專(zhuān)利名稱(chēng)：：抑制副粘病毒感染的抗病毒組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明大體上涉及微生物學(xué)、病毒學(xué)、傳染性疾病和免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及抑制或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染的多肽、多肽片段和有機(jī)小分子。
背景技術(shù)：
：呼吸道合胞病毒(RSV)是非分節(jié)負(fù)鏈RNA病毒，而且是嬰幼兒、患有潛在疾病或免疫異常的患者和老年人中下呼吸道(LRT)疾病的主要起因(Domachowske和Rosenberg，1999；Hall，2001)。事實(shí)上，全球每年發(fā)生65,000,000例RSV感染，導(dǎo)致160,000人死亡(Robbins和Freeman，1988)。僅在美國(guó)，每年有100,000名因受RSV感染而患有嚴(yán)重肺炎和細(xì)支氣管炎的兒童被送進(jìn)醫(yī)院治療(Glezen等人，1986；Katz，1985)。1992年估計(jì)美國(guó)感染上RSV的住院和不必住院的兒童的開(kāi)支超過(guò)每年340000000美元(Wertz和Sullender，1992)。目前沒(méi)有預(yù)防人類(lèi)疾病的得到許可的疫苗。因此，季節(jié)性流行病期間所出生的無(wú)免疫性嬰兒必須依賴(lài)于從母親得到的抗體來(lái)預(yù)防由RSV引發(fā)的嚴(yán)重LRT疾病。對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)嬰兒來(lái)說(shuō)，由于母親的免疫狀況和得自母親的抗體的有限半衰期，因此這可能產(chǎn)生問(wèn)題。目前已經(jīng)批準(zhǔn)兩個(gè)生物藥品IVIG和人類(lèi)化單克隆抗體帕利珠(palivizumab)(Synagis)來(lái)預(yù)防高風(fēng)險(xiǎn)嬰兒的感染(Hall，2001；Krilov，2002)。盡管免疫預(yù)防的益處是明顯的，但是開(kāi)支卻是巨大的。除了上述生物藥品之外，還存在一種得到許可的藥劑利巴韋林(ribavirin)來(lái)治療由RSV所引發(fā)的急性呼吸道疾病(Torrence和Powel，2002)。然而，利巴韋林是致畸劑，并且對(duì)醫(yī)院工作人員、父母和其他生育年齡的親屬造成安全風(fēng)險(xiǎn)；因此利巴韋林的益處是有爭(zhēng)議的(Hall，2001；Krilov，2002)。因此，在缺少得到許可的疫苗的情況下，目前極為需要具有改良效力和增加安全性的新穎醫(yī)藥和/或生物化合物來(lái)預(yù)防由例如RSV的副粘病毒所引發(fā)的LRT疾病。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明廣泛涉及抑制或預(yù)防哺乳動(dòng)物中感染的抗病毒組合物。更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及抑制或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染的新穎抗病毒分子和其醫(yī)藥組合物。因此，在某些實(shí)施例中，本發(fā)明針對(duì)包含CCL5多肽的抗病毒組合物，其中CCL5多肽抑制哺乳動(dòng)物受檢者中的副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染。在一個(gè)特定實(shí)施例中，副粘病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)。在另一個(gè)實(shí)施例中，CCL5多肽通過(guò)阻斷RSV融合(F)蛋白與哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞之間的互作來(lái)抑制RSV感染。在某些實(shí)施例中，CCL5多肽是合成CCL5多肽或重組表達(dá)的CCL5多肽。在某些其他實(shí)施例中，CCL5多肽在哺乳動(dòng)物受檢者中是作為無(wú)生物活性的趨化因子。在一個(gè)特定實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物受檢者是人類(lèi)。在其他實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物受檢者是經(jīng)馴養(yǎng)的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物，其選自由牛、馬、豬、狗、貓、山羊和綿羊組成的群組。在另一個(gè)實(shí)施例中，CCL5多肽包含SEQIDNO1的氨基酸序列。在某些實(shí)施例中，CCL5多肽是NH2-末端經(jīng)修飾的CCL5多肽。在一個(gè)特定實(shí)施例中，NH2-末端經(jīng)修飾的CCL5多肽選自由氨氧基戊烷-CCL5(AOP-CCL5)、Met-CCL5、Nα-壬?；?CCL5(NNY-CCL5)、Δ1-2截短型CCL5和Δ1-8截短型CCL5組成的群組。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的抗病毒組合物進(jìn)一步包含一個(gè)或一個(gè)以上的CCL5肽片段，其中所述片段包含SEQIDNO1的CCL5多肽的約10至20個(gè)相鄰氨基酸。在特定實(shí)施例中，所述一個(gè)或一個(gè)以上CCL5肽片段選自由SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17和SEQIDNO18組成的群組。在其他實(shí)施例中，CCL5肽片段包含SEQIDNO2的氨基酸序列。在某些實(shí)施例中，SEQIDNO2肽片段進(jìn)一步被定義為SEQIDNO1的NH2-末端肽。在某些其他實(shí)施例中，CCL5多肽被進(jìn)一步定義為人類(lèi)CCL5多肽。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的抗病毒組合物進(jìn)一步包含SEQIDNO1的CCL5多肽的NH2-末端的肽模擬物。在一個(gè)特定實(shí)施例中，CCL5多肽的NH2-末端的肽模擬物是包含SEQIDNO19、SEQIDNO20或SEQIDNO21氨基酸序列的逆轉(zhuǎn)CCL5多肽。在某些其他實(shí)施例中，本發(fā)明的抗病毒組合物進(jìn)一步包含結(jié)合CCR3趨化因子受體的有機(jī)分子。在某些所述實(shí)施例中，所述有機(jī)分子是CCR3受體拮抗劑。在一個(gè)特定實(shí)施例中，所述有機(jī)分子包含一個(gè)或一個(gè)以上的以下化學(xué)結(jié)構(gòu)在某些其他實(shí)施例中，本發(fā)明的抗病毒組合物是藉由鼻內(nèi)投藥或非經(jīng)腸投藥而投與哺乳動(dòng)物受檢者。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的抗病毒組合物進(jìn)一步包含為CCR1拮抗劑或CCR5拮抗劑的有機(jī)分子。在某些實(shí)施例中，為CCR1拮抗劑的有機(jī)分子包含一個(gè)或一個(gè)以上的以下化學(xué)結(jié)構(gòu)在某些實(shí)施例中，為CCR5拮抗劑的有機(jī)分子包含一個(gè)或一個(gè)以上的以下化學(xué)結(jié)構(gòu)在其他實(shí)施例中，本發(fā)明針對(duì)包含編碼CCL5多肽的多核苷酸序列的重組表達(dá)載體。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明針對(duì)經(jīng)包含編碼CCL5多肽的多核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或侵染的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明針對(duì)包含CCL5多肽的NH2-末端肽片段的抗病毒組合物，其中所述片段包含CCL5多肽的NH2-末端的約10至20個(gè)相鄰氨基酸，其中所述片段抑制哺乳動(dòng)物受檢者中的副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染。在一個(gè)特定實(shí)施例中，副粘病毒是RSV。在另一個(gè)實(shí)施例中，CCL5多肽包含SEQIDNO1氨基酸序列。在其他實(shí)施例中，NH2-末端肽片段包含選自由以下序列組成的群組的氨基酸序列SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17和SEQIDNO18。在某些實(shí)施例中，NH2-末端多肽片段包含SEQIDNO2氨基酸序列。在某些實(shí)施例中，所述組合物在哺乳動(dòng)物受檢者中是作為無(wú)生物活性的趨化因子。在其他實(shí)施例中，所述抗病毒組合物是藉由鼻內(nèi)投藥或非經(jīng)腸投藥而投與哺乳動(dòng)物受檢者。在其他實(shí)施例中，NH2-末端的CCL5肽片段通過(guò)阻斷RSV融合(F)蛋白與哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞之間的互作來(lái)抑制RSV感染。在某些其他實(shí)施例中，所述抗病毒組合物進(jìn)一步包含一個(gè)或一個(gè)以上選自由氨氧基戊烷-CCL5(AOP-CCL5)、Met-CCL5、Nα-壬?；?CCL5(NNY-CCL5)、Δ1-2截短型CCL5和Δ1-8截短型CCL5組成的群組的NH2-末端經(jīng)修飾的CCL5多肽。在一個(gè)實(shí)施例中，抗病毒組合物進(jìn)一步包含SEQIDNO1的CCL5多肽的NH2-末端的肽模擬物。在一個(gè)特定實(shí)施例中，CCL5多肽的NH2-末端多肽模擬物是包含SEQIDNO19、SEQIDNO20或SEQIDNO21氨基酸序列的逆轉(zhuǎn)CCL5多肽。在另一個(gè)實(shí)施例中，抗病毒組合物進(jìn)一步包含為CCR1受體、CCR3受體或CCR5受體的拮抗劑的有機(jī)分子。在一個(gè)特定實(shí)施例中，CCR1受體、CCR3受體或CCR5受體的拮抗劑包含如由式I-XII所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在某些其他實(shí)施例中，本發(fā)明針對(duì)包含編碼NH2-末端CCL5肽片段的多核苷酸序列的重組表達(dá)載體。在某些其他實(shí)施例中，本發(fā)明針對(duì)經(jīng)包含編碼NH2-末端CCL5肽片段的多核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或侵染的宿主細(xì)胞。在某些其他實(shí)施例中，本發(fā)明針對(duì)通過(guò)基于計(jì)算機(jī)的分子模型化而設(shè)計(jì)的有機(jī)小分子模擬物，所述基于計(jì)算機(jī)的分子模型化使用SEQIDNO1的前15個(gè)CCL5NH2-末端氨基酸的原子X(jué)、Y、Z坐標(biāo)，其中X、Y、Z坐標(biāo)見(jiàn)于選自由1RTN、1RTO、1EQT和1B3A組成的群組的BrookhavenProteinDataBank文件。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明針對(duì)包含上述由基于計(jì)算機(jī)的分子模型化而設(shè)計(jì)的有機(jī)分子的抗病毒組合物。在某些其他實(shí)施例中，本發(fā)明針對(duì)CCL5多肽的NH2-末端的肽模擬物，其中所述多肽模擬物抑制哺乳動(dòng)物受檢者中的副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染。在某些實(shí)施例中，所述模擬物是通過(guò)使用SEQIDNO1的前15個(gè)CCL5NH2-末端氨基酸的原子X(jué)、Y、Z坐標(biāo)的基于計(jì)算機(jī)的分子模型化而設(shè)計(jì)，其中X、Y、Z坐標(biāo)包含于選自由1RTN、1RTO、1EQT和1B3A組成的群組的BrookhavenProteinDataBank文件中。在一個(gè)特定實(shí)施例中，肽模擬物是回折模擬物。在某些實(shí)施例中，回折模擬物是β-轉(zhuǎn)角模擬物、單環(huán)β-轉(zhuǎn)角模擬物、雙環(huán)β-轉(zhuǎn)角模擬物、γ-轉(zhuǎn)角模擬物或單環(huán)γ-轉(zhuǎn)角模擬物。在某些其他實(shí)施例中，肽模擬物包含于抗病毒組合物中。在某些其他實(shí)施例中，本發(fā)明針對(duì)預(yù)防或抑制哺乳動(dòng)物宿主中的副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染的方法，所述方法包含對(duì)所述宿主投與醫(yī)藥學(xué)有效量的本發(fā)明抗病毒組合物。根據(jù)以下詳細(xì)描述，根據(jù)其優(yōu)選實(shí)施例并且根據(jù)權(quán)利要求書(shū)，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢(shì)將變?yōu)轱@而易見(jiàn)。圖1展示CCL5抑制上皮表面處的RSV感染。Hep-2單層在受RSVA2感染之前，經(jīng)指定劑量的重組rCCL5(環(huán)形)或met-CCL5(正方形)預(yù)處理(感染前一小時(shí))。三天后，計(jì)數(shù)菌斑，并表示為相對(duì)于僅經(jīng)培養(yǎng)基中病毒培養(yǎng)而未暴露于趨化因子的對(duì)照孔(100％感染率)的感染百分比(±1標(biāo)準(zhǔn)偏差)。圖2展示HEp-2和A549細(xì)胞上CCR1、CCR3和CCR5的表達(dá)。用細(xì)胞刮取器將HEp-2和A549細(xì)胞單層從組織培養(yǎng)瓶中小心地移出。用與藻紅蛋白結(jié)合的抗人類(lèi)CCR1或抗CCR3mAb，或者與FITC結(jié)合的抗CCR5(FL2-H，x軸，實(shí)線)來(lái)染色細(xì)胞。y軸展示相對(duì)細(xì)胞數(shù)目(計(jì)數(shù))。圖3展示CCL5的重疊合成肽與Hep-2細(xì)胞單層的結(jié)合。用遞增濃度(0.0039-4.0μg/ml)的所示經(jīng)生物素標(biāo)記的肽培養(yǎng)(4℃)可存活Hep-2細(xì)胞單層。沖洗之后，將單層固定在甲醇中，并且通過(guò)OD450-550下的ELISA來(lái)觀察肽的結(jié)合。圖4A和4B展示CCL5多肽對(duì)CCL3多肽的水療法曲線。圖4A是CCL5(SEQIDNO1的氨基酸5至68)與CCL3(SEQIDNO22的氨基酸5至69)比對(duì)的水療法曲線。圖4B是CCL5(SEQIDNO1的氨基酸5至31)與CCL3(SEQIDNO22的氨基酸5至31)比對(duì)的水療法曲線。用Kyte和Doolittle(1982)的氨基酸水療法值產(chǎn)生y軸的水療法標(biāo)尺，其具有9氨基酸移動(dòng)平均窗口。標(biāo)尺上負(fù)水療法值表示親水性環(huán)境，而標(biāo)尺上正數(shù)表示疏水性環(huán)境。具體實(shí)施例方式本發(fā)明下文的描述是關(guān)于所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
需要用于投與易受副粘病毒感染，尤其是呼吸道合胞病毒(RSV)感染的哺乳動(dòng)物宿主(例如人類(lèi))的有效抗病毒分子。因此，在某些實(shí)施例中，本發(fā)明針對(duì)新穎抗病毒分子和其醫(yī)藥組合物。如下文所定義，本發(fā)明的“抗病毒分子”是“多肽”、“趨化因子多肽”、趨化因子“多肽片段”(下文“肽片段”)、“有機(jī)小分子”(或“小分子模擬物”)或“肽模擬物(peptidemimetic)”(或“擬肽(peptidomimetic)”)，其中所述抗病毒分子抑制或預(yù)防哺乳動(dòng)物細(xì)胞的副粘病毒感染。趨化因子是在指引細(xì)胞朝向受傷或感染部位運(yùn)動(dòng)中起重要作用的小分子量細(xì)胞因子(Baggiolini，2001)。舉例來(lái)說(shuō)，人們認(rèn)為趨化因子CCL5(也稱(chēng)為“RANTES”；其是對(duì)調(diào)控活化、正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的英文首字母縮寫(xiě))在對(duì)由RSV復(fù)制所引起的組織傷害區(qū)域的白細(xì)胞募集方面起主要作用(Appay和Rowland-Jones，2001；Moser和Loetscher，2001)?；诒Ｊ匕腚装彼峄虻臄?shù)目和間距將趨化因子分為亞家族，將其命名為C、CC、CXC和CX3C。先前已經(jīng)確定，經(jīng)RSV感染誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞中的基因表達(dá)和趨化因子分泌(Harrison，1999；Noah等人，2002；Zhang，2001)。此外，CC家族的某些趨化因子多肽已經(jīng)展示擁有有效對(duì)抗人類(lèi)免疫缺失病毒1型(HIV-1)的抗病毒特性(Lusso，2002；Lehner，2002；Proudfoot等人，2003)。舉例來(lái)說(shuō)，HIV-1通過(guò)結(jié)合CCR5作為主要共受體而進(jìn)入T細(xì)胞和巨嗜細(xì)胞。趨化因子多肽CCL5(RANTES)、CCL3(MIP-1α)和CCL4(MIP-1β)是阻斷CCR5作為HIV-1共受體并進(jìn)而預(yù)防HIV-1感染的抑制性配體。本發(fā)明首次展示重組CCL5(rCCL5)多肽、N-末端經(jīng)修飾CCL5多肽和N-末端CCL5肽片段(a)抑制人類(lèi)上皮細(xì)胞受RSV感染(實(shí)例2)，(b)阻斷上皮細(xì)胞與RSV的融合(F)蛋白的互作(實(shí)例3)，且(c)抑制活體內(nèi)RSV感染(實(shí)例4)。與所公開(kāi)的HIV-1感染的趨化因子抑制的報(bào)導(dǎo)相反(例如趨化因子CCL3、CCL4和CCL5)(Lusso，2002；Lehner，2002；Proudfoot等人，2003)，本發(fā)明的數(shù)據(jù)證明僅發(fā)生CCL5的RSV感染的趨化因子抑制，而其他例如CCL3(MIP-1α)或CCL4(MIP-1β)的CC抑制劑并不發(fā)生(參看實(shí)例2)，這表明RSV可能利用不同于CCR5的受體(即，與HIV-1相反)。通過(guò)已知與CCL5結(jié)合的受體(CCR1、CCR3和CCR5)的流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢查人類(lèi)上皮細(xì)胞。結(jié)果證實(shí)，CCR3(而非CCR1或CCR5)是在HEp-2和A549上皮細(xì)胞的表面上表達(dá)(參看，實(shí)例3和圖1)，這表明CCL5阻斷上皮細(xì)胞表面上RSV與CCR3之間的互作。測(cè)試其他已知與CCR3結(jié)合的重組CC趨化因子(Baggiolini，2001)，以確定其是否也降低RSV感染性。用遞增量的重組CCL11(嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(eotaxin))、CCL8(MCP-2)或CCL15(MIP-1δ)來(lái)預(yù)先處理HEp-2細(xì)胞單層并不減弱RSV感染性(表10和表12)。此外，在針對(duì)CCR1、CCR3和/或CCR5的多或單克隆抗趨化因子受體抗體的存在下預(yù)培養(yǎng)HEp-2細(xì)胞單層并不降低RSV感染性(數(shù)據(jù)未顯示)。先前已經(jīng)證實(shí)，活體外，使用缺少SH(小疏水性)蛋白和/或G(粘附)蛋白的突變RSV菌株，僅F(融合)蛋白足以介導(dǎo)RSV粘附(Karron等人，1997)。因此，通過(guò)檢查rCCL5抑制缺失G蛋白和/或SH蛋白的RSV菌株的感染的能力來(lái)進(jìn)一步研究CCL5抑制。用缺失SH蛋白(RSVΔSH)或G蛋白C-末端的外部域截去氨基酸118(RSVΔ118)的經(jīng)遺傳修飾的RSV菌株來(lái)進(jìn)行一系列研究。所述研究表明，相對(duì)于僅經(jīng)培養(yǎng)基中病毒培養(yǎng)的對(duì)照細(xì)胞，經(jīng)10μg/mlrCCL5或Met-CCL5預(yù)處理降低RSVΔ118和RSVΔSH病毒的感染率。