專利名稱：作為雌激素藥劑的(4－羥基苯基)－1h－吲哚－3－甲醛肟衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及(羥苯基)-1H-吲哚-3-甲醛肟衍生物、其作為雌激素藥劑的用途、以及其制備方法。
背景技術(shù)：
已經(jīng)有很多文獻(xiàn)記載過(guò)雌激素在哺乳動(dòng)物組織中具有多種功效，目前已知雌激素可以影響很多器官系統(tǒng)[Mendelsohn和Karas，NewEngland Journal of Medicine 3401801-1811(1999)，Epperson等人，Psychosomatic Medicine 61676-697(1999)，Crandall，Journalof Womens Health & Gender Based Medicine 81155-1166(1999)，Monk和Brodaty，Dementia & Geriatric Cognitive Disorders 111-10(2000)，Hurn和Macrae，Journal of Cerebral Blood Flow &Metabolism 20631-652(2000)，Calvin，Maturitas 34195-210(2000)，F(xiàn)inking等人，Zeitschrift fur Kardiologie 89442-453(2000)，Brincat，Maturitas 35107-117(2000)，Al-Azzawi，Postgraduate MedicalJournal 77292-304(2001)]。雌激素可以通過(guò)多種方式對(duì)組織產(chǎn)生作用。或許最具特征性的作用機(jī)理是它們與雌激素受體相互作用，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變。雌激素受體是由配體活化的轉(zhuǎn)錄因子，屬于細(xì)胞核激素受體超家族。該家族的其它成員包括孕酮、雄激素、糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素受體。一旦結(jié)合配體之后，這些受體發(fā)生二聚，然后既可以通過(guò)直接結(jié)合DNA上的特定序列(稱作響應(yīng)元件)，也可以通過(guò)與反過(guò)來(lái)直接結(jié)合特定DNA序列的其它轉(zhuǎn)錄因子(例如AP1)相互作用來(lái)活化基因轉(zhuǎn)錄[Moggs和Orphanides，EMBO Reports 2775-781(2001)，Hall等人，Journal of Biological Chemistry 27636869-36872(2001)，McDonnell，Principles Of Molecular Regulation.p351-361(2000)]。有一類“輔調(diào)節(jié)(coregulatory)”蛋白還可以與配體結(jié)合的受體發(fā)生相互作用，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性[McKenna等人，Endocrine Reviews 20321-344(1999)]。另外還表明，雌激素受體可以同時(shí)通過(guò)依賴于配體的方式和不依賴于配體的方式抑制NFKB-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄[Quaedackers等人，Endocrinology 1421156-1166(2001)，Bhat等人，Journal of Steroid Biochemistry & MolecularBiology 67233-240(1998)，Pelzer等人，Biochemical & BiophysicalResearch Communications 2861153-7(2001)]。
雌激素受體還可以通過(guò)磷酸化作用活化。這種磷酸化作用通過(guò)生長(zhǎng)因子例如EGF介導(dǎo)，在配體不存在下引起基因轉(zhuǎn)錄變化[Moggs和Orphanides，EMBO Reports 2775-781(2001)，Hall等人，Journalof Biological Chemistry 27636869-36872(2001)]。
雌激素影響細(xì)胞的另一略具特征性的方式是通過(guò)所謂的膜受體。是否存在這類受體是有所爭(zhēng)議的，但是已有很多文獻(xiàn)記載雌激素可以由細(xì)胞引發(fā)出非常迅速的非基因組響應(yīng)。負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)導(dǎo)上述效應(yīng)的這種分子實(shí)體未被最后分離，但是有證據(jù)表明它至少與雌激素受體的核心形式有關(guān)[Levin，Journal of Applied Physiology 911860-1867(2001)，Levin，Trends in Endocrinology & Metabolism 10374-377(1999)]。
至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩種雌激素受體。第一種雌激素受體在大約15年前被克隆，現(xiàn)在被稱作ERαGreen等人，Nature 320134-9(1986)]。第二種相對(duì)而言是較近發(fā)現(xiàn)的，被稱作ERβ[Kuiper等人，Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America935925-5930(1996)]。對(duì)ERβ的早期研究集中于分析其對(duì)各種配體的親和力，并且實(shí)際上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與ERα存一些差異。已經(jīng)很詳細(xì)地繪制了ERβ在齒動(dòng)物中的組織分布，其與ERα并不一致。例如小鼠和大鼠子宮的組織主要表達(dá)ERα，而小和大鼠肺主要表達(dá)ERβ[Couse等人，Endocrinology 1384613-4621(1997)，Kuiper等人，Endocrinology 138863-870(1997)]。即使在同一器官內(nèi)部，ERα和ERβ的分布也可能是不同的。例如，在小鼠卵巢中，ERβ高度表達(dá)于粒層細(xì)胞中，而ERα主要集中在鞘和基質(zhì)細(xì)胞中[Sar和Welsch，Endocrinology 140963-971(1999)，F(xiàn)itzpatrick等人，Endocrinology1402581-2591(1999)]。然而，有實(shí)例表明這些受體可以共表達(dá)，而且也有體外證據(jù)證實(shí)ERα和ERβ以形成雜二聚體[Cowley等人，Journal of Biological Chemistry 27219858-19862(1997)]。
最有效的內(nèi)源性雌激素是17β-雌二醇。已經(jīng)公開(kāi)了很多可以模擬或阻斷17β-雌二醇活性的化合物。具有大致與17β-雌二醇相同生物活性的化合物被稱作“雌激素受體激動(dòng)劑”。那些當(dāng)與17β-雌二醇聯(lián)合給藥時(shí)阻斷其活性的化合物被稱作“雌激素受體拮抗劑”。實(shí)際上，雌激素受體激動(dòng)劑和雌激素受體拮抗劑活性之間存在一定關(guān)系，某些化合物在某些組織中作為雌激素受體激動(dòng)劑，而在其它組織中卻是雌激素受體拮抗劑。這些具有混合活性的化合物被稱作選擇性的雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，在治療上是有用的藥物(例如EVISTA)[McDonnell，Journal of the Society for Gynecologic Investigation 7S10-S15(2000)，Goldstein等人，Human Reproduction Update 6212-224(2000)]。為什么同一化合物可以具有細(xì)胞特異性的準(zhǔn)確原因目前尚未闡明，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)受體構(gòu)象和/或輔調(diào)節(jié)蛋白的周圍環(huán)境存在差異。
已知在某些情況下雌激素受體在結(jié)合配體時(shí)可以接受不同的構(gòu)象。然而，僅僅是最近才發(fā)現(xiàn)這些變化所帶來(lái)的結(jié)果和精妙之處。已經(jīng)通過(guò)與不同的配體共結(jié)晶發(fā)現(xiàn)了ERα和ERβ的三維結(jié)構(gòu)，其清楚顯示出螺旋12在雌激素受體拮抗劑的存在下?lián)Q位，這樣在空間上阻礙了受體-輔調(diào)節(jié)蛋白之間發(fā)生相互作用所需要的蛋白序列[Pike等人，Embo 184608-4618(1999)，Shiau等人，Cell 95927-937(1998)]。另外，還可以使用噬菌體展示技術(shù)來(lái)識(shí)別在不同配體存在下與雌激素受體發(fā)生相互作用的肽[Paige等人，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 963999-4004(1999)]。例如，識(shí)別出能辨別受全雌激素受體激動(dòng)劑17β-雌二醇和己烯雌酚束縛的ERα的肽。已表明，另一肽能辨別受ERα和ERβ束縛的氯米芬。這些資料表明，各配體潛在地使受體置于可能具有不同生物活性且既獨(dú)特又不可預(yù)期的構(gòu)象中。
如上所述，雌激素可以影響各種生物過(guò)程。另外，在討論有關(guān)性別差異時(shí)(例如發(fā)病頻率、應(yīng)急反應(yīng)等)，相關(guān)的解釋還可能涉及雄性和雌性之間所存在的雌激素水平差異。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及(羥苯基)-1H-吲哚-3-甲醛肟衍生物。在某些方面，本發(fā)明涉及式1化合物或其可藥用鹽或前藥
其中R1是氫、任選被取代的烷基、鹵素、CN、或任選被取代的烷氧基；R2是氫、任選被取代的烷基、或任選被取代的苯基；或者R1和R2一起可以形成5-7元環(huán)；以及R3和R4各自獨(dú)立地是H、OH、鹵素、CN、任選被取代的苯基、任選被取代的烷基或任選被取代的烷氧基。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有化合物1和可藥用載體的藥物組合物。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這類化合物在治療或預(yù)防例如炎性腸病的疾病中的用途。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了可用于治療和/或預(yù)防例如炎性腸病的疾病(包括克羅恩氏病和結(jié)腸炎)的式1的雌激素化合物或其可藥用鹽或前藥 其中R1是氫、任選被取代的烷基、鹵素、CN、或任選被取代的烷氧基；R2是氫、任選被取代的烷基、或任選被取代的苯基；或者R1和R2一起可以形成5-7元環(huán)；以及R3、和R4各自獨(dú)立地是H、OH、鹵素、CN、任選被取代的苯基、任選被取代的烷基或任選被取代的烷氧基。
在化合物1的某些實(shí)施方案中，R1是烷基，優(yōu)選低級(jí)烷基，例如甲基。在其它實(shí)施方案中，R2是氫、或烷基，優(yōu)選低級(jí)烷基，例如甲基。其它實(shí)施方案包括其中R1和R2一起形成6元環(huán)的組合。在部分實(shí)施方案中，R3是H、鹵素或CN。R4在部分實(shí)施方案中是氫。在部分其它實(shí)施方案中，R4是氟。在部分實(shí)施方案中，R4是鄰位氟。
當(dāng)本發(fā)明化合物含有堿性基團(tuán)時(shí)，可藥用鹽可以由有機(jī)和無(wú)機(jī)酸形成，例如乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、馬來(lái)酸、丙二酸、扁桃酸、蘋果酸、鄰苯二甲酸、鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、萘磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、樟腦磺酸、以及類似已知的可接受的酸形成。當(dāng)本發(fā)明化合物含有酸性基團(tuán)時(shí)，上述鹽還可以由有機(jī)和無(wú)機(jī)堿形成，例如堿金屬鹽(如鈉、鋰、或鉀鹽)、堿土金屬鹽、銨鹽、含有1-6個(gè)碳原子的烷基銨鹽或在各烷基中含有1-6個(gè)碳原子的二烷基銨鹽、以及在各烷基中含有1-6個(gè)碳原子的三烷基銨鹽。
