專利名稱：腎來(lái)源的干細(xì)胞及其分離、分化和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體涉及分離腎干細(xì)胞的方法、由該方法分離的細(xì)胞和這些細(xì)胞的治療應(yīng)用。更具體的，本發(fā)明涉及分離的、腎來(lái)源的、具有分化形成任一或所有三胚層(內(nèi)胚層、中胚層、外胚層)細(xì)胞的祖細(xì)胞，以及分離所述細(xì)胞和誘導(dǎo)由所述方法分離的細(xì)胞的特異性分化的方法，和這些細(xì)胞中存在的特異性標(biāo)志物如蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子。
背景技術(shù)：
腎的腎毒性和缺血性損傷導(dǎo)致急性腎衰，多數(shù)經(jīng)常表現(xiàn)為急性腎小管壞死(ATN)。損傷后，腎經(jīng)歷再生反應(yīng)，導(dǎo)致腎功能的恢復(fù)。對(duì)再生腎小管的細(xì)胞來(lái)源了解很少。新腎小管細(xì)胞的三種可能來(lái)源是(1)臨近的受破壞較少的腎小管細(xì)胞；(2)推測(cè)可能為骨髓起源的腎外細(xì)胞，歸巢到受損腎；或(3)駐留的腎干細(xì)胞。有證據(jù)支持受破壞較少的腎小管細(xì)胞的作用。重演發(fā)育過(guò)程，這些細(xì)胞脫分化、增殖并最終重新形成裸露的腎小管的內(nèi)層、恢復(fù)腎的結(jié)構(gòu)和功能完整性[1-5]。已經(jīng)表征了定義這種腎再生的分子事件，并且已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃腿梭w內(nèi)測(cè)試了加速所述修復(fù)過(guò)程的策略[1-6]。
發(fā)現(xiàn)具有分化成不同細(xì)胞譜系的骨髓來(lái)源的干細(xì)胞已經(jīng)導(dǎo)致重新審視參與器官損傷恢復(fù)的細(xì)胞來(lái)源和過(guò)程[7-14]。骨髓來(lái)源的細(xì)胞能遷移到腎并形成腎小管上皮細(xì)胞[15-17]。然而，腎外細(xì)胞對(duì)再生性腎反應(yīng)的貢獻(xiàn)小。骨髓細(xì)胞也能向腎小球腎炎動(dòng)物模型中的腎小球和腎移植后內(nèi)皮和間質(zhì)組織提供細(xì)胞[8-26]。
已經(jīng)在很多器官中發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞，這些器官包括骨髓、胃腸道粘膜、肝、腦、胰、前列腺和皮膚[27-31]。這些細(xì)胞參與這些器官中的正常細(xì)胞更替，并是器官損傷后的細(xì)胞來(lái)源?？寺》治鲆呀?jīng)證明成體腎的單個(gè)細(xì)胞具有腎小管生成的能力，盡管所述細(xì)胞還沒(méi)有非常詳細(xì)的表征[32]。腎發(fā)育的深入研究已經(jīng)證明單個(gè)后腎間充質(zhì)細(xì)胞能形成腎單位除集合管之外所有部分的上皮細(xì)胞，集合管的上皮細(xì)胞由輸尿管芽細(xì)胞形成[33]。后腎間充質(zhì)的譜系限制出現(xiàn)在發(fā)育較晚階段[34]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供分離的多能腎祖細(xì)胞(MRPC)，所述細(xì)胞對(duì)波形蛋白、Oct-4、CD90和CD44呈現(xiàn)細(xì)胞標(biāo)志物陽(yáng)性，對(duì)關(guān)閉帶、細(xì)胞角蛋白、SSEA-1、NCAM、CD11b、CD45、CD31、CD106和I與II類MHC分子呈現(xiàn)細(xì)胞標(biāo)志物陰性。本發(fā)明提供非胚胎和/或非生殖細(xì)胞的分離的MRPC。上述本發(fā)明細(xì)胞可具有在體外、活體外或體內(nèi)誘導(dǎo)分化形成中胚層、外胚層和內(nèi)胚層起源的至少一種分化細(xì)胞類型的能力。本發(fā)明的細(xì)胞可具有誘導(dǎo)分化成兩種分化細(xì)胞類型或所有三種分化細(xì)胞類型的能力。例如，所述細(xì)胞可具有誘導(dǎo)分化形成至少腎、內(nèi)皮、神經(jīng)元和肝細(xì)胞類型的細(xì)胞(“指定類型的細(xì)胞”是指組成器官或參與器官功能的感興趣的所有細(xì)胞，僅舉幾例，腎小球膜細(xì)胞和腎小管細(xì)胞，它們是腎細(xì)胞類型的細(xì)胞)的能力。所述細(xì)胞可以是人細(xì)胞、大鼠細(xì)胞或小鼠細(xì)胞。所述細(xì)胞可以來(lái)自胎兒、新生兒、兒童或成體。繼續(xù)體外培養(yǎng)后(例如，細(xì)胞已培養(yǎng)超過(guò)4個(gè)月或已經(jīng)歷至少約90到約160次群體倍增)，所述細(xì)胞還可以表達(dá)高水平端粒酶并維持長(zhǎng)端粒，例如長(zhǎng)約12Kb、約16Kb或約23Kb的端粒。
本發(fā)明也提供上述MRCP群體和擴(kuò)張所述MRCP的培養(yǎng)基的組合物。所述培養(yǎng)基可以包括血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子(PDGF-BB)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和白血病抑制因子(LIF)。所述組合物的細(xì)胞也具有分化形成中胚層、外胚層和內(nèi)胚層起源的至少一種分化細(xì)胞類型的能力。
本發(fā)明進(jìn)一步提供從上述MRPC獲得的分化細(xì)胞，其中所述后代細(xì)胞可以是腎、肝、神經(jīng)元或內(nèi)皮細(xì)胞。所述腎細(xì)胞可以是腎小管細(xì)胞。
本發(fā)明提供分離的轉(zhuǎn)基因MRPC，其中通過(guò)插入預(yù)選的分離DNA、或通過(guò)用預(yù)選的分離DNA替換所述細(xì)胞基因組的節(jié)段、或通過(guò)刪除或滅活所述細(xì)胞基因組的至少一部分，所述MRPC的基因組已經(jīng)被改變。這種改變可以是通過(guò)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，如通過(guò)病毒載體整合，或通過(guò)使用DNA病毒、RNA病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體插入DNA。作為替代方案，所述分離的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的細(xì)胞基因組一部分可以用反義核酸分子滅活，所述反義核酸分子的序列與待滅活細(xì)胞基因組的所述部分的序列互補(bǔ)。進(jìn)而，所述細(xì)胞基因組的一部分可以用對(duì)應(yīng)待滅活細(xì)胞基因組的所述部分序列的核酶序列來(lái)滅活。另外，所述細(xì)胞基因組的一部分可以用對(duì)應(yīng)待滅活細(xì)胞基因組所述部分序列的小干擾RNA(siRNA)序列滅活。所述改變的基因組可以含有選擇或篩選標(biāo)志物基因的基因序列，該基因的表達(dá)使得所述具有改變基因組的祖細(xì)胞或其后代可以與具有未改變基因組的祖細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。例如，所述標(biāo)志物可以是綠色、紅色或黃色熒光蛋白、β-gal、Neo、DHFRm或潮霉素。所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以表達(dá)能被誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、酶或其它細(xì)胞產(chǎn)物表達(dá)的其它細(xì)胞機(jī)制所調(diào)節(jié)的基因。
本發(fā)明提供通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)腎細(xì)胞約4周而分離MRPC的方法，其中所述培養(yǎng)基基本由DMEM-LG、MCDB-201、胰島素—轉(zhuǎn)鐵蛋白—硒(ITS)、地塞米松、抗壞血酸2-磷酸、青霉素、鏈霉素和胎牛血清(FCS)組成，其中還有表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子(PDGF-BB)和白血病抑制因子(LIF)。所述細(xì)胞可以培養(yǎng)約4-6周，或更長(zhǎng)時(shí)間，或當(dāng)多數(shù)細(xì)胞類型已經(jīng)死亡并且培養(yǎng)物變成單形態(tài)的紡錘形細(xì)胞。所述細(xì)胞可以培養(yǎng)于纖連蛋白上，并可以維持于約2-5×102細(xì)胞/cm2的濃度。所述方法進(jìn)一步可以包括在添加生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所鋪的細(xì)胞。所使用的生長(zhǎng)因子可以選自PDGF-BB、EGF、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)和LIF。
本發(fā)明提供包含促進(jìn)未分化MRPC繼續(xù)生長(zhǎng)或分化的因子的細(xì)胞分化溶液。具體的，本發(fā)明提供培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基，由此用支持這些細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)的培養(yǎng)基直接從腎組織衍生MRPC。例如，所述培養(yǎng)基的組成可以是60％DMEM-LG(Gibco-BRL，Grand Island，NY)、40％MCDB-201(Sigma Chemical Co，St.Louis，MO)、含1×胰島素—轉(zhuǎn)鐵蛋白—硒(ITS)、10-9M地塞米松(Sigma)和10-4M抗壞血酸2-磷酸(Sigma)、100U青霉素和1000U鏈霉素(Gibco)與2％胎牛血清(FCS)(Hyclone Laboratories，Logan，UT)，還含表皮生長(zhǎng)因子(EGF)10ng/ml、血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子(PDGF)-BB10ng/m和白血病抑制因子(LIF)10ng/ml(全部來(lái)自R&D Systems，Minneapolis，MN)。所述細(xì)胞可以生長(zhǎng)于纖連蛋白(FN)(Sigma)上。所述細(xì)胞可以維持于約2-5×102細(xì)胞/cm2的濃度。