用rCCL5(10μg/ml)預(yù)先處理也降低突變cp32/D1(缺少SH和G蛋白)和RSV的親代B1菌株的感染(實(shí)例3，表15)。因此，rCCL5抑制缺失G和/或SH蛋白的RSV菌株的感染。為了確定CCL5抑制RSV感染的區(qū)域，合成代表SEQIDNO1的所有68個(gè)氨基酸的一系列9個(gè)CCL5肽片段(15聚體，由7個(gè)氨基酸重疊)(實(shí)例4和表2)，并且在用于感染的活體內(nèi)小鼠模型中測(cè)試。當(dāng)與RSV感染同時(shí)投與或在RSV感染之前投與時(shí)，代表CCL5NH2-末端前15個(gè)氨基酸殘基的肽1(SEQIDNO2)是活體內(nèi)的主要抑制肽(實(shí)例4，表16和表17)。總而言之，本發(fā)明的數(shù)據(jù)表明新穎的CCL5抑制機(jī)制，其中CCL5阻斷發(fā)生在RSV包膜中的F蛋白與上皮細(xì)胞表面之間的互作。此外，已經(jīng)鑒定出抑制RSV感染的代表CCL5的NH2-末端部分的CCL5肽片段。因此，在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的抗病毒分子是CCL5多肽、NH2-末端經(jīng)修飾的CCL5多肽、NH2-末端CCL5肽片段、經(jīng)修飾NH2-末端CCL5肽片段、設(shè)計(jì)以模擬CCL5多肽的NH2-末端部分的肽模擬物或設(shè)計(jì)以模擬CCL5多肽的NH2-末端部分的小分子，其中所述抗病毒分子抑制或預(yù)防哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其是上皮細(xì)胞的副粘病毒感染。如下文所定義，“副粘病毒”涵蓋副粘液病毒科的病毒，其包括(但不限于)RSV、副流感病毒(PIV)1-4型、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人類(lèi)偏肺病毒(humanMetapneumovirus)、尼派(Nipah)病毒、亨德拉(Hendra)病毒、牛瘟病毒和犬瘟病毒。A.抗病毒分子如上文所述，本發(fā)明的抗病毒分子是抑制或預(yù)防哺乳動(dòng)物細(xì)胞的副粘病毒感染的多肽、肽片段、有機(jī)小分子或肽模擬物。更具體來(lái)說(shuō)，抗病毒分子是阻斷、抑制或預(yù)防副粘病毒F蛋白與上皮細(xì)胞表面受體之間互作，進(jìn)而阻止副粘病毒進(jìn)入細(xì)胞的多肽、肽片段、有機(jī)小分子或肽模擬物。本發(fā)明的抗病毒多肽(和其片段)和抗病毒肽模擬物/小分子模擬物分別在下文部分A.1和A.2闡述。1.CCL5多肽和其片段在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的抗病毒分子是CCL5多肽，經(jīng)化學(xué)修飾的CCL5多肽或經(jīng)遺傳修飾的CCL5多肽。在一個(gè)特定實(shí)施例中，CCL5多肽在其N(xiāo)H2-末端經(jīng)修飾。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的抗病毒分子是NH2-末端CCL5肽片段、經(jīng)化學(xué)修飾的NH2-末端CCL5肽片段或經(jīng)遺傳修飾的NH2-末端CCL5肽片段，其中所述肽片段包含抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞的副粘病毒感染的CCL5多肽的NH2-末端部分。如下文所定義，全長(zhǎng)CCL5多肽具有約7.8kDa的分子量，并且包含SEQIDNO1氨基酸序列。在某些實(shí)施例中，SEQIDNO1的全長(zhǎng)CCL5多肽是合成多肽或重組表達(dá)CCL5多肽。本發(fā)明的全長(zhǎng)CCL5多肽包含與SEQIDNO1氨基酸序列具有至少95％一致性的氨基酸序列，其中所述多肽抑制或預(yù)防哺乳動(dòng)物細(xì)胞的副粘病毒感染。因此，CCL5多肽涵蓋包含以下物質(zhì)的多肽(a)SEQIDNO1所示的氨基酸序列，(b)SEQIDNO1多肽的天然發(fā)生等位變體，(c)從除人類(lèi)之外的生物體分離的多肽(例如，CCL5多肽的直系同源物)和(d)SEQIDNO1的NH2-末端經(jīng)修飾的CCL5多肽。根據(jù)本發(fā)明CCL5多肽的等位變體涵蓋以下情況的多肽(1)從人類(lèi)細(xì)胞分離，和(2)含有與SEQIDNO1人類(lèi)CCL5多肽的實(shí)質(zhì)同源性。CCL5多肽的等位變體是維持抑制或預(yù)防哺乳動(dòng)物細(xì)胞的副粘病毒感染的CCL5多肽的天然發(fā)生氨基酸序列變體。因此，將CCL5多肽的等位變體定義為“功能性變體”。功能性變體僅含有SEQIDNO1的一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸的保守性置換，或者多肽非關(guān)鍵區(qū)內(nèi)非關(guān)鍵殘基的置換、缺失或插入。舉例來(lái)說(shuō)，觀察到NH2-末端CCL5肽片段(SEQIDNO2)抑制哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞的副粘病毒感染(實(shí)例4)。此外，HIV-1感染的CCL5抑制的結(jié)構(gòu)和功能研究進(jìn)一步揭示氨基酸殘基Phe12、Tyr14和Ile15對(duì)于抗HIV-1活性是至關(guān)重要的(Nardese等人，2001)。因此，在某些優(yōu)選實(shí)施例中，全長(zhǎng)CCL5多肽的等位變體包含實(shí)質(zhì)上與SEQIDNO1的人類(lèi)多肽同源的多肽，其中所述多肽不包含氨基酸Phe12、Tyr14和Ile15的置換或缺失。本發(fā)明進(jìn)一步提供CCL5多肽的非人類(lèi)直系同源物。CCL5多肽的直系同源物是從非人類(lèi)哺乳動(dòng)物類(lèi)有機(jī)物分離的多肽，并且擁有CCL5多肽的抗病毒特性?？奢p易地鑒別出CCL5多肽的直系同源物包含與SEQIDNO1實(shí)質(zhì)上同源的氨基酸序列。例如BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool；Altschul等人，1990)、AACompIdent和AACompSim(Wilkens等人，1998)的程序是在SwissInstituteofBioinformatics(SIB)的ExPASy(ExpertProteinAnalysisSystem)蛋白組學(xué)服務(wù)器上公開(kāi)可用的，并且尤其可用于鑒別公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源多肽，這些公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)例如GenBank、ProteinDataBank(PDB)、SwissProt、ProteinInformationResource(PIR)和ProteinResearchFoundation(PRF)。如先前所闡述，趨化因子(也稱(chēng)為趨化細(xì)胞因子)是在指引或募集細(xì)胞(例如單核細(xì)胞)朝向受傷或感染部位運(yùn)動(dòng)中起重要作用的小分子量(例如，約8-10kDa)多肽。在某些實(shí)施例中，CCL5多肽(或其片段)是經(jīng)化學(xué)修飾的CCL5多肽或經(jīng)遺傳修飾的CCL5多肽，使得經(jīng)修飾的CCL5多肽在哺乳動(dòng)物受檢者中是作為無(wú)生物活性的趨化因子促效劑。舉例來(lái)說(shuō)，CCL5修飾削弱、降低或鈍化CCL5多肽作為趨化因子促效劑的生物活性，其中經(jīng)修飾的CCL5多肽保留其抑制副粘病毒感染的能力。如文中所定義，“趨化因子促效劑”或“趨化因子或趨化因子促效劑的生物活性”是指趨化因子多肽(例如CCL5)誘導(dǎo)或刺激趨化性、鈣流動(dòng)、炎癥和類(lèi)似過(guò)程的能力。通過(guò)例如鈣流動(dòng)測(cè)定、趨化性測(cè)定、N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷酶測(cè)定和類(lèi)似測(cè)定的方法檢測(cè)或測(cè)量本發(fā)明趨化因子多肽的促效劑活性(Proudfoot等人，1996；Simmons等人，1997；Gong和Clark-Lewis，1995；Fincham，1988)(例如，參看實(shí)例6)。在某些實(shí)施例中，CCL5多肽在其N(xiāo)H2-末端經(jīng)遺傳和/或化學(xué)修飾，其中NH2-末端修飾使CCL5失去作為趨化因子促效劑的活性。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
已經(jīng)描述一些CCL5NH2-末端修飾使CCL5趨化因子失去活性。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)保留CCL5(RANTES)的起始甲硫氨酸(Met)時(shí)，所得Met-CCL5(Met-RANTES)多肽(1)失去作為趨化因子促效劑的活性(例如，Met-CCL5不刺激或誘導(dǎo)Ca2+流動(dòng)或趨化性)，(2)對(duì)抗CCR5受體處由CCL5和CCL3(MIP-1α)所誘導(dǎo)的“趨化因子”作用(Proudfoot等人，1996)和(3)抑制主要人類(lèi)巨嗜細(xì)胞培養(yǎng)物的HIV-1感染(Simmons等人，997)。如下文所定義，“Met-CCL5”或“Met-RANTES”多肽包含SEQIDNO1氨基酸序列，并且進(jìn)一步包含SEQIDNO1位置1處絲氨酸殘基的甲硫氨酸氨基酸NH2-末端。也已經(jīng)描述使CCL5趨化因子失去活性的截短型NH2-末端CCL5多肽。舉例來(lái)說(shuō)，Arenzana-Seisdedos等人(1996)合成了一種其中前8個(gè)氨基酸被去除(命名為RANTES(9-68))的截短型CCL5多肽(下文稱(chēng)為“CCL5(Δ1-8)”)和一種其中前2個(gè)氨基酸被去除(命名為RANTES(3-68))的截短型CCL5多肽(下文稱(chēng)為“CCL5(Δ1-2)”)，其中截短型多肽缺乏趨化性和白細(xì)胞活化特性并且抑制HIV-1感染。如下文所定義，“CCL5(Δ1-8)”多肽包含SEQIDNOI的氨基酸殘基9至68。如下文所定義，“CCL5(Δ1-2)”多肽包含SEQIDNO1的氨基酸殘基3至68。也已經(jīng)描述使CCL5趨化因子失去活性的CCL5多肽的化學(xué)修飾。所述修飾包括向CCL5的NH2-末端絲氨酸殘基添加氨氧基戊烷基團(tuán)(稱(chēng)為“AOP-RANTES”或“AOP-CCL5”)(Simmons等人，1997)，和向CCL5的NH2-末端絲氨酸殘基添加Nα-壬?；鶊F(tuán)(稱(chēng)為“Nα-壬酰基-RANTES”、“NNY-RANTES”和“NNY-CCL5”)(Mosier等人，1999)。如下文所定義，AOP-CCL5多肽包含SEQIDNO1氨基酸序列，并且進(jìn)一步包含共價(jià)連接于SEQIDNO1第一個(gè)絲氨酸殘基的氨氧基戊烷基團(tuán)。如下文所定義，NNY-CCL5多肽包含SEQIDNO1氨基酸序列，并且進(jìn)一步包含共價(jià)連接于SEQIDNO1第一個(gè)絲氨酸殘基的Nα-壬?；??；蛘撸琒er1殘基經(jīng)另一個(gè)氨基酸(例如Gly1)置換，其中位置1處的經(jīng)置換氨基酸包含經(jīng)共價(jià)連接的AOP或NNY。因此，在某些實(shí)施例中，在本發(fā)明CCL5多肽的一級(jí)序列中進(jìn)行修飾和改變以使CCL5失去作為趨化因子促效劑的活性，其中經(jīng)修飾的CCL5保留其抗副粘病毒特性。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)在一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)水平上的復(fù)雜互作來(lái)確定多肽的功能和/或生物活性，并且因此可以在多肽序列(或其潛在的DNA編碼序列)中進(jìn)行某些氨基酸序列置換，且獲得具有相似特性(例如抗病毒特性)的多肽。在進(jìn)行這些改變時(shí)，應(yīng)考慮氨基酸的水療法指數(shù)(例如，參看圖10A和10B)。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
通常應(yīng)了解賦予多肽交互性生物功能的水療法氨基酸指數(shù)的重要性(例如，Kyte和Doolittle，1982；Eisenberg等人，1984；Hopp和Woods，1981)。已知某些氨基酸被具有相似水療法指數(shù)或分值的其他氨基酸所置換，并且仍然得到具有相似生物活性的多肽。舉例來(lái)說(shuō)，氨基酸殘基的相對(duì)水療法特征影響所得多肽的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，這又界定多肽與，例如，酶、底物、受體、抗體、抗原和類(lèi)似分子的其他分子的互作。如上文所略述，氨基酸置換通常是基于氨基酸側(cè)鏈置換基的相對(duì)相似性，例如疏水性、親水性、電荷、大小等等?？紤]在內(nèi)的許多前述特征的示范性置換是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并列于表1中。表1氨基酸置換原初示范性殘基殘基置換在某些實(shí)施例中，CCL5多肽在其N(xiāo)H2-末端經(jīng)修飾，其中NH2-末端修飾使CCL5失去作為趨化因子促效劑的活性。因此，在某些所述實(shí)施例中，使用位點(diǎn)特異性突變發(fā)生在CCL5多肽的NH2-末端對(duì)其修飾(例如，CCL5Δ1-8，Arenzana-Seisdedos等人，1996)。或者，通過(guò)所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的化學(xué)和合成修飾在CCL5多肽(或其片段)的NH2-末端對(duì)其修飾(例如，AOP-CCL5，Simmons等人，1997；NNY-CCL5，Mosier等人，1999)。位點(diǎn)特異性突變發(fā)生也可用于通過(guò)優(yōu)先DNA的特異突變發(fā)生來(lái)制備第二代CCL5多肽(例如，趨化活性降低的抗病毒多肽(或其片段)和/或抗病毒特性增加的CCL5多肽(或其片段))。位點(diǎn)特異突性變發(fā)生允許通過(guò)使用編碼所需突變的DNA序列的特異性寡核苷酸序列以及足夠數(shù)目的相鄰核苷酸來(lái)產(chǎn)生突變體，而提供足夠大小和序列復(fù)雜性的引物序列，以在經(jīng)橫斷的缺失連接處的兩側(cè)均形成穩(wěn)定雙鏈(duplex)。通常約17至25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的引物為優(yōu)選，其中在經(jīng)改變的序列的連接處的兩側(cè)均有約5至10個(gè)殘基。位點(diǎn)特異性突變發(fā)生技術(shù)是所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
所熟知的，并且通常采用可以單鏈和雙鏈形式存在的噬菌體載體(例如，參看美國(guó)專(zhuān)利第5,556,747號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,789,166號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利第6,391,548號(hào)；各專(zhuān)利案全文均以引用的方式并入本文)。在特定實(shí)施例中，本發(fā)明針對(duì)CCL5多肽片段。如本文所使用術(shù)語(yǔ)“多肽片段”、“肽片段”和“蛋白片段”可交替使用。如下文所定義，CCL5肽片段是具有與全長(zhǎng)和成熟CCL5氨基酸序列的部分(但非全部)完全相同的氨基酸序列的CCL5多肽。因此，多肽片段包含，例如，SEQIDNO1的CCL5多肽的至少7個(gè)或7個(gè)以上(例如，8、10、12、14、16、18、20或更多)的相鄰氨基酸。通過(guò)重組表達(dá)方法、合成肽化學(xué)或通過(guò)全長(zhǎng)CCL5多肽的化學(xué)剪切或酶剪切生產(chǎn)或產(chǎn)生CCL5肽片段。片段是“獨(dú)立的(freestanding)”，并且包含于更大的多肽中，所述片段形成所述更大多肽的一部分或區(qū)域，最優(yōu)選是單一的連續(xù)區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施例中，CCL5肽片段包含SEQIDNO1的全長(zhǎng)CCL5多肽的約10至20個(gè)相鄰氨基酸(例如，10聚體、11聚體、12聚體、13聚體、14聚體、15聚體等)。如實(shí)例4所描述，產(chǎn)生一系列9個(gè)重疊CCL5肽片段(15聚體)(參看下表2)，并且通過(guò)活體外和活體內(nèi)RSV感染測(cè)定來(lái)進(jìn)行測(cè)試。在這些測(cè)定中觀察到代表CCL5前15個(gè)NH2-末端氨基酸(即SEQIDNO1的氨基酸1-15)的1號(hào)肽(SEQIDNO2)是9個(gè)經(jīng)測(cè)試的重疊CCL5肽中最具抑制性的。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中也已知NH2-末端CCL5肽片段抑制淋巴細(xì)胞的HIV-1感染。舉例來(lái)說(shuō)，Nardese等人(2001)設(shè)計(jì)出一系列包含形成CCL5上的疏水性片的NH2-環(huán)與β1-鏈殘基的合成12聚體肽(例如，見(jiàn)下文A.2部分和表5A)，跨越NH2-環(huán)與β1-鏈芳烴簇的19聚體和跨越Cysll-Cys43的環(huán)狀24聚體。所述肽在下文所指示的氨基酸位置處經(jīng)乙?；?Ac)和氨基化(NH2)。在急性感染測(cè)定中，跨越NH2-環(huán)與β1-鏈芳烴簇的19聚體(Ac-Cys11-Tyr29-NH2；SEQIDNO16)的抗HIV-1效力顯著高于NH2-環(huán)衍生的十二聚體Ac-Cys11-Ala22-NH2(SEQIDNO13)的抗HIV-1效力(平均ID50＝8.9+/-3.8μM對(duì)51.5+/-6.3μM；P＜0.0001)。缺少β1-鏈芳烴簇的兩個(gè)較短肽(Cysll-Lys25與Cys11-Glu26)的有效性較低(分別為平均ID50＝48.1+/-6.8μM與44.7+/-3.3μM)，這證明所述芳烴簇對(duì)HIV-1抗病毒活性的重要性?？缭降诙c第三半胱氨酸之間整個(gè)區(qū)域的環(huán)狀24聚體(環(huán)-Cysll-Cys34；SEQIDNO17)比原初的十二聚體(SEQIDNO13)抑制HIV-1更有效(ID50＝29.8+/-1.6μM)，但比19聚體(SEQIDNO16)的低。未觀察到用來(lái)源于CXCR4配體SDF-1的共線性對(duì)照環(huán)肽的作用。這些發(fā)現(xiàn)證明CCL5的β1-鏈內(nèi)的芳烴簇對(duì)于抗HIV-1活性是關(guān)鍵的，證明此區(qū)域連同NH2-環(huán)包含在CCR5受體界面內(nèi)。對(duì)抑制RSV感染(表2；1號(hào)肽)和HIV感染(表3)的CCL5肽片段進(jìn)行比對(duì)，并展示于下表4中。表4中(粗體文字)也顯示包含SEQIDNO18氨基酸序列的一致CCL5肽片段(17號(hào)肽)。表2重疊CCL5合成肽十五聚體(15聚體)的氨基酸序列表3抗HIVCCL5十二聚體(12聚體)、CCL5十九聚體(19聚體)和環(huán)24聚體的氨基酸序列表4抗RSV與抗HIV-1CCL5片段的氨基酸序列比對(duì)和一致氨基酸序列因此，在某些實(shí)施例中，CCL5肽片段包含SEQIDNO2氨基酸序列，其代表全長(zhǎng)CCL5多肽的NH2-末端15個(gè)殘基。在其他實(shí)施例中，SEQIDNO2的CCL5肽在其一個(gè)或一個(gè)以上的NH2-末端氨基酸殘基處經(jīng)修飾。在其他實(shí)施例中，CCL5肽片段包含SEQIDNO18氨基酸序列或其N(xiāo)H2-末端經(jīng)修飾的片段。在某些其他實(shí)施例中，SEQIDNO2、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17或SEQIDNO18的CCL5肽片段的一級(jí)和二級(jí)序列用于設(shè)計(jì)下文A.2部分中所闡述的肽模擬物或有機(jī)小分子模擬物。在本發(fā)明某些實(shí)施例中預(yù)期通過(guò)化學(xué)剪切或酶剪切將CCL5多肽剪切成片段。