除非另有明確定義，本文中使用的單獨(dú)或作為另一基團(tuán)一部分的術(shù)語(yǔ)“烷基”是指被取代或未被取代的脂肪族烴鏈，包括但并不限于含有1-12個(gè)碳原子、優(yōu)選1-6個(gè)碳原子的直鏈和支鏈。例如術(shù)語(yǔ)“烷基”包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基和叔丁基。具體包括在“烷基”定義范圍內(nèi)的有任選被取代的脂肪族烴鏈。術(shù)語(yǔ)“低級(jí)烷基”是指含有1-6個(gè)碳原子的烷基，在某些實(shí)施方案中含有1-3個(gè)碳原子。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“烷氧基”是指基團(tuán)R-O-，其中R是烷基，優(yōu)選含有1-6個(gè)碳原子。
本文定義中使用的碳數(shù)目是指碳骨架和碳支鏈，并不包括取代基例如烷氧基取代基等中的碳原子。
本文中使用的單獨(dú)或作為另一基團(tuán)一部分的術(shù)語(yǔ)“苯基”是指被取代或未被取代的苯基。
任選被取代的烷基、鏈烯基、和苯基可以被一個(gè)或多個(gè)取代基取代。適宜的任選的取代基可以獨(dú)立地選自硝基、氰基、-N(R11)(R12)、鹵素、羥基、羧基、烷基、鏈烯基、鏈炔基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、芳氧基、雜芳氧基、烷基烷氧基、烷氧羰基、烷氧烷氧基、全氟烷基、全氟烷氧基、芳烷基、烷芳基、羥烷基、烷氧烷基、烷硫基、-S(O)2-N(R11)(R12)、-C(＝O)-N(R11)(R12)、(R11)(R12)N-烷基、(R11)(R12)N-烷氧烷基、(R11)(R12)N-烷基芳氧基烷基、-S(O)s-芳基(其中s＝0-2)、或者-S(O)s-雜芳基(其中s＝0-2)。在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，烷基、鏈烯基、鏈炔基、環(huán)烷基或苯基的優(yōu)選取代基包括硝基、氰基、-N(R11)(R12)、鹵素、羥基、芳基、雜芳基、烷氧基、烷氧烷基、和烷氧羰基。在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，芳基和雜芳基的優(yōu)選取代基包括-N(R11)(R12)、烷基、鹵素、全氟烷基、全氟烷氧基、芳烷基和烷芳基。R11和R12各自獨(dú)立地選自氫和烷基。
本文中使用的單獨(dú)或作為另一基團(tuán)一部分的術(shù)語(yǔ)“鏈烯基”是指含有至少一個(gè)雙鍵的被取代或未被取代的脂肪族烴鏈，包括但并不限于含有2-8個(gè)碳原子的直鏈和支鏈。優(yōu)選該鏈烯基含有1或2個(gè)雙鍵。這類鏈烯基可能存在E或Z構(gòu)型，因此本發(fā)明包括這兩種構(gòu)型。具體包括在“鏈烯基”定義內(nèi)的有任選被取代的脂肪族烴鏈。與鏈烯基相連的雜原子例如O、S或N-R不能與結(jié)合雙鍵的碳原子相連。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)鏈炔基是指可以含有1-3個(gè)三鍵、具有2-7個(gè)碳原子的脂肪族、直鏈或支鏈烴鏈。本文中使用的術(shù)語(yǔ)環(huán)烷基是指具有3-8個(gè)碳原子的單碳環(huán)，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。本文中使用的單獨(dú)或作為另一基團(tuán)一部分的術(shù)語(yǔ)芳基是指含有芳族5-13元單或雙碳環(huán)，例如苯基或萘基。優(yōu)選含有芳基部分的基團(tuán)是環(huán)中含有5-7個(gè)碳原子的單環(huán)。本文中使用的單獨(dú)或作為另一基團(tuán)一部分的術(shù)語(yǔ)雜芳基是指含有1-5個(gè)獨(dú)立地可為氮、氧或硫的雜原子的芳族5-13元含碳單環(huán)或雙環(huán)。優(yōu)選含有雜芳基部分的基團(tuán)是環(huán)中含有5-7元的單環(huán)，其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)原子獨(dú)立地選自氮、氧、或硫。適宜的芳基包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吲哚基和喹啉基。
被鹵素取代的烷基和鏈烯基實(shí)例包括1-溴乙烯基、1-氟乙烯基、1，2-氟基、2，2-二氟乙烯基、1，2，2-三氟乙烯基、1，2-二溴乙烷、1，2-二氟乙烷、1-氟-2-溴乙烷、CF2CF3、CF2CF2CF3等。
術(shù)語(yǔ)鹵素包括溴、氯、氟、和碘，優(yōu)選為溴、氯或氟。
至于提供本發(fā)明所包括的化合物或物質(zhì)而言，根據(jù)本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“提供”是指要么直接施用這類化合物或物質(zhì)，要么施用在體內(nèi)可形成有效量的所述化合物或物質(zhì)的前藥、衍生物、或類似物。
在制備本發(fā)明化合物中用到的試劑既可以商購(gòu)得到，也可以按照現(xiàn)有文獻(xiàn)中描述過(guò)的常規(guī)方法制備得到。
下面的流程

圖1-3描述了本發(fā)明幾個(gè)代表性實(shí)施例的制備。
流程圖1
流程圖2 流程圖3 本發(fā)明化合物是雌激素受體調(diào)節(jié)劑，可用于治療或抑制至少部分由雌激素缺乏或過(guò)量介導(dǎo)、或者可以通過(guò)使用雌激素藥劑而得到治療或抑制的病癥、障礙或病理狀態(tài)。本發(fā)明化合物尤其可用于治療其中內(nèi)生性雌激素嚴(yán)重減少的近絕經(jīng)、絕經(jīng)、或絕經(jīng)后患者。絕經(jīng)期通常被定義為最后的自然月經(jīng)期，其特征在于卵巢功能停止，導(dǎo)致血流中的循環(huán)雌激素嚴(yán)重減少。本文中使用的絕經(jīng)期還包括雌激素生成減少的情形，這種情形可能是由手術(shù)、或化學(xué)上引起的，也可能是由導(dǎo)致卵巢功能過(guò)早退化或停止的病理狀態(tài)引起的。
因此，本發(fā)明的化合物可用于治療或抑制骨質(zhì)疏松癥以及抑制骨脫礦質(zhì)化(bone demineralization)，骨脫礦質(zhì)化可能是由于個(gè)體中新骨組織的形成與老組織的再吸收之間失去平衡而引起的，最終導(dǎo)致骨凈損失。在很多個(gè)體中均會(huì)出現(xiàn)這類骨缺失，特別是絕經(jīng)后的婦女、接受過(guò)雙側(cè)卵巢切除術(shù)的人群、正在接受或已經(jīng)接受過(guò)長(zhǎng)期皮質(zhì)類甾醇治療的人群、遭受性腺發(fā)育不全的人群、以及患有柯興氏綜合癥的人群。在患有骨折、具有缺陷性骨結(jié)構(gòu)的個(gè)體、以及正在接受骨相關(guān)手術(shù)和/或假肢植入的人群中，使用這些化合物還可以解決他們對(duì)于包括牙骨和口腔骨在內(nèi)的骨的具體需要。除了上述這些問(wèn)題之外，這些化合物還可用于治療或抑制骨關(guān)節(jié)炎、低鈣血癥、高鈣血癥、佩吉特氏病(Paget′s disease)、骨軟化癥、骨鈣質(zhì)缺乏、多發(fā)性骨髓瘤以及對(duì)骨組織具有有害作用的其它形式的癌癥。
本發(fā)明的化合物還可用于治療或抑制良性或惡性的異常組織生長(zhǎng)，包括前列腺肥大、子宮平滑肌瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜異位、子宮內(nèi)膜癌、多囊性卵巢綜合癥、子宮內(nèi)膜息肉、良性乳房疾病、子宮腺肌病、卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌、CNS癌(例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤或astioblastomia)。
本發(fā)明的化合物具有心臟保護(hù)特性，因而可用于降低膽固醇、甘油三酯、Lp(a)、和LDL水平；抑制或治療高膽固醇血癥；高脂血癥；心血管疾病；動(dòng)脈粥樣硬化癥；外周血管疾?。辉侏M窄、和血管痙攣；以及抑制因?qū)е旅庖呓閷?dǎo)的血管損傷的細(xì)胞活動(dòng)而引起的血管壁損傷。為了抑制骨質(zhì)疏松，在使用雌激素治療絕經(jīng)期后患者和使用雌激素治療男性患者時(shí)，上述心臟保護(hù)特性特別重要。
本發(fā)明的化合物還是抗氧化劑，因而可用于治療或抑制游離基誘導(dǎo)的病理狀態(tài)。需要抗氧化劑治療的具體情形有癌癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、阿耳茨海默氏病、骨病、老化、炎性疾病、外周血管疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自體免疫疾病、呼吸窘迫、氣腫、再灌注損傷的預(yù)防、病毒性肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎、肺結(jié)核、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、成人呼吸窘迫綜合癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷和中風(fēng)。
本發(fā)明的化合物還可用于提高認(rèn)知力，治療或抑制老年性癡呆、阿耳茨海默氏病、認(rèn)知減退、神經(jīng)變性疾病，提高神經(jīng)保護(hù)作用或認(rèn)知力提高作用。
本發(fā)明的化合物還可用于治療或抑制炎性腸病、潰瘍性直腸炎、克羅恩氏病、和結(jié)腸炎；與絕經(jīng)相關(guān)的病癥，例如血管舒縮癥狀包括潮熱、陰道或外陰萎縮、萎縮性陰道炎、陰道干燥、搔癢癥、性交困難、排尿困難、尿頻、尿失禁、尿道感染、血管舒縮癥狀包括潮熱、肌痛、關(guān)節(jié)痛、失眠、過(guò)敏等；男性型禿發(fā)；皮膚萎縮；痤瘡；II型糖尿病；功能障礙性子宮出血；和不育癥。
本發(fā)明的化合物可用于其中閉經(jīng)是有益的病理狀態(tài)中，所述病理狀態(tài)例如白血病、子宮內(nèi)膜脫除、慢性腎病或肝病或者凝固疾病或障礙。
本發(fā)明的化合物可用作避孕藥，尤其是當(dāng)其與孕激素聯(lián)用時(shí)。
應(yīng)該理解的是，在給藥用于治療或抑制特定病理狀態(tài)或障礙時(shí)，其有效劑量可能取決于所使用的特定化合物、給藥方式、待治療病癥的癥狀、及其嚴(yán)重程度、以及待治療個(gè)體相關(guān)的身體因素。本發(fā)明化合物的有效給藥可以按照大約0.1mg/天至大約1,000mg/天的口服劑量服用。優(yōu)選按照大約10mg/天至大約600mg/天、更優(yōu)選大約50mg/天至大約600mg/天，分成單一劑量或者兩次或更多次的分劑量給藥。預(yù)期的日劑量可望隨給藥途徑的不同而不同。
上述劑量可以按照任意一種用于將本發(fā)明的活性化合物引導(dǎo)至接受者血流中的方式給藥，包括口服、經(jīng)植入物、非腸道(包括靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下注射)、直腸、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、和經(jīng)皮給藥。
含有本發(fā)明活性化合物的口服制劑可以含有任意一種常用的口服劑型，包括片劑、膠囊劑、含劑形式、藥片、錠劑以及口服液體制劑、混懸劑或溶液劑。膠囊劑可以含有(一種或多種)活性化合物與惰性填充劑和/或稀釋劑例如可藥用淀粉(如玉米、馬鈴薯或木薯淀粉)、糖、人造甜味劑、粉狀纖維素例如結(jié)晶和微晶纖維素、面粉、明膠、樹(shù)膠等的混合物。有用的片劑可以按照常規(guī)的擠壓法、濕法制粒法或干法制粒法制備得到，同時(shí)使用可藥用的稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑、表面改性劑(包括表面活性劑)、助懸劑或穩(wěn)定劑，包括但不限于硬脂酸鎂、硬脂酸、滑石、十二烷基硫酸鈉、微晶纖維素、羧甲基纖維素鈣、聚乙烯基吡咯烷酮、明膠、藻酸、阿拉伯膠、黃原膠、檸檬酸鈉、復(fù)合硅酸鹽、碳酸鈣、甘氨酸、糊精、蔗糖、山梨糖醇、磷酸氫二鈣、硫酸鈣、乳糖、高嶺土、甘露醇、氯化鈉、滑石、干燥淀粉和糖粉。優(yōu)選的表面改性劑包括非離子和陰離子表面改性劑。表面改性劑的代表性實(shí)例包括但不限于泊洛沙姆188、苯扎氯銨、硬脂酸鈣、十八醇十六醇混合物、聚乙二醇單鯨蠟基醚(cetomacrogol)乳化蠟、山梨坦酯、膠體二氧化硅、磷酸鹽、十二烷基硫酸鈉、硅酸鎂鋁、和三乙醇胺。本發(fā)明的口服制劑可以采用常規(guī)的延遲釋出或限時(shí)釋出制劑以改變活性化合物的吸收情況。該口服制劑還可以將活性成分包含在水或果汁中給藥，如果需要的話，可以含有適宜的增溶劑或乳化劑。
在某些情形中，可能需要將化合物以氣霧劑的形式直接施用至氣道。
本發(fā)明的化合物還可以通過(guò)非腸道或腹膜內(nèi)給藥。該活性化合物的游離堿或其可藥用鹽的溶液劑或混懸劑可以在適當(dāng)混合有例如羥丙基纖維素的表面活性劑的水中制備得到。還可以在甘油、液體聚乙二醇及其在油中的混合物中制備得到分散劑。在儲(chǔ)存和使用的常規(guī)條件下，這些制劑中可以含有防腐劑以抑制微生物的生長(zhǎng)。