本發(fā)明還提供根據(jù)上述方法分離的腎細(xì)胞和哺乳動(dòng)物MRPC的培養(yǎng)克隆群體。
本發(fā)明提供通過(guò)向哺乳動(dòng)物給予全異體的MRPC誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物耐受隨后的MRPC來(lái)源的組織移植物或其它器官移植物從而重構(gòu)哺乳動(dòng)物腎的方法。
本發(fā)明提供通過(guò)給予適當(dāng)生長(zhǎng)因子并使細(xì)胞生長(zhǎng)從而將未分化的MRPC在活體外擴(kuò)張成分化細(xì)胞的方法。這些生長(zhǎng)因子可以包括FGF2、TGF、LIF、VEGF、bFGF、FGF-4、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，或其組合。本發(fā)明還提供由此方法獲得的分化細(xì)胞。這種分化細(xì)胞可以是外胚層、中胚層或內(nèi)胚層細(xì)胞。所述分化細(xì)胞還可以是腎、內(nèi)皮、神經(jīng)元或肝細(xì)胞類型的。另外，所述分化的腎細(xì)胞可以是腎小管細(xì)胞。
本發(fā)明提供上述細(xì)胞的多種用途。例如，本發(fā)明提供體內(nèi)分化MRPC的方法，這是通過(guò)上述方法分離多能腎祖細(xì)胞并將擴(kuò)張的所述細(xì)胞群體給予對(duì)象，導(dǎo)致所述細(xì)胞群體被植入并體內(nèi)分化成組織特異性細(xì)胞，使得由于損傷或疾病而有缺陷的細(xì)胞或器官的功能第一次被提高、重構(gòu)或提供。所述組織特異性細(xì)胞可以是腎、內(nèi)皮、神經(jīng)元或肝細(xì)胞類型的。還提供由此方法獲得的分化細(xì)胞。
本發(fā)明還提供通過(guò)給予治療有效量的上述細(xì)胞或其后代治療需要治療的對(duì)象的方法。所述MRPC或其后代可以歸巢到所述對(duì)象的一種或多種器官并移植入其內(nèi)和/或其上，使得由于損傷或疾病而有缺陷的細(xì)胞或器官的功能第一次被提高、重構(gòu)或提供。所述后代可以具有進(jìn)一步分化的能力，或者它們可以是終末分化的。
本發(fā)明提供使用所述分離細(xì)胞的方法，這是通過(guò)宮內(nèi)移植細(xì)胞群以形成細(xì)胞或組織的嵌合體，從而在移植后的出生前或出生后人或動(dòng)物中產(chǎn)生人細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在所述人或動(dòng)物中產(chǎn)生治療性酶、蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物以糾正遺傳缺陷。本發(fā)明還提供使用所述細(xì)胞在需要治療治療的對(duì)象中進(jìn)行基因治療的方法，包括通過(guò)將編碼期望基因產(chǎn)物的分離的預(yù)選DNA導(dǎo)入所述細(xì)胞中從而遺傳改變所述細(xì)胞，培養(yǎng)擴(kuò)張所述細(xì)胞，并將所述細(xì)胞給予所述對(duì)象以產(chǎn)生期望基因產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供修復(fù)需要這種修復(fù)的對(duì)象中的損壞組織的方法，包括培養(yǎng)擴(kuò)張所述分離MRPC，并將有效量的所述擴(kuò)張細(xì)胞給予所述具有損壞組織的對(duì)象。另外，本發(fā)明還提供修復(fù)需要這種修復(fù)的對(duì)象中的損壞組織的方法，包括將外源分子給予所述對(duì)象刺激內(nèi)源性MRPC增殖并分化成腎的不同細(xì)胞譜系。例如，本發(fā)明提供當(dāng)通過(guò)給予分子如LIF、集落刺激因子或胰島素樣生長(zhǎng)因子而刺激時(shí)，腎中存在的內(nèi)源性MRPC細(xì)胞增殖并分化成腎的不同細(xì)胞譜系的方法。這些受刺激的MRPC然后能有助于疾病如急性腎小管壞死中腎的再生和疾病如肝硬化中非腎組織的再生。
本發(fā)明提供使用MRPC誘導(dǎo)對(duì)傳染性因子免疫應(yīng)答的方法，包括遺傳改變多能腎祖細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)張的克隆群體，以表達(dá)激發(fā)抗傳染性因子的保護(hù)性免疫應(yīng)答的一種或多種預(yù)選抗原性分子，并向所述對(duì)象給予有效誘導(dǎo)所述免疫應(yīng)答的量的所述遺傳改變的細(xì)胞。
本發(fā)明提供使用MRPC鑒定與生理異常相關(guān)的遺傳多態(tài)性的方法，包括從統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的、從中可獲得表型數(shù)據(jù)的個(gè)體群中分離所述MRPC，培養(yǎng)擴(kuò)張來(lái)自統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的個(gè)體群的MRPC以建立MRPC培養(yǎng)物，在培養(yǎng)的MRPC中鑒定至少一種遺傳多態(tài)性，誘導(dǎo)培養(yǎng)的MRPC分化，并通過(guò)將具有正?；蛐偷腗RPC表現(xiàn)的分化模式與具有鑒定的遺傳多態(tài)性的MRPC表現(xiàn)的分化模式比較，表征與所述至少一種遺傳多態(tài)性相關(guān)的異常代謝過(guò)程。
本發(fā)明進(jìn)一步提供治療對(duì)象中癌癥的方法，包括遺傳改變MRPC以表達(dá)殺腫瘤蛋白、抗血管生成蛋白或與刺激抗原免疫應(yīng)答相關(guān)蛋白一起在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白，并向所述對(duì)象給予有效抗癌量的所述遺傳改變的MRPC。
本發(fā)明提供使用MRPC表征對(duì)生物或藥理因子的細(xì)胞應(yīng)答的方法，包括從統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的個(gè)體群分離MRPC，培養(yǎng)擴(kuò)張從統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的個(gè)體群分離的所述MRPC以建立多種MRPC培養(yǎng)物，將所述MRPC培養(yǎng)物與一種或多種生物或藥理因子接觸，鑒定對(duì)所述一種或多種生物或藥理因子的一種或多種細(xì)胞應(yīng)答，和比較來(lái)自所述統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的群體中個(gè)體的MRPC培養(yǎng)物的一種或多種細(xì)胞應(yīng)答。
本發(fā)明還提供將特異性分化細(xì)胞用于治療的方法，包括將所述特異性分化細(xì)胞給予需要的患者。進(jìn)一步提供遺傳工程化MRPC用于選擇性表達(dá)內(nèi)源基因或轉(zhuǎn)基因的用途，和體內(nèi)生長(zhǎng)的MRPC用于移植/給予動(dòng)物以治療疾病的用途。例如，來(lái)源于MRPC的分化細(xì)胞可用于治療與腎的腎小管、血管、間質(zhì)或腎小球結(jié)構(gòu)相關(guān)的疾病。例如細(xì)胞可用于治療腎小球基底膜疾病，如Alports綜合征；腎小管轉(zhuǎn)運(yùn)疾病，如Bartter綜合征、胱氨酸尿或腎性尿崩癥；各種病因的進(jìn)行性腎病，如糖尿病性腎病或腎小球腎炎；Fabry病、高草酸尿，用于加速?gòu)募毙阅I小管壞死中恢復(fù)。所述細(xì)胞可用于將細(xì)胞植入哺乳動(dòng)物，包括給予自體、異體或異種細(xì)胞以恢復(fù)或糾正所述哺乳動(dòng)物的組織特異性代謝功能、酶功能、結(jié)構(gòu)功能或其它功能。所述細(xì)胞可用于將細(xì)胞植入哺乳動(dòng)物，引起細(xì)胞類型的體內(nèi)分化，并用于將所述分化的腎祖細(xì)胞給予所述哺乳動(dòng)物。所述細(xì)胞，或其體內(nèi)或體外分化的后代，可用于糾正遺傳病、退行性疾病或癌癥過(guò)程。它們可用作治療劑例如輔助患者從癌癥治療的化療或放療、自身免疫病治療的恢復(fù)，或誘導(dǎo)受體耐受。
本發(fā)明進(jìn)一步提供分析上述MRPC的基因譜圖(gene profiling)的方法，以及該基因譜圖在數(shù)據(jù)庫(kù)中的用途。還提供分析基因譜圖后的上述MRPC用于輔助藥物發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫(kù)中的用途。
本發(fā)明進(jìn)一步提供使用MRPC或從MRPC分化的細(xì)胞與載體(carrier)裝置一起形成人工腎。合適的載體裝置在本領(lǐng)域公知。例如，所述載體裝置可以是中空纖維基裝置。與該裝置一起使用的所述分化的MRPC可以是腎細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供從對(duì)象血液中除去毒素的方法，包括將所述血液在活體外與形成中空纖維基裝置內(nèi)層的分離的MRPC接觸。
另外，在上述方法中，所述細(xì)胞可以與可接受的基質(zhì)如藥學(xué)上可接受的基質(zhì)一起給予。所述基質(zhì)可以是可生物可降解的。所述基質(zhì)還可以提供另外的遺傳物質(zhì)、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子或促進(jìn)所述細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的其它因子。所述細(xì)胞還可以在給予之前被膠囊化。所述膠囊化細(xì)胞可以包含于聚合物膠囊中。
本發(fā)明的細(xì)胞還可以通過(guò)各種給予方法給予對(duì)象，包括局部注射、全身注射、腸胃外給予、口服給予或?qū)m內(nèi)注射給胚胎。上述方法的對(duì)象可以是哺乳動(dòng)物。所述哺乳動(dòng)物可以是人。
本發(fā)明還提供鑒定輔助腎再生的藥物因子、包括生物因子的方法，包括用在腎單位形成過(guò)程中被活化的基因的啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)染MRPC，其中所述啟動(dòng)子區(qū)可操作的連接到受體基因，使所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞與藥物因子接觸，并檢測(cè)表達(dá)的由所述標(biāo)志物基因編碼的表達(dá)蛋白，其中所述蛋白檢測(cè)鑒定藥物因子是否能輔助腎再生。所述標(biāo)志物基因可以是綠色、紅色或黃色熒光蛋白、β-gal、Neo、DHFRm或潮霉素。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A-C.(A)來(lái)源于成體骨髓的小鼠MAPC的相差顯微圖；(B)小鼠多能腎祖細(xì)胞的相差顯微圖；和(C)大鼠腎祖細(xì)胞的相差顯微圖。所有三種細(xì)胞具有相似的紡錘形態(tài)。