這通過(guò)用蛋白水解酶(即蛋白酶)處理經(jīng)純化的CCL5多肽實(shí)現(xiàn)，蛋白水解酶包括(但不限于)絲氨酸蛋白酶(例如，胰凝乳蛋白酶、胰島素、胞漿素、彈性蛋白酶、凝血酶、substilin)、金屬蛋白酶(例如，羧肽酶A、羧肽酶B、亮氨酸氨基肽酶、嗜熱菌蛋白酶、膠原酶)、硫醇蛋白酶(例如，木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、鏈球菌(Streptococcal)蛋白酶、梭菌蛋白酶)和/或酸性蛋白酶(例如，胃蛋白酶、胃亞蛋白酶、胰蛋白酶原)。用化學(xué)手段也產(chǎn)生多肽片段，例如用溴化氰(CNBr)、2-硝基-5-硫氰基苯甲酸、異苯甲酸、BNPA-糞臭素、羥胺或稀酸溶液處理多肽。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的CCL5多肽片段通過(guò)所屬領(lǐng)域已知的肽合成技術(shù)重組表達(dá)和制備(Barany等人，1997；Simmons等人，1997；Proudfoot等人，1996；Proudfoot等人，1999；美國(guó)專(zhuān)利第5,258,454號(hào))，并且在實(shí)例1中描述。2.肽模擬物和有機(jī)小分子模擬物關(guān)于藥物設(shè)計(jì)的普通方法包括檢查與特定疾病相關(guān)的蛋白-蛋白互作，然后設(shè)計(jì)可以模擬或結(jié)合于一個(gè)互作蛋白的小分子。生物活性通常來(lái)源于由二級(jí)結(jié)構(gòu)單元所產(chǎn)生的蛋白表面的僅一小局部區(qū)，二級(jí)結(jié)構(gòu)單元例如α-螺旋、β-片層、β-轉(zhuǎn)角、γ-轉(zhuǎn)角、β-鏈、環(huán)結(jié)構(gòu)和類(lèi)似結(jié)構(gòu)單元。因此，通常設(shè)計(jì)有機(jī)小分子模擬物和肽模擬物，以通過(guò)模擬蛋白折疊表面(即三級(jí)結(jié)構(gòu))的這些局部結(jié)構(gòu)單元(即二級(jí)結(jié)構(gòu))來(lái)發(fā)揮其生物活性。“肽模擬物”或“擬肽”是指各種類(lèi)型和類(lèi)別的分子，只要所得分子模擬或類(lèi)似所需多肽二級(jí)(或局部三級(jí))結(jié)構(gòu)單元。舉例來(lái)說(shuō)，肽模擬物是通過(guò)使用酰胺鍵等排體和/或天然肽骨架的修飾(包括鏈延長(zhǎng)或雜原子并入)來(lái)模擬肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的寡聚體；其實(shí)例包括氮雜肽、寡氨基甲酸鹽、寡脲、β-肽、γ-肽、寡(亞苯基乙炔撐)、乙烯類(lèi)似(vinylogous)磺酰肽、聚-N-取代甘氨酸(類(lèi)肽)和類(lèi)似物(例如，參看Gellman，1998；Kirshenbaum等人，1999；Barron和Zuckermann，1999)。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知設(shè)計(jì)和合成肽模擬物的方法。在某些實(shí)施例中，預(yù)期肽模擬物用于克服蛋白酶敏感性、穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)和/或相對(duì)于天然發(fā)生的CCL5肽類(lèi)似物改進(jìn)生物利用率。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的肽模擬物是回折模擬物，例如β-轉(zhuǎn)角模擬物、單環(huán)β-轉(zhuǎn)角模擬物、雙環(huán)β-轉(zhuǎn)角模擬物、γ-轉(zhuǎn)角模擬物或單環(huán)γ-轉(zhuǎn)角模擬物。通常認(rèn)為β-鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)是隨機(jī)構(gòu)型，但最近認(rèn)為其是許多生物分子受體所識(shí)別的蛋白結(jié)構(gòu)的基本與離散單元。舉例來(lái)說(shuō)，已經(jīng)令人信服地證明，所有蛋白水解酶以經(jīng)延長(zhǎng)的β-鏈結(jié)構(gòu)與其抑制劑/底物結(jié)合，其中肽骨架或等同非肽分子呈線性構(gòu)型排列(Tyndall和Fairlie，1999；Fairlie等人，2000；Bode和Huber，1992)。β-轉(zhuǎn)角是多肽結(jié)構(gòu)中多肽鏈反向的部位。這些轉(zhuǎn)角為極性，且主要位于蛋白分子的表面上(即溶劑所暴露)，并且因此充當(dāng)受體結(jié)合、抗體識(shí)別和肽模擬物設(shè)計(jì)的理想部位。因此，在某些實(shí)施例中，抑制或預(yù)防哺乳動(dòng)物受檢者內(nèi)的副粘病毒感染的分子是肽模擬物或有機(jī)小分子模擬物(下文“小分子”或“小分子模擬物”)。本發(fā)明的肽模擬物或小分子模擬物被設(shè)計(jì)成模擬或類(lèi)似于下文所述CCL5多肽或其經(jīng)修飾的CCL5多肽(例如Met-CCL5；AOP-CCL5)的某些二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)單元。通過(guò)二維和三維NMR已經(jīng)分解出CCL5的三維溶液結(jié)構(gòu)(Skelton等人，1995)。所獲NMR數(shù)據(jù)用于產(chǎn)生20成員總體的能量最低的CCL5結(jié)構(gòu)，其以1RTN登記名存放在BrookhavenProteinDataBank中。也存放了用20個(gè)CCL5結(jié)構(gòu)通過(guò)2000步計(jì)算機(jī)模擬(insilico)能量最低化計(jì)算出的平均CCL5結(jié)構(gòu)(PDB登記名1RTO)。最近，已經(jīng)化學(xué)合成了AOP-CCL5，且分解出了它的高解析度(1.6A)晶體結(jié)構(gòu)，并且以PDB登記名1B3A存放(Wilken等人，1999)，其后不久分解出Met-CCL5的高解析度(1.6A)晶體結(jié)構(gòu)，其以DB登記名lEQT存放(Hoover等人，2000)。CCL5的多肽折疊與其他CC和CXC多肽的折疊相似，形成三鏈、反平行的β-片層，其側(cè)翼為COOH-末端α-螺旋。下表5A和表5B中分別列出由NMR(PDB1RTO；Skelton等人，1995)和X射線結(jié)晶學(xué)(PDB1B3A；Wilken等人，1999)所確定的CCL5和AOP-CCL5的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元。表5ACCL5二級(jí)結(jié)構(gòu)表5BAOP-CCL5二級(jí)結(jié)構(gòu)CCL5二聚體的NMR溶液結(jié)構(gòu)(Skelton等人，1995)展示部分雜亂的NH2-末端區(qū)，接著是指向標(biāo)記二-半胱氨酸基序的短鏈(β0)，以310轉(zhuǎn)角結(jié)束的延長(zhǎng)區(qū)(NH2-環(huán))、由環(huán)所連接的三條反平行β-鏈(β1-β3)和COOH-末端α-螺旋。趨化因子二聚體的生理相關(guān)性仍然存在爭(zhēng)論，但是最近的研究指出CCL5的生物學(xué)功能依賴(lài)于二聚結(jié)構(gòu)(Nardese等人，2001)。根據(jù)兩位點(diǎn)趨化因子模型，趨化因子的兩個(gè)截然不同的區(qū)域參與與趨化因子受體的互作對(duì)受體活化而言關(guān)鍵性的NH2-末端，和負(fù)責(zé)主要對(duì)接事件(dockingevent)的另一域，有人提出其包括NH2-環(huán)區(qū)域(Clark-Lewis，1994；Schraufstatter，1995；Lowman等人，1996；Pakianathan等人，1997；Crump等人，1997Hemmerich等人，1999；Laurence等人，2000)。因?yàn)橼吇蜃铀閷?dǎo)的HIV-1阻斷和HIV-1共受體功能均不需要趨化因子受體的信號(hào)傳遞活性，因此相信NH2-環(huán)在HIV-1感染的生理學(xué)中起樞紐作用(Nardese等人，2001)。CCL5的功能作圖(描述于上文A.1部分)符合NMR溶液結(jié)構(gòu)(Nardese等人，2001)。CCL5二聚體的表面靜電勢(shì)的分析表明，對(duì)于HIV-1抗病毒活性關(guān)鍵的NH2-環(huán)殘基(Phe12、Tyr14和Ile15)顯示于分子表面上，在那里它們有助于大(1802)疏水性溶劑暴露片的形成。此結(jié)構(gòu)特征與作為受體對(duì)接位點(diǎn)的潛在作用一致。舉例來(lái)說(shuō)，Phe12在相關(guān)CC趨化因子MCP-1中結(jié)構(gòu)上與Tyr13等同，所述Tyr13與CCR2結(jié)合有關(guān)，并且與其他NH2-環(huán)殘基一起促使形成疏水性表面槽。類(lèi)似地，MIP-1β中的等同殘基Phe13對(duì)于CCR5結(jié)合與趨化因子二聚化起關(guān)鍵作用。然而，CCL5上的疏水性片也涵蓋位于展示HIV-1抗病毒活性的β1-鏈肽的中心的芳香烴殘基簇(Tyr27-Tyr29)(例如，參看上文部分A.1)。因此，Nardese等人的結(jié)構(gòu)分析揭示NH2-環(huán)與β1-鏈殘基均有助于假定的CCR5受體界面的形成。令人感興趣的是，CCL5的β1-鏈殘基并非是抑制哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞的RSV感染所需的，這暗示了RSV感染的CCL5抑制的替代機(jī)制(或替代結(jié)構(gòu)單元)的可能性(即相對(duì)于HIV-1感染)。具有倒轉(zhuǎn)氨基酸手性的肽模擬物(即天然發(fā)生L-氨基酸立體異構(gòu)體的D-氨基酸立體異構(gòu)體)本能地抵抗蛋白酶所介導(dǎo)的消化，并且因此代表用于治療應(yīng)用的合適候選者。Nardese等人(2001)合成具有反向肽鍵以阻止原初側(cè)鏈局部化學(xué)的NH2-環(huán)/β1-鏈19聚體的倒轉(zhuǎn)模擬物。逆轉(zhuǎn)肽(Ac-D-Tyr29-D-Cys11-NH2；SEQIDNO19)有效抑制HIV-1包膜所介導(dǎo)的細(xì)胞融合，其效力(平均ID50＝13.3+/-2.7μM)與其L-氨基酸對(duì)應(yīng)物(SEQIDNO16)可比，并且其對(duì)抗趨化現(xiàn)象。相反，用具有相似氨基酸組成和疏水性值的對(duì)照逆轉(zhuǎn)肽未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生作用。這些生物學(xué)活性證實(shí)逆轉(zhuǎn)引起肽側(cè)邊側(cè)鏈的原初空間定向的保存的預(yù)測(cè)。因此，在某些實(shí)施例中，本發(fā)明針對(duì)從SEQIDNO1約氨基酸殘基1至約氨基酸殘基30的CCL5多肽的肽模擬物，其中肽模擬物抑制哺乳動(dòng)物受檢者的副粘病毒感染。在一個(gè)特定實(shí)施例中，肽模擬物基于如SEQIDNO2所示的SEQIDNO1的NH2-末端CCL5肽片段的氨基酸殘基1至15，并且展示抑制RSV感染(實(shí)例4)。在另一個(gè)實(shí)施例中，肽模擬物基于SEQIDNO1的氨基酸殘基1至22。在另一個(gè)實(shí)施例中，肽模擬物基于SEQIDNO1的氨基酸殘基1至29。在另一個(gè)實(shí)施例中，肽模擬物是包含以如下反向順序的SEQIDNO1氨基酸殘基11至29的逆轉(zhuǎn)肽Ac-YFYEKIHARPLPRAIYAFC-NH2(SEQIDNO19)，下文表示為“Ac-D-Tyr29-D-Cys11-NH2”。在另一個(gè)實(shí)施例中，肽模擬物是包含以如下反向順序的SEQIDNO1氨基酸殘基1至34的逆轉(zhuǎn)肽Ac-CKGSTYFYEKIHARPLRPAIYAFCCPTTDSSYPS-NH2(SEQIDNO20)，下文表示為“Ac-D-Cys34-D-Ser1-NH2”。在另一個(gè)實(shí)施例中，肽模擬物是包含以如下反向順序的SEQIDNO1氨基酸殘基1至15的逆轉(zhuǎn)肽Ac-IYAFCCPTTDSSYPS-NH2(SEQIDNO21)，下文表示為“Ac-D-Iso15-D-Ser1-NH2”。在另一個(gè)實(shí)施例中，肽模擬物或小分子模擬物包含NH2-環(huán)氨基酸Phe12、Tyr14和Ile15的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)單元。如下文所述，這些結(jié)構(gòu)單元可通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬分子模型化和選自由1EQT(Met-CCL5)、1B3A(AOP-CCL5)和1RTO(CCL5)組成的群組的BrookhavenProteinDataBank分子坐標(biāo)登記文件的直觀化而輕易地確定。在其他實(shí)施例中，CCL5(PDB1RTN；PDB1RTO)、Met-CCL5(PDB1EQT)和/或AOP-CCL5(PDB1B3A)的分子坐標(biāo)用于產(chǎn)生(通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬分子模型化)SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO18或其N(xiāo)H2-末端片段的第二代肽模擬物。如前文所述，CCL5的多肽折疊與其他CC和CXC趨化因子(例如CCL3、CCL4)的多肽折疊相似。然而，本發(fā)明證明CCL5，而不是CCL3(MIP-1α)或CCL4(MIP-1β)抑制上皮細(xì)胞的RSV感染，這暗示RSV(與HIV-1相反)可能利用不同于CCR5的受體。為了進(jìn)一步闡述CCL5所介導(dǎo)的RSV感染的抑制的序列和/或結(jié)構(gòu)要求，通過(guò)氨基酸序列比對(duì)(表6)、水療法曲線(圖4A和圖4B)和分子模型化/直觀化(圖11)來(lái)比較CCL5和CCL3多肽。如實(shí)例5所述，CCL5與CCL3(MIP-1α)序列的比較表明CCL5與CCL3共享32個(gè)一致氨基酸(即48％一致性)，并且具有約78％氨基酸序列相似性(表6)。表6CCL5與CCL3的BLAST比對(duì)全長(zhǎng)CCL5與全長(zhǎng)CCL3的水療法曲線(Kyte和Doolittle，1982)的比較(圖4A和圖4B)表明，CCL5與CCL3間的最大水療序列分歧發(fā)生在這些多肽的NH2-末端內(nèi)(例如，參看實(shí)例5)。計(jì)算機(jī)模擬(SWISS-MODEL和Swiss-PdbViewer(Guex和Peitsch，1997))模型化CCL5(PBD1RTO)與CCL3(PBD1B53)的能量最低結(jié)構(gòu)，并且三級(jí)結(jié)構(gòu)(或折疊)疊加，NH2-末端氨基酸1至7(數(shù)據(jù)未顯示)和COOH-末端氨基酸64至68除外。與CCL5/CCL3水療法曲線相似(圖4A)，CCL5與CCL3之間的最大結(jié)構(gòu)序列分歧發(fā)生在NH2-末端氨基酸殘基內(nèi)。不希望由任何特定理論約束，預(yù)期HIV-1感染的CCL5抑制與RSV抑制之間的差異可能部分上是由CCL5NH2-末端的前15個(gè)氨基酸調(diào)控。因此，在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的肽模擬物或小分子模擬物模擬包含SEQIDNO2氨基酸序列的CCL5NH2-末端肽片段。在一個(gè)特定實(shí)施例中，如表7所闡述，肽模擬物基于CCL5、AOP-CCL5或Met-CCL5的前15個(gè)氨基酸的二面角。表7CCL5、MET-CCL5和AOP-CCL5的前15個(gè)NH2-末端氨基酸的二面角在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，抗病毒分子是抑制或預(yù)防哺乳動(dòng)物細(xì)胞的副粘病毒感染的非肽小分子模擬物(與肽模擬物相反)。與肽模擬物的設(shè)計(jì)類(lèi)似，本發(fā)明的非肽小分子被設(shè)計(jì)成模擬SEQIDNO1的CCL5多肽的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)單元或氨基酸殘基。在一個(gè)特定實(shí)施例中，小分子基于SEQIDNO2所示的SEQIDNO1的NH2-末端CCL5肽片段的氨基酸殘基1至15。在另一個(gè)實(shí)施例中，小分子基于SEQIDNO13所示的SEQIDNO1的氨基酸殘基11至22。在另一個(gè)實(shí)施例中，小分子基于SEQIDNO16所示的SEQIDNO1的氨基酸殘基11至29。在另一個(gè)實(shí)施例中，小分子基于SEQIDNO18的逆轉(zhuǎn)肽模擬物Ac-D-Tyr29-D-Cys11-NH2。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的小分子模擬由NH2-環(huán)的氨基酸殘基Phe12、Ala13、Tyr14和He15所形成的CCL5疏水性片。在某些實(shí)施例中，小分子模擬物包含如功能性和折疊CCL5多肽中所發(fā)現(xiàn)的氨基酸Phe12、Tyr14和Ile15的三維分子排列，其中根據(jù)CCL5(PDB1RTO)分子坐標(biāo)、AOP-CCL5(PDB1B3A)或Met-CCL5(PDB1EQT)分子坐標(biāo)的二面角，Phe12、Tyr14和Ile15空間受束縛。在其他實(shí)施例中，如Nardese等人所描述(2001)，本發(fā)明的小分子模擬由NH2-環(huán)的氨基酸殘基Phe12、Ala13、Tyr14和Ile15以及β-片層的殘基Tyr27、Phe28和Tyr29所形成的CCL5疏水性片。在某些其他實(shí)施例中，CCL5(PDB1RTN；PDB1TRO)、Met-CCL5(PDB1EQT)和/或AOP-CCL5(PDB1B3A)的分子坐標(biāo)用于產(chǎn)生(通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬分子模型化和計(jì)算)模擬CCL5疏水性片的小分子。如上所述，本發(fā)明的某些數(shù)據(jù)表明CCR3是用于RSV進(jìn)入哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞的共受體。因此，在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明針對(duì)與CCR3受體的小分子拮抗劑、CCR3受體的肽拮抗劑、CCR3受體模擬物或其組合結(jié)合投藥的本發(fā)明抗病毒分子。在某些實(shí)施例中，CCR3拮抗劑是包含一個(gè)或一個(gè)以上的以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的分子在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的抗病毒分子與CCR1受體的小分子拮抗劑結(jié)合投藥。在某些實(shí)施例中，CCR1拮抗劑是包含一個(gè)或一個(gè)以上的以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的分子在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的抗病毒分子與CCR5受體的小分子拮抗劑結(jié)合投藥。在某些實(shí)施例中，CCR5拮抗劑是包含一個(gè)或一個(gè)以上的以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的分子B.編碼趨化因子的多核苷酸、重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞在某些實(shí)施例中，趨化因子多肽(例如CCL5、CCL3)、截短型趨化因子多肽(例如CCL5A1-8)、趨化因子片段(例如SEQIDNO2的CCL5)等重組表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，編碼趨化因子多肽的多核苷酸包含于質(zhì)粒載體中，并且在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)。編碼本發(fā)明全長(zhǎng)CCL5多肽的多核苷酸序列如SEQIDNO23所述。