適合注射給藥的藥物劑型包括無(wú)菌水溶液劑或分散劑以及用于臨時(shí)配制無(wú)菌注射溶液劑或分散劑的無(wú)菌粉劑。在任何情形中，這種劑型必須無(wú)菌且具有易于注射的流動(dòng)性。它在制造和儲(chǔ)存條件下必須保持穩(wěn)定，同時(shí)還必須能夠抵抗微生物例如細(xì)菌和真菌的污染。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)的溶劑或者分散介質(zhì)、及其適宜的混合物，以及植物油。
對(duì)于本發(fā)明而言，經(jīng)皮給藥被理解為包括所有透過(guò)體表和體內(nèi)通道(包括上皮和粘膜組織)內(nèi)層的給藥方式。使用本發(fā)明化合物、或其可藥用鹽的洗劑、霜?jiǎng)?、泡沫、貼劑、混懸劑、溶液劑、和栓劑(直腸和陰道給藥)形式可以實(shí)現(xiàn)上述給藥。
通過(guò)使用含有活性化合物以及對(duì)該活性化合物呈惰性且對(duì)皮膚無(wú)毒的載體的經(jīng)皮貼劑可以實(shí)現(xiàn)經(jīng)皮給藥，從而釋放出藥劑以通過(guò)皮膚系統(tǒng)性吸收入血液中。載體可以為任意形式，例如乳膏和軟膏、糊、凝膠、和閉合裝置。乳膏和軟膏可以是水包油或油包水型的粘性液體或半固體乳狀液。由分散于含有活性成分的石油或親水性石油中的吸附性粉末組成的糊也是適宜的。各種閉合裝置可以用于將活性成分釋放入血液中，例如將半透膜覆蓋在含有活性成分和載體(可有可無(wú))的儲(chǔ)藏庫(kù)、或者含有活性成分的基質(zhì)上。其它閉合裝置在文獻(xiàn)中是已知的。
栓劑可以由傳統(tǒng)材料制成，傳統(tǒng)材料包括可可脂(可以加入也可以不加入蠟以調(diào)節(jié)栓劑的熔點(diǎn))、和甘油。還可以使用水溶性栓劑基質(zhì)，例如具有不同分子量的聚乙二醇。
實(shí)施例1a1-(4-芐氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚向2-甲基吲哚(3.28g，25mmol)、4-芐氧基碘苯(7.76g，25mmol)、碳酸鉀(2.65g，25mmol)、和N-甲基吡咯烷酮(250mL)的混合物中加入溴化亞銅(I)(0.5g，3.5mmol)。攪拌后的溶液加熱至180℃，保持18小時(shí)。反應(yīng)混合物冷卻后，傾入冰上，用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用水和鹽水洗滌后，用無(wú)水MgSO4干燥，除去溶劑得到暗色液體。通過(guò)硅膠色譜法(2％乙酸乙酯-己烷)純化得到為白色固體的標(biāo)題化合物(30％)mp 95-96℃；1H NMR(DMSO-d6)δ2.24(3H，s)，5.19(2H，s)，6.38(1H，s)，6.93-7.04(3H，m)，7.20(2H，d，J＝1.9Hz)，7.23(2H，d，J＝3.1Hz)，7.32-7.53(8H，m)；MS m/z(M+H)+314對(duì)C22H19NO0.1H2O的分析計(jì)算值C，83.83；H，6.14；N，4.44。
實(shí)測(cè)值C，83.84；H，6.18；N，4.29。
實(shí)施例1b5-氟-1-(4-芐氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚將5-氟-2-甲基吲哚(5.0g，33.5mmol)與4-芐氧基碘苯(10.40g，33.5mmol)按照前面實(shí)施例1a中采用的步驟反應(yīng)得到白色固體(23％)mp 94-95℃；1H NMR(DMSO-d6)δ2.23(3H，s)，5.19(2H，s)，6.39(1H，s)，6.84-6.94(2H，m)，7.19-7.29(3H，m)，7.34-7.44(5H，m)，7.51(2H，d，J＝7.1Hz)；MS m/z(M+H)+332。
對(duì)C22H18NOF的分析計(jì)算值C，79.74；H，5.47；N，4.23。
實(shí)測(cè)值C，79.54；H，5.54；N，4.21。
實(shí)施例1c5-氯-1-(4-甲氧甲基氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚將5-氯-2-甲基吲哚(4.14g，25mmol)與4-甲氧基甲基氧基碘苯(6.20g，25mmol)按照前面實(shí)施例1a中采用的步驟反應(yīng)得到無(wú)色液體(19％)1H NMR(DMSO-d6)δ2.25(3H，s)，3.44(2H，s)，5.28(2H，s)，6.40(1H，s)，6.96(1H，d，J＝8.8Hz)，7.02(1H，dd，J＝2.0Hz，J＝8.8Hz)，7.22(2H，d，J＝8.8Hz)，7.36(2H，d，J＝8.8Hz)，7.55(1H，d，J＝2.0Hz)；MS m/z(M+H)+302/304(1Cl)。
對(duì)C17H16ClNO2的分析計(jì)算值C，67.66；H，5.34；N，4.64。
實(shí)測(cè)值C，67.49；H，5.17；N，4.51。
實(shí)施例1d5-溴-1-(4-甲氧甲基氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚將5-溴-2-甲基吲哚(5.59g，23.8mmol)與4-甲氧甲基氧基碘苯(7.47g，23.8mmol)按照前面實(shí)施例1a中采用的步驟反應(yīng)得到無(wú)色液體(8.4％)1H NMR(DMSO-d6)δ2.23(3H，s)，3.43(2H，s)，5.26(2H，s)，6.39(1H，s)，6.94(1H，d，J＝8.7Hz)，7.01(1H，dd，J＝2.2Hz，J＝8.6Hz)，7.20(2H，d，J＝8.6Hz)，7.34(2H，d，J＝8.6Hz)，7.53(1H，d，J＝2.2Hz)；MS m/z(M+H)+346/348(1Br)。
對(duì)C17H16BrNO2的分析計(jì)算值C，58.98；H，4.66；N，4.05。
實(shí)測(cè)值C，58.72；H，4.53；N，4.17。
實(shí)施例1e
(4E)-9-(4-芐氧基苯基)-1，2，3，9-四氫-4H-咔唑?qū)⑦沁?8.70g，39.7mmol)與4-芐氧基碘苯(12.33g，39.7mmol)按照前面實(shí)施例1a中采用的步驟反應(yīng)得到棕褐色固體(20％)mp128-129℃；1H NMR(DMSO-d6)δ1.86(4H，br s)，2.55(2H，br s)，2.72(2H，br s)，5.16(2H，s)，7.00-7.03(2H，m)，7.05-7.08(1H，m)，7.13-7.16(2H，m)，7.27-7.30(2H，m)，7.33-7.36(1H，m)，7.40-7.43(2H，m)，7.49(2H，d，J＝7.2Hz)；MS m/z(M+H)+354。
對(duì)C25H23NO的分析計(jì)算值C，84.95；H，6.56；N，3.96。
實(shí)測(cè)值C，84.74；H，6.76；N，3.91。
實(shí)施例1f1-(4-芐氧基-3-氟苯基)-2-甲基-1H-吲哚向2-甲基吲哚(6.23g，47.5mmol)、4-芐氧基-3-氟溴苯(14.066g，50mmol)、碳酸鉀(5.83g，55mmol)、和N-甲基吡咯烷酮(500mL)的混合物中加入溴化亞銅(I)(1.0g，7mmol)。攪拌后的溶液加熱至180℃，保持18小時(shí)。反應(yīng)混合物冷卻后，傾入冰上，用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用水和鹽水洗滌后，用無(wú)水MgSO4干燥，除去溶劑得到暗色液體，將其通過(guò)硅膠色譜法(2％乙酸乙酯-己烷)純化得到為白色固體的標(biāo)題化合物(3.45gr.22％收率)mp 70-71℃；1H NMR(DMSO-d6)δ2.26(3H，s)，5.28(2H，s)，6.39(1H，s)，6.99-7.05(3H，m)，7.21-7.24(2H，m)，7.36-7.54(7H，m))；MS m/z(M+H)+332對(duì)C22H18NOF0.1H2O的分析計(jì)算值C，79.31；H，5.51；N，4.20。
實(shí)測(cè)值C，79.29；H，5.39；N，4.16。
實(shí)施例2a1-(4-芐氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛將三氯氧化磷(3mL)加入至無(wú)水二甲基甲酰胺(6mL)中，混合物在室溫下攪拌15分鐘。加入1-(4-芐氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚(0.94g，3mmol)在二甲基甲酰胺(10mL)中的混合物，混合物加熱至80℃，持續(xù)18小時(shí)。反應(yīng)混合物傾入冰上，通過(guò)加入2NNaOH調(diào)節(jié)pH至7?；旌衔镉靡宜嵋阴ポ腿?2×100mL)。有機(jī)層用水和鹽水萃取，MgSO4干燥。蒸發(fā)得到為暗色固體的產(chǎn)物。將其通過(guò)硅膠色譜法(10％ EtOAC-己烷)純化得到白色固體(63％)mp150-152℃；1H NMR(DMSO-d6)δ2.54(3H，s)，5.22(2H，s)，6.99(1H，d，J＝7.9Hz)，7.17-7.42(4H，m)，7.45-7.54(7H，m)，8.17(1H，d，J＝7.5Hz)，10.19(1H，s)；MS m/z(M+H)+342。
對(duì)C23H19NO2的分析計(jì)算值C，80.92；H，5.61；N，4.10。
實(shí)測(cè)值C，80.76；H，5.70；N，3.93。
實(shí)施例2b5-氟-1-(4-芐氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛將三氯氧化磷(5mL)加入至無(wú)水二甲基甲酰胺(10mL)中，混合物在室溫下攪拌15分鐘，向其中加入5-氟-1-(4-芐氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚(1.63g，4.9mmol)的二甲基甲酰胺(10mL)溶液，按照實(shí)施例2a中采用的步驟反應(yīng)得到棕褐色固體(85％)mp 219-220℃；1H NMR(DMSO-d6)δ2.53(3H，s)，5.22(2H，s)，6.99-7.06(2H，m)，7.27(2H，d，J＝8.9Hz)，7.37-7.53(7H，m)，7.86(1H，dd，J＝2.5Hz，J＝9.5Hz)；MS m/z(M+H)+360。
對(duì)C23H18FNO2·0.5H2O的分析計(jì)算值C，74.99；H，5.20；N，3.80。
實(shí)測(cè)值C，74.91；H，4.96；N，3.59。
實(shí)施例2c5-氯-1-(4-羥基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛將三氯氧化磷(5mL)加入至無(wú)水二甲基甲酰胺(10mL)中，在室溫下攪拌15分鐘，向其中加入5-氯-1-(4-甲氧甲基氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚(1.22g，3.5mmol)的二甲基甲酰胺(10mL)溶液。溶液按照實(shí)施例2a中采用的步驟反應(yīng)得到棕褐色固體(85％)mp＞240℃；1H NMR(DMSO-d6)δ2.52(3H，s)，6.97-7.02(3H，m)，7.22(1H，dd，J＝2.3Hz，J＝8.7Hz)，7.30(2H，d，J＝8.6Hz)，8.40(1H，d，J＝2.1Hz)，10.02(1H，s)，10.16(1H，s)；MS m/Z(M+H)+286/288(1Cl)。
對(duì)C16H12ClNO2·0.3H2O的分析
計(jì)算值C，66.01；H，4.36；N，4.81。
實(shí)測(cè)值C，65.85；H，4.10；N，4.74。
實(shí)施例2d5-溴-1-(4-羥基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛將三氯氧化磷(2.5mL)加入至無(wú)水二甲基甲酰胺(5mL)中，在室溫下攪拌15分鐘，向其中加入5-溴-1-(4-甲氧甲基氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚(0.65g，1.9mmol)的二甲基甲酰胺(10mL)溶液。溶液按照實(shí)施例2a中采用的步驟反應(yīng)得到棕褐色固體(51％)mp＞250℃；1H NMR(DMSO-d6)δ2.50(3H，s)，6.95-7.02(3H，m)，7.21(1H，dd，J＝2.4Hz，J＝8.8Hz)，7.28(2H，d，J＝8.7Hz)，8.38(1H，d，J＝2.2Hz)，9.98(1H，s)，10.14(1H，s)；MS m/Z(M+H)+318/320(1Br)。
對(duì)C16H12BrNO2·0.2H2O的分析計(jì)算值C，55.99；H，3.88；N，4.35。
實(shí)測(cè)值C，55.69；H，3.95；N，4.15。