圖2A-B.小鼠MRPC的相差圖(A)和掃描電子顯微圖(B)證明細(xì)胞聚集成原始小球。
圖3A-B.小鼠MRPC的免疫組化，(A)FITC標(biāo)記的抗細(xì)胞角蛋白抗體染色，顯示細(xì)胞角蛋白的細(xì)胞漿染色；和(B)德克薩斯紅標(biāo)記的抗ZO-1抗體，顯示沿細(xì)胞邊緣的特征性spickled染色。
圖4A-D.培養(yǎng)于對(duì)照培養(yǎng)基(A和B)或含腎發(fā)生混合物的培養(yǎng)基(C和D)中的小鼠MRPC的相差圖(A和C)和相同圖像的熒光顯微圖(B和D)。在所述混合物存在下，細(xì)胞聚集并變成與Pax-2表達(dá)一致的eGFP陽(yáng)性。
圖5A-F.大鼠MRPC(A)能被誘導(dǎo)分化成內(nèi)皮(B)、神經(jīng)元(C)和肝細(xì)胞(D)。特征性相差形態(tài)和標(biāo)志物的免疫組化被標(biāo)出來(lái)(E和F)。
圖6A-B.Oct-4β-Geo轉(zhuǎn)基因大鼠的腎，(A)β-半乳糖苷酶活性染色(藍(lán)色細(xì)胞指示陽(yáng)性染色)；(B)β半乳糖苷酶的免疫組化(棕色染色指示陽(yáng)性細(xì)胞)。箭頭指示間質(zhì)區(qū)中的陽(yáng)性染色細(xì)胞。
圖7.200次群體倍增下的MRPC的FACS分析，證明100％的二倍體細(xì)胞。
圖8.Southern印跡分析，證明在90和160次群體倍增后端粒長(zhǎng)度被維持。
圖9.大鼠MRPC的轉(zhuǎn)染和體外分化。用MSCV-eGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染大鼠MRPC，通過(guò)FACS選擇高水平GFP表達(dá)的細(xì)胞。這些細(xì)胞被稱為eMRCP。如圖9所示，eGFP能容易的通過(guò)直接熒光和抗GFP抗體檢測(cè)。eGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞仍能用適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基分化成其它細(xì)胞類型。示出了分化成內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元的eMRPC的形態(tài)的實(shí)例。
圖10A-B.囊下注射后的體內(nèi)分化。eMRPC注射到Fisher大鼠的腎小囊下。三周后，取腎進(jìn)行共聚焦顯微檢查。圖10A顯示在注射位點(diǎn)的囊下形成的GFP陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)節(jié)和包括的囊樣結(jié)構(gòu)。圖10B顯示一些GFP陽(yáng)性細(xì)胞已經(jīng)被摻入腎小管。
圖11A-F.腎缺血/再灌注后的體內(nèi)分化(缺血/再灌注后的再生腎)。A)MRPC的腎小管管型；B)駐入腎小球的MRPC；C)存在于再生腎小管的幾個(gè)MRPC(箭頭)；D)MRPC陽(yáng)性腎小管的分組；E)具有很多MRPC的腎小管；F)該腎小管中的幾個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞，包括成簇的可能來(lái)自間質(zhì)MRPC細(xì)胞的細(xì)胞。
圖12.PCNA染色ARF模型中的主動(dòng)脈內(nèi)注射。缺血-再灌注損傷和MRPC注射后兩周收獲的Fisher大鼠腎的冷凍切片。切片上增殖細(xì)胞核抗原(PCNA，粉紅)染色陽(yáng)性的細(xì)胞、細(xì)胞核(TOPRO3，藍(lán))和表達(dá)eGFP的MRPC(綠)。摻入腎小管的MRPC呈現(xiàn)PCNA染色陽(yáng)性。
圖13.ZO-1染色。缺血-再灌注損傷和MRPC注射后兩周收獲的Fisher大鼠腎的冷凍切片。切片上緊密連接蛋白關(guān)閉帶-1(ZO-1，紅)染色陽(yáng)性的細(xì)胞、細(xì)胞核(TOPRO3，藍(lán))和表達(dá)eGFP的MRPC(綠)。由此可見(jiàn)摻入腎小管后MRPC表達(dá)ZO-1。
圖14.波形蛋白染色。缺血-再灌注損傷和MRPC注射后兩周收獲的Fisher大鼠腎的冷凍切片。切片上間質(zhì)中波形蛋白(紅)染色陽(yáng)性的細(xì)胞、細(xì)胞核(TOPRO3，藍(lán))和表達(dá)eGFP的MRPC(綠)。由此可見(jiàn)摻入腎小管后MRPC喪失波形蛋白表達(dá)。
圖15.PHE-A(近端腎小管標(biāo)志物)染色。缺血-再灌注損傷和MRPC注射后兩周收獲的Fisher大鼠腎的冷凍切片。切片上近端腎小管標(biāo)志物PHE-A(紅)染色陽(yáng)性的細(xì)胞、細(xì)胞核(TOPRO3，藍(lán))和表達(dá)eGFP的MRPC(綠)。由此可見(jiàn)摻入腎小管的MRPC對(duì)PHE-A染色陽(yáng)性。
圖16.PNA(遠(yuǎn)端腎小管標(biāo)志物)染色。缺血-再灌注損傷和MRPC注射后兩周收獲的Fisher大鼠腎的冷凍切片。切片上遠(yuǎn)端腎小管標(biāo)志物花生凝集素(PNA，紅)染色陽(yáng)性的細(xì)胞、細(xì)胞核(TOPRO3，藍(lán))和表達(dá)eGFP的MRPC(綠)。由此可見(jiàn)摻入腎小管的MRPC對(duì)PNA染色陽(yáng)性。
圖17.THP(亨利袢標(biāo)志物)染色。缺血-再灌注損傷和MRPC注射后兩周收獲的Fisher大鼠腎的冷凍切片。切片上亨利袢標(biāo)志物Tamm Horsfall蛋白(THP，紅)染色陽(yáng)性的細(xì)胞、細(xì)胞核(TOPRO3，藍(lán))和表達(dá)eGFP的MRPC(綠)。由此可見(jiàn)摻入腎小管的MRPC對(duì)THP染色弱。
圖18.快速藥物發(fā)現(xiàn)模型針對(duì)細(xì)胞命運(yùn)。
具體實(shí)施方案急性腎衰后的腎功能恢復(fù)依賴于壞死腎小管細(xì)胞用功能性腎上皮細(xì)胞的替換。這些新腎小管細(xì)胞的來(lái)源被認(rèn)為是臨近的、受破壞較少的腎小管細(xì)胞，盡管腎外細(xì)胞也有一定程度的貢獻(xiàn)。
本發(fā)明人已經(jīng)分離并表征了腎中存在的能分化成不同細(xì)胞譜系的干細(xì)胞。這些來(lái)源于腎的干細(xì)胞此處被稱為多能腎祖細(xì)胞(MRPC)。MRPC的來(lái)源包括成體、新生兒、兒童或胎兒的腎。MRPC可以來(lái)自正常和/或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。MRPC可以來(lái)自損傷或未損傷的、健康或有疾病的腎。MRPC可以分化形成任何或所有三種生殖細(xì)胞層(內(nèi)胚層、中胚層、外胚層)。此處所述的多能成體干細(xì)胞用本發(fā)明人建立的方法分離，本發(fā)明人鑒定了表征MRPC的多種特異性細(xì)胞標(biāo)志物。
本發(fā)明的方法可用于從人、大鼠、小鼠和其它物種來(lái)源的任何成體、兒童或胎兒分離MRPC。因此本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)在可以獲得腎活組織，并根據(jù)發(fā)明人鑒定的這些細(xì)胞之上或之中表達(dá)的標(biāo)志物、使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的陽(yáng)性或陰性選擇技術(shù)來(lái)分離細(xì)胞，從而分離MRPC，無(wú)需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明人已經(jīng)產(chǎn)生了分離和表征成體腎來(lái)源干細(xì)胞的重要數(shù)據(jù)。這些細(xì)胞的存在對(duì)理解損傷腎的修復(fù)應(yīng)答有重要影響并改變了腎再生的當(dāng)前模型。本發(fā)明的MRPC分化的體外模式系統(tǒng)允許測(cè)試負(fù)責(zé)腎細(xì)胞譜系進(jìn)程(例如，未分化干細(xì)胞向分化腎細(xì)胞——包括腎的小管細(xì)胞——的進(jìn)程)的特異性因子。未誘導(dǎo)狀態(tài)或經(jīng)不同程度分化后的MRPC為腎病的細(xì)胞治療提供重要的治療工具，或作為向受破壞腎遞送治療性基因或因子的載體。成體腎來(lái)源的干細(xì)胞的存在對(duì)其它器官系統(tǒng)的損傷和修復(fù)研究也有重要影響。
Verfaillie等人分離了成體骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，這些細(xì)胞被稱為多能成體祖細(xì)胞或MAPC，它們有能力體外分化為間充質(zhì)細(xì)胞以及具有臟壁中胚層、神經(jīng)外胚層和內(nèi)胚層特征的細(xì)胞[35]。發(fā)明人將相似的培養(yǎng)條件應(yīng)用于成體腎以確定成體腎中是否存在腎干細(xì)胞。在衍生腎干細(xì)胞的細(xì)胞群體方面它們是成功的。
分離腎祖細(xì)胞(MRPC)用培養(yǎng)MAPC使用的相似培養(yǎng)條件從小鼠和大鼠腎分離腎祖細(xì)胞(即干)細(xì)胞[35]。具體的說(shuō)，將所述細(xì)胞鋪于低血清培養(yǎng)基。例如，培養(yǎng)基可以含有以下成分50-60％DMEM-LG(Gibco-BRL，Grand Island，NY)，30-40％MCDB-201(SigmaChemical Co，St.Louis，MO)，以及1×胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(ITS)，10-8M-10-9M地塞米松(Sigma)和10-3M-10-4M抗壞血酸2-磷酸(Sigma)，100U青霉素和1000U鏈霉素(Gibco)，還有纖連蛋白(FN)(Sigma)和1-3％胎牛血清(FCS)(Hyclone Laboratories，Logan，UT)和5-20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、5-20ng/ml血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子(PDGF)-BB和5-20ng/ml白血病抑制因子(LIF)(全部來(lái)自R&D Systems，Minneapolis，MN)。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基含有60％DMEM-LG，40％MCDB-201，以及1×ITS，10-9M地塞米松和10-4M抗壞血酸2-磷酸，100U青霉素和1000U鏈霉素，還有纖連蛋白和2％胎牛血清和10ng/ml EGF、10ng/ml PDGF-BB和10ng/ml LIF。該培養(yǎng)基用于維持和擴(kuò)張未分化狀態(tài)的細(xì)胞。細(xì)胞維持于2-5×102細(xì)胞/cm2。所述分離細(xì)胞呈現(xiàn)波形蛋白和Oct-4細(xì)胞標(biāo)志物陽(yáng)性，呈現(xiàn)關(guān)閉帶、細(xì)胞角蛋白和I與II類MHC分子陰性。所述細(xì)胞對(duì)CD90和CD44也呈現(xiàn)抗原陽(yáng)性，對(duì)SSEA-1、NCAM、CD11b、CD45、CD31和CD106呈現(xiàn)抗原陰性。