當(dāng)將趨化因子多核苷酸用于趨化因子多肽、其片段或其截短物的重組產(chǎn)生時(shí)，所述多核苷酸包括所述多肽的編碼序列或讀碼框中多肽的編碼序列和其他編碼序列，例如編碼前導(dǎo)或分泌序列、前體蛋白(pre-protein)序列、蛋白原(pro-protein)序列、前蛋白原(prepro-protein)序列或其他融合肽部分的序列。舉例來(lái)說(shuō)，有助于經(jīng)融合多肽純化的標(biāo)記序列可以與編碼序列連接(參看Gentz等人，1989，其全文以引用的方式并入本文)。因此，本發(fā)明預(yù)期制備出允許表達(dá)產(chǎn)物的His標(biāo)簽純化的融合多肽的多核苷酸。多核苷酸也可以含有非編碼5’和3’序列，例如轉(zhuǎn)錄、非轉(zhuǎn)錄序列，拼接和聚腺苷酸化信號(hào)。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)其所連接的另一核酸的核酸分子。本發(fā)明的載體包括所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的載體，例如質(zhì)粒載體、病毒載體和類(lèi)似載體。原核生物中蛋白的表達(dá)最通常是在大腸桿菌(E.coli)中用含有針對(duì)融合蛋白或非融合蛋白表達(dá)的組成型或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的載體進(jìn)行。融合載體向其中所編碼的蛋白、向重組蛋白的氨基或羧基末端加入若干氨基酸。所述融合載體通常用于三種目的1)增加重組蛋白的表達(dá)；2)增加重組蛋白的溶解性；和3)通過(guò)充當(dāng)親合純化中的配體來(lái)輔助重組蛋白的純化。在融合表達(dá)載體中，通常在融合部分與重組蛋白的連接位點(diǎn)處引入蛋白水解裂解位點(diǎn)，以能夠在融合蛋白純化之后將重組蛋白從融合部分分離出來(lái)。所述酶和其相關(guān)識(shí)別序列包括因子X(jué)a、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達(dá)載體包括分別將谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或蛋白A融合于目標(biāo)重組蛋白的pGEX(PharmaciaBiotechInc；Smith和Johnson，1988)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly；MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)。合適的可誘導(dǎo)的非融合大腸桿菌表達(dá)載體的實(shí)例包括pTrc(Amann等人，1988)和pETIld(Studier等人，1990)。在某些實(shí)施例中，將重組表達(dá)載體引入至“宿主細(xì)胞”內(nèi)，其中表達(dá)趨化因子多肽。本文可交替使用“經(jīng)遺傳工程改造的宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”。宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，趨化因子多肽在細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌、卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis))、昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如Sf9或Sf21細(xì)胞)、酵母(例如釀酒酵母(S.cerevisiae))或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、NIH3T3、PER.C6、NSO或COS細(xì)胞)中表達(dá)。其他合適宿主細(xì)胞為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知。通過(guò)常用轉(zhuǎn)化、侵染或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入至原核或真核細(xì)胞內(nèi)。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”、“侵染”和“轉(zhuǎn)染”意指多種用于將外源核酸(例如DNA)引入至宿主細(xì)胞內(nèi)的所屬領(lǐng)域所公認(rèn)的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-右旋糖所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(lipofection)、侵染或電穿孔。轉(zhuǎn)化、侵染或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法可參看Sambrook等人(″MolecularCloningALaboratoryManual″第2版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989)和其他實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。本發(fā)明宿主細(xì)胞，例如培養(yǎng)物中原核或真核宿主細(xì)胞，也可以用于生產(chǎn)(即表達(dá))大量的所需趨化因子多肽。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供用本發(fā)明的宿主細(xì)胞生產(chǎn)趨化因子多肽的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法包含在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(向其中引入編碼多肽的重組表達(dá)載體)直至趨化因子多肽產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含將趨化因子多肽從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞中分離出來(lái)。本發(fā)明的表達(dá)載體可用作制備大量自身編碼趨化因子多肽的DNA的手段，并且可用作制備編碼多肽的手段。預(yù)期當(dāng)本發(fā)明的趨化因子多肽通過(guò)重組手段制備時(shí)，可采用原核或真核表達(dá)載體作為穿梭系統(tǒng)。C.抗病毒醫(yī)藥組合物在某些優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明抗病毒分子和醫(yī)藥學(xué)可接受的載劑的醫(yī)藥組合物。將抗病毒分子并入適于投用與例如人類(lèi)的哺乳動(dòng)物受檢者的醫(yī)藥組合物中。所述組合物通常包含“活性”成分(即抗病毒分子)和“醫(yī)藥學(xué)可接受的載劑”。如下文所使用，術(shù)語(yǔ)“醫(yī)藥學(xué)可接受的載劑”意欲包括與醫(yī)藥投藥相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑和類(lèi)似物質(zhì)。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知所述介質(zhì)和試劑用于醫(yī)藥活性物質(zhì)的使用方法。只要任何常用介質(zhì)或試劑與活性化合物相容，那么所述介質(zhì)就可用于本發(fā)明的組合物中。組合物中也可以并入補(bǔ)充性活性化合物。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物被調(diào)配成適合其預(yù)期投藥途徑。投藥途徑的實(shí)例包括非經(jīng)腸(例如靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi))、粘膜(例如口服、直腸、鼻內(nèi)、面頰、陰道、呼吸道)和透皮(局部)。用于非經(jīng)腸、真皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或懸浮液可以包括以下組份無(wú)菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細(xì)菌劑，例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲脂；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；緩沖劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；和用于調(diào)節(jié)張性的試劑，例如氯化鈉或右旋糖?？捎盟峄驂A調(diào)節(jié)pH值，例如鹽酸或氫氧化鈉。非經(jīng)腸制劑可密封于安瓿、一次性注射器或者由玻璃或塑料制成的多劑量瓶?jī)?nèi)。適于可注射使用的醫(yī)藥組合物包括無(wú)菌含水溶液(其中水可溶)或分散液，和用于臨時(shí)制備無(wú)菌可注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。對(duì)于靜脈內(nèi)投藥來(lái)說(shuō)，合適載劑包括生理鹽水、細(xì)菌抑制水、CremophorELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情形下，組合物必須為無(wú)菌，并且應(yīng)為一定程度的流體以易于注射。組合物在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下應(yīng)該穩(wěn)定，并且應(yīng)針對(duì)免受微生物(例如細(xì)菌和真菌)污染行為而保存。載劑是含有(例如)水、乙醇、多元醇(甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)和其合適混合物的溶劑或分散介質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)使用例如卵磷脂的涂層，通過(guò)維持分散液情形下的所需粒子大小和通過(guò)使用表面活性劑來(lái)維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。通過(guò)各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑來(lái)防止微生物行為，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸和類(lèi)似試劑。在許多情形下，組合物中優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖、多元醇，例如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。通過(guò)在組合物中包括延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，來(lái)產(chǎn)生可注射組合物的延長(zhǎng)吸收。通過(guò)在具有一種上述所列的成分或上述成分的組合的適當(dāng)溶劑中并入所需量的活性化合物來(lái)制備無(wú)菌可注射溶液，隨后如果需要?jiǎng)t進(jìn)行過(guò)濾滅菌。通常通過(guò)將活性化合物并入至含有堿性分散介質(zhì)和上文所列的所需其他成分的無(wú)菌媒劑中來(lái)制備分散液。在用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末的情形下，優(yōu)選制備方法是真空干燥和冷凍干燥，從而由先前無(wú)菌過(guò)濾溶液產(chǎn)生活性成分和任何其他所需成分的粉末?？诜M合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載劑。其可以密封于明膠膠囊內(nèi)或壓制成片劑。為了達(dá)到口服治療投藥的目的，在活性化合物中并入賦形劑，并且以片劑、錠劑或膠囊的形式使用。也可以用流體載劑制備口服組合物以用作漱口水，其中流體載劑中的化合物口服并漱口，并且吐出或咽下。醫(yī)藥學(xué)相容粘合劑和/或佐劑物質(zhì)也可以作為組合物的部分包括在內(nèi)。片劑、藥丸、膠囊、錠劑和類(lèi)似劑型可以含有任何以下的成分或相似性質(zhì)的化合物粘合劑，例如微晶纖維素、黃芪膠或明膠；賦形劑，例如淀粉或乳糖；崩解劑，例如褐藻酸、羥基乙酸淀粉鈉(Primogel)或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑，例如膠狀二氧化硅；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或者調(diào)味劑，例如薄荷油、水楊酸甲酯或橘子香料。對(duì)于吸入投藥來(lái)說(shuō)，以來(lái)自加壓容器或含有例如氣體(例如二氧化碳)的合適推進(jìn)劑的配出器或噴霧器的氣溶膠噴霧形式傳遞化合物。也可以通過(guò)粘膜或透皮手段來(lái)全身性投藥。對(duì)于粘膜或透皮投藥來(lái)說(shuō)，調(diào)配物中使用對(duì)于待滲透屏障適當(dāng)?shù)臐B透劑。所述滲透劑通常是所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的，并且對(duì)于粘膜投藥來(lái)說(shuō)包括(例如)去污劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。通過(guò)使用鼻噴霧器或栓劑來(lái)完成粘膜投藥。對(duì)于透皮投藥來(lái)說(shuō)，將活性化合物調(diào)配成所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
通常已知的藥膏、軟膏、膠或乳膏。對(duì)于直腸傳遞來(lái)說(shuō)，也以栓劑(例如用常用栓劑基，例如可可油和其他甘油酯)或延遲灌腸劑的形式制備化合物。在一個(gè)實(shí)施例中，用可以保護(hù)化合物以免從身體快速消除的載劑制備活性化合物，例如受控釋放調(diào)配物，其包括植入體和微膠囊傳遞系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾?、生物可相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(ethylenevinylacetate)、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原質(zhì)、聚原酸酯和聚乳酸。制備所述調(diào)配物的方法對(duì)于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。所述物質(zhì)也可商業(yè)購(gòu)自AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals，Inc。脂質(zhì)體懸浮液(包括靶向具有抗病毒抗原的單克隆抗體的受染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也用作醫(yī)藥學(xué)可接受的載劑。根據(jù)所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
已知方法制備所述物質(zhì)，例如如美國(guó)專(zhuān)利第4,522,811號(hào)所描述的方法，其以引用的方式并入本文。將口服或非經(jīng)腸組合物調(diào)配成易于投藥且劑量均一的劑量單位形式是尤其有利的。下文所用的劑量單位形式是指適合作為待治療的受檢者的一元?jiǎng)┝康奈锢黼x散單位；各單位含有經(jīng)計(jì)算與所需醫(yī)藥載劑結(jié)合產(chǎn)生所需治療作用的預(yù)定量的活性化合物。本發(fā)明劑量單位形式的具體情況受支配于或直接依賴(lài)于活性化合物的獨(dú)特特征和待達(dá)到的特定治療作用以及復(fù)合所述活性化合物以治療個(gè)體的
技術(shù)領(lǐng)域：
的固有限制。應(yīng)了解，醫(yī)藥學(xué)可接受的媒劑是指進(jìn)入醫(yī)藥組合物中不引起副作用，且(例如)可能有助于活性化合物投藥，增加醫(yī)藥組合物體內(nèi)壽命和/或效力，增加醫(yī)藥組合物在溶液中的溶解性或增強(qiáng)醫(yī)藥組合物的保存的化合物或化合物組合。這些醫(yī)藥學(xué)可接受的媒劑是眾所周知的，并且可以由所屬領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所選活性化合物的性質(zhì)和投藥模式來(lái)調(diào)整。本發(fā)明的組合物通常以含有標(biāo)準(zhǔn)的、熟知的無(wú)毒生理可接受的載劑、佐劑和媒劑(如果需要)的劑量單位調(diào)配物非經(jīng)腸投藥。下文所用術(shù)語(yǔ)非經(jīng)腸包括靜脈內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)注射或輸液技術(shù)。根據(jù)已知技術(shù)，使用合適分散劑或濕潤(rùn)劑和懸浮劑來(lái)調(diào)配可注射制劑，例如無(wú)菌可注射水性或油性懸浮液。無(wú)菌可注射制劑也可以是無(wú)毒非經(jīng)腸可接受的稀釋劑或溶劑中的無(wú)菌可注射溶液或懸浮液，例如1，3-丁二醇溶液。在這些可接受的媒劑和溶劑中，可以使用水、林格(Ringer)溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，習(xí)慣上將無(wú)菌、固定油用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可以使用任何溫和固定油，包括合成單甘油酯或二甘油酯。此外，脂肪酸，例如油酸，可以用于制備可注射制劑。優(yōu)選載劑包括用磷酸鹽、乳酸鹽、三羥甲基氨基甲烷(Tris)和類(lèi)似物緩沖的中性鹽水溶液。當(dāng)投用病毒載體時(shí)，載體經(jīng)充分純化以使其基本上無(wú)不良污染物，例如缺陷干擾腺病毒顆?；騼?nèi)毒素和其他熱原質(zhì)，因此其不在接受載體構(gòu)建體的個(gè)體中引起任何不適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)。純化載體的優(yōu)選手段包括使用浮力密度梯度，例如氯化銫梯度離心。載劑可以是脂質(zhì)體。用脂質(zhì)體作為傳遞媒劑的手段在所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中是熟知的。本文所引用的所有專(zhuān)利和公開(kāi)案均以引用的方式并入本文。D.實(shí)例除另有詳細(xì)描述外，均使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知和常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)進(jìn)行以下實(shí)例。以下實(shí)例僅為說(shuō)明性的目的，而不應(yīng)理解為以任何方式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)例1材料與方法趨化因子與試劑。除另有說(shuō)明外，所有重組(r)人類(lèi)趨化因子和抗人類(lèi)趨化因子受體抗體均購(gòu)自R&DSystemsInc.(Minneapolis，MN)。重組人類(lèi)CCL5和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)-1α(CXCL12)分別自BiosourceInternational(Camarillo，CA)和Wyeth(Andover，MA)獲得。所述研究中使用抗CC趨化因子受體(CCR)的單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體(mAb)針對(duì)人類(lèi)CCR3(目錄號(hào)MAB155)或CCR5(目錄號(hào)MAB182)。針對(duì)來(lái)自CCR1(目錄號(hào)sc-7934)、CCR3(目錄號(hào)sc-7897)、CCR4(目錄號(hào)sc-6126)或CCR5(目錄號(hào)sc-8283)的肽序列而培育的經(jīng)親合純化的多克隆抗體是購(gòu)自SantaCruzBiotechnology(SantaCruz，CA)?？谷祟?lèi)CX3CR1多克隆抗體(目錄號(hào)TP502AF)是購(gòu)自TorreyPinesBiolabs(Houston，TX)。