實(shí)施例2e(4E)-9-(4-芐氧基苯基)-1，2，3，9-四氫-4H-咔唑-4-酮向攪拌后的(4E)-9-(4-芐氧基苯基)-1，2，3，9-四氫-4H-咔唑(1.55g，4.4mmol)、四氫呋喃(30mL)、和水(20mL)的溶液中加入DDQ(1g，4.4mmol)。繼續(xù)攪拌30分鐘，粗產(chǎn)物過(guò)濾后用水洗滌。產(chǎn)物通過(guò)硅膠色譜法純化(25％EtOAc-己烷)得到白色固體(57％)mp219-220℃；1H NMR(CDCl3)δ2.18-2.25(2H，m)，2.62(2H，t，J＝5.9Hz)，2.79(2H，t，J＝6.1Hz)，5.16(2H，s)，7.11-7.51(12H，m)，8.30(1H，d，J＝7.9Hz)；MS m/z(M+H)+368。
對(duì)C25H21NO2·0.5H2O的分析計(jì)算值C，79.76；H，5.86；N，3.72。
實(shí)測(cè)值C，79.86；H，5.75；N，3.53。
實(shí)施例2f1-(4-芐氧基苯基)-H-吲哚-3-甲醛將1H-吲哚-3-甲醛(3.63g，25mmol)與4-芐氧基碘苯(7.76g，25mmol)按照前面實(shí)施例1a中采用的步驟反應(yīng)得到黃色固體(12％)mp 62-64℃；1H NMR(DMSO-d6)δ5.22(2H，s)，7.26(2H，d，J＝8.8Hz)，7.32-7.52(7H，m)，7.61(2H，d，J＝8.8Hz)，8.19-8.22(1H，m)，8.54(1H，s)，10.02(1H，s)；MS m/z(M+H)+328。
對(duì)C22H17NO2·0.1H2O的分析計(jì)算值C，80.27；H，5.27；N，4.25。
實(shí)測(cè)值C，80.15；H，5.05；N，3.97。
實(shí)施例2g1-(4-芐氧基-3-氟苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛將三氯氧化磷(3mL)加入至無(wú)水二甲基甲酰胺(6mL)中，混合物在室溫下攪拌15分鐘。加入1-(4-芐氧基-3-氟苯基)-2-甲基-1H-吲哚(1.03g，3.1mmol)在二甲基甲酰胺(10mL)中的混合物，然后混合物加熱至80℃，保持18小時(shí)。反應(yīng)混合物傾入冰上，通過(guò)加入2N NaOH調(diào)節(jié)pH為7。混合物用乙酸乙酯萃取(2×100mL)，有機(jī)層用水和鹽水洗滌，MgSO4干燥，蒸發(fā)得到為暗色固體的產(chǎn)物。通過(guò)硅膠色譜法純化(25％EtOAC-己烷)得到白色固體(0.84gr，76％)mp 166-168-152℃；1H NMR(DMSO-d6)δ2.55(3H，s)，5.30(2H，s)，7.04(1H，d，J＝6.9Hz)，7.19-7.28(2H，m)，7.23-7.52(7H，m)，7.44(2H，dd，J＝6.0Hz，J＝1.4Hz)，7.59(1H，dd，J＝11.7Hz，J＝2.5)，8.17(1H，dd，J＝7.0Hz，J＝1.0)，10.20(1H，s)Hz；MS m/z(M+H)+360。
對(duì)C23H18FNO2(0.1H2O)的分析計(jì)算值C，76.48；H，5.08；N，3.88。
實(shí)測(cè)值C，76.39；H，4.81；N，3.69。
實(shí)施例3a1-(4-芐氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟將1-(4-芐氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛(0.64g，1.9mmol)、鹽酸羥胺(0.25g，3，6mmol)、甲醇(25mL)和吡啶(1mL)的溶液加熱回流30分鐘。混合物冷卻后，蒸發(fā)除去甲醇。產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取(2×50mL)，有機(jī)層用水和鹽水洗滌，MgSO4干燥。蒸發(fā)除去溶劑，產(chǎn)物通過(guò)硅膠色譜法純化(25％乙酸乙酯-己烷)得到白色固體(53％)mp 171-173℃；1H NMR(DMSO-d6)δ2.31(3H，s)，5.20(2H，s)，6.94-7.J01(1H，m)，7.10-7.14(2H，m)，7.23(2H，d，J＝8.9Hz)，7.37-7.47(5H，m)，7.52(2H，d，J＝7.4Hz)，8.01-8.03(1H，m)，8.41(1H，s)，10.66(1H，s)；MS m/z(M+H)+357。
對(duì)C23H20N2O2·0.5H2O的分析計(jì)算值C，75.60；H，5.79；N，7.67。
實(shí)測(cè)值C，75.12；H，5.53；N，7.34。
實(shí)施例3b5-氟-1-(4-芐氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟將5-氟-1-(4-芐氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛(0.97g，2.7mmol)、鹽酸羥胺(0.25g，3，6mmol)、甲醇(25mL)和吡啶(1mL)的溶液按照實(shí)施例3a中的步驟反應(yīng)得到白色固體(88％)mp 183-185℃；1H NMR(DMSO-d6)δ2.30(3H，s)，5.20(2H，s)d，6.94-6.97(2H，m)，7.23(2H，d，J＝8.9Hz)，7.37-7.46(5H，m)，7.52(2H，d，J＝6.8Hz)，7.71(1H，d，J＝10.1Hz)，8.41(1H，s)，10.72(1H，s)；MS m/z(M+H)+375。
對(duì)C23H19FN2O2的分析計(jì)算值C，73.78；H，5.11N，7.48。
實(shí)測(cè)值C，73.55；H，5.03；N，7.35。
實(shí)施例3e(4E)-9-(4-芐氧基苯基)-1，2，3，9-四氫-4H-咔唑-4-酮肟將(4E)-9-(4-芐氧基苯基)-1，2，3，9-四氫-4H-咔唑-4-酮(1.00g，2.7mmol)、鹽酸羥胺(0.56g，8.1mmol)、甲醇(25mL)和吡啶(1mL)的混合物按照實(shí)施例3a中的反應(yīng)得到白色固體(51％)mp241-243℃；1H NMR(DMSO-d6)δ1.83-1.92(2H，m)，2.65(2H，t，J＝5.9Hz)，2.72(2H，t，J＝6.0Hz)，5.20(2H，s)，7.09-7.14(3H，m)，7.22(2H，d，J＝8.8Hz)，7.36-7.46(5H，m)，7.51(2H，d，J＝6.9Hz)，8.00-8.02(1H，m)，10.46(1H，s)；MS m/z(M-H)-379。
對(duì)C25H24N2O2的分析計(jì)算值C，78.51；H，5.80；N，7.32。
實(shí)測(cè)值C，78.24；H，5.52；N，7.26。
實(shí)施例3f
1-(4-芐氧基苯基)-H-吲哚-3-甲醛肟將1-(4-芐氧基苯基)-H-吲哚-3-甲醛(0.50g，1.5mmol)、鹽酸羥胺(0.25g，3，6mmol)、甲醇(25mL)和吡啶(1mL)的混合物按照實(shí)施例3a中的步驟反應(yīng)得到黃色固體(61％)mp 152-154℃；1H NMR(DMSO-d6)δ5.20(2H，s)，7.19-7.53(12H，m)，7.86(1H，s)，8.10(1H，d，J＝7.5Hz)，10.75(1H，s)；MS m/z(M+H)+383。
對(duì)C22H18N2O2的分析計(jì)算值C，77.17；H，5.30；N，8.18。
實(shí)測(cè)值C，77.49；H，5.44；N，7.85。
實(shí)施例3g1-(4-芐氧基-3-氟苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟向攪拌后的1-(4-芐氧基-3-氟苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛(0.81g，2.3mmol)、鹽酸羥胺(0.25g，3.6mmol)和甲醇(25mL)的溶液中加入吡啶(1mL)。反應(yīng)混合物加熱回流，保持30分鐘?；旌衔锢鋮s后，蒸發(fā)除去甲醇，殘余物投入乙酸乙酯/水中。產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取(2×50mL)，乙酸乙酯層用水和鹽水洗滌，MgSO4干燥。蒸發(fā)除去溶劑，粗產(chǎn)物通過(guò)硅膠色譜法純化(25％乙酸乙酯-己烷)得到白色固體(0.7gr，83％)mp 167-168℃；1H NMR(DMSO-d6)δ2.32(3H，s)，5.29(2H，s)，6.99-7.01(1H，m)，7.10-7.17(2H，m)，7.25-7.28(1H，m)，7.37-7.42(1H，m)，7.43-7.49(3H，m)，7.49-7.54(2H，m)，8.01-8.04(1H，m)，8.41(1H，s)，10.67(1H，s)；MS m/z(M+H)+375。
對(duì)C23H19FN2O2的分析計(jì)算值C，73.78；H，5.11；N，7.48。
實(shí)測(cè)值C，73.53；H，5.06；N，7.32。
實(shí)施例41-(4-羥基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟向攪拌后的二氯甲烷(20mL)、Pd(OAc)2(50mg，0.2mmol)、和三乙基硅烷(2mL)的溶液中加入三乙胺(1mL)，混合物在室溫下攪拌15分鐘。向混合物中加入1-(4-芐氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟(0.36g，1mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液，攪拌90分鐘。加入乙酸乙酯(25mL)和氯化銨(25mL的10％溶液)，產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取(2×25mL)。合并的有機(jī)層用水(3×25mL)和鹽水(25mL)洗滌，MgSO4干燥。除去溶劑后，得到液體，將其溶解于無(wú)水四氫呋喃(10mL)中。向該混合物中加入氟化四丁基銨(3mL)。攪拌30分鐘后，混合物用乙酸乙酯和水萃取。有機(jī)層用水和鹽水洗滌，MgSO4干燥。蒸發(fā)除去溶劑后得到固體粗產(chǎn)物，其通過(guò)硅膠色譜法純化(25％乙酸乙酯-己烷)得到淺黃色固體(83％)mp171-173℃；1H NMR(DMSO-d6)δ2.29(3H，s)，6.95(4H，d，J＝7.7Hz)，7.09-7.13(2H，m)，7.22(2H，d，J＝8.7Hz)，7.98-8.01(1H，m)，8.40(1H，s)，9.89(1H，s)，10.63(1H，s)；MS m/z(M+H)+267。
對(duì)C16H14N2O2的分析計(jì)算值C，72.17；H，5.30；N，10.52。
實(shí)測(cè)值C，71.78；H，5.23；N，10.37。
實(shí)施例55-氟-1-(4-羥基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟將5-氟-1-(4-芐氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟(0.49g，1.3mmol)按照實(shí)施例4中使用的步驟反應(yīng)得到白色固體(67％)mp162-163℃；1H NMR(DMSO-d6)δ2.29(3H，s)，6.94-6.97(4H，m)d，7.23(2H，d，J＝8.6Hz)，7.70(2H，d，J＝10.1Hz)，8.39(1H，s)，9.92(1H，s)，10.70(1H，s)；MS m/z(M+H)+285。
對(duì)C16H13FN2O2的分析計(jì)算值C，67.60；H，4.61；N，9.85。
實(shí)測(cè)值C，67.44；H，4.67；N，9.79。
實(shí)施例65-氯-1-(4-羥基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟將5-氯-1-(4-羥基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛(0.63g，2.2mmol)、鹽酸羥胺(0.30g，4.3mmol)、甲醇(25mL)和吡啶(1mL)的混合物按照實(shí)施例4中使用的步驟反應(yīng)得到白色固體(68％)mp212-213℃；1H NMR(DMSO-d6)δ2.29(3H，s)，6.96(3H，d，J＝8.7Hz)，7.12(1H，dd，J＝2.2Hz，J＝8.7Hz)，7.24(2H，d，J＝8.7Hz)，8.03(1H，d，J＝2.1Hz)，8.40(1H，s)，9.93(1H，s)，10.75(1H，s)；MS m/z(M+H)+301/303(1Cl)。
對(duì)C16H13ClN2O2的分析計(jì)算值C，63.90；H，4.36；N，9.31。
實(shí)測(cè)值C，63.63；H，4.12；N，9.17。
實(shí)施例75-溴-1-(4-羥基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟將5-溴-1-(4-羥基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛(0.16g，0.5mmol)、鹽酸羥胺(0.10g，1.4mmol)、甲醇(10mL)和吡啶(0.2mL)的混合物按照實(shí)施例4中使用的步驟反應(yīng)得到白色固體(66％)mp209-211℃；1H NMR(DMSO-d6)δ2.29(3H，s)，6.92-6.97(3H，m)，7.20-7.25(3H，m)，8.19(1H，d，J＝1.9Hz)，8.39(1H，s)，9.94(1H，br s)，10.76(1H，s)；MS m/z(M+H)+345/347(1Br)。