一旦建立細(xì)胞培養(yǎng)，就可以用含40％FCS和10％DMSO的DMEM冷凍并保存細(xì)胞為冷凍保存物。制備培養(yǎng)細(xì)胞的冷凍保存物的其它方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員也是已知的。
體外分化腎祖細(xì)胞使用適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)因子、趨化因子和細(xì)胞因子，可以將本發(fā)明的MRPC誘導(dǎo)分化形成多種細(xì)胞譜系，例如包括外胚層、中胚層或內(nèi)胚層來(lái)源的各種細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施例中，如上分離的細(xì)胞能被誘導(dǎo)分化。MRPC與含F(xiàn)GF2、TGF-β、和LIF的“腎發(fā)生混合物”一起培養(yǎng)。除了形態(tài)變化以外，所述細(xì)胞表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物，包括細(xì)胞角蛋白和關(guān)閉帶-1(ZO-1)。這些細(xì)胞是急性腎衰后再生細(xì)胞的來(lái)源。
防止免疫排斥的移植方法通用供體細(xì)胞可操作MRPC作為通用供體細(xì)胞，并用于治療遺傳病或其它疾病和替換酶的基因治療。盡管未分化MRPC不表達(dá)I型HLA或II型HLA抗原，一些分化后代表達(dá)至少I型HLA抗原。通過(guò)消除I型HLA和II型HLA抗原并潛在的引入預(yù)期受體的HLA抗原，使細(xì)胞不成為NK介導(dǎo)殺傷的容易的靶標(biāo)，或變得對(duì)無(wú)限制病毒復(fù)制和/或惡性轉(zhuǎn)化敏感，MRPC可以被修飾用作通用供體細(xì)胞。通過(guò)同源重組或在啟動(dòng)子區(qū)引入點(diǎn)突變或在所述抗原的起始外顯子中引入導(dǎo)致終止密碼子的點(diǎn)突變，如用chimeroplast，可以實(shí)現(xiàn)HLA抗原的消除。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺相關(guān)病毒或其它病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或經(jīng)用所述HLA抗原cDNA轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)宿主HLA抗原的轉(zhuǎn)移。
宮內(nèi)移植以繞過(guò)免疫識(shí)別MRPC可以用于宮內(nèi)移植以在免疫系統(tǒng)發(fā)育之前糾正遺傳異常，或?qū)雽⒈凰拗髂褪艿募?xì)胞。這可以是在動(dòng)物中大量制備人細(xì)胞的方式，或可以用作通過(guò)移植生成正確蛋白質(zhì)或酶的細(xì)胞而糾正人胚胎遺傳缺陷的方式?；蛑委熆蓮纳眢w提取并分離本發(fā)明的MRPC以未分化狀態(tài)在培養(yǎng)中生長(zhǎng)，或誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，并用各種技術(shù)尤其是病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)得以遺傳改變。遺傳物質(zhì)的攝入和表達(dá)是可證明的，并且外來(lái)DNA的表達(dá)在整個(gè)發(fā)育期間穩(wěn)定。將外來(lái)DNA插入干細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和其它載體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染后，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)表達(dá)在終末分化細(xì)胞中持續(xù)存在，證明導(dǎo)入MRPC的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體表達(dá)在整個(gè)分化期間持續(xù)。
基因治療的候選基因例如包括編碼IV型膠原α5鏈(COL4A5)、多囊蛋白、α-半乳糖苷酶A、噻嗪類敏感的氯化鈉共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NCCT)、nephrin、輔肌動(dòng)蛋白或水通道蛋白(aquaporin)2的基因。
這些基因可以由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，從而使酶表達(dá)水平可以得到調(diào)節(jié)。這些誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)可以包括與待生成蛋白連接的人雌激素受體(ER)的突變的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這要求個(gè)體攝入他莫西芬以誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。替代方案有四環(huán)素開(kāi)關(guān)系統(tǒng)、RU486和雷帕霉素誘導(dǎo)系統(tǒng)。獲得相對(duì)選擇性表達(dá)的其它方法是使用組織特異性啟動(dòng)子。例如，可以導(dǎo)入由KSP-鈣粘蛋白、nephrin或uromodulin特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因。
遺傳改變的MRPC可以局部導(dǎo)入或全身輸注。它們可遷移到腎，在此細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和其它因子誘導(dǎo)細(xì)胞分化?，F(xiàn)作為周圍組織一部分的分化細(xì)胞保留生成所導(dǎo)入基因的蛋白產(chǎn)物的能力。
遺傳改變的MRPC也可以包封在惰性載體中，使細(xì)胞在生成分泌蛋白時(shí)免受宿主免疫系統(tǒng)影響。細(xì)胞微膠囊化技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知(例如見(jiàn)Chang，P.，et al.[45])。細(xì)胞微膠囊化材料例如包括聚合物膠囊、藻酸-聚-L-賴氨酸-藻酸微膠囊、聚-L-賴氨酸-藻酸鋇膠囊、藻酸鋇膠囊、聚丙烯腈/聚氯乙烯(PAN/PVC)中空纖維和聚醚砜(PES)中空纖維。例如美國(guó)專利No.5,639,275(Baetge，E.，et al.)[46]描述了用含遺傳工程化細(xì)胞的生物相容性膠囊長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)生物活性分子的改進(jìn)裝置和方法。這些生物相容性免疫隔離膠囊與本發(fā)明的MRPC組合，提供治療多種生理疾病的方法。
微膠囊化本發(fā)明細(xì)胞的另一優(yōu)點(diǎn)是存在向微膠囊中摻入各種細(xì)胞的機(jī)會(huì)，每種細(xì)胞產(chǎn)生生物治療分子。本發(fā)明的MRPC可被誘導(dǎo)分化成多種完全不同的譜系，每種譜系能被遺傳改變以生成治療有效水平的生物活性分子。攜帶不同遺傳元件的MRPC可以被包封在一起以產(chǎn)生各種生物活性分子。
可以在活體外遺傳改變本發(fā)明的MRPC，以消除一種最顯著的基因治療屏障。例如，可以獲得對(duì)象的腎活組織，并從所述活組織中分離MRPC。然后遺傳改變所述MRPC以表達(dá)一種或多種期望的基因產(chǎn)物。然后可以在活體外篩選或選擇MRPC以鑒定已被成功改變的細(xì)胞，這些細(xì)胞可以局部或全身性重新導(dǎo)入所述對(duì)象。作為替代方案，MRPC可以被遺傳改變并培養(yǎng)誘導(dǎo)分化形成用于移植的特定細(xì)胞譜系。每種情況下，所述移植MRPC提供能表達(dá)所期望基因產(chǎn)物的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來(lái)源。該方法可用于治療Alports綜合征、巴特綜合征、胱氨酸尿、腎性尿崩癥、腎小管酸中毒、范科尼綜合征、法布里病、多囊性腎病，僅作為幾個(gè)例子。本發(fā)明的細(xì)胞可被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而可以提供靶基因產(chǎn)物的更持久來(lái)源。
