(無效對照)n＝30，T組(蓮葉提取干燥物1g/日)n＝34，R組(蓮葉提取干燥物2g/日)n＝31。
表5人試驗組構成及平均年齡

試驗以將無效對照作為對照的雙盲檢驗法進行。受試者在攝取被測食品前的2周觀察期間后，將上述茶飲料分為上午和下午、每日2瓶(200ml×2/日)進行攝取，歷時12周。對受試者實施身體測定和糖耐量試驗，研究蓮葉提取干燥物的影響。
9-(2)身體測定對各受試者，在攝取前、攝取6周后、攝取12周后的各時間點實施身體測定。測定項目測定了身高、體重、腰圍、BMI、臀圍、體脂肪率、內臟脂肪水平。體脂肪率和內臟脂肪水平的測定使用OmronBody Composition Monitor HBF-352進行實施。內臟脂肪水平10相當于內臟脂肪面積100cm2。
結果示于表6和表7。在表6和表7中，S組(無效對照)n＝30，T組(蓮葉提取干燥物1g/日)n＝34，R組(蓮葉提取干燥物2g/日)n＝31。
表6人試驗(體格指數1)平均值±S.D.
p＜0.05#[S vs R]p＜0.05*(Dunnett’s test)
表7人試驗(體格指數2)平均值±S.D.
p＜0.05#[S vs R]p＜0.05*(Dunnett’s test)通過攝取6和12周2g/日的蓮葉提取干燥物，體重、BMI、體脂肪率、內臟脂肪水平、腰圍、臀圍與對照組相比顯著降低，可確認蓮葉提取干燥物導致的降低作用。另外，通過攝取6周1g/日的蓮葉提取干燥物，與對照組相比，體重、體脂肪率顯著降低。12周的攝取中，體重、BMI、體脂肪率、內臟脂肪水平、腰圍與對照組相比顯著降低。
9-(3)糖耐量試驗對各受試者在攝取前、攝取12周后實施2次糖耐量試驗(75g葡萄糖/人)。受試者避免在采血前夜晚上21點后進食。試驗當天，最初在空腹狀態(tài)下采血，作為葡萄糖負荷前的血液。接著負荷75g葡萄糖，隨時間變化采集負荷30、60、90分鐘后的血液。試驗在上午11點之前完成。使用日立自動分析裝置7075測定血漿中的血糖值。
結果如圖7所示。在圖7中，將相對于葡萄糖負荷前血糖值的各經過時間后的血糖值作為葡萄糖相對值(％)表示。以各經過時間的葡萄糖相對值為基礎求出0～120分鐘的AUC(Area Under Curve)。S組(無效對照)n＝30，T組(蓮葉提取干燥物1g/日)n＝34，R組(蓮葉提取干燥物2g/日)n＝31。通過攝取12周的蓮葉干燥提取物，可見葡萄糖負荷30分鐘后及60分鐘后的血糖上升抑制。
9-(4)總結如上所述，與動物試驗相同，對人也可見蓮葉提取干燥物導致的體脂肪降低作用，對于人，通過攝取6周2g/日的蓮葉干燥提取物，體脂肪量降低，反映為體重的降低。另外，攝取12周1g/日時也得到同樣效果。由這些效果和葡萄糖耐量試驗的結果認為，在降低體脂肪量的同時有減輕胰島素抵抗性的作用。
綜上所述，通過本發(fā)明，能夠提供槲皮素作為β3腎上腺素能受體激動性物質。本發(fā)明的物質可特別用作改善肥胖、糖尿病治療的新的選擇。
序列表<110>明治乳業(yè)株式會社<120>來自于植物的β3腎上腺素能受體激動性物質及其利用<130>M1-A0302P<150>JP 2003-374836<151>2003-11-04<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>36<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>An artificially synthesized primer sequence<400>1ccgctagcca ccatggctcc gtggcctcac gagaag 36<210>2<211>31<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>An artificially synthesized primer sequence<400>2ccgaattcta cccgtcgagc cgttggcaaa g 3權利要求
1.一種由槲皮素構成的β3腎上腺素能受體激動性物質。
2.如權利要求1所述的物質，其中槲皮素來自于植物。
3.如權利要求2所述的物質，其中植物為蓮科。
4.一種用于糖尿病治療或預防的藥劑，其含有權利要求1～3任一項所述的物質。
5.一種用于肥胖的治療或預防的藥劑，其含有權利要求1～3任一項所述的物質，且具有脂肪代謝改善效果。
6.一種用于糖尿病治療或預防的食品，其含有權利要求1～3任一項所述的物質。
7.一種用于肥胖的治療或預防的食品，其含有權利要求1～3任一項所述的物質。
8.一種由含有槲皮素的蓮制備物所構成的β3腎上腺素能受體激動性物質。
全文摘要
本發(fā)明制作蓮葉提取物，發(fā)現其有效成分之一為槲皮素。并且，使槲皮素作用于人β
文檔編號A61P3/04GK1902189SQ200480039800
公開日2007年1月24日 申請日期2004年11月4日 優(yōu)先權日2003年11月4日
發(fā)明者坪井洋, 池上秀二, 神山智敬, 紀再思, 淺見幸夫, 伊藤裕之, 小田宗宏, 進和男 申請人:明治乳業(yè)株式會社