對(duì)C16H13BrN2O2·0.5H2O的分析計(jì)算值C，54.26；H，3.98；N，7.91。
實(shí)測(cè)值C，54.26；H，3.68；N，7.65。
實(shí)施例8(4E)-9-(4-羥基苯基)-1，2，3，9-四氫-4H-咔唑-4-酮肟將(4E)-9-(4-芐氧基苯基)-1，2，3，9-四氫-4H-咔唑-4-酮肟(0.23g，0.6mmol)按照實(shí)施例4中使用的步驟反應(yīng)得到棕褐色固體(40％)mp 227-229℃；1H NMR(DMSO-d6)δ1.87-1.91(2H，m)，2.63(2H，t，J＝5.9Hz)，2.71(2H，t，J＝6.1Hz)，6.95(2H，d，J＝8.6Hz)，7.09-7.13(3H，m)，7.26(2H，d，J＝8.5Hz)，7.98-8.00(1H，m)，9.85(1H，s)，10.43(1H，s)；MS m/z(M+H)+293。
對(duì)C18H16N2O2的分析計(jì)算值C，73.95；H，5.52；N，9.58。
實(shí)測(cè)值C，73.61；H，5.39；N，9.42。
實(shí)施例91-(4-羥基苯基)-1H-吲哚-3-甲醛肟將1-(4-芐氧基苯基)-1H-吲哚-3-甲醛肟(0.31g，0.9mmol)按照實(shí)施例4中使用的步驟反應(yīng)得到黃色固體(18％)mp 95-97℃；1H NMR(DMSO-d6)δ6.94-6.98(2H，m)，7.19-7.29(2H，m)，7.36-7.45(4H，m)，8.31(1H，s)，9.80-9.83(1H，m)，10.72(1H，s)，11.44(1H，s)MS m/z(M+H)+253。
對(duì)C15H12N2O2的分析計(jì)算值C，71.42；H，4.79；N，11.10。
實(shí)測(cè)值C，71.85；H，5.36；N，9.70。
實(shí)施例101-(3-氟-4-羥基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟向攪拌后的二氯甲烷(10mL)、Pd(OAc)2(50mg，0.2mmol)、和三乙基硅烷(3mL)的溶液中加入三乙胺(1.5mL)，混合物在環(huán)境溫度下攪拌15分鐘。向混合物中加入1-(4-芐氧基-3-氟苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟(0.52g，1.4mmol)的二氯甲烷(15mL)溶液，繼續(xù)攪拌4小時(shí)。加入乙酸乙酯(25mL)和氯化銨(25mL的10％溶液)，產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取(2×25mL)。合并的有機(jī)層用水(3×25mL)和鹽水(25mL)萃取，MgSO4干燥。除去溶劑后得到液體，將其溶解于無(wú)水四氫呋喃(10mL)中。向該攪拌中的溶液中加入氟化四丁基銨(3mL)。攪拌30分鐘后，混合物投入乙酸乙酯/水中，振搖，分離兩層。有機(jī)部分用水和鹽水洗滌，MgSO4干燥。蒸發(fā)除去溶劑后，粗產(chǎn)物固體通過(guò)硅膠色譜法純化(25％乙酸乙酯-己烷)得到淺黃色固體(0.22g，56％)mp 182-184℃；1H NMR(DMSO-d6)δ2.31(3H，s)，6.98-7.01(1H，m)，7.07-7.17(4H，m)，7.35(1H，dd，J＝11.7Hz，J＝2.4Hz)，7.99-8.03(1H，m)，8.40(1H，s)，10.35(1H，br s)，10.64(1H，s)；MS m/z(M+H)+285。
對(duì)C16H13FN2O2(0.3H2O)的分析計(jì)算值C，66.34；H，4.57；N，9.30。
實(shí)測(cè)值C，66.38；H，4.61；N，9.85。
實(shí)施例11對(duì)ERα或ERβ受體的選擇性評(píng)價(jià)了本發(fā)明代表性實(shí)施例與17β-雌二醇競(jìng)爭(zhēng)ERα和ERβ的能力。該測(cè)試提供了一種測(cè)定某具體化合物是否結(jié)合雌激素受體(并因而被稱作″具有雌激素活性″)以及其是否對(duì)ERαERβ具有選擇性的方法。結(jié)果如下表所示，表達(dá)為IC50。將17β-雌二醇引入作為用于對(duì)比的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。下面簡(jiǎn)要描述了所采用的步驟。制備得到表達(dá)人類ERα或Rβ的雌激素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(D、E、和F)的大腸桿菌粗溶解產(chǎn)物。將受體和化合物稀釋在補(bǔ)充有1mM EDTA的1XDulbecco’s PBS(DPBS)中。使用高結(jié)合力掩蔽微量滴定板，將100uL受體(1uG/孔)與2nM[3H]-17β-雌二醇和各種濃度的化合物結(jié)合。在室溫下保持5-15小時(shí)后，滴定板用DPBS/1mM EDTA洗滌，通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)法測(cè)量結(jié)合放射性。將IC50定義為使總的17β-雌二醇結(jié)合力降低50％的化合物的濃度。所得到的結(jié)果如下表所示。
表1.1-(4’-羥基-苯基)-1H-吲哚-3-甲醛肟衍生物
在上述標(biāo)準(zhǔn)藥理測(cè)試步驟中得到的結(jié)果表明本發(fā)明的化合物是雌激素化合物，某些化合物對(duì)于ERβ受體具有強(qiáng)烈的優(yōu)先親和力。本發(fā)明化合物從對(duì)ERβ具有比ERα高的優(yōu)先親和力到對(duì)兩種受體同時(shí)具有幾乎相當(dāng)?shù)挠H和力變動(dòng)。因此，本發(fā)明化合物具有各種至少部分基于其受體親和力選擇性特征的活性。另外，由于各種新受體配體絡(luò)合物不同，因此它與各種輔調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用也是不相同的，本發(fā)明化合物根據(jù)所處細(xì)胞環(huán)境將顯示出不同的調(diào)節(jié)活性。例如，在某些細(xì)胞類型中，某化合物可作為雌激素激動(dòng)劑，而在其它組織中，該化合物卻是拮抗劑。具有上述活性的化合物通常被稱作SERM(選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)。然而，與大多數(shù)雌激素不同的是，很多SERM并不引起子宮濕重的增加。這些化合物在子宮中具有抗雌激素活性，因而在子宮組織中可以完全拮抗雌激素激動(dòng)劑的營(yíng)養(yǎng)(trophic)活性。然而，這些化合物在骨、心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作為雌激素激動(dòng)劑。由于這些化合物具有上述的組織選擇性，因而它們可用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物的由雌激素缺乏(在某些組織例如骨和心血管中)或雌激素過(guò)量(在子宮或乳腺中)引起的或者與此相關(guān)的病理狀態(tài)或綜合癥。
甚至超出上述細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)作用之上，本發(fā)明化合物還潛在地對(duì)某種受體類型是激動(dòng)劑，而對(duì)另一種受體卻是拮抗劑。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某化合物對(duì)ERβ是拮抗劑，而對(duì)ERα卻是激動(dòng)劑(Meyers，MarvinJ.；Sun，Jun；Carlson，Kathryn E.；Katzenellenbogen，Benita S.；Katzenellenbogen，John A..J.Med.Chem.(1999)，42(13)，2456-2468)。這種ERSAA(雌激素受體選擇性激動(dòng)劑拮抗劑)活性為這一系列化合物提供了藥理學(xué)上顯著不同的雌激素活性。
可以方便地利用標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)測(cè)試步驟測(cè)得所給測(cè)試化合物的活性特征。下面簡(jiǎn)要概述了幾種代表性測(cè)試步驟。用于SERM的標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)測(cè)試步驟還可以參見(jiàn)美國(guó)專利4,418,068和5,998,402。
實(shí)施例12大鼠子宮營(yíng)養(yǎng)/抗子宮營(yíng)養(yǎng)測(cè)試步驟可以在幼年大鼠子宮營(yíng)養(yǎng)測(cè)試(4天)中測(cè)得化合物的雌激素和抗雌激素特性(如L.J.Black和R.L.Goode，Life Sciences，26，1453(1980)在先所述)。將未發(fā)育成熟的斯普拉-道來(lái)氏大鼠(Sprague-Dawley大鼠)(雌性，18天大)分成六組測(cè)試。這些動(dòng)物通過(guò)每天ip注射10uG化合物、100uG化合物、(100uG化合物+1uG 17β-雌二醇)以檢查抗雌激素類、和1uG 17β-雌二醇處理，使用50％DMSO/50％鹽水作為注射媒介物。這些動(dòng)物在第四天通過(guò)CO2窒息處死，取出子宮，剝?nèi)ミ^(guò)量的油脂，除去所有液體，測(cè)得濕重。取出一個(gè)角的一部分進(jìn)行組織學(xué)分析，其余的用來(lái)分離出完整的RNA以評(píng)價(jià)補(bǔ)體成分3基因表達(dá)。
實(shí)施例136-周切除卵巢的大鼠測(cè)試步驟-骨和心臟保護(hù)作用在自Taconic Farm手術(shù)一天后，得到切除卵巢或假切除卵巢的雌性斯普拉-道來(lái)氏CD大鼠(重240-275g)。將其3或4只大鼠/籠、按照12/12(光亮/黑暗)的時(shí)間表豢養(yǎng)在室內(nèi)，同時(shí)提供食物(Purina5K96C鼠食)和充足的水。動(dòng)物在到達(dá)1天后開(kāi)始進(jìn)行各項(xiàng)研究治療，按指示每周給藥7天，持續(xù)6周。對(duì)各項(xiàng)研究，將一組未接受任何治療的彼此年齡相當(dāng)?shù)倪M(jìn)行過(guò)假手術(shù)后的大鼠作為未被處理的、雌激素充足的對(duì)照組。
全部治療以指定濃度在1％吐溫80的生理鹽水溶液中進(jìn)行，使得治療量達(dá)到0.1mL/100g體重。將17β雌二醇溶解于玉米油(20μg/mL)中，按照0.1mL/大鼠進(jìn)行皮下給藥。根據(jù)組平均體重測(cè)量結(jié)果，每隔三周調(diào)節(jié)一次劑量。
在開(kāi)始治療五周后以及結(jié)束研究一周前，評(píng)價(jià)每只大鼠的骨礦物質(zhì)密度(BMD)。使用XCT-960M(pQCT；Stratec Medizintechnik，Pforzheim，Germany)評(píng)價(jià)麻醉后的大鼠中脛骨近端的總密度和小梁密度。測(cè)量如下進(jìn)行在掃描前的十五分鐘，將每只大鼠通過(guò)腹膜內(nèi)注射45mg/kg氯胺酮、8.5mg/kg賽拉嗪、和1.5mg/kg乙酰丙嗪麻醉。
將右后肢拉過(guò)直徑為25mm的聚碳酸酯試管，綁在丙烯酸支架上使得踝關(guān)節(jié)位于90°角、膝關(guān)節(jié)位于180°。聚碳酸酯試管被固定在滑動(dòng)平臺(tái)上使得其與pQCT的孔徑相垂直。調(diào)節(jié)平臺(tái)使得股骨的遠(yuǎn)端和脛骨的近端位于掃描區(qū)域內(nèi)。將平面掃描圖像設(shè)定成長(zhǎng)度為10mm，線性分辨率為0.2mm。當(dāng)掃描圖像顯示在監(jiān)測(cè)器上后，定位脛骨的近端。從距離該點(diǎn)3.4mm處開(kāi)始pQCT掃描。pQCT掃描厚度為1mm，體素(三維象素)大小為0.140mm，且由145次薄片投影組成。
pQCT掃描完成后，圖像顯示在監(jiān)測(cè)器上。描畫(huà)出包括脛骨但是無(wú)腓骨的感興趣區(qū)域的輪廓。使用迭代算法自動(dòng)除去軟組織。剩余骨的密度(總密度)以mg/cm3表示。將骨外側(cè)的55％在同心螺旋機(jī)中剝離。剩余骨的密度(小梁密度)以mg/cm3表示。BMD評(píng)價(jià)一周后，大鼠通過(guò)二氧化碳窒息實(shí)施安樂(lè)死，收集血液進(jìn)行膽固醇測(cè)量。取出子宮，稱重。使用利用膽固醇/HP試劑盒的Boehringer-MannheimHitachi 911臨床分析器測(cè)量總膽固醇。使用Dunnet’s檢驗(yàn)的單向方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。