遺傳改變MRPC的方法通過(guò)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法將DNA或RNA導(dǎo)入細(xì)胞，此處所述方法分離的細(xì)胞可被遺傳修飾。這些方法一般分成四大類(1)病毒轉(zhuǎn)移，例如，包括使用DNA或RNA病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、猴病毒40(SV40)、腺病毒、辛德比斯病毒和牛乳頭瘤病毒；(2)化學(xué)轉(zhuǎn)移，包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染和DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染方法；(3)膜融合轉(zhuǎn)移，例如，使用負(fù)載DNA的膜泡，如脂質(zhì)體、血影細(xì)胞(red blood cell ghost)和原生質(zhì)體；和(4)物理轉(zhuǎn)移技術(shù)，如微注射、電穿孔或直接“裸”DNA轉(zhuǎn)移。通過(guò)插入預(yù)選的分離DNA、通過(guò)用預(yù)選的分離DNA替換所述細(xì)胞基因組的節(jié)段或通過(guò)刪除或滅活所述細(xì)胞基因組的至少一部分，可以遺傳改變MRPC。通過(guò)各種手段可以實(shí)現(xiàn)刪除或滅活細(xì)胞基因組的至少一部分，例如，包括但不限于遺傳重組、用反義技術(shù)(可以包括使用肽核酸或PNA)或用核酶技術(shù)。通過(guò)同源重組或病毒整合入宿主細(xì)胞基因組可以實(shí)現(xiàn)插入一或多種預(yù)選DNA序列。用質(zhì)粒表達(dá)載體和核定位序列也可以將期望基因序列導(dǎo)入細(xì)胞，尤其是導(dǎo)入細(xì)胞核。指導(dǎo)多核苷酸入核的方法已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中描述。使用允許用某些化學(xué)物/藥物正或負(fù)誘導(dǎo)感興趣基因的啟動(dòng)子，可以導(dǎo)入遺傳物質(zhì)，這些遺傳物質(zhì)在給予既定藥物/化學(xué)物后可被消除，或可以加標(biāo)簽以允許用化學(xué)物誘導(dǎo)(包括但不限于他莫西芬反應(yīng)性突變雌激素受體)在特定細(xì)胞區(qū)隔(包括但不限于細(xì)胞膜)中表達(dá)。
磷酸鈣轉(zhuǎn)染依靠質(zhì)粒DNA/鈣離子的沉淀，它可用于將含靶基因或多核苷酸的質(zhì)粒DNA導(dǎo)入分離或培養(yǎng)的MRPC中。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將質(zhì)粒DNA混合入氯化鈣溶液，然后加入磷酸緩沖溶液中。形成沉淀以后將溶液直接加入培養(yǎng)細(xì)胞中。DMSO或甘油處理可用于提高轉(zhuǎn)染效率，用雙-羥乙基氨基乙磺酸(BES)可以提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體的水平。磷酸鈣轉(zhuǎn)染系統(tǒng)有商品提供(如ProFection，Promega Corp.，Madison，WI)。
DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員也是已知的，當(dāng)需要瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)比磷酸鈣轉(zhuǎn)染更優(yōu)選，因?yàn)樗?jīng)常更有效。
因?yàn)楸景l(fā)明的細(xì)胞是分離細(xì)胞，微注射對(duì)于轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)到細(xì)胞中會(huì)特別有效。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將細(xì)胞置于光學(xué)顯微鏡的工作臺(tái)上。在顯微鏡提供的放大輔助下，將玻璃微吸管導(dǎo)入核中注射DNA或RNA。這種方法有利，因?yàn)樗峁┢谕z傳物質(zhì)向核中的直接遞送，避免被注射多核苷酸的細(xì)胞漿和溶酶體降解。這種技術(shù)已經(jīng)有效的用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生殖系修飾。
本發(fā)明的細(xì)胞也可用電穿孔進(jìn)行遺傳修飾。將靶DNA或RNA加入培養(yǎng)細(xì)胞懸液中。將DNA/RNA-細(xì)胞懸液置于兩個(gè)電極之間并施加電脈沖，引起細(xì)胞外膜瞬間滲透性，表現(xiàn)為出現(xiàn)跨膜孔。靶多核苷酸通過(guò)膜上的開(kāi)孔進(jìn)入細(xì)胞，當(dāng)電場(chǎng)中斷后，孔在約1-30分鐘內(nèi)閉合。
可用與多核苷酸形成穩(wěn)定復(fù)合體的陽(yáng)離子脂質(zhì)體進(jìn)行DNA或RNA的脂質(zhì)體遞送，以遺傳修飾細(xì)胞。為了穩(wěn)定脂質(zhì)體復(fù)合體，可以加入二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)或二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)。用于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移的推薦試劑是Lipofectin(LifeTechnologies，Inc.)，它有商品供應(yīng)。例如，Lipofectin是陽(yáng)離子脂質(zhì)N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N-N-N-三甲基氯化銨和DOPE的混合物。體內(nèi)或體外遞送線性DNA、質(zhì)粒DNA或RNA可以用脂質(zhì)體遞送完成，脂質(zhì)體能攜帶較大的DNA，一般能保護(hù)多核苷酸不被降解，并能靶向特定細(xì)胞或組織，由于這些事實(shí)，脂質(zhì)體遞送可以是優(yōu)選的方法。依賴脂質(zhì)體技術(shù)的其它多種遞送系統(tǒng)也有商品供應(yīng)，包括EffecteneTM(Qiagen)、DOTAP(Roche Molecular Biochemicals)、FuGene 6TM(Roche MolecularBiochemicals)和Transfectam(Promega)。引入純化的病毒或細(xì)胞囊膜成分可以增強(qiáng)陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率，如水泡性口炎病毒囊膜的純化的G糖蛋白(VSV-G)，見(jiàn)Abe，A.，et al.[47]的方法。
已經(jīng)表明用脂質(zhì)多胺包被的DNA可有效遞送DNA進(jìn)入原代和建立的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)可用于將靶DNA導(dǎo)入MRPC。這種技術(shù)一般性描述于Loeffler，J.and Behr，J.[48]。
裸質(zhì)粒DNA可直接注射入由來(lái)自分離MRPC的分化細(xì)胞形成的組織團(tuán)。這種技術(shù)已經(jīng)顯示可有效轉(zhuǎn)移質(zhì)粒DNA進(jìn)入骨骼肌組織，已經(jīng)觀察到單次肌肉注射后小鼠骨骼肌中表達(dá)超過(guò)19個(gè)月。分裂越快的細(xì)胞攝入裸質(zhì)粒DNA的效率越高。因此，有利的是用質(zhì)粒DNA處理之前刺激細(xì)胞分裂。
微粒(microprojectile)基因轉(zhuǎn)移也可用于體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因進(jìn)入MRPC。微?；蜣D(zhuǎn)移的基本操作由J.Wolff[49]描述。簡(jiǎn)單的說(shuō)，編碼靶基因的質(zhì)粒DNA包被到微珠上，微珠通常是1-3微米大小的金或鎢顆粒。將包被顆粒放置到載片上，載片插在發(fā)射室上面。發(fā)射以后，載片被加速到達(dá)保持網(wǎng)，保持網(wǎng)形成停止載片進(jìn)一步運(yùn)動(dòng)的屏障，使包被多核苷酸的顆粒被推動(dòng)，通常由氦氣流推動(dòng)，到達(dá)目標(biāo)表面，如由分化MRPC形成的組織團(tuán)。微顆粒注射技術(shù)以前已被描述，且這些方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知(見(jiàn)[50-52])。
信號(hào)肽可與質(zhì)粒DNA連接[53]以指導(dǎo)DNA入核進(jìn)行更高效表達(dá)。
病毒載體可用于遺傳改變本發(fā)明的MRPC及其后代。如之前已經(jīng)描述的物理方法那樣，使用病毒載體遞送例如一種或多種靶基因、多核苷酸、反義分子或核酶序列進(jìn)入細(xì)胞。病毒載體和使用它們將DNA遞送到細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？捎糜谶z傳改變本發(fā)明細(xì)胞的病毒載體的實(shí)例包括但不限于腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(包括慢病毒載體)、α-病毒載體(如辛德比斯病毒載體)和皰疹病毒載體。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)快速分裂的細(xì)胞，盡管也已經(jīng)開(kāi)發(fā)很多用于有效轉(zhuǎn)移DNA進(jìn)入非分裂細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體[54]。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細(xì)胞系對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。包裝細(xì)胞系提供病毒載體衣殼生成和毒粒成熟需要的病毒蛋白。通常，這些包括gag、pol和env逆轉(zhuǎn)錄病毒基因。適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系選自產(chǎn)生親嗜性、異嗜性或雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的已知細(xì)胞系，提供一定程度的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)特異性。
逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA載體通常與包裝細(xì)胞系一起用于在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生期望靶序列/載體組合。簡(jiǎn)單的說(shuō)，逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA載體是一種質(zhì)粒DNA，其中在多克隆位點(diǎn)附近含有兩個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR，還含有SV40啟動(dòng)子，第一個(gè)LTR位于該SV40啟動(dòng)子的5’端，SV40與克隆到多克隆位點(diǎn)中的靶基因序列可操作的連接，隨后是3’第二個(gè)LTR。逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA載體形成以后，可以用前述磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染將其轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞系。病毒生成約48小時(shí)以后，收獲此時(shí)含有靶基因序列的病毒載體。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體靶向特定細(xì)胞類型已經(jīng)被Martin，F(xiàn)等[55]證明，他們使用抗表面糖蛋白高分子量黑素瘤相關(guān)抗原的單鏈可變片段抗體，將該抗體與雙嗜性鼠白血病病毒包膜融合，以使載體靶向遞送靶基因到黑素瘤細(xì)胞中。當(dāng)期望用靶向遞送時(shí)，例如當(dāng)分化細(xì)胞是期望的遺傳改變目標(biāo)時(shí)，與抗體片段融合的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可用于靶向遞送到這些細(xì)胞中，所述抗體片段抗從本發(fā)明MRPC分化的各種細(xì)胞譜系表達(dá)的特異性標(biāo)志物。
慢病毒載體也可用于遺傳改變本發(fā)明細(xì)胞。很多這種載體已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述并且對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知[56]。這些載體已經(jīng)有效的遺傳改變?nèi)嗽煅杉?xì)胞[57]。慢病毒載體的包裝細(xì)胞系已經(jīng)描述[58-59]。
重組皰疹病毒，如I型單純皰疹病毒(HSV-1)已經(jīng)成功用于向表達(dá)紅細(xì)胞生成素受體的細(xì)胞進(jìn)行靶向DNA遞送[60]。這些載體也可用于遺傳改變本發(fā)明的細(xì)胞，本發(fā)明已經(jīng)證明這些細(xì)胞可以被病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)。
腺病毒載體具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，可插入DNA片段高達(dá)8kb，并且能感染復(fù)制和分化細(xì)胞。很多腺病毒載體已經(jīng)描述于文獻(xiàn)中并且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知[61-62]。將靶DNA插入腺病毒載體的方法對(duì)基因治療領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的，使用重組腺病毒載體將靶DNA導(dǎo)入特定細(xì)胞類型的方法也是已知的[63]。通過(guò)修改病毒載體纖維序列已經(jīng)證明對(duì)某些細(xì)胞類型的結(jié)合親合力。已經(jīng)描述基因轉(zhuǎn)移中允許調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的腺病毒載體系統(tǒng)[64]。擴(kuò)增具有遺傳修飾性受體特異性的腺病毒載體的系統(tǒng)也已經(jīng)描述，以提供向特定細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向[65]。最近描述的綿羊腺病毒載體甚至解決了已有體液免疫干擾成功基因轉(zhuǎn)移的潛在可能性[66]。
也已經(jīng)有提供靶向基因轉(zhuǎn)移和穩(wěn)定基因表達(dá)的、使用分子結(jié)合物載體(molecularconjugate vector)的腺病毒載體，通過(guò)將含靶基因的質(zhì)粒DNA與聚賴氨酸縮合來(lái)構(gòu)建這些載體，其中所述聚賴氨酸與不能復(fù)制的腺病毒連接。
α-病毒載體，尤其是辛德比斯病毒載體，也可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)本發(fā)明的細(xì)胞。這些載體有商品供應(yīng)(Invitrogen，Carlsbad，CA)，并已描述于例如美國(guó)專利No.5,843,723[68]以及Xiong，C.，et al.[69]，Bredenbeek，P.J.，et al.[70]和Frolov，I.，et al.[71]。
在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)中，用遺傳標(biāo)志物可以證明靶細(xì)胞的成功轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，已經(jīng)表明維多利亞水母(Aequorea victoria)的綠色熒光蛋白是鑒定和跟蹤遺傳修飾造血細(xì)胞的有效標(biāo)志物[72]。替代性選擇標(biāo)志物包括β-Gal基因、截短型神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體、藥物選擇標(biāo)志物(包括但不限于NEO、MTX、潮霉素)。
MRPC可用于組織修復(fù)本發(fā)明的干細(xì)胞也可用于組織修復(fù)。發(fā)明人已經(jīng)證明本發(fā)明的MRPC分化形成所有三種生殖細(xì)胞層。例如，通過(guò)前述方法，MRPC誘導(dǎo)分化成肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元，或者可以植入腎以增強(qiáng)從疾病中恢復(fù)，所述疾病包括腎小管上皮細(xì)胞疾病，如運(yùn)輸障礙或急性腎小管壞死；腎小球疾病，如Alports綜合征；腎小管-間隙疾??；和腎脈管系統(tǒng)障礙如HUS/TTP。
基質(zhì)也用于將本發(fā)明細(xì)胞遞送到特定解剖學(xué)位點(diǎn)，其中在基質(zhì)中摻入特定生長(zhǎng)因子，或者由摻入基質(zhì)中的質(zhì)粒編碼特定生長(zhǎng)因子，而所述基質(zhì)被細(xì)胞攝入，這些生長(zhǎng)因子可用于指導(dǎo)起始細(xì)胞群體的生長(zhǎng)。DNA可被摻入基質(zhì)的孔中，例如在用于形成某些聚合物基質(zhì)的成泡過(guò)程期間摻入。隨著用于成泡過(guò)程的聚合物擴(kuò)張，它將DNA限制于這些孔中，實(shí)現(xiàn)受控和持續(xù)地釋放質(zhì)粒DNA。這種基質(zhì)制備方法由Shea，et al.描述[73]。
編碼細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子或激素的質(zhì)粒DNA可以誘捕于聚合物基因活化的基質(zhì)載體中，如Bonadio，J.，et al.[74]所述。然后將可生物降解的聚合物植入腎附近，此處植入MRPC并吸收DNA，使MRPC生成高局部濃度的所述細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子或激素，加速受破壞組織的修復(fù)。
本發(fā)明提供的細(xì)胞或通過(guò)本發(fā)明方法分離的MRPC可用于生成移植組織或器官。Oberpenning，et al.[75]報(bào)道通過(guò)培養(yǎng)犬膀胱外層的肌肉細(xì)胞和犬膀胱內(nèi)層的襯層細(xì)胞，從這些培養(yǎng)物中制備組織片，并包被小聚合物球使肌肉細(xì)胞在外側(cè)、襯層細(xì)胞在內(nèi)側(cè)，從而形成了工作膀胱。然后將該球插入狗的泌尿系統(tǒng)，則開(kāi)始發(fā)揮膀胱的功能。Nicklason，et al.[76]報(bào)道了從培養(yǎng)的平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞生成長(zhǎng)血管移植材料。從培養(yǎng)細(xì)胞形成組織層的其它方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知(例如見(jiàn)Vacanti，et al.，U.S.Patent No.5,855,610[77])。這些方法與本發(fā)明細(xì)胞組合使用時(shí)尤其有效。
對(duì)于此處所述的目的，遺傳改變或未改變的、本發(fā)明的自體或異體MRPC可以分化或未分化形式給予患者，可以直接注射到腎位置，全身性，附在可接受基質(zhì)的表面上或表面周圍，或藥學(xué)上可接受的載體組合。
MRPC提供研究分化途徑的模式系統(tǒng)本發(fā)明的細(xì)胞還可以用于進(jìn)一步研究發(fā)育過(guò)程。例如，Ruley，et al.(WO 98/40468)[78]已經(jīng)描述抑制特定基因表達(dá)并獲得受抑制基因DNA序列的載體和方法?？捎幂d體如Ruley所述的載體處理本發(fā)明細(xì)胞，所述載體抑制可以通過(guò)DNA序列分析鑒定的基因表達(dá)。然后可誘導(dǎo)細(xì)胞分化并可以表征所述改變基因型/表型的作用。
例如，Hahn，et al.[79]證明，當(dāng)一組已知與癌癥相關(guān)的基因被導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，正常人上皮成纖維細(xì)胞可被誘導(dǎo)經(jīng)歷致瘤性轉(zhuǎn)變。
用含誘導(dǎo)型表達(dá)元件的載體控制基因表達(dá)提供研究某些基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞分化影響的方法。誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。一種這樣的系統(tǒng)是No，D.，et al.[80]所述的蛻皮激素誘導(dǎo)型系統(tǒng)。
MRPC可用于研究特定遺傳改變、毒性物質(zhì)、化療劑或其它藥劑對(duì)發(fā)育途徑的影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的組織培養(yǎng)技術(shù)允許大量培養(yǎng)幾百幾千種來(lái)自不同個(gè)體的細(xì)胞樣品，提供進(jìn)行快速篩選懷疑具有如致畸性或致突變性的化合物的機(jī)會(huì)。