CCL5的一系列9個(gè)重疊合成肽(表1)(Schall等人，1988)是購(gòu)自Sigma-Genosys(TheWoodlands，TX)，或用標(biāo)準(zhǔn)肽化學(xué)方法合成。根據(jù)廠商說(shuō)明(Pierce；Rockford，IL)用EZ-LINKTMNHS(N-羥基琥珀酰亞胺生物素)化學(xué)標(biāo)記所述肽。對(duì)于活體外和活體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，分別將凍干肽溶解于補(bǔ)充有5％(V/V)FBS(Hyclone；Logan，UT)、2mML-谷氨酰胺和2％青霉素(penicillin)/鏈霉素(streptomycin)(GibcoBRL)的Dulbecco最小基本培養(yǎng)基(Dulbecco’sMinimumEssentialMedia)(DMEM，GibcoBRL；GrandIsland，NY)中；或者重構(gòu)于PBS中，并且在指定濃度下使用。所述肽純度均大于90％?？谷诤弦种苿㏑FI-641(Raznikov等人，2001)在PBS中稀釋?zhuān)⑶乙?5微克/劑量活體內(nèi)投放。病毒備料。如上所述(Hancock等人，1996)，在完全培養(yǎng)基(補(bǔ)充有2mML-谷氨酰胺、2％青霉素/鏈霉素和10％(V/V)FBS的DMEM，37℃、5％CO2)中培養(yǎng)的HEp-2細(xì)胞(ATCCCCL23)中繁殖野生型RSV菌株A2與B1(Wright等人，1973)和缺失SH與G基因(核苷酸4064-5462)的突變體RSV菌株cpts248/404(Ackerlind等人，1988)、rA2cpts248/404ASH(Crowe等人，1994)和cp32/D1(Karron等人，1997))。使用上文所述用于cp52的方法從B1菌株分離cp32/D1突變體(Crowe等人，1996；Karron等人，1997)。在所述研究中也使用在G蛋白的氨基酸117處用遺傳工程方法截短的重組RSV(rA2cpΔG118)。所有病毒備料均通過(guò)4℃下15分鐘低速(200g)離心凈化從細(xì)胞溶菌產(chǎn)物中制備。病毒感染性活體外抑制。使HEp-2細(xì)胞單層在含有完全培養(yǎng)基的96孔組織培養(yǎng)板(Falcon，BectonDicksonandCo.；FranklinLakes，NJ)中生長(zhǎng)。在一式三份含有指定量重組趨化因子或抗趨化因子受體抗體的孔中，在4℃或37℃下預(yù)處理所述單層1小時(shí)。在移去趨化因子或抗體之后，在相同溫度下用所示野生型或突變型RSV菌株侵染單層1小時(shí)，并且隨后覆蓋上2％葡聚糖(Sephadex)(AmershamBiosciences；Piscataway，NJ)。也在細(xì)胞受侵染之后1小時(shí)，或者在將單層同時(shí)暴露于病毒與指定劑量的趨化因子或CCL5肽的1∶1混合物之后評(píng)估抗病毒活性。單獨(dú)或組合測(cè)試5至100μg/ml培養(yǎng)基劑量范圍內(nèi)的抗趨化因子受體抗體的抑制特性。病毒感染性活體內(nèi)抑制。在以RSV的A2菌株(約2×106pfu)的1∶1混合物攻毒之前1小時(shí)或之后1小時(shí)或與其同時(shí)對(duì)雌性BALB/c小鼠(8-10周齡，CharlesRiverLaboratories；Wilmington，ME)投與肽(125微克至500微克/劑量)。所有投藥均為鼻內(nèi)(0.05ml)，并且在注射麻醉下進(jìn)行(60mg克他命(ketamine)/千克和2.5mg賽拉嗪(xylazine)/千克(TheButlerCo.；DublinOH))。四天之后移去肺，勻質(zhì)化，并通過(guò)低速離心凈化，驟冷，并儲(chǔ)存于-70℃下直至用HEp-2細(xì)胞單層進(jìn)行菌斑測(cè)定(Hancock等人，1996)。所有動(dòng)物均在美國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理認(rèn)證協(xié)會(huì)(AmericanAssociationforAccreditationofLaboratoryAnimalCare)許可的設(shè)施中圈養(yǎng)。菌斑測(cè)定。用抗F蛋白(L4)mAb如上文所述(Hancock等人，1996)顯現(xiàn)病毒菌斑(Paradiso等人，1991；Walsh和Hruska，1983)。其后，用blotto封閉劑(PBS，5％奶粉)沖洗細(xì)胞，并且用辣根過(guò)氧化物酶共扼山羊抗小鼠IgG((KirkegaardandPerryLaboratories，Inc.；Gaithersburg，MD)培養(yǎng)。用含有在PBS中的0.1％H2O2的0.05％4-氯-1-萘酚檢測(cè)結(jié)合抗體。菌斑計(jì)數(shù)之后，相對(duì)于僅暴露于培養(yǎng)基中病毒而無(wú)趨化因子或抗趨化因子受體抗體的單層，計(jì)算平均感染百分比(一式三份孔的±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。CCL5肽與HEp-2細(xì)胞的相互作用。使用ELISA評(píng)估合成肽與HEp-2細(xì)胞單層的相對(duì)結(jié)合。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，以每孔0.2ml完全培養(yǎng)基中3×104HEp-2細(xì)胞接種96孔板(Falcon)。過(guò)夜培養(yǎng)(37℃，5％CO2)之后，在冰上冷卻單層大約15分鐘。向二份重復(fù)孔中加入從0.49μg至500μg/mlDMEM(補(bǔ)充有1％FBS、2％青霉素/鏈霉素和2mML-谷氨酰胺)的上升劑量的經(jīng)生物素標(biāo)記的肽，并且在4℃下培養(yǎng)1小時(shí)。隨后用80％甲醇(JTBaker；Phillipsburg，NJ)固定(室溫下20分鐘)單層。用PBS洗滌之后，用0.3％(V/V)H2O2(Sigma；St.LouisMO)培養(yǎng)單層(室溫下30分鐘)，再次洗滌并且用經(jīng)生物素標(biāo)記的抗人類(lèi)CCL5mAb(R&Dsystems)探查(4℃下30分鐘)。其后，用抗生蛋白鏈菌素-HRP(Zymed；SanFrancisco，CA)培養(yǎng)單層(室溫下1小時(shí))。用TMB一步底物溶液(TMBOne-StepSubstrateSolution)(DAKO；Carpinteria，CA)顯影孔。用MolecularDevicesVersamax酶標(biāo)儀(microplatereader)(Sunnyvale，CA)測(cè)定(450nm，參照為550nm)光密度。流式細(xì)胞術(shù)。為了確定CCR的表達(dá)，用細(xì)胞刮取器將A549和HEp-2細(xì)胞從6孔板(Falcon)小心地移出，并且用抗CCR1(目錄號(hào)FAB182F)、CCR3(目錄號(hào)FAB145P)或CCR5(目錄號(hào)FAB155P)的經(jīng)生物素標(biāo)記的mAb培養(yǎng)，接著用抗生蛋白鏈菌素-藻紅蛋白培養(yǎng)。用標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)分析細(xì)胞(FACSort，BeetonDickinson；MountainView，CA)。所有試劑均購(gòu)自R&Dsystems。檢測(cè)CCL5。根據(jù)廠商(R&DSystems)說(shuō)明用ELISA檢測(cè)RSV感染24小時(shí)后HEp-2和A549上皮細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液中所分泌的CCL5。用MolecularDevicesVersamax酶標(biāo)儀測(cè)定(450nm，參照為550nm)光密度。為了確定感染之后CCL5mRNA復(fù)制體數(shù)目和RSV基因組數(shù)目，開(kāi)發(fā)出定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)測(cè)定法。用RNeasy小量試劑盒(MiniKit)(Qiagen；Valencia，CA)和QiaShredders(Qiagen)從細(xì)胞單層分離出總細(xì)胞RNA。在加入RiboGreenRNA定量試劑(QuantitationReagent)(MolecularProbes；Eugene，OR.)之后，在CytoFluor4000熒光讀板儀(AppliedBiosystems)上測(cè)量RNA濃度。根據(jù)廠商說(shuō)明用TaqMan反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(AppliedBiosystems)反轉(zhuǎn)錄1微克的總細(xì)胞RNA。用與RSVA2的L基因的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的DNA引物-探針組來(lái)測(cè)定所得eDNA中RSV基因組的存在與否。此外，根據(jù)廠商說(shuō)明，用含有引物-探針組的人類(lèi)RANTESTaqManPre-Developed測(cè)定試劑(PDAR)(AppliedBiosystems；FosterCity，California)來(lái)檢測(cè)CCL5eDNA。在ABIPrism7700序列檢測(cè)器(Perkin-Elmer；Pittsburgh，PA)上進(jìn)行PCR、熒光檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計(jì)分析。使用JMP統(tǒng)計(jì)軟件(SASInstituteInc.；Cary，NC)，通過(guò)Tukey-KramerHSD多重比較或?qū)W生t-測(cè)驗(yàn)來(lái)確定對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后的顯著差異(p＜0.05)。數(shù)據(jù)表示為±1標(biāo)準(zhǔn)偏差。在單獨(dú)研究中所有數(shù)據(jù)均證明相似的結(jié)果。實(shí)例2CCL5抑制上皮細(xì)胞受RSV感染在本實(shí)例中，活體外證明，人類(lèi)氣道上皮細(xì)胞響應(yīng)于RSV感染而產(chǎn)生CCL5多肽。表8和表9展示分別檢測(cè)RSV感染對(duì)mRNA復(fù)制體數(shù)目的數(shù)量增加和對(duì)A549與HEp-2細(xì)胞單層分泌CCL5的影響的實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。在A549單層中，CCL5mRNA復(fù)制體數(shù)在感染之后2天(7倍)和3天(20倍)增加。所述數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，隨著RSV復(fù)制的進(jìn)行，CCL5轉(zhuǎn)錄本的數(shù)目相對(duì)于RSV基因組復(fù)制體數(shù)顯著增加(表8)。CCL5mRNA比RSV基因組復(fù)制體數(shù)的比率在培養(yǎng)第一天與第三天之間增加16倍。早在感染之后24小時(shí)即在培養(yǎng)物上清液中檢測(cè)到CCL5蛋白(表9)。因此，響應(yīng)于RSV感染，所分泌的單層增加CCL5多肽的量。表8人類(lèi)肺上皮細(xì)胞系受RSV感染后誘導(dǎo)CCL5a的表達(dá)a.A549細(xì)胞經(jīng)RSVA2(RSV)感染(MOI＝0.09)或僅在培養(yǎng)基中培養(yǎng)(對(duì)照)，并且在其后1至3天通過(guò)定量實(shí)時(shí)RCR對(duì)總細(xì)胞RNA測(cè)定CCL5mRNA復(fù)制體數(shù)和負(fù)鏈RSV基因組復(fù)制體數(shù)。b.表示每納克總RNA的CCL5mRNA復(fù)制體數(shù)。c.表示CCL5mRNA復(fù)制體數(shù)比RSV基因組復(fù)制體數(shù)的比率。表9人類(lèi)上皮細(xì)胞系受RSV感染后增加培養(yǎng)基中所分泌的CCL5的量aa.A549和HEp-2細(xì)胞經(jīng)RSVA2(RSV)感染(MOI＝0.09)或僅在培養(yǎng)基中培養(yǎng)(對(duì)照)。其后1-3天收集培養(yǎng)物上清液，并且通過(guò)ELISA分析所分泌的CCL5。b.數(shù)目表示每毫升培養(yǎng)基的CCL5皮克數(shù)。c.ND表示未測(cè)。進(jìn)一步調(diào)查CCL5抑制上皮細(xì)胞受RSV感染的潛能。表10和表11描述單獨(dú)實(shí)驗(yàn)，其中HEp-2細(xì)胞單層預(yù)先暴露(1小時(shí))于遞升量的人類(lèi)rCCL5減少感染。在最大測(cè)試劑量(10μgrCCL5/ml)下，相對(duì)于僅在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的對(duì)照單層，感染率降低至大約30％(表10)和20％(表11)。抑制作用等同于726nm的中值抑制濃度(IC50)。抑制性取決于劑量，如1μg和5μg的抑制性低于10μgrCCL5/ml培養(yǎng)基的抑制性。HEp-2細(xì)胞預(yù)先暴露于(1小時(shí))相似濃度的重組MIP-1α/CCL3、MIP-1β/CCL4、MCP-2/CCL8或嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子/CCL11(表10和表11)或重組MIP-1δ/CCL15或SDF-1α/CXCL12(表12)不減弱感染性。數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，感染性的抑制需要在將病毒加入單層之前(表12)或在將病毒加入單層的同時(shí)(表13)，將細(xì)胞單層經(jīng)rCCL5(10μg/ml)處理。當(dāng)在病毒吸收1小時(shí)之后(表12)或在熱變性之后(表13)投放時(shí)，rCCL5不減少活體外感染性。A549單層經(jīng)rCCL5預(yù)先處理也抑制RSV感染(數(shù)據(jù)未顯示)。表10CCL5抑制人類(lèi)上皮細(xì)胞受RSV感染aa.HEp-2細(xì)胞單層暴露于1、5或10μg/ml的CCL5(RANTES)、CCL3(MlP-1α)、CCL8(MCP-2)或CCL11(嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子)1小時(shí)。其后，用培養(yǎng)基沖洗單層3次，并且用RSV的A2菌株感染1小時(shí)。培養(yǎng)3天后，計(jì)數(shù)菌斑以確定病毒感染程度。將數(shù)據(jù)表示為相對(duì)于僅經(jīng)培養(yǎng)基中病毒培養(yǎng)而未暴露于趨化因子的對(duì)照孔(100％感染率)的感染百分比(±1標(biāo)準(zhǔn)偏差)。表11CCL5抑制人類(lèi)上皮細(xì)胞受RSV感染aa.HEp-2細(xì)胞單層暴露于1、5或10μg/ml的CCL5(RANTES)、CCL3(MlP-1α)或CCL4(MIP-1β)1小時(shí)。其后，用培養(yǎng)基沖洗單層3次，并且用RSV的A2菌株感染1小時(shí)。培養(yǎng)3天后，計(jì)數(shù)菌斑以確定病毒感染程度。將數(shù)據(jù)表示為相對(duì)于僅經(jīng)培養(yǎng)基中病毒培養(yǎng)而未暴露于趨化因子的對(duì)照孔(100％感染率)的感染百分比(±1標(biāo)準(zhǔn)偏差)。表12RSV感染的抑制依賴(lài)于CCL5的預(yù)先投放aa.在感染(PRE)前1小時(shí)或在移除RSVA2(POST)后小時(shí)，HEp-2細(xì)胞單層經(jīng)10μg/mlCCL5、CCL3、CCL15(MIP-1δ)或CXCL12(SDF-1)處理。三天后，計(jì)數(shù)菌斑，并表示為相對(duì)于僅經(jīng)培養(yǎng)基中病毒培養(yǎng)而未暴露于趨化因子的對(duì)照孔(100％感染率)的感染百分比(±1標(biāo)準(zhǔn)偏差)。表13感染的抑制依賴(lài)于CCL5的預(yù)先投藥或與RSV同時(shí)投藥，并且對(duì)熱變性敏感aa.CCL5(10μg/ml)或/和等體積PBS在感染前(PRE)1小時(shí)投放，或者同時(shí)(SIM)與RSV混合投放至HEp-2細(xì)胞單層。其他組包括由熱(HEAT)變性的CCL5。其后3天計(jì)數(shù)菌斑。實(shí)例3CCL5阻斷上皮細(xì)胞與RSV融合(F)蛋白間的互作為了確定直接通過(guò)阻斷病毒與細(xì)胞表面配體的互作，或者其次在配體-受體互作之后向外部傳遞信號(hào)途徑中是否發(fā)生感染的抑制，用保留N-末端甲硫氨酸(met)-CCL5的rCCL5進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(Proudfoot等人，1996)。Met-CCL5保留起始甲硫氨酸，并且在受體結(jié)合后無(wú)生物活性(Simmons等人，2000)。在最大測(cè)試劑量(20μgmet-CCL5/ml)下，感染率大約為對(duì)照細(xì)胞的25％(圖1)。met-CCL5的抑制特性也依賴(lài)于劑量。1.25μgmet-CCL5/ml的預(yù)先處理導(dǎo)致大約80％的感染率，而0.313或0.156μgmet-CCL5/ml劑量無(wú)抑制性。當(dāng)在4℃下相繼進(jìn)行感染和rCCL5投放以阻止CCR聚集時(shí)，也測(cè)試對(duì)復(fù)制的抑制，這對(duì)于向外部傳遞信號(hào)是重要的(Blanpainetal.，2002)。4℃下經(jīng)20μgrCCL5/ml預(yù)處理(1小時(shí))后，感染率大約為對(duì)照組的14％，并且與當(dāng)于37℃下相繼經(jīng)rCCL5處理并感染時(shí)所觀察到的感染率相似(16％)(表14)。因此，數(shù)據(jù)表明，rCCL5能夠在可能限制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞級(jí)聯(lián)的條件下(4℃)抑制復(fù)制。表14人類(lèi)上皮細(xì)胞系在4℃或37℃下經(jīng)CCL5預(yù)先處理后抑制RSV感染aa.HEp-2細(xì)胞單層在4℃或37℃下經(jīng)指定劑量的重組CCL5預(yù)處理1小時(shí)。RSVA2感染三天后，計(jì)數(shù)菌斑，并表示為相對(duì)于僅經(jīng)培養(yǎng)基中病毒培養(yǎng)而未暴露于趨化因子的對(duì)照孔(100％感染率)的感染百分比。最近報(bào)導(dǎo)，活化支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)CCR3(Stellato等人，2001)。因?yàn)镃CL5也是CCR1和CCR5的配體(Pakianathah等人，1997)，因此通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢查上皮細(xì)胞以確定已知結(jié)合CCL5的受體。圖2所示的結(jié)果證實(shí)，在HEp-2和A549上皮細(xì)胞表面上表達(dá)CCR3。未檢測(cè)到CCR1和CCR5。因此，數(shù)據(jù)表明，CCL5阻斷RSV與上皮細(xì)胞表面上CCR3之間的互作。測(cè)試其他已知與CCR3結(jié)合的重組趨化因子(Baggiolini，2001)以確定其是否降低感染率。用遞升量的重組嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子/CCL11、MCP-2/CCL8或MIP-1δ/CCL15來(lái)預(yù)先處理HEp-2細(xì)胞單層并不減弱RSV的感染性(表10和表12)。因?yàn)镃XCR4也功能性地表達(dá)在活化支氣管上皮細(xì)胞上(Eddleston等人，2002)，因此也測(cè)試重組SDF-1α/CXCL12，但不減弱感染(表12)。在多克隆或單克隆抗趨化因子受體抗體存在下，HEp-2細(xì)胞單層的預(yù)培養(yǎng)或侵染不降低RSV感染性(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)檢查rCCL5抑制缺失位于病毒包膜中3個(gè)糖蛋白(F、G和SH蛋白)中一或兩個(gè)的RSV菌株的感染的能力來(lái)進(jìn)一步研究抑制機(jī)制。用缺失SH蛋白(rA2cpts248/404ΔSH)或G蛋白C-末端的外部域在氨基酸118處截短(rA2cpGΔ118)的經(jīng)遺傳修飾的菌株來(lái)進(jìn)行一系列研究。