實(shí)施例14MCF-7/ERE抗增殖測(cè)試步驟在DMSO中制備得到測(cè)試化合物的儲(chǔ)備溶液(通常為0.1M)，然后用DMSO進(jìn)行10-100倍稀釋使得操作溶液達(dá)到1或10mM。DMSO儲(chǔ)備液儲(chǔ)存于4℃(0.1M)或-20℃(＜0.1M)下。使MCF-7細(xì)胞以每周兩次通過(guò)生長(zhǎng)培養(yǎng)基[D-MEM/F-12培養(yǎng)基，含有10％(v/v)熱滅活胎牛血清、1％(v/v)青霉素-鏈霉素、和2mM glutaMax-1]傳代。細(xì)胞保持在置于5％ CO2/95％濕空氣培養(yǎng)器中的37℃通氣燒瓶中。在治療前一天，將細(xì)胞用生長(zhǎng)培養(yǎng)基以25,000/鋪96孔滴定板中，在37°下培養(yǎng)過(guò)夜。
細(xì)胞在37℃下用50μl/孔的1∶10稀釋的腺病毒5-ERE-tk-熒光素酶在試驗(yàn)培養(yǎng)基[無(wú)酚磺酞的D-MEM/F-12培養(yǎng)基，含有10％(v/v)熱滅活且炭剝離(charcoal-stripped)的胎牛血清、1％(v/v)青霉素-鏈霉素、2mM glutaMax-1、1mM丙酮酸鈉]中感染2小時(shí)。然后將孔用150μλ試驗(yàn)培養(yǎng)基洗滌一次。最后，細(xì)胞分成多份復(fù)制品在37℃下處理24小時(shí)，8孔/使用150μλ/孔媒介物(≤0.1％ v/v DMSO)或者用試驗(yàn)培養(yǎng)基稀釋≥1000倍的化合物治療。
在1μM的單劑量下進(jìn)行測(cè)試化合物的初期篩選，其中所測(cè)試化合物是單獨(dú)的(激動(dòng)劑模式)或者與0.1nM 17β-雌二醇聯(lián)合(EC80；拮抗劑模式)。每個(gè)96孔滴定板還包括媒介物對(duì)照組(0.1％ v/vDMSO)和激動(dòng)劑對(duì)照組(0.1或1nM 17β-雌二醇)。在激動(dòng)劑和/或拮抗劑模式中，對(duì)由10-14至10-5M對(duì)數(shù)增加的活性化合物進(jìn)行劑量響應(yīng)試驗(yàn)。根據(jù)這些劑量響應(yīng)曲線，分別得到EC50和IC50值。各治療組最后的滴定孔中含有5μl 3×10-5M ICI-182,780(10-6M最終濃度)作為ER拮抗劑對(duì)照。
治療后，將細(xì)胞在振蕩器上用25μl/孔的1X細(xì)胞培養(yǎng)溶解試劑(Promega Corporation)溶解15分鐘。細(xì)胞溶解產(chǎn)物(20μl)轉(zhuǎn)移至96光度計(jì)盤中，使用100μl/孔的熒光素酶(PromegaCorporation)在MicroLumat LB 96 P光度計(jì)(EG & G Berthold)中測(cè)量熒光素酶活性。在注入底物之前，對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行1秒鐘背景測(cè)量。在注入底物之后，測(cè)得延遲1秒鐘后10秒內(nèi)的熒光素酶活性。將這些來(lái)自光度計(jì)的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換至Macintosh個(gè)人電腦并用JMP軟件(SAS Institute)分析；該程序減去來(lái)自每個(gè)孔熒光素酶活性的背景讀數(shù)，然后計(jì)算每組治療的平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
上述熒光素酶數(shù)據(jù)通過(guò)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，利用Huber M-估計(jì)器降低遠(yuǎn)離中心的經(jīng)轉(zhuǎn)換結(jié)果的權(quán)重。利用JMP軟件來(lái)分析轉(zhuǎn)換和加權(quán)后的數(shù)據(jù)進(jìn)行單向ANOVA(Dunnett′s檢驗(yàn))。將化合物治療組與激動(dòng)劑模式中的媒介物對(duì)照組結(jié)果、或者拮抗劑模式中的陽(yáng)性激動(dòng)劑對(duì)照組結(jié)果(0.1nM 17β-雌二醇)進(jìn)行對(duì)比。對(duì)于最初的單劑量試驗(yàn)而言，如果化合物治療組結(jié)果顯著不同于相應(yīng)的對(duì)照組的話(p＜0.05)，就將結(jié)果表達(dá)為相對(duì)于17β-雌二醇對(duì)照組的百分比[也就是((化合物-媒介物對(duì)照組)/(17β-雌二醇對(duì)照組-媒介物對(duì)照組))×100]。另外，利用JMP軟件由非線形劑量-響應(yīng)曲線確定EC50和/或IC50值。
實(shí)施例15對(duì)LDL氧化作用的抑制-抗氧化劑活性由屠宰場(chǎng)獲得豬主動(dòng)脈，清洗后轉(zhuǎn)入冷卻后的PBS中，收集主動(dòng)脈上皮細(xì)胞。為了收集上述細(xì)胞，將主動(dòng)脈的肋間血管打結(jié)，主動(dòng)脈的一端用鉗子夾住。將新鮮、滅菌過(guò)濾后的0.2％膠原酶(Sigma TypeI)置于血管中，血管另一端用鉗子夾住以形成閉合體系。主動(dòng)脈在37℃下培養(yǎng)15-20分鐘，然后收集膠原酶溶液，在2000xg下離心分離5分鐘。將團(tuán)粒懸浮于7mL上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基由無(wú)酚磺酞且補(bǔ)充有炭剝離的FBS(5％)的DMEM/Ham’s F12培養(yǎng)基、NuSerum(5％)、L-谷氨酰胺(4mM)、青霉素-鏈霉素(1000U/ml，100μg/ml)和慶大霉素(gentimicin)(75μg/ml)組成，然后播種于100mm培養(yǎng)皿中，在37℃、5％CO2中培養(yǎng)。20分鐘后，細(xì)胞用PBS沖洗，加入新鮮培養(yǎng)基，在24小時(shí)重復(fù)上述操作。大約一周后上述細(xì)胞匯合。這些上皮細(xì)胞通常一周飼養(yǎng)兩次，在匯合時(shí)用胰蛋白酶作用后以1∶7的比例播種。在待評(píng)價(jià)化合物(5μM)存在下、于37℃允許進(jìn)行12.5μg/mL LDL的細(xì)胞介導(dǎo)氧化作用，持續(xù)4小時(shí)。結(jié)果以抑制氧化過(guò)程的百分?jǐn)?shù)表示，通過(guò)TBARS(硫代巴比妥酸反應(yīng)活性物質(zhì))方法對(duì)游離醛進(jìn)行分析而測(cè)得(Yagi K.，Biochem Med 15212-216(1976))。
實(shí)施例16D12下丘腦細(xì)胞測(cè)試步驟由RCF17親代細(xì)胞系亞克隆得到D12大鼠下丘腦細(xì)胞，冷凍儲(chǔ)藏。常規(guī)地將其置于DMEM∶F12(1∶1)、glutaMAX-1(2mM)、青霉素(100U/ml)-鏈霉素(100mg/ml)、加10％胎牛血清(FBS)中生長(zhǎng)。細(xì)胞置于無(wú)酚磺酞的培養(yǎng)基(DMEM∶F12、glutaMAX、青霉素-鏈霉素)中，所述培養(yǎng)基含有低于匯合密度(1-4×106細(xì)胞/150mm皿)的2-10％炭剝離FBS。細(xì)胞稍后再次用含有2％經(jīng)剝離血清(stripped serum)的培養(yǎng)基飼養(yǎng)24小時(shí)。為了測(cè)試激動(dòng)活性，將細(xì)胞用10nM 17β-雌二醇或者各種劑量的測(cè)試化合物(1mM或者從1pM至1mM)處理。為了測(cè)試拮抗活性，將細(xì)胞用0.1nM 17β-雌二醇在存在或不存在各種劑量(100pM至1mM)的測(cè)試化合物的情形下處理。對(duì)照皿也用DMSO處理，作為陰性對(duì)照組。加入激素48小時(shí)后，將細(xì)胞溶解然后進(jìn)行結(jié)合測(cè)試步驟。
對(duì)于每次細(xì)胞結(jié)合測(cè)試步驟，將100-150mg蛋白質(zhì)用150ml體積的10nM3H-R5020+100-倍過(guò)量的R5020培養(yǎng)。在96孔板中進(jìn)行平行三份反應(yīng)(三組有R5020，三組無(wú)R5020)。加入蛋白質(zhì)提取物后，接著首先加入3H-R5020或3H-R5020+100x未標(biāo)記的R5020。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1-2小時(shí)。通過(guò)加入100ml冷的TE(pH為7.4)中5％炭(Norit SX-4)、0.5％右旋糖苷69K(Pharmacia)終止反應(yīng)。在室溫下保持5分鐘后，將結(jié)合配體和非結(jié)合的配體通過(guò)離心分離(5分鐘，1000RCF，4℃)。除去上清液(～150ml)并轉(zhuǎn)移至閃爍瓶中。加入閃爍液(Beckman Ready Protein+)后，樣本在閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)1分鐘。
實(shí)施例17CNS視前區(qū)中的孕酮受體將六十(60)天大的雌性斯普拉-道來(lái)氏大鼠切除掉卵巢。動(dòng)物豢養(yǎng)在光周期為12小時(shí)光亮、12小時(shí)黑暗的動(dòng)物看護(hù)裝置中，給其自由供應(yīng)自來(lái)水和嚙齒動(dòng)物食物。
將切除卵巢的動(dòng)物隨機(jī)分成幾組，向其注射媒介物(50％ DMSO、40％ PBS、10％乙醇媒介物)、17β-雌二醇(200ng/kg)或者測(cè)試化合物。其它的動(dòng)物在注射17β-雌二醇之前1小時(shí)注射測(cè)試化合物，以評(píng)價(jià)該化合物的拮抗特性。皮下注射六小時(shí)后，動(dòng)物用致死劑量的CO2實(shí)施安樂(lè)死，收集它們的大腦并冷凍。
將收集到的動(dòng)物組織在-16℃的低溫保持器上進(jìn)行切割，隨后收集在硅烷涂覆的載玻片上。所述安有切片的載玻片接著在42℃的載玻片加溫器上干燥，儲(chǔ)存在干燥的-80℃載玻片盒中。在處理之前，將這些干燥后的載玻片盒緩慢溫?zé)嶂潦覝?在-20℃下持續(xù)12-16小時(shí)；在4℃下持續(xù)2小時(shí)；室溫下持續(xù)1小時(shí))以消除載玻片上的凝聚的發(fā)生，從而降低組織和RNA降解。將干燥載玻片裝填在金屬支架上，隨后固定在4％多聚甲醛(pH9.0)中保持5分鐘，然后按照前述方法處理。
將含有大鼠PR cDNA 9(配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)中815bp片段的質(zhì)粒線性化，用來(lái)生成與大鼠PR mRNA部分互補(bǔ)的S 35-UTP標(biāo)記探針。將處理后的安有切片的載玻片與20ml含有核糖核酸探針(4-6×10 6DPM/載玻片)和50％甲酰胺的雜交混合物雜交，在55℃的濕化室中培養(yǎng)過(guò)夜。上午將載玻片置于浸泡在2×SSC(0.15M NaCl、0.015M檸檬酸鈉；pH7.0)/10mM DTT中的金屬支架上。支架整體轉(zhuǎn)移至大容器中，在室溫、于2×SSC/10mM DTT中洗滌15分鐘，同時(shí)溫和攪拌。然后將載玻片在37℃的RNase緩沖液中洗滌30分鐘，用37℃的RNase A(2mg/ml)洗滌30分鐘，在室溫下的1×SSC中洗滌15分鐘。載玻片隨后在65℃的0.1×SSC中洗滌(2×30分鐘)除去非特異性標(biāo)記，在室溫下的0.1×SSC中沖洗15分鐘，用一系列等級(jí)的醇醋酸銨(70％、95％、和100％)脫水。風(fēng)干后的載玻片與x-射線膠片對(duì)置3天，然后照相處理。將所有動(dòng)物的載玻片一起雜交、洗滌、曝光和照相處理，以消除由于條件批間分析差異而產(chǎn)生的差異。
實(shí)施例18大鼠潮熱-CNS影響手術(shù)后得到切除卵巢的雌性、60天大的斯普拉-道來(lái)氏大鼠。在第一次治療之前至少8天進(jìn)行手術(shù)。動(dòng)物單獨(dú)豢養(yǎng)在12小時(shí)光亮/黑暗周期下，使之隨意攝取標(biāo)準(zhǔn)鼠食和水。
每組研究中包括兩組對(duì)照組。劑量按照在10％ DMSO的芝麻油(sc研究)或者1.0％吐溫80的鹽水(po研究)中的mg/kg平均組體重給藥。向動(dòng)物施用劑量為0.01-10mg/kg平均組體重的測(cè)試化合物。各組測(cè)試中包括媒介物和乙炔雌二醇(EE)對(duì)照(0.1mg/kg，sc或0.3mg/kg，po)組。當(dāng)測(cè)試化合物的拮抗劑活性時(shí)，聯(lián)合施用0.1或0.3mg/kg的EE分別進(jìn)行sc或po研究。一直施用測(cè)試化合物，直到尾部皮膚溫度被測(cè)出的那天。