為研究發(fā)育途徑，可用特定生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子或其它藥劑處理MRPC，包括懷疑具有致畸性的化學(xué)物處理。也可用前述方法和載體遺傳修飾MRPC。而且，可用反義技術(shù)或用導(dǎo)入細(xì)胞中改變天然基因序列表達(dá)的蛋白質(zhì)處理來(lái)改變MRPC。例如，信號(hào)肽序列可用于將期望肽或多肽導(dǎo)入細(xì)胞。Rojas，et al.[81]已經(jīng)描述了將多肽和蛋白質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞中的特別有效的技術(shù)。這種方法產(chǎn)生多肽或蛋白質(zhì)產(chǎn)物，所述產(chǎn)物能導(dǎo)入培養(yǎng)基并跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位到細(xì)胞內(nèi)部。這樣可使用任意數(shù)量的蛋白質(zhì)，以確定靶蛋白對(duì)細(xì)胞分化的影響。作為替代方案，Phelan et al.[82]所述的技術(shù)可用于連接皰疹病毒蛋白VP22到功能蛋白上，以進(jìn)入細(xì)胞。
通過(guò)導(dǎo)入外來(lái)DNA或經(jīng)沉默或外切基因組DNA，也可將本發(fā)明細(xì)胞遺傳工程化，從而產(chǎn)生具有缺陷表型的分化細(xì)胞，以測(cè)試潛在化療劑或基因治療載體的有效性。
MRPC提供各種分化和未分化培養(yǎng)細(xì)胞類型供高通量篩選本發(fā)明的MRPC例如可培養(yǎng)于96孔或其它多孔培養(yǎng)板，以提供例如靶細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子或藥物基因組學(xué)或藥物遺傳學(xué)方面藥物組合物的高通量篩選系統(tǒng)。本發(fā)明的MRPC提供獨(dú)特的系統(tǒng)，其中來(lái)自同一個(gè)體的細(xì)胞可以被分化形成特定細(xì)胞譜系。與多數(shù)原代培養(yǎng)物不同，這些細(xì)胞可以在培養(yǎng)中維持，并可以在以后研究。來(lái)自同一個(gè)體和來(lái)自不同個(gè)體的細(xì)胞的多種培養(yǎng)物可用感興趣的因子處理，以確定所述細(xì)胞的因子對(duì)具有相同遺傳背景的某些類型的分化細(xì)胞或?qū)z傳不相同個(gè)體的相似類型的細(xì)胞的作用是否存在差異。因此，例如，可以及時(shí)和成本有效的方式篩選細(xì)胞因子、趨化因子、藥物組合物和生長(zhǎng)因子，以更清楚闡明它們的作用。從大個(gè)體群中分離并表征了是否存在遺傳多態(tài)性尤其是單核苷酸多態(tài)性的細(xì)胞可以保存于細(xì)胞培養(yǎng)物庫(kù)中，用于各種篩選技術(shù)。例如，來(lái)自統(tǒng)計(jì)顯著的個(gè)體群的多能成體干細(xì)胞提供高通量篩選鑒定多態(tài)性的理想系統(tǒng)，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法確定，所述多態(tài)性與對(duì)各種物質(zhì)的陽(yáng)性或陰性反應(yīng)增加相關(guān)，所述物質(zhì)例如是藥物組合物、疫苗制劑、細(xì)胞毒性化學(xué)物、突變劑、細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、激素、抑制性化合物、化療劑以及多種其它化合物或因子。從這些研究中獲得的信息對(duì)治療傳染性疾病、癌癥和多種代謝疾病有廣泛應(yīng)用潛力。
在使用MRPC表征對(duì)生物或藥理因子或這些因子的組合庫(kù)的細(xì)胞應(yīng)答的方法中，從統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的個(gè)體群中分離MRPC，培養(yǎng)擴(kuò)張，并使之與一種或多種生物或藥理因子接觸。當(dāng)分化細(xì)胞是某些生物或藥理因子的期望靶標(biāo)時(shí)，可以在培養(yǎng)擴(kuò)張之前或之后誘導(dǎo)分化MRPC。通過(guò)比較來(lái)自統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的個(gè)體群的MRPC培養(yǎng)物的一種或多種細(xì)胞應(yīng)答，可以確定所述生物或藥理因子的作用。作為替代方案，遺傳相同的MRPC或從其分化的細(xì)胞可用于篩選分離的(separate)化合物，如組合庫(kù)中的化合物。與基于細(xì)胞的高通量篩選組合使用的基因表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)被描述[83]。用于鑒定內(nèi)皮細(xì)胞活化抑制劑的高通量篩選技術(shù)已經(jīng)由Rice等描述，其中使用原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)[84]。本發(fā)明的細(xì)胞提供多種細(xì)胞類型，既有終末分化的也有未分化的，用于鑒定大量靶生物或藥理因子的高通量篩選技術(shù)。最重要的是，本發(fā)明的細(xì)胞提供來(lái)自多種遺傳多樣性個(gè)體的培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)源，這些個(gè)體可對(duì)生物和藥理因子產(chǎn)生不同應(yīng)答。
MRPC可以凍存原種形式提供，單獨(dú)提供或與預(yù)包裝的培養(yǎng)基和培養(yǎng)添加劑組合，并可以另外組合提供分開(kāi)包裝的有效濃度的適當(dāng)因子，以誘導(dǎo)分化成特定細(xì)胞類型。作為替代方案，MRPC可以凍存原種形式提供，所述凍存原種由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備，并含有由上述方法誘導(dǎo)分化的細(xì)胞。
MRPC和遺傳譜分析遺傳性變異對(duì)疾病易感性可有間接和直接影響。對(duì)于直接影響，甚至導(dǎo)致單核苷酸多態(tài)性(SNP)的單個(gè)核苷酸變化都可以改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列，直接影響疾病或疾病易感性。經(jīng)?？梢栽隗w外檢測(cè)到所得蛋白質(zhì)的功能性改變。例如，某些APO-脂蛋白E基因型與某些個(gè)體中阿爾茨海默病的發(fā)作和進(jìn)程有關(guān)。
DNA序列異?？赏ㄟ^(guò)動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交、DNA芯片技術(shù)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它技術(shù)檢測(cè)。據(jù)估計(jì)，蛋白質(zhì)編碼區(qū)僅占人基因組的約3％，并估計(jì)可能有200,000-400,000種共有SNP位于編碼區(qū)。
使用SNP相關(guān)遺傳分析的現(xiàn)有研究設(shè)計(jì)涉及從可進(jìn)行表型表征的許多個(gè)體獲得供遺傳分析的樣本。不幸的是，如此獲得的遺傳相關(guān)性僅限于鑒定與易鑒定表型相關(guān)的特定多態(tài)性，并且不提供疾病深層原因的進(jìn)一步信息。
本發(fā)明的MRPC提供橋接疾病相關(guān)遺傳元件的鑒定和患病個(gè)體中最終表型表達(dá)之間間隙的必要元素。簡(jiǎn)單的說(shuō)，從統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的可獲得表型數(shù)據(jù)的個(gè)體群中分離MRPC[85]。然后培養(yǎng)擴(kuò)張這些MRPC樣品，并將所述細(xì)胞的亞培養(yǎng)物保存為凍存原種，該凍存原種可用于提供供隨后發(fā)育研究的培養(yǎng)物。從細(xì)胞的擴(kuò)張群體，可進(jìn)行多種遺傳分析，以鑒定遺傳多態(tài)性。例如，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的當(dāng)前技術(shù)如DNA芯片技術(shù)[86-90]，在較短時(shí)間內(nèi)在大樣本群體中鑒定單核苷酸多態(tài)性。SNP分析技術(shù)也已經(jīng)由本領(lǐng)域技術(shù)人員描述[91-97]。
當(dāng)某些多態(tài)性與特定疾病表型相關(guān)時(shí)，可用非攜帶者的細(xì)胞作為對(duì)照，來(lái)自鑒定為多態(tài)性攜帶者的個(gè)體的細(xì)胞可用于研究發(fā)育異常。本發(fā)明的MRPC具體提供研究與特定遺傳病表現(xiàn)相關(guān)的發(fā)育異常的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，因?yàn)槭褂么颂幩龅哪承┓椒ê捅绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的某些其它方法，這些細(xì)胞可以被誘導(dǎo)分化形成特定細(xì)胞類型。例如，當(dāng)特定SNP與腎病相關(guān)時(shí)，可使用未分化的MRPC和分化形成腎前體或其它腎源細(xì)胞的MRPC來(lái)表征所述多態(tài)性的細(xì)胞效應(yīng)?？稍诜只^(guò)程中跟蹤表現(xiàn)某些多態(tài)性的細(xì)胞，以鑒定影響藥物靈敏度、對(duì)趨化因子和細(xì)胞因子的應(yīng)答、對(duì)生長(zhǎng)因子、激素和抑制劑的應(yīng)答以及對(duì)受體表達(dá)和/或功能變化的應(yīng)答的遺傳元件。這些信息對(duì)于設(shè)計(jì)針對(duì)遺傳來(lái)源的或有遺傳傾向的疾病的治療方法是無(wú)價(jià)的。
在本發(fā)明使用MRPC鑒定與生理異常相關(guān)的遺傳多態(tài)性的方法中，從統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的可獲得表型數(shù)據(jù)的個(gè)體群中分離MRPC(本領(lǐng)域技術(shù)人員定義統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著群體為足以包括具有至少一種遺傳多態(tài)性的成員的群體大小)，并培養(yǎng)擴(kuò)張以建立MRPC培養(yǎng)物。然后使用來(lái)自所述培養(yǎng)細(xì)胞的DNA鑒定所述群體的培養(yǎng)MRPC之間的遺傳多態(tài)性，并誘導(dǎo)分化所述細(xì)胞。通過(guò)比較具有正常基因型的MRPC表現(xiàn)的分化模式和具有已鑒定遺傳多態(tài)性或具有對(duì)假定藥物應(yīng)答的MRPC表現(xiàn)的分化模式，鑒定并表征與具體遺傳多態(tài)性相關(guān)的異常代謝過(guò)程。