表15證明，相對(duì)于僅以培養(yǎng)基中病毒培養(yǎng)的對(duì)照細(xì)胞，經(jīng)10μg/mlrCCL5或met-CCL5預(yù)處理降低rA2cpGΔ118和rA2cpts248/404ΔSH病毒的感染性。用rCCL5(10μg/ml)預(yù)先處理也降低由突變型cp32/D1(缺少SH和G蛋白)和RSV的親代B1菌株的感染(表8)。因此，rCCL5抑制缺失G和/或SH蛋白的病毒的感染。總體來(lái)說(shuō)，數(shù)據(jù)表明，rCCL5阻斷發(fā)生在包膜內(nèi)F蛋白與上皮細(xì)胞表面之間的互作。表15CCL5抑制缺失SH和/或G包膜糖蛋白的突變型RSV菌株感染HEP-2細(xì)胞aa.HEp-2細(xì)胞單層經(jīng)10μg/ml重組CCL5或met-CCL5處理1小時(shí)。移除CCL5之后，單層經(jīng)指定RSV菌株感染。實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2表示2個(gè)獨(dú)立研究的結(jié)果。3(A2)或5天(rA2cpΔ118、248/404、248/404ΔSH、B1和cp32/D1)培養(yǎng)之后觀察菌斑。將數(shù)據(jù)表示為相對(duì)于僅經(jīng)培養(yǎng)基中病毒培養(yǎng)而未暴露于趨化因子的對(duì)照孔(100％感染率)的感染百分比。b.ND表示未完成。實(shí)例4由CCL5的合成N-末端肽活體內(nèi)抑制RSV感染CCL5可以通過(guò)阻斷包膜內(nèi)F蛋白與上皮細(xì)胞表面上趨化因子受體(例如CCR3)或負(fù)電荷葡糖胺聚糖(GAG)之間的互作來(lái)抑制感染。F蛋白具有由正電荷氨基酸組成的肝磷脂結(jié)合(HBD)基序，所述基序?qū)τ跉獾郎掀ぜ?xì)胞的感染是重要的(Feldman等人，2000)。顯示CCL5的C末端α-螺旋區(qū)對(duì)于抑制HIV-1感染有所作用(Burns等人，1998)。與同源受體或GAG互作的氨基酸殘基分別位于CCL5的N-末端(Pakianathan等人，1997)和C-末端(Proudfoot等人，2001)區(qū)。為了檢測(cè)這些可能性，合成了一系列代表CCL5所有68個(gè)氨基酸的肽(15聚體，由7個(gè)氨基酸重疊)(表2)。作為起始篩選，將肽以生物素標(biāo)記并且評(píng)估與人類(lèi)上皮細(xì)胞的結(jié)合。圖3描述代表性實(shí)驗(yàn)，其中遞增濃度的經(jīng)生物素標(biāo)記肽在4℃下用活HEp-2細(xì)胞培養(yǎng)。所得到的數(shù)據(jù)指示，rCCL5和代表CCL5N-末端15個(gè)殘基的肽1(SEQIDNO2)容易與上皮細(xì)胞單層結(jié)合。含有RSVG蛋白(Feldman等人，1999)的一致HBD的合成肽(肽19)也與單層結(jié)合。代表CCL5的HBD的肽7-9不容易與單層結(jié)合。因此，數(shù)據(jù)表明發(fā)生了感染抑制，這是因?yàn)镃CL5的N-末端區(qū)(肽1；SEQIDNO2)阻斷包膜內(nèi)F蛋白與上皮細(xì)胞表面之間的互作。為了進(jìn)一步驗(yàn)證所述假設(shè)，在BALB/c小鼠模型中評(píng)估CCL5的相同肽對(duì)RSVA2菌株感染的抑制。表16和表17中所描述的結(jié)果是5個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表。結(jié)果證實(shí)，當(dāng)同時(shí)與病毒投與(表16和表17)或在感染之前1小時(shí)給藥(表17)時(shí)，肽1(500微克/劑量，10mg/ml)活體內(nèi)有抑制性。感染4天后未經(jīng)處理的BALB/c小鼠的肺含有每克組織大約5log10PFU。相比較來(lái)說(shuō)，經(jīng)共投與肽1的小鼠肺部的RSV滴定度為1,000(表16和表17)至100倍(表16)以下。當(dāng)肽1在感染之前1小時(shí)投放時(shí)，病毒負(fù)載量減少超過(guò)50倍，并且顯著地少于未經(jīng)處理小鼠中所觀察的病毒負(fù)載量(表17)。在5個(gè)實(shí)驗(yàn)中與投與300μg或更多的肽1相關(guān)的病毒負(fù)載量的平均減少量為2.4log10。肽1的抑制特性依賴(lài)于劑量。共投與300-500μg肽1顯著地降低病毒負(fù)載量。250μg或125μg劑量下未觀察到此現(xiàn)象(表16)。與rCCL5活體外研究相似(表12)，當(dāng)感染之后1小時(shí)投與時(shí)，肽1不抑制感染(表17)。數(shù)據(jù)揭示，代表CCL5的C-末端HBD(肽7-9)的肽(500微克/劑量，10mg/ml)抑制性較低。表16中所示的數(shù)據(jù)證實(shí)，共投與肽8或9與RSV降低感染性(大約10倍)。所有實(shí)驗(yàn)中與500微克/劑量的肽7-9相關(guān)的病毒負(fù)載量的平均減少量分別為1.1、1.0和1.4log10。所有實(shí)驗(yàn)中與500微克/劑量的肽2、4和6相關(guān)的病毒負(fù)載量的平均減少量分別為0.9、1.2和0.5log10(數(shù)據(jù)未顯示)。代表氨基酸184-198的肽19、RSVG蛋白的HBD和醫(yī)藥化合物RFI-641(Razinkov等人，2001)抑制RSV感染。因此，在CCL5肽中，肽1活體外結(jié)合活上皮細(xì)胞，并且活體內(nèi)最具抑制性。所有肽活體外的抑制僅在391至525μM的IC50值時(shí)發(fā)生(數(shù)據(jù)未顯示)。表16CCL5的合成肽活體內(nèi)抗病毒活性aa.對(duì)BALB/c小鼠同時(shí)投與等體積混合的RSVA2(約1×106PFU)和指定量(微克/劑量)的合成肽。其后4天，確定肺中幾何平均傳染性病毒滴定度(±1標(biāo)準(zhǔn)偏差)。測(cè)定的檢測(cè)極限大約為1.5log10。每組有5只小鼠。b.向?qū)φ招∈笸杜c與指定量的肽#19(代表RSVG蛋白的肝磷脂結(jié)合域)、RFI-641和PBS混合的RSV。表17當(dāng)在RSV感染之前而非之后給藥時(shí)，CCL5的肽1活體內(nèi)有抑制性a.對(duì)BALB/c小鼠在感染之前1小時(shí)(Pre)或之后1小時(shí)(Post)投與500μg指定CCL5肽1，或者以等體積混合并與RSVA2同時(shí)投與。向?qū)φ招∈笸杜c相當(dāng)劑量(約1×106PFU)的與肽#7或PBS等體積混合的RSV。4天后，測(cè)定幾何平均傳染性病毒滴定度(±1標(biāo)準(zhǔn)偏差)。測(cè)定的檢測(cè)極限大約為1.5log10。每組有5只小鼠。實(shí)例5CCL5與CCL3多肽序列的比較如實(shí)例2詳述，趨化因子CCL5而非CCL3(MIP-1α)或CCL4(MIP-1β)抑制上皮細(xì)胞RSV感染。這表明RSV利用不同于CCR5的受體。因此，為了進(jìn)一步闡述CCL5所介導(dǎo)的RSV感染的抑制的序列和/或結(jié)構(gòu)要求，通過(guò)氨基酸序列比對(duì)(表6)、水療法曲線(圖4A和圖4B)和分子模型化/直觀化(數(shù)據(jù)未顯示)來(lái)比較CCL5和CCL3多肽。CCL5(SEQIDNO1)和CCL3(SEQIDNO21)的氨基酸序列首先通過(guò)有間隙的“BLAST2序列”比對(duì)算法(BLASTP版本2.2.6；缺省矩陣BLOSUM62)進(jìn)行比較，這種算法是采用對(duì)于成對(duì)蛋白-蛋白(或DNA-DNA)序列比較的BLAST引擎并且通過(guò)使用動(dòng)態(tài)程序設(shè)計(jì)來(lái)延伸重要比對(duì)殘基對(duì)而產(chǎn)生有間隙的比對(duì)的交互式工具(Tatusova和Madden，1999)。CCL5氨基酸序列展現(xiàn)在BLASTP比對(duì)上方(加框殘基)，并且CCL3氨基酸序列展現(xiàn)在比對(duì)下方(表6)。CCL5(氨基酸殘基4-68)和CCL3(氨基酸殘基3-69)的BLAST比對(duì)表明所述多肽共享32個(gè)一致氨基酸(即48％序列一致性)，并且具有約78％氨基酸序列相似性。比對(duì)包括CCL5(SEQIDNO1)的Tyr7與Tyr8之間的一個(gè)氨基酸間隙，CCL5前3個(gè)NH2-末端氨基酸的遺失(SEQIDNO1的Ser1-Tyr3)，CCL3前2個(gè)NH2-末端氨基酸的遺失(SEQIDNO21的Ser1-Leu2)和CCL3的COOH-末端氨基酸的遺失(SEQIDNO21的Ala69)。全長(zhǎng)CCL5與全長(zhǎng)CCL3的水療法曲線(Kyte和Doolittle，1982)的比較(圖4A和圖4B)指示CCL5與CCL3之間的最大水療序列分歧發(fā)生在這些多肽的NH2-末端內(nèi)。舉例來(lái)說(shuō)，CCL5的前4個(gè)NH2-末端氨基酸(Ser1-Pro2-Tyr3-Ser4)為親水性，而CCL3的前4個(gè)NH2-末端氨基酸(Ser1-Leu2-Ala3-Ala4)主要是疏水性(數(shù)據(jù)未顯示)。CCL5和CCL3的前四個(gè)氨基酸的水療法評(píng)分不能以滑動(dòng)窗口尺寸9加以計(jì)算，且因此這些氨基酸在圖4A和圖4B中所展示的水療法曲線中省略。CCL5的NH2-末端保持親水性直至氨基酸8(Ser8)，隨后接著是NH2-環(huán)結(jié)構(gòu)的疏水性氨基酸Pro9-Cys10-Cys11-Phe12-Ala13-Tyr14-lso15-Ala16。令人感興趣的是，CCL3的NH2-末端，直至約氨基酸30，與CCL5的水療法特征具有倒轉(zhuǎn)的關(guān)系(或鏡像)。相反，從約氨基酸31至COOH-末端的結(jié)尾，這兩個(gè)多肽的水療法特征幾乎一致(圖4A)。用公開(kāi)可用的(即通過(guò)ExPASy萬(wàn)維網(wǎng)服務(wù)器可得到的)軟件包SWISS-MODEL和Swiss-PdbViewer(Guex和Peitsch，1997)模型化CCL5(PBD1RTO；Skelton等人，1995)與CCL3(PBD1B53；Czaplewski等人，1999)的能量最低結(jié)構(gòu)。這兩個(gè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(或折疊)重疊，而NH2-末端氨基酸1至7和COOH-末端氨基酸64至68(數(shù)據(jù)未顯示)除外。碳骨架的最佳擬合分析(SWISS-MODEL“MagicFit”)描繪(繪制帶狀圖)全長(zhǎng)CCL5多肽(SEQIDNO1的氨基酸Ser1至Ser68)和全長(zhǎng)CCL3多肽(SEQIDNO22的氨基酸Ser1至Ala69)。與水療法曲線相似，CCL5與CCL3之間的最大結(jié)構(gòu)序列分歧發(fā)生在NH2-末端氨基酸殘基內(nèi)。最后，從結(jié)構(gòu)上分析包含肽1片段(即氨基酸1至15)的CCL5蛋白的NH2-末端部分(數(shù)據(jù)未顯示)，其被證明針對(duì)RSV感染是最具抑制性的。用BrookhavenProteinDataBank分子坐標(biāo)(分別以1RTO、1EQT和1B3A名存放)通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬(SWISS-MODEL和Swiss-PdbViewer)計(jì)算CCL5、Met-CCL5和AOP-CCL5的二面角(φ和ψ)。這些計(jì)算的結(jié)果展示于表7中。實(shí)例6趨化因子促效劑測(cè)定趨化因子測(cè)定。根據(jù)由Proudfoot等人(1996)修改的Gong和Clark-Lewis方法(1995)實(shí)現(xiàn)THP-1細(xì)胞趨化性(細(xì)胞遷移)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將200μl培養(yǎng)基(含有0.01MHEPES、10％熱滅活胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和0.005％慶大霉素(gentamicin)的RPMI1640)中的5.6×105細(xì)胞置于安裝有5-μm濾紙的96孔Boyden微腔(NeuroProbe；CabinJohn，MD)的上腔室中。隨后，將含有配體和Met-CCL5適當(dāng)稀釋液的370μl上述培養(yǎng)基(減去胎牛血清)置于96孔Boyden微腔的下腔室中。在37℃、5％CO2下培養(yǎng)60分鐘后，從上方孔中移出細(xì)胞，并且加入200μl含有20μMEDTA的磷酸鹽緩沖鹽水以分開(kāi)粘附于濾紙上的細(xì)胞。在4℃下培養(yǎng)30分鐘后，在1800×g下離心所述板10分鐘，并且從下方孔中移除上清液。通過(guò)CellTiter96TM非放射性細(xì)胞增殖測(cè)定(Promega)來(lái)測(cè)量遷移細(xì)胞數(shù)目，此測(cè)定監(jiān)控四唑藍(lán)(tetrazoliumblue)轉(zhuǎn)化成其甲(formazan)產(chǎn)物。如Fincham等人(1988)所述測(cè)量單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的趨化性。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將50ml新鮮血液收集于含有0.1MEDTA、3％右旋糖和3％葡萄糖的15-ml溶液中以防止聚集。使所述混合物在37℃下沉淀1小時(shí)。通過(guò)將14ml血漿在7mlFicoll上分層并且將所述離心機(jī)解除制動(dòng)而在15℃下296×g離心20分鐘來(lái)分離PMN和淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞位于Ficoll與血漿的界面處，而PMN形成球粒(pellet)。通過(guò)低滲溶解從PMN移除污染的紅血球(主要是嗜中性粒細(xì)胞)，并且洗滌殘余白血球并以106個(gè)白血球/毫升的濃度重懸于RPMI1640培養(yǎng)基中。通過(guò)加入106個(gè)綿羊紅血細(xì)胞/毫升并且在4℃下散開(kāi)(rosetting)60分鐘，接著再進(jìn)行Ficoll梯度離心，而從淋巴細(xì)胞部分純化大約40-50×106個(gè)單核細(xì)胞/毫升。在PBS緩沖液(140mMNaCl、3mMKCl、8mMNa2HPO4、1.5mMKH2PO4，pH7.4)中洗滌單核細(xì)胞，并且重懸于RPMI1640培養(yǎng)基中。用96孔Boyden微腔測(cè)定單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的趨化性。在培養(yǎng)基(含有2mML-谷氨酰胺、25mMHEPES和10％熱滅活胎牛血清的RPMI1640)中制得受試抗病毒分子(例如，經(jīng)修飾的NH2-末端CCL5肽片段)的連續(xù)稀釋液。向測(cè)定孔的下方腔室中加入25μl趨化因子(chemoattractant)，并且用不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜覆蓋，所述膜的孔隙大小對(duì)嗜中性粒細(xì)胞而言為3μm，而對(duì)單核細(xì)胞為5μm。向頂部孔中加入含有106個(gè)細(xì)胞/毫升的50μl溶液。對(duì)于嗜中性粒細(xì)胞，將測(cè)定板在37℃下培養(yǎng)20分鐘，而對(duì)于單核細(xì)胞，培養(yǎng)30分鐘。隨后用PBS緩沖液洗滌膜的上表面，且將膜下側(cè)的細(xì)胞固定于甲醇中。用Field’sA和B染劑的混合物(Bender和Hobein)對(duì)膜進(jìn)行染色，并且風(fēng)干。隨后用ZeissAxiophot顯微鏡和VIDAS圖像分析軟件(KONTRONElectronics，Zurich，Switzerland)計(jì)數(shù)膜表面下的細(xì)胞。鈣流動(dòng)測(cè)定。用重組或合成CCL5和10-10M濃度范圍的受試抗病毒分子來(lái)測(cè)量嗜中性粒細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣的流動(dòng)。在37℃下，以2μMFura-2染料在KrebsRinger緩沖液(1.36mMNaCl、1.8mMKCl、1.2mMKH2PO4、1.2mMMgSO4、5mMNaHCO3、1.2mMCaCl2、0.21mMEGTA、5.5mMD-葡萄糖、20mMHEPES)中培養(yǎng)細(xì)胞30分鐘。Fura-2染料在340nm下受激發(fā)，并且用熒光計(jì)在500nm下監(jiān)控?zé)晒獍l(fā)光。用等式[Ca]＝Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)計(jì)算細(xì)胞內(nèi)Ca2+，其中Kd是Ca2+結(jié)合染料的離解常數(shù)，且F是任意熒光單位。加入過(guò)量的10mMEGTA以螯合Ca2+并且計(jì)算Fmin。通過(guò)加入20mM三羥甲基氨基甲烷來(lái)調(diào)節(jié)pH值至8.5，并且用50μM毛地黃皂苷(digitonin)溶解細(xì)胞。由將所溶解細(xì)胞暴露于過(guò)量1mMCa2+后的熒光值計(jì)算Fmax。參考文獻(xiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,258,454美國(guó)專(zhuān)利5,556,747美國(guó)專(zhuān)利5,789,166美國(guó)專(zhuān)利6,391,548美國(guó)專(zhuān)利5,817,879Akerlind等人，″Respiratorysyncytialvirusheterogeneityofsubgroupstrains″，JGenVirol，692145-2154，1988。Altschul等人，″Basiclocalalignmentsearchtool″，J.Mol.Biol.，215403-410，1990。Appay和Rowland-Jones，″RANTESaversatileandcontroversialchemokine″，TrendsImmunol，2283-87，2001。Arenzana-Seisdedos等人，″HIVBlockedByChemokineAntagonist″，Nature，383400，1996。Baggiolini，″Chemokinesinpathologyandmedicine″，JInternMed，25091-104，2001。Barany等人，Int.J.PeptideProteinRes.30，705-739，1987。Barron和Zuckermann，″BioinspiredPolymericMaterialsIn-BetweenProteinsandPlastic″，Curr.Opin.Chem.Biol.，3681-687，1999。Bartz等人，″Respiratorysyncytialvirusdecreasesthecapacityofmyeloiddendriticcellstoinduceinterferon-gammainnaiveTcells″，Immunology，10949-57，2003。Beaulieu等人，″Expressionofafunctionaleotaxin(CCchemokineligand11)receptorCCR3byhumandendriticcells″，JImmunol，1692925-2936，2002。Becker等人，″RSVinfectionofhumanairwayepithelialcellscausesproductionofthebetachemokineRANTES″，Am.J.Physiol，272L512-520，1997。Berger等人，″ChemokinereceptorsasHIV-1coreceptorsRolesinviralentry，tropismanddisease″，AnnuRevImmunol，17657-700，1999。Blanpain等人，″MultipleactivestatesandoligomerizationofCCR5revealedbyfunctionalpropertiesofmonoclonalantibodies″，Mol.Biol.Cell，13723-737，2002。Bode和Huber，Eur.J.Biochem.204433-451，1992。Bonville等人，″Macrophageinflammatoryprotein-1-alphaandRANTESarepresentinnasalsecretionsduringongoingupperrespiratorytractinfection″，PedAllergyandImmunology，1039-44，1999。