四天的馴化周期之后，動(dòng)物使用感興趣的化合物每天治療一次。有10只動(dòng)物/治療組?；衔锏慕o藥要么通過(guò)向頸背sc注射0.1ml，要么po 0.5ml體積。在治療后的第三天，皮下植入嗎啡藥丸(75mg硫酸嗎啡)。在治療后的第五天，再植入一個(gè)或兩個(gè)嗎啡藥丸。在第八天，給大約一半的動(dòng)物注射氯胺酮(80mg/kg，肌內(nèi))，同時(shí)在離尾根大約一英寸的尾上捆扎上一與MacLab數(shù)據(jù)獲得系統(tǒng)(APIInstruments，Milford，MA)相連的熱電偶。該系統(tǒng)可以連續(xù)測(cè)出尾部皮膚溫度。測(cè)量15分鐘內(nèi)的基線溫度，然后皮下給藥(0.2ml)納洛酮(1.0mg/kg)以阻斷嗎啡的影響，然后測(cè)量1小時(shí)內(nèi)的尾部皮膚溫度。在第九天，取出其余動(dòng)物進(jìn)行類似的分析。
實(shí)施例19在分離的大鼠主動(dòng)脈環(huán)中的血管舒縮功能將斯普拉-道來(lái)氏大鼠(240-260克)分成四組1.正常的未切除卵巢(保持完整)2.切除卵巢(ovex)且用媒介物治療3.切除卵巢且用17β-雌二醇治療(1mg/kg/天)4.切除卵巢且用測(cè)試化合物治療(即1mg/kg/天)動(dòng)物在治療前的三周左右切除卵巢。通過(guò)胃管飼法給每只動(dòng)物服用1mg/kg/天懸浮于含有1％吐溫-80的蒸餾去離子水中的17β-硫酸雌二醇或測(cè)試化合物。媒介物治療組的動(dòng)物服用適當(dāng)體積的藥物治療組中使用的媒介物。
動(dòng)物通過(guò)吸入CO2實(shí)施安樂(lè)死并放血。迅速取出其胸主動(dòng)脈，置于37℃具有下述組成(mM)的生理溶液中NaCl(54.7)、KCl(5.0)、NaHCO3(25.0)、MgCl22H2O(2.5)、D-葡萄糖(11.8)和CaCl2(0.2)，其用CO2-O295％/5％充氣直到最后的pH達(dá)到7.4。除去外表面的血管外膜，將血管切成2-3mm寬的環(huán)。這些環(huán)懸浮于10mL組織浴中，一端與組織浴的底部相連，另一端與力傳感器相連。給環(huán)施加1克的靜止張力。這些環(huán)平衡1小時(shí)后，獲得信號(hào)并加以分析。
平衡后，將環(huán)曝露于濃度增加的苯福林(10-8-10-4M)中，記錄張力。隨后組織浴用新鮮的緩沖液清洗3次。洗凈后，向組織浴中加入200mM L-NAME，平衡30分鐘。然后重復(fù)上述苯福林濃度響應(yīng)曲線。
實(shí)施例20八臂旋臂迷宮-提高認(rèn)知力使用送到時(shí)重200-250g的雄性斯普拉-道來(lái)氏CD大鼠(CharlesRiver，Kingston，NY)。這些大鼠用可隨意攝取標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室食物和水豢養(yǎng)一周，每六只一籠。在維持在22℃下、且具有12小時(shí)光亮/黑暗循環(huán)的群體室中進(jìn)行豢養(yǎng)，其中在上午6:00給光。馴化熟悉后，動(dòng)物單獨(dú)豢養(yǎng)，同時(shí)保持在自由飼養(yǎng)重量的85％水平，一旦達(dá)到穩(wěn)定的重量，讓大鼠開(kāi)始適應(yīng)8-臂旋臂迷宮。
迷宮結(jié)構(gòu)由Peele和Baron迷宮(Pharmacology，Biochemistry，and Behavior，29143-150，1988)變型而來(lái)。將迷宮提高至高度為75.5cm，且由一環(huán)形區(qū)域組成，所述環(huán)形區(qū)域被八只由中心輻射出來(lái)的手臂包圍，所述手臂彼此等距。每只旋臂58cm長(zhǎng)×13cm高。在開(kāi)始每次活動(dòng)之前，將有機(jī)玻璃圓筒放下來(lái)以在迷宮中心部分圍住動(dòng)物。迷宮各旋臂裝備有3組與數(shù)據(jù)采集單元連接的光電元件，所述數(shù)據(jù)采集單元反過(guò)來(lái)再與計(jì)算機(jī)相連。該光電元件用于跟蹤大鼠在迷宮中的活動(dòng)情況。藥丸飼養(yǎng)器位于每只旋臂末端的食物杯上方，當(dāng)旋臂的外側(cè)光電元件在指定活動(dòng)中被第一次活化時(shí)，投入兩枚45mg的巧克力藥丸。迷宮位于測(cè)試室中，測(cè)試室的每面墻壁上貼有黑色和白色的具有幾何圖形的海報(bào)作為視覺(jué)信號(hào)。在訓(xùn)練和測(cè)試過(guò)程中，聽(tīng)得見(jiàn)白噪音(～70db)。
訓(xùn)練過(guò)程由五期組成，每段期間中的日活動(dòng)量持續(xù)5或10分鐘。在將大鼠置于迷宮中心部分的時(shí)間與升高圓筒開(kāi)始活動(dòng)的時(shí)間之間加上10秒鐘的延遲時(shí)間。在I期中，將限食的數(shù)對(duì)大鼠放置在迷宮中10分鐘，同時(shí)沿著迷宮的八只旋臂分散放置45mg巧克力藥丸。在II期中，將各只大鼠單獨(dú)置于迷宮中持續(xù)10分鐘，同時(shí)沿著中央光電元件至各旋臂食物杯分散放置藥丸。在III期中，將各只大鼠置于迷宮中持續(xù)10分鐘，僅僅在各旋臂的食物杯里面及其周圍放置一些食物藥丸。在IV期中，給大鼠10分鐘的時(shí)間來(lái)收集位于各旋臂中的兩枚藥丸。重新返回旋臂中則被認(rèn)為出現(xiàn)失誤。大鼠按照上述方式每天進(jìn)行訓(xùn)練，直到其在連續(xù)三天的訓(xùn)練時(shí)間內(nèi)所取得的標(biāo)準(zhǔn)成績(jī)低于或等于2次總失誤。總的馴化和訓(xùn)練時(shí)間大約為三周。
在磷酸鹽緩沖的鹽水中制備測(cè)試化合物，然后以1ml/kg的體積給藥。使用東莨菪堿HBr(0.3mg/kg s.c.)作為損傷劑，其使得失誤率增加(喪失記憶)。在任意的既定測(cè)試日中第一次接觸迷宮之前的30分鐘，同時(shí)向腹膜內(nèi)施用測(cè)試化合物與東茛菪堿。
為了評(píng)價(jià)測(cè)試化合物，設(shè)計(jì)一8×8平衡拉丁方用于重復(fù)測(cè)量以利用最少量的動(dòng)物獲得高的試驗(yàn)效率。進(jìn)行了八個(gè)試驗(yàn)期間，每周兩次，在各期間中隨機(jī)應(yīng)用八種治療(媒介物、東茛菪堿、三個(gè)劑量的測(cè)試化合物與東茛菪堿)。每次治療緊跟在相同次數(shù)的其它治療之后。因此，可以評(píng)估出每次治療殘留下來(lái)的影響，同時(shí)除去其直接治療影響。在ANOVA之后，使用針對(duì)調(diào)正平均數(shù)的Dunnett′s雙向檢驗(yàn)進(jìn)行多重比對(duì)。
如果動(dòng)物在第一次曝露期間五分鐘內(nèi)沒(méi)有作出四次正確選擇，或者在第二次曝露結(jié)束前沒(méi)有作出總共八次選擇，則被認(rèn)為對(duì)該次活動(dòng)“休眠”。所有在施用超過(guò)一個(gè)劑量的測(cè)試化合物之后就表現(xiàn)為“休眠”的動(dòng)物被排除在分析之外。
實(shí)施例21神經(jīng)保護(hù)作用對(duì)初級(jí)皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)物中細(xì)胞的時(shí)間依賴性死亡的抑制利用Monyer等人.1989，Brain Research 483347-354描述的方法的變型形式由0-1天大的大鼠腦獲得初級(jí)皮質(zhì)神經(jīng)元。將分散的腦組織置于DMEM/10％ PDHS(妊娠供體馬血清)中生長(zhǎng)三天，然后用阿糖胞苷(ARC)處理兩天除去污染的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。在第五天，除去ARC培養(yǎng)基，用DMEM/10％ PDHS替代。神經(jīng)元細(xì)胞在使用之前繼續(xù)培養(yǎng)4-7天。
對(duì)照初級(jí)神經(jīng)元培養(yǎng)物在培養(yǎng)的第12-18天間顯示出進(jìn)行性細(xì)胞死亡。測(cè)試化合物在第9天加入至保持于DMEM和10％ PDHS中的六個(gè)培養(yǎng)物，同時(shí)保留殘余的培養(yǎng)物作為對(duì)照品，在第12和16天評(píng)價(jià)12個(gè)培養(yǎng)物中乳酸脫氫酶(LD)的濃度。使用由Wroblewski等人.1955，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.90210-213描述的方法的變型形式測(cè)定LD。LD是一種在臨床和基礎(chǔ)研究中通常用于測(cè)定組織存活力的細(xì)胞溶質(zhì)酶。培養(yǎng)基LD的增加直接與細(xì)胞死亡有關(guān)。
針對(duì)由低血糖引起的細(xì)胞毒性的神經(jīng)保護(hù)作用在FALCON 25 cm2組織培養(yǎng)瓶中，將由ATCC獲得的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞按照在含有FBS的RPMI培養(yǎng)基中1×106細(xì)胞/ml的濃度鋪板。在出現(xiàn)低血糖前的4小時(shí)棄去維持培養(yǎng)基，細(xì)胞單層在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中洗滌兩次，然后在37℃以無(wú)血清方式或無(wú)血清加測(cè)試化合物方式培養(yǎng)4小時(shí)。在加入適當(dāng)?shù)钠咸烟翘幚碇?，使用Kreb′s Ringer磷酸鹽緩沖液將單層洗滌兩次。RPMI培養(yǎng)基含有2mg葡萄糖/ml；燒瓶被分成六組，分別接收100％葡萄糖(2mg/ml)、80％葡萄糖(1.6mg/ml)、60％葡萄糖(1.2mg/ml)或0％葡萄糖(緩沖液)或者用測(cè)試化合物補(bǔ)充。全部燒瓶培養(yǎng)20小時(shí)后，利用錐蟲(chóng)藍(lán)評(píng)價(jià)全部細(xì)胞、活細(xì)胞、以及死亡細(xì)胞的數(shù)量。
針對(duì)興奮性中毒氨基酸的神經(jīng)保護(hù)作用將五只含有SK-N-SH成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的培養(yǎng)皿用測(cè)試化合物處理，五只培養(yǎng)皿用RPMI培養(yǎng)基處理。4小時(shí)后，所有細(xì)胞用NMDA(500μM)處理5分鐘。然后測(cè)量總的活細(xì)胞和死亡細(xì)胞。
針對(duì)氧-葡萄糖剝奪的神經(jīng)保護(hù)作用分析固縮核以測(cè)量凋亡由E18胎鼠制得皮質(zhì)神經(jīng)元，然后以密度為100,000細(xì)胞/孔鋪板在預(yù)涂聚-D-賴氨酸(10ng/ml)和血清的8-孔腔載玻片上。將細(xì)胞在含有10％ FCS的高糖DMEM中鋪板，置于37℃、充滿10％ CO2/90％空氣的培養(yǎng)器中。第二天，通過(guò)用含有B27補(bǔ)充物的高糖DMEM替代培養(yǎng)基以除去血清，隨后將細(xì)胞保存在培養(yǎng)基不再有任何變化的培養(yǎng)器中，直到試驗(yàn)當(dāng)天。在第6天，將載玻片分成兩組；對(duì)照組和OGD組。對(duì)照組中的細(xì)胞施用含有葡萄糖和普通B27(無(wú)抗氧化劑)的DMEM。OGD組中的細(xì)胞施用已在真空下脫氣15分鐘的含有普通B27的無(wú)糖DMEM。細(xì)胞在密閉室中用90％N2/10％ CO2沖洗10分鐘，在37℃下培養(yǎng)6小時(shí)。6小時(shí)后，對(duì)照組和OGD組中的細(xì)胞均進(jìn)行下述培養(yǎng)基替代，所述培養(yǎng)基含有媒介物(DMSO)或測(cè)試化合物于含有普通B27的含糖DMEM中。細(xì)胞再次返回至含氧量正常的37℃培養(yǎng)器中。24小時(shí)后，將細(xì)胞在4℃的4％PFA中固定持續(xù)10分鐘，用Topro(熒光核結(jié)合染料)染色。利用激光掃描細(xì)胞計(jì)數(shù)器通過(guò)測(cè)量固縮核評(píng)價(jià)凋亡。
測(cè)量作為細(xì)胞死亡標(biāo)志的LDH釋放量由E18胎鼠制得皮質(zhì)神經(jīng)元，然后以密度為150,000細(xì)胞/孔鋪在預(yù)涂有聚-D-賴氨酸(10ng/ml)和血清的48-孔培養(yǎng)板上。將細(xì)胞在含有10％ FCS的高糖DMEM中鋪板，置于37℃、充滿10％ CO2/90％空氣的培養(yǎng)器中。第二天，通過(guò)用含有B27補(bǔ)充物的高糖DMEM替代培養(yǎng)基以除去血清。在第6天，將細(xì)胞分成兩組；對(duì)照組和OGD組。對(duì)照組中的細(xì)胞施用含有葡萄糖和普通B27(無(wú)抗氧化劑)的DMEM。OGD組中的細(xì)胞施用含有普通B27的無(wú)糖DMEM，在真空下脫氣15分鐘。細(xì)胞在密閉室中用90％ N2/10％ CO2沖洗10分鐘，在37℃下培養(yǎng)6小時(shí)。6小時(shí)后，對(duì)照組和OGD組中的細(xì)胞均用下述培養(yǎng)基替代，所述培養(yǎng)基含有媒介物(DMSO)或測(cè)試化合物于含有普通B27的含糖DMEM中。細(xì)胞再次返回至含氧量正常的37℃培養(yǎng)器中。24小時(shí)后，通過(guò)測(cè)量LDH(乳酸脫氫酶)向培養(yǎng)基中的釋放量評(píng)價(jià)細(xì)胞死亡情況。對(duì)于LDH測(cè)定，將整份50μl培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至96孔板中。加入140μl 0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.5)和100μl 0.2mg/ml NADH后，滴定板置于室溫下的暗處20分鐘。反應(yīng)通過(guò)加入10μl丙酮酸鈉引發(fā)。立即使用Thermomax板讀數(shù)器(Molecular Devices)在340nM處讀取上述滴定板。每隔6秒鐘記錄一次作為NADH濃度指數(shù)的吸光度，持續(xù)5分鐘，然后使用代表NADH消失比例的斜率來(lái)計(jì)算LDH活性。