MRPC和疫苗遞送當(dāng)遺傳改變產(chǎn)生抗原性蛋白時(shí)，本發(fā)明的MRPC也可用作抗原提呈細(xì)胞。例如，使用多種已改變的自體或異體祖細(xì)胞，并提供本發(fā)明祖細(xì)胞和質(zhì)粒的組合，所述質(zhì)粒嵌入生物降解基質(zhì)中用于延長(zhǎng)釋放以轉(zhuǎn)染伴隨細(xì)胞，可激發(fā)對(duì)一種或多種抗原的免疫應(yīng)答，通過(guò)依次釋放抗原提呈細(xì)胞潛在性提高免疫應(yīng)答的最終效果。本領(lǐng)域已知在長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)多次給予一些抗原經(jīng)最終抗原激發(fā)后產(chǎn)生更高的免疫應(yīng)答。
異源的分化或未分化MRPC疫苗載體提供通過(guò)外來(lái)細(xì)胞表面標(biāo)志物刺激免疫系統(tǒng)的附加優(yōu)點(diǎn)。疫苗設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示用多種抗原刺激免疫系統(tǒng)能引發(fā)對(duì)疫苗制劑中某些單個(gè)抗原的免疫應(yīng)答升高。
已經(jīng)鑒定例如甲型肝炎、乙型肝炎、水痘(禽痘)、脊髓灰質(zhì)炎、白喉、百日咳、破傷風(fēng)、萊姆病、麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹、乙型流感(Hib)、BCG、日本腦炎、黃熱病和輪狀病毒的免疫有效抗原。
通過(guò)擴(kuò)張克隆群體的多能腎祖細(xì)胞培養(yǎng)，遺傳改變擴(kuò)張細(xì)胞以表達(dá)一種或多種預(yù)選的抗原性分子以誘發(fā)抗傳染性因子的保護(hù)性免疫應(yīng)答，向所述對(duì)象導(dǎo)入誘導(dǎo)免疫應(yīng)答有效量的遺傳改變細(xì)胞，可以實(shí)施用本發(fā)明的MRPC誘導(dǎo)對(duì)象如人對(duì)傳染性因子免疫應(yīng)答的方法。給予遺傳改變細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域已知。有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的遺傳改變細(xì)胞的量是產(chǎn)生期望抗原的充分表達(dá)從而產(chǎn)生可測(cè)量抗體應(yīng)答的細(xì)胞的量，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行測(cè)量。優(yōu)選的，所述抗體應(yīng)答是保護(hù)性抗體應(yīng)答，通過(guò)用適當(dāng)傳染性因子攻擊時(shí)對(duì)疾病的抵抗力來(lái)檢測(cè)所述抗體應(yīng)答。
MRPC和癌癥治療本發(fā)明的MRPC提供癌癥治療的新型載體。例如，當(dāng)局部或全身遞送時(shí)，MRPC可被誘導(dǎo)分化形成歸巢到腎組織的細(xì)胞。通過(guò)遺傳工程化這些細(xì)胞并經(jīng)外部遞送元件刺激而經(jīng)歷凋亡，可以破壞新形成的血管并消除流向腫瘤的血流。外部遞送元件的實(shí)例是抗生素四環(huán)素，其中細(xì)胞已經(jīng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)凋亡的基因如Caspase或BAD，所述基因位于四環(huán)素應(yīng)答元件的控制下。四環(huán)素應(yīng)答元件已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述[98]，提供了內(nèi)皮細(xì)胞中體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)調(diào)控[99]，并且有商業(yè)供應(yīng)(CLONETECHLaboratories，Palo Alto，CA)。
作為替代方案，未分化MRPC或分化形成特定細(xì)胞譜系的MRPC可以被遺傳改變以生成產(chǎn)物，用于輸出到細(xì)胞外環(huán)境，所述產(chǎn)物對(duì)腫瘤細(xì)胞有毒性或破壞血管發(fā)生(如色素上皮來(lái)源的因子(PEDF)[100])。例如，Koivunen，et al.[101]描述了含選擇性抑制MMP-2和MMP-9(與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶)氨基酸序列的環(huán)肽，所述環(huán)肽在動(dòng)物模型中阻止腫瘤生長(zhǎng)和侵入，并在體內(nèi)特異性靶向血管生成性血管。當(dāng)需要將細(xì)胞遞送到腫瘤部位、產(chǎn)生腫瘤抑制性產(chǎn)物、然后被破壞時(shí)，細(xì)胞還可以被遺傳改變以引入位于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的促凋亡蛋白。
MRPC也提供遞送癌癥疫苗的載體，因?yàn)樗鼈兡軓幕颊咧蟹蛛x、活體外培養(yǎng)、活體外遺傳改變以表達(dá)適當(dāng)抗原，尤其是和與增加對(duì)抗原的免疫應(yīng)答相關(guān)的受體組合時(shí)更是如此，并重新導(dǎo)入所述對(duì)象以誘發(fā)對(duì)腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。含MRPC或MRPC分離培養(yǎng)成分的試劑盒本發(fā)明的MRPC可以在試劑盒中與適當(dāng)包裝材料一起提供。例如，MRPC可以凍存原種形式提供，附隨單獨(dú)包裝的前述適當(dāng)因子和培養(yǎng)基，用于未分化狀態(tài)培養(yǎng)。另外，也可提供單獨(dú)包裝的前述的分化誘導(dǎo)因子。
本發(fā)明也可以提供含有效量的用于分離培養(yǎng)患者細(xì)胞的適當(dāng)因子的試劑盒。從患者獲得腎活組織以后，臨床技術(shù)人員僅需要用此處所述方法用試劑盒中提供的刺激因子選擇MRPC，然后用作為試劑盒組分提供的培養(yǎng)基用本發(fā)明所述方法培養(yǎng)細(xì)胞，基本培養(yǎng)基的組成已在前述。
本發(fā)明的一個(gè)方面是制備在臨床條件下從人對(duì)象分離MRPC的試劑盒。使用包裝在一起的試劑盒組分，可以從腎活組織分離MRPC。使用包括分化因子、培養(yǎng)基和用于分離和/或誘導(dǎo)培養(yǎng)物中MRPC分化的說(shuō)明書的其它試劑盒組分，臨床技術(shù)人員可以從患者自身腎組織樣品中產(chǎn)生成群的未分化或分化細(xì)胞。試劑盒中其它的材料可提供遞送多核苷酸的載體，所述多核苷酸編碼細(xì)胞表達(dá)的期望蛋白。這些載體例如可以使用隨試劑盒提供的磷酸鈣轉(zhuǎn)染材料和使用說(shuō)明而導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞?？梢蕴峁⑦z傳改變的MRPC注射回患者的其它材料。
參考以下具體實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例1.分離腎祖細(xì)胞(MRPC)小鼠腎細(xì)胞來(lái)源包括2-4月齡β-半乳糖苷酶基因轉(zhuǎn)基因的C57B1/6ROSA26小鼠。此外，從含由控制eGFP蛋白表達(dá)的Pax-2啟動(dòng)子組成的轉(zhuǎn)基因的FVB小鼠的腎分離細(xì)胞(由Dr.Michael Bendel-Stenzel，U.of Minnesota惠贈(zèng))。大鼠腎來(lái)源包括2-4月齡Fisher大鼠，包括Oct-4β-Geo轉(zhuǎn)基因大鼠，其中所含轉(zhuǎn)基因組合新霉素抗性基因與lacZ報(bào)告基因，所述lacZ報(bào)告基因位于包括近端和遠(yuǎn)端增強(qiáng)子的3.6kb小鼠Oct-4上游序列控制之下(由Dr.Austin Smith，U.of Edinburgh惠贈(zèng))[36]。該策略允許通過(guò)在培養(yǎng)基中包括G418而直接選擇Oct-4表達(dá)細(xì)胞。Oct-4與多能性相關(guān)。
安樂(lè)死以后立即收獲腎，部分消化，然后將細(xì)胞懸液鋪于上述培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含血清低并且缺乏支持已知原代腎細(xì)胞系生長(zhǎng)所需要的生長(zhǎng)因子，但含有已知支持MAPC生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子。保持低細(xì)胞密度以避免細(xì)胞-細(xì)胞接觸。4-6周后多數(shù)細(xì)胞類型死亡，培養(yǎng)物變成單形性紡錘體形細(xì)胞(圖1A-1C)。這些細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為24-36小時(shí)，已經(jīng)培養(yǎng)了90次群體倍增，沒(méi)有衰老跡象。經(jīng)FACS分析，這些細(xì)胞具有正常核型和DNA含量，這使它們與癌性細(xì)胞不同。MRPC表達(dá)Oct-4和波形蛋白，但不表達(dá)細(xì)胞角蛋白或I或II類MHC分子，這與“干細(xì)胞”表型一致。
實(shí)施例2.表面標(biāo)志物的FACS分析MRPC上存在的細(xì)胞表面標(biāo)志物經(jīng)FACS分析。細(xì)胞計(jì)量分析在FACS流式細(xì)胞儀(Beckton Dickinson，San Diego，USA)上進(jìn)行。用7AAD排除死細(xì)胞，基于3層級(jí)門進(jìn)行雙重排除(前/側(cè)分散(FSC/SSC)面積，F(xiàn)SC高度/寬度和SSC高度/寬度)。未染色細(xì)胞和對(duì)應(yīng)的同種型抗體用作陰性對(duì)照。每個(gè)反應(yīng)計(jì)數(shù)5000次事件。所用抗體包括小鼠抗大鼠CD90-PerCP、CD11b-FITC、CD45-PE、CD106-PE、CD44H-FITC、RT1B-生物素、RT1A-生物素、CD31-生物素(全部來(lái)自BecktonDickinson，San Diego，USA)和純化的抗小鼠SSEA-1(MAB4301，來(lái)自Chemicon，Temecula，