Bourgeois等人，″Heparin-likestructuresonrespiratorysyncytialvirusareinvolvedinitsinfectivityinvitro″，JVirol，727221-7227，1998。Burns等人，″Anewmonoclonalantibody，mAb4A12，identifiesarolefortheglycosaminoglycan(GAG)bindingdomainofRANTESintheantiviraleffectagainstHIV-1andintracellularCa2+signaling″，JExpMed，1881917-1927，1998。Chung等人，″TheThree-DimensionalSolutionStructureofRANTES″，Biochemistry，349307-9314，1995。Clark-Lewis等人，M.J.Biol.Chem.，26916075-16081，1994。Crowe等人，″Afurtherattenuatedderivativeofacold-passagedtemperature-sensitivemutantofhumanrespiratorysyncytialvirusretainsimmunogenicityandprotectiveefficacyagainstwild-typechallengeinseronegativechimpanzees″，Vaccine，12783-790，1994。Crowe等人，″LivesubgroupBrespiratorysyncytialvirusvaccinesthatareattenuated，geneticallystable，andimmunogenicinrodentsandnonhumanprimates″，JInfectDis，173829-839，1996。Crump等人，EMBOJ.，166996-7007，1997。Czaplewski等人，″IdentificationofAminoAcidResiduesCriticalforAggregationofHumanCcChemokinesMacrophageInflammatoryProtein(Mip)-1Alpha，Mip-1Beta，andRantes.CharacterisationofActiveDisaggregatedChemokineVariants″，J.Biol.Chem.27416077，1999。Dairaghi等人，″AbductionofchemokineelementsbyHerpesviruses″，SeminarsinVirology，8377-385，1998。Domachowske等人，″Respiratorysyncytialvirusinfectionimmuneresponse，immunopathogenesis，andtreatment″，ClinMicrobiolRev，12298-309，1999。Dorig等人，″ThehumanCD46isareceptorformeaslesvirus(Edmonstonstrain)″，Cell，75295-305，1993。Dorner等人，″MIP-lalpha，MIP-lbeta，RANTES，andATAC/lymphotactinfunctiontogetherwithIFN-gammaastype1cytokines″，ProcNatlAcadSciUSA.996181-6186，2002。Eddleston等人，″FunctionalexpressionoftheC-X-CchemokinereceptorCXCR4byhumanbronchialepithelialcellsregulationbyproinflammatorymediators″，JImmunol，1696445-6451，2002。Eguchi和Kahn，″Design，Synthesis，andApplicationofPeptideSecondaryStructureMimetics，MiniReviewsinMedicinalChemistry，2447-462，2002。Eisenberg等人，J.Mol.Biol.，179125-142，1984。Elliott等人，″RecombinantrespiratorysyncytialviruseslackingtheC-terminalthirdoftheattachment(G)proteinareimmunogenicandattenuatedinvivoandinvitro″，Manuscriptsubmitted，2004。Fairlie等人，J.Med.Chem.，431271-1281，2000。Feldman等人，″Identificationofalinearheparinbindingdomainforhumanrespiratorysyncytialvirusattachmentglycoprotein″，G.JVirol.，736610-6617，1999。Feldman等人，″Thefusionglycoproteinofhumanrespiratorysyncytialvirusfacilitatesvirusattachmentandinfectivityviaaninteractionwithcellularheparinsulfate″，JVirol，746442-6447，2000。Fincham等人，J.Immunol.140，4294-4299，1988。Gellman，″FoldamersAManifesto″，Ace.Chem.Res.，31173-180，1998。Glen和Fairlie，″MimeticsofthePeptideβ-Strand″，MiniReviewsinMedicinalChemistry，2433-445，2002。Gong和Clark-Lewis，J.Exp.Med.，181631-640，1995。Gorman等人，″Antiviralactivityandstructuralcharacteristicsofthenonglycosylatedcentralsubdomainofhumanrespiratorysyncytialvirusattachment(G)glycoprotein″，JBiolChem.，27638988-94，2001。Guex和Peitsch，″SWISS-MODELandtheSwiss-PdbViewerAnenvironmentforcomparativeproteinmodeling″，Electrophoresis182714-2723，1997。HallC.B.，″Respiratorysyncytialvirusandparainfluenzavirus″，NEnglJMed，213441917-28，200l。Hancock等人，″GenerationofatypicalpulmonaryinflammatoryresponsesinBALB/cmiceafterimmunizationwiththenativeattachment(G)glycoproteinofrespiratorysyncytialvirus″，JVirol，707783-7791，1996。Harrison等人，″Respiratorysyncytialvirus-inducedchemokineexpressioninthelowerairwayseosinophilrecruitmentanddegranulation″，AmJRespCritCareMed，1591918-1924，1999。Hemmerich等人，Biochemistry，3813013-13025，1999。Hickling等人，″ArecombinanttrimericsurfactantproteinDcarbohydraterecognitiondomaininhibitsrespiratorysyncytialvirusinfectioninvitroandinvivo″，EurJImmunol，293478-3484，1999。Hoover等人，″TheCrystalStructureofMet-RantesComparisonwithNativeRantesandAop-Rantes″，ProteinandPeptideLetters，7200，2000。Hopp和Woods，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，783824-3828，1981。Jaovisidha等人，″Respiratorysyncytialvirusstimulatesneutrophildegranulationandchemokinerelease″，JImmunol，1632816-2820，1999。Jois等人，″Designofβ-turnBasedTherapeuticAgents″，CurrentPharmaceuticalDesign，91209-1224，2003。Karron等人，″Respiratorysyncytialvirus(RSV)SHandGproteinsarenotessentialforviralreplicationinvitroclinicalevaluationandmolecularcharacterizationofacold-passaged，attenuatedRSVsubgroupBmutant″，ProcNatlAcadSciUSA，9413961-13966，1997。Kirshenbaum等人，″DesigningPolymersthatMimicBiomolecules″，Curr.Opin.Struct.Biol.，9530-535，1999。KrilovL.R.，″Palivizumab.inthepreventionofrespiratorysyncytialvirusdisease″，ExpertOpinBiolTher，2763-769，2002。KrilovLR，″Safetyissuesrelatedtotheadministrationofribavirin″，PediatrInfectDisJ，21479-81，2002。Krusat等人，″Heparin-dependentattachmentofrespiratorysyncytialvirus(RSV)tohostcells″，.ArchVirol，1421247-1254，1997。Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.，157105-132，1982。Lalani等人，″Useofchemokinereceptorsbypoxviruses″，Science，2861968-1971，1999。Langedijk等人，″StructuralhomologyofthecentralconservedregionoftheattachmentproteinGofrespiratorysyncytialviruswiththefourthsubdomainof55-kDatumornecrosisfactorreceptor″，Virology，243293-302，1998。Laurence等人，Biochemistry，393401-3409，2000。Lee等人，″EpitopemappingofCCR5revealsmultipleconformationalstatesanddistinctbutoverlappingstructuresinvolvedinchemokineandcoreceptorfunction″，J.Biol.Chem.，2749617-9626，1999。LehnerT.，″TheroleofCCR5chemokineligandsandantibodiestoCCR5coreceptorsinpreventingHIVinfection″，TrendsImmunol，23347-351，2002。Liu等人，″Cellsurfaceheparansulfateanditsrolesinassistingviralinfections″，MedResRev.，221-25，2002。Locati等人，″ChemokinesandchemokinereceptorsbiologyandclinicalrelevanceininflammationandAIDS″，Annu.Rev.Med.，50425-440，1999。Lowman等人，J.Biol.Chem.，27114344-14352，1996。LussoP.，″HIVandchemokinesimplicationsfortherapyandvaccine″，Vaccine，201964-1967，2002。Malhotra等人，″Isolationandcharacterizationofpotentialrespiratorysyncytialvirusreceptor(s)onepithelialcells″，MicrobesInfect，5123-33，2003。Martin等人，″StructuralandfunctionalanalysisoftheRANTES-glycosaminoglycansinteractions″，Biochemistry，406303-6318，2001。Martinez等人，″Enhancedneutralizationofhumanrespiratorysyncytialvirusbymixturesofmonoclonalantibodiestotheattachment(G)glycoprotein″，JGenVim，792215-2220，1998。Monfardini等人，″Structure-basedDesignofMimeticsfroGM-CSF″，CurrentPharmaceuticalDesign，82185-2199，2002.Moser等人，″Lymphocytetrafficcontrolbychemokines″，NatImmunol，2123-128，2001。Mosier等人，″HighlyPotentRANTESAnaloguesEitherPreventCCR5-UsingHumanImmunodeficiencyVirusType1InfectionInVivoorRapidlySelectforCXR4-UsingVariants″，J.ofVirology，733544-3550，1999。Nardese等人，″StructuraldeterminantsofCCR5recognitionandHIV-1blockadeinRANTES″，NatStructBiol，.8611-615，2001。Nardese等人，″StructuraldeterminantsofCCR5recognitionandHIV-1blockadeinRANTES″，NatureStructuralBiology，8611-615，2001。Noah等人，″Chemokinesandinflammationinthenasalpassagesofinfantswithrespiratorysyncytialvirusbronchiolitis″，ClinImmunol，10486-95，2002。Olsewska-Pazdrak等人，″Cell-specificexpressionofRANTES，MCP-1，andMIP-lalphabylowerairwayepithelialcellsandeosinophilsinfectedwithrespiratorysyncytialvirus″，J.Virol，724756-4764，1998。Pakianathan等人，″DistinctbutoverlappingepitopesfortheinteractionofaCC-chemokinewithCCRl，CCR3andCCR5″，Biochemistry，369642-9648，1997。Pakianathan等人，Biochemistry369642-8648，1997。Paradiso等人，″Mappingofafusionrelatedepitopeoftherespiratorysyncytialvirusfusionprotein″，Vaccine，9231-237，1991。Pastey等人，″ARhoA-derivedpeptideinhibitssyncytiumformationinducedbyrespiratorysyncytialvirusandparainfluenzavirustype3″，NatMed，635-40，2000。Patch和Barron，″MimicryofBioactivePeptidesviaNon-Natural，Sequence-SpecificPeptidomimeticOligomers″，CurrentOpin.InChem.Biol.，6872-877，2002。Proudfoot等人，″ExtensionofrecombinanthumanRANTESbytheretentionoftheinitiatingmethionineproducesapotentantagonist″，JBiolChem，2712599-2603，1996。Proudfoot等人，″Strategiesforchemokineantagonistsastherapeutics.SeminImmunol.，1557-65，2003。Proudfoot等人，″TheBBXBmotifofRANTESistheprincipalsiteforheparinbindingandcontrolsreceptorselectivity″，JBiolChem，27610620-10626，2001。Razinkov等人，″RFI-641inhibitsentryofrespiratorysyncytialvirusviainteractionswithfusionprotein″，ChemBiol.，8645-659，2001。Saito等人，″RespiratorysyncytialvirusinducesselectiveproductionofthechemokineRANTESbyupperairwayepithelialcells，″J.Infect.Dis，175497-504，1997。Schall等人，″AhumanTcell-specificmoleculeisamemberofanewgenefamily″，J.Immunol，1411018-1025，1988。Schraufstatter等人，J.Biol.Chem.，27010428-10431，1995。Simmons等人，″Co-receptorusebyHIVandinhibitionofHIVinfectionbychemokinereceptorligands″，ImmunolRev，177112-126，2000。Simmons等人，″PotentInhibitionofHIV-1InfectivityinMacrophagesandLymphocytesbyaNovelCCR5Antagonist″，Science，276276-279，1997。Skelton等人，″ProtonNMRAssignmentsandSolutionConformationofRANTES，aChemokineoftheC-CType″，Biochemistry，345329-5342，1995。Staunton等人，″Acelladhesionmolecule，ICAM-1，isthemajorsurfacereceptorforrhinoviruses″，Cell，56849-853，1989。Stellato等人，″ExpressionoftheC-CchemokinereceptorCCR3inhumanairwayepithelialcells″，J.Immunol.，1661457-1461，2001。Tatusova和Madden，″BLAST2Sequences，aNewToolforComparingProteinandNucleotideSequences″，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.，174(2)247-50，1999。Tekkanat等人，″RANTES(CCL5)productionduringprimaryrespiratorysyncytialvirusinfectionexacerbatesairwaydisease″，EurJImmunol，323276-3284，2002。Thomas等人，″Respiratorysyncytialvirus-inducedRANTESproductionfromhumanbronchialepithelialcellsisdependentonnuclearfactor-kappaBnuclearbindingandisinhibitedbyadenovirus-mediatedexpressionofinhibitorofkappaBalpha″，J.Immunol.，1611007-1016，1998。Torrence等人，″Thequestforanefficaciousantiviralforrespiratorysyncytialvirus″，AntivirChemChemother.