LDH活性(U/ml)＝(ΔA/分鐘)(TCF)(20)(0.0833)/(.78)其中0.0833＝正比常數(shù)0.78＝儀表光程長(zhǎng)(cm)實(shí)施例22HLA大鼠測(cè)試步驟-克羅恩氏病和炎性腸病由Taconic獲得雄性HLA-B27大鼠，同時(shí)向其無(wú)限制地提供食物(PMI實(shí)驗(yàn)室食物5001)和水。在研究開(kāi)始時(shí)，這些大鼠為22-26周大。
向大鼠皮下施用下述制劑之一，每天一次。每組五只大鼠，在實(shí)施安樂(lè)死前的兩小時(shí)內(nèi)給予最后的劑量。
·媒介物(50％ DMSO/50％ Dulbecco’s PBS)·17α-乙炔基-17β-雌二醇(10μg/kg)·測(cè)試化合物每天觀察其大便質(zhì)量，按照下述標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)腹瀉＝3；大便柔軟＝2；大便正常＝1。在測(cè)試步驟結(jié)束時(shí)，收集血清儲(chǔ)存在-70℃下。制備結(jié)腸切片進(jìn)行組織學(xué)分析，同時(shí)分析其它片段的髓過(guò)氧化酶活性。
采用下述方法測(cè)量髓過(guò)氧化酶活性。收集結(jié)腸組織，然后快速冷凍在液氮中。使用完整結(jié)腸的一代表性樣本來(lái)確保各樣本之間具有一致性。組織儲(chǔ)存在-80℃至使用。接下來(lái)，組織稱重(大約500mg)后在1∶15 w/v 5mM H2KPO4(pH6)洗滌緩沖液中勻化。所述組織在2-8℃、于20,000xg下在Sorvall RC 5B離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)45分鐘。隨后棄去上清液。組織在含有10mM EDTA和0.5％ Hex AmmoniumBromide的2.5ml(1∶5 w/v)50mM H2KPO4中重懸并勻化，以有助溶解細(xì)胞內(nèi)的MPO。組織在液氮中冷凍后，在37℃-水浴中解凍，超聲波處理15秒鐘以保證細(xì)胞膜裂解。重復(fù)上述步驟三次。然后將樣本置于冰決上持續(xù)20分鐘，在2-8℃、12,000xg下離心15分鐘。上清液在這些步驟后進(jìn)行分析。
通過(guò)向反應(yīng)試管中加入含有0.167 O-鄰聯(lián)二茴香胺/ml和0.0005％H2O2的2.9ml 50mM H2KPO4制備得到測(cè)試混合物。當(dāng)過(guò)氧化氫降解時(shí)，O-鄰聯(lián)二茴香胺被氧化，同時(shí)以取決于濃度的方式在460nm處發(fā)生吸收?；旌衔锛訜嶂?5℃。將一百(100)μL組織上清液加入至反應(yīng)試管中，在25℃下培養(yǎng)1分鐘，然后轉(zhuǎn)移1ml至一次性塑料試管中。每隔2分鐘的反應(yīng)時(shí)間在460nm處測(cè)量比照含有2.9ml反應(yīng)混合物和100μl 0.5％溴化銨溶液的空白的OD。
通過(guò)將吸光度@460與由純化人類MPO 31.1單元/小瓶制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，對(duì)酶活性單元進(jìn)行量化。MPO復(fù)水后，用含有10mMEDTA和0.5％Hex Ammonium Bromide的50mM H2KPO4連續(xù)稀釋至四種已知濃度。將樣本吸光度與上述曲線對(duì)照測(cè)得活性。
按照下述方法進(jìn)行組織學(xué)分析。將結(jié)腸組織浸泡于10％中性緩沖福爾馬林中。結(jié)腸的每段標(biāo)本分成四個(gè)樣本進(jìn)行評(píng)價(jià)。上述利用福爾馬林固定的組織在真空滲入處理機(jī)中處理進(jìn)行石蠟包埋。樣本以5μm切片，然后用蘇木精和曙紅(H&E)染色，采用Boughton-Smith后調(diào)整的比例進(jìn)行盲組織評(píng)價(jià)。評(píng)分結(jié)束后，樣本脫盲(unblind)，將數(shù)據(jù)列表后利用具有多重平均對(duì)照的ANOVA線形模型進(jìn)行分析。
將本文中所引入的所有專利、出版物、以及其它文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考。
權(quán)利要求
1.下式的化合物或其可藥用鹽或前藥 其中R1是氫、任選被取代的烷基、鹵素、CN、或任選被取代的烷氧基；R2是氫、任選被取代的烷基、或任選被取代的苯基；或R1和R2一起可以形成5-7元環(huán)；以及R3和R4各自獨(dú)立地是H、OH、鹵素、CN、任選被取代的苯基、任選被取代的烷基或任選被取代的烷氧基。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1是任選被取代的烷基。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的化合物，其中R2是氫或任選被取代的烷基。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中R1和R2一起形成6-元環(huán)。
5.權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的化合物，其中R3是H、鹵素或CN。
6.權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的化合物，其中R4是氫。
7.權(quán)利要求6的化合物，其中R4是F。
8.權(quán)利要求1的化合物，選自(a)1-(4-羥基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟；(b)5-氟-1-(4-羥基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟；(c)5-氯-1-(4-羥基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟；(d)5-溴-1-(4-羥基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟；(e)(4E)-9-(4-羥基苯基)-1，2，3，9-四氫-4H-咔唑-4-酮肟；或者(f)1-(4-羥基苯基)-H-吲哚-3-甲醛肟或(g)1-(3-氟-4-羥基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟。
9.一種藥物組合物，所述藥物組合物含有a)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的化合物和b)可藥用載體。
10.一種抑制有該需要的哺乳動(dòng)物中的骨質(zhì)疏松癥的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的化合物。
11.一種抑制有該需要的哺乳動(dòng)物中的骨關(guān)節(jié)炎、低鈣血癥、高鈣血癥、佩吉特氏病、骨軟化癥、骨鈣質(zhì)缺乏、多發(fā)性骨髓瘤或者對(duì)骨組織具有有害作用的其它形式的癌癥的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的化合物。
12.一種抑制有該需要的哺乳動(dòng)物中的良性或惡性的異常組織生長(zhǎng)的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的化合物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述異常組織生長(zhǎng)是前列腺肥大、子宮平滑肌瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜異位、子宮內(nèi)膜癌、多囊性卵巢綜合癥、子宮內(nèi)膜息肉、良性乳房疾病、子宮腺肌病、卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌、或CNS癌。
14.一種在有該需要的哺乳動(dòng)物中降低膽固醇、甘油三酯、Lp(a)、或LDL水平的方法；或者抑制高膽固醇血癥、高脂血癥、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化癥、外周血管疾病、再狹窄、或血管痙攣的方法；或者因?qū)е旅庖呓閷?dǎo)的血管損傷的細(xì)胞活動(dòng)而引起的血管壁損傷的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的化合物。
15.一種抑制有該需要的哺乳動(dòng)物中的由游離基誘導(dǎo)的病理狀態(tài)的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的化合物。
16.一種在有該需要的哺乳動(dòng)物中提供認(rèn)知力提高或神經(jīng)保護(hù)作用的方法；或者治療或抑制老年性癡呆、阿耳茨海默氏病、認(rèn)知減退、神經(jīng)變性疾病的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的化合物。
17.一種抑制有該需要的哺乳動(dòng)物中的炎性腸病、潰瘍性直腸炎、克羅恩氏病、結(jié)腸炎、潮熱、陰道或外陰萎縮、萎縮性陰道炎、陰道干燥、搔癢癥、性交困難、排尿困難、尿頻、尿失禁、尿道感染、血管舒縮癥狀、男性型禿發(fā)、皮膚萎縮、痤瘡、II型糖尿病、功能障礙性子宮出血、或者不育癥的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的化合物。
18.一種抑制有該需要的哺乳動(dòng)物中的白血病、子宮內(nèi)膜脫除、慢性腎病或肝病或者凝固疾病或障礙的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的化合物。
19.權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的化合物，用作藥物。
20.權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的化合物在制備用于下述情形的藥物中的用途抑制有該需要的哺乳動(dòng)物中的骨質(zhì)疏松癥，抑制有該需要的哺乳動(dòng)物中的骨關(guān)節(jié)炎、低鈣血癥、高鈣血癥、佩吉特氏病、骨軟化癥、骨鈣質(zhì)缺乏、多發(fā)性骨髓瘤或者對(duì)骨組織具有有害作用的其它形式的癌癥，抑制有該需要的哺乳動(dòng)物中的良性或惡性的異常組織生長(zhǎng)，在有該需要的哺乳動(dòng)物中降低膽固醇、甘油三酯、Lp(a)、或LDL水平；或者抑制高膽固醇血癥；高脂血癥；心血管疾??；動(dòng)脈粥樣硬化癥；外周血管疾??；再狹窄、或血管痙攣；或者抑制因?qū)е旅庖呓閷?dǎo)的血管損傷的細(xì)胞活動(dòng)而引起的血管壁損傷，抑制有該需要的哺乳動(dòng)物中的由游離基誘導(dǎo)的病理狀態(tài)，在有該需要的哺乳動(dòng)物中提供認(rèn)知力提高或神經(jīng)保護(hù)作用；或者治療或抑制老年性癡呆、阿耳茨海默氏病、認(rèn)知減退、或神經(jīng)變性疾病，抑制有該需要的哺乳動(dòng)物中的炎性腸病、潰瘍性直腸炎、克羅恩氏病、結(jié)腸炎、潮熱、陰道或外陰萎縮、萎縮性陰道炎、陰道干燥、搔癢癥、性交困難、排尿困難、尿頻、尿失禁、尿道感染、血管舒縮癥狀；男性型禿發(fā)；皮膚萎縮；痤瘡；II型糖尿?。还δ苷系K性子宮出血；或者不育癥，者抑制有該需要的哺乳動(dòng)物中的白血病、子宮內(nèi)膜脫除、慢性腎病或肝病或者凝固疾病或障礙。
全文摘要
本發(fā)明提供了具有下述結(jié)構(gòu)的式(I)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑、或其可藥用鹽(見(jiàn)圖)其中R
文檔編號(hào)A61P5/00GK1867329SQ200480029795
公開(kāi)日2006年11月22日 申請(qǐng)日期2004年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月12日
發(fā)明者R·E·穆肖, S·M·鮑恩, E·S·曼納斯 申請(qǐng)人:惠氏公司