，13325-344，2002。Tripp等人，″CX3CchemokinemimicrybyrespiratorysyncytialvirusGglycoprotein″，NatImmunol，2732-738，2001。Tyndall和Fairlie，J.Mol.Recognition，12363-370，1999。Walsh等人，″Monoclonalantibodiestorespiratorysyncytialvirusproteinsidentificationofthefusionprotein″，JVirol，47171-177，1983。Welliver等人，″Beta-chemokines，butneitherThelpertype1norThelpertype2cytokines，correlatewithseverityofillnessduringrespiratorysyncytialvirusinfection″，PediatrInfectDisJ，21457-461，2002。Whitehead等人，″RecombinantRespiratorySyncytialVirusBearingaDeletionofeithertheNS2orSHGeneIsAttenuatedinChimpanzees″，J.Virol，733438-3442，1999。Wilken等人，″TotalChemicalSynthesisandHigh-ResolutionCrystalStructureofthePotentanti-HIVProteinAOP-RANTES″，Chemistry&Biology，643-51，1999。Wilkens等人，″ProteinIdentificationandAnalysisToolsintheExPASyServer″，2-DProteomeAnalysisProtocols(1998).EditorA.J.Link.HumanaPress，NewJersey。Wright等人，″Geneticstudiesofrespiratorysyncytialvirustemperature-sensitivemutants″，ArchGesamteVirusforsch，41238-247，1973。Zhang等人，″Expressionofrespiratorysyncytialvirus-inducedchemokinegenenetworksinlowerairwayepithelialcellsrevealedbycDNAmicroarrays″.JVirol，759044-9058，2001。序列表<110>惠氏公司<120>抑制副粘病毒感染的抗病毒組合物<130>AM101465<160>22<170>PatentInversion3.2<210>1<211>68<212>PRT<213>智人<400>1SerProTyrSerSerAspThrThrProCysCysPheAlaTyrIleAla151015ArgProLeuProArgAlaHisIleLysGluTyrPheTyrThrSerGly202530LysCysSerAsnProAlaValValPheValThrArgLysAsnArgGln354045ValCysAlaAsnProGluLysLysTrpValArgGluTyrIleAsnSer505560LeuGluMetSer65<210>2<211>15<212>PRT<213>智人<400>2SerProTyrSerSerAspThrThrProCysCysPheAlaTyrIle151015<210>3<211>15<212>PRT<213>智人<400>3ThrProCysCysPheAlaTyrIleAlaArgProLeuProArgAla151015<210>4<211>15<212>PRT<213>智人<400>4IleAlaArgProLeuProArgAlaHisIleLysGluTyrPheTyr151015<210>5<211>15<212>PRT<213>智人<400>5AlaHisIleLysGluTyrPheTyrThrSerGlyLysCysSerAsn151015<210>6<211>15<212>PRT<213>智人<400>6TyrThrSerGlyLysCysSerAsnProAlaValValPheValThr151015<210>7<211>14<212>PRT<213>智人<400>7ProAlaValValPheValThrArgLysAsnArgGlnValCys1510<210>8<211>15<212>PRT<213>智人<400>8ThrArgLysAsnArgGlnValCysAlaAsnProGluLysLysTrp151015<210>9<211>15<212>PRT<213>智人<400>9CysAlaAsnProGluLysLysTrpValArgGluTyrIleAsnSer151015<210>10<211>15<212>PRT<213>智人<400>10GluLysLysTrpValArgGluTyrIleAsnSerLeuGluMetSer151015<210>11<211>12<212>PRT<213>智人<400>11ThrThrProCysCysPheAlaTyrIleAlaArgPro1510<210>12<211>12<212>PRT<213>智人<400>12ProCysCysPheAlaTyrIleAlaArgProLeuPro1510<210>13<211>12<212>PRT<213>智人<400>13CysPheAlaTyrIleAlaArgProLeuProArgAla1510<210>14<211>12<212>PRT<213>智人<400>14HisIleLysGluTyrPheTyrThrSerGlyLysCys1510<210>15<211>12<212>PRT<213>智人<400>15SerGlyLysCysSerAsnProAlaValValPheVal1510<210>16<211>19<212>PRT<213>智人<400>16CysPheAlaTyrIleAlaArgProLeuProArgAlaHisIleLysGlu151015TyrPheTyr<210>17<211>24<212>PRT<213>智人<400>17CysPheAlaTyrIleAlaArgProLeuProArgAlaHisIleLysGlu151015TyrPheTyrThrSerGlyLysCys20<210>18<211>34<212>PRT<213>智人<400>18SerProTyrSerSerAspThrThrProCysCysPheAlaTyrIleAla151015ArgProLeuProArgAlaHisIleLysGluTyrPheTyrThrSerGly202530LysCys<210>19<211>19<212>PRT<213>智人<400>19TyrPheTyrGluLysIleHisAlaArgProLeuProArgAlaIleTyr151015AlaPheCys<210>20<211>34<212>PRT<213>智人<400>20CysLysGlySerThrTyrPheTyrGluLysIleHisAlaArgProLeu151015ArgProAlaTleTyrAlaPheCysCysProThrThrAspSerSerTyr202530ProSer<210>21<211>15<212>PRT<213>智人<400>21IleTyrAlaPheCysCysProThrThrAspSerSerTyrProSer151015<210>22<211>69<212>PRT<213>智人<400>22SerLeuAlaAlaAspThrProThrAlaCysCysPheSerTyrThrSer151015ArgGlnIleProGlnAsnPheIleAlaAlaTyrPheGluThrSerser202530GlnCysSerLysProGlyValIlePheLeuThrLysArgSerArgGln354045ValCysAlaAspProSerGluGluTrpValGlnLysTyrValSerAsp505560LeuGluLeuSerAla6權(quán)利要求1.一種包含CCL5多肽的抗病毒組合物，其中所述CCL5多肽抑制哺乳動(dòng)物受檢者受副粘液病毒科(副粘病毒)病毒的感染。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述副粘病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述CCL5多肽通過(guò)阻斷RSV融合(F)蛋白與哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞之間的互作來(lái)抑制RSV感染。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述CCL5多肽是合成CCL5多肽或經(jīng)重組表達(dá)的CCL5多肽。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述CCL5多肽在哺乳動(dòng)物受檢者中作為趨化因子是無(wú)生物活性的。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述哺乳動(dòng)物受檢者是人類(lèi)。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述哺乳動(dòng)物受檢者是經(jīng)馴養(yǎng)的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物，其選自由牛、馬、豬、狗、貓、山羊和綿羊組成的群組。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述CCL5多肽包含SEQIDNO1氨基酸序列。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述CCL5多肽是NH2-末端經(jīng)修飾的CCL5多肽。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述NH2-末端經(jīng)修飾的CCL5多肽是選自由氨氧基戊烷-CCL5(AOP-CCL5)、Met-CCL5、Nα-壬?；?CCL5(NNY-CCL5)、Δ1-2截短型CCL5和Δ1-8截短型CCL5組成的群組。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其進(jìn)一步包含一個(gè)或一個(gè)以上的CCL5肽片段，其中所述片段包含SEQIDNO1的CCL5多肽的約10至20個(gè)相鄰氨基酸。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述一個(gè)或一個(gè)以上的CCL5肽片段是選自由SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17和SEQIDNO18組成的群組。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述CCL5肽片段包含SEQIDNO2氨基酸序列。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述SEQIDNO2肽片段進(jìn)一步被定義為SEQIDNO1的NH2-末端肽。15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述CCL5多肽進(jìn)一步被定義為人類(lèi)CCL5多肽。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其進(jìn)一步包含SEQIDNO1的CCL5多肽的NH2-末端的肽模擬物。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述CCL5多肽的NH2-末端的肽模擬物是包含SEQIDNO19、SEQIDNO20或SEQIDNO21氨基酸序列的逆轉(zhuǎn)CCL5多肽。18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其進(jìn)一步包含結(jié)合CCR3趨化因子受體的有機(jī)分子。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述有機(jī)分子是CCR3受體拮抗劑。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述有機(jī)分子包含一個(gè)或一個(gè)以上的式I、II或III的化學(xué)結(jié)構(gòu)。21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物是通過(guò)鼻內(nèi)投藥或非經(jīng)腸投藥而投與哺乳動(dòng)物受檢者。22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其進(jìn)一步包含為CCR1拮抗劑或CCR5拮抗劑的有機(jī)分子。23.一種重組表達(dá)載體，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的CCL5多肽的多核苷酸序列。24.一種經(jīng)根據(jù)權(quán)利要求23所述的載體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或侵染的宿主細(xì)胞。25.一種包含CCL5多肽的NH2-末端肽片段的抗病毒組合物，其中所述片段包含CCL5多肽的NH2-末端的約10至20個(gè)相鄰氨基酸，其中所述片段抑制哺乳動(dòng)物受檢者受副粘液病毒科(副粘病毒)病毒的感染。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述副粘病毒是RSV。27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述CCL5多肽包含SEQIDNO1氨基酸序列。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述NH2-末端肽片段包含選自由以下序列組成的群組的氨基酸序列SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17和SEQIDNO18。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，其中所述NH2-末端肽片段包含SEQIDNO2氨基酸序列。30.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述組合物在哺乳動(dòng)物受檢者中作為趨化因子是無(wú)生物活性的。31.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述組合物是通過(guò)鼻內(nèi)投藥或非經(jīng)腸投藥而投與哺乳動(dòng)物受檢者。32.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述NH2-末端CCL5肽片段通過(guò)阻斷RSV融合(F)蛋白與哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞之間的互作來(lái)抑制RSV感染。33.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其進(jìn)一步包含一個(gè)或一個(gè)以上選自由氨氧基戊烷-CCL5(AOP-CCL5)、Met-CCL5、Nα-壬?；?CCL5(NNY-CCL5)、Δ1-2截短型CCL5和Δ1-8截短型CCL5組成的群組的NH2-末端經(jīng)修飾的CCL5多肽。34.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其進(jìn)一步包含SEQIDNO1的CCL5多肽的NH2-末端的肽模擬物。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的組合物，其中所述CCL5多肽的NH2-末端的肽模擬物是包含SEQIDNO19、SEQIDNO20或SEQIDNO21氨基酸序列的逆轉(zhuǎn)CCL5多肽。36.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其進(jìn)一步包含為CCR1受體、CCR3受體或CCR5受體的拮抗劑的有機(jī)分子。37.一種重組表達(dá)載體，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求25所述的NH2-末端CCL5肽片段的多核苷酸序列。38.一種經(jīng)根據(jù)權(quán)利要求37所述的載體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或侵染的宿主細(xì)胞。39.一種有機(jī)小分子模擬物，其是通過(guò)使用SEQIDNO1的前15個(gè)CCL5NH2-末端氨基酸的原子X(jué)、Y、Z坐標(biāo)的基于計(jì)算機(jī)的分子模型化設(shè)計(jì)而成，其中所述X、Y、Z坐標(biāo)見(jiàn)于選自由1RTN、1RTO、1EQT和1B3A組成的群組的BrookhavenProteinDataBank文件中。40.一種包含根據(jù)權(quán)利要求39所述的有機(jī)分子的抗病毒組合物。41.一種CCL5多肽的NH2-末端的肽模擬物，其中所述肽模擬物抑制哺乳動(dòng)物受檢者受副粘液病毒科(副粘病毒)病毒的感染。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的肽模擬物，其中所述模擬物是通過(guò)使用SEQIDNO1的前15個(gè)CCL5NH2-末端氨基酸的原子X(jué)、Y、Z坐標(biāo)的基于計(jì)算機(jī)的分子模型化設(shè)計(jì)而成，其中所述X、Y、Z坐標(biāo)被包含于選自由1RTN、1RTO、1EQT和1B3A組成的群組的BrookhavenProteinDataBank文件中。43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的肽模擬物，其中所述模擬物是回折模擬物。44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的肽模擬物，其中所述回折模擬物是β-轉(zhuǎn)角模擬物、單環(huán)β-轉(zhuǎn)角模擬物、雙環(huán)β-轉(zhuǎn)角模擬物、γ-轉(zhuǎn)角模擬物或單環(huán)γ-轉(zhuǎn)角模擬物。45.一種包含根據(jù)權(quán)利要求41所述的肽模擬物的抗病毒組合物。46.一種用于預(yù)防或抑制哺乳動(dòng)物宿主受副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染的方法，所述方法包含對(duì)所述宿主投與醫(yī)藥學(xué)有效量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物。47.一種用于預(yù)防或抑制哺乳動(dòng)物宿主中副粘病毒感染的方法，所述方法包含對(duì)所述宿主投與醫(yī)藥學(xué)有效量的根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物。48.一種用于預(yù)防或抑制哺乳動(dòng)物宿主中副粘病毒感染的方法，所述方法包含對(duì)所述宿主投與醫(yī)藥學(xué)有效量的根據(jù)權(quán)利要求39所述的組合物。49.一種用于預(yù)防或抑制哺乳動(dòng)物宿主受副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染的方法，其中所述方法包含對(duì)所述宿主投與醫(yī)藥學(xué)有效量的根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合物。全文摘要本發(fā)明針對(duì)用于投與易受副粘病毒感染，尤其是呼吸道合胞病毒(RSV)感染的哺乳動(dòng)物宿主(例如人類(lèi))的抗病毒素。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的抗病毒分子是多肽、趨化因子多肽、趨化因子多肽片段、有機(jī)小分子或肽模擬物，其中所述抗病毒分子抑制或預(yù)防哺乳動(dòng)物細(xì)胞的副粘病毒感染。文檔編號(hào)A61P31/14GK1902223SQ200480039227公開(kāi)日2007年1月24日申請(qǐng)日期2004年12月28日優(yōu)先權(quán)日2003年12月30日發(fā)明者杰拉爾德·歐文·漢考克,保羅·威廉·特比申請(qǐng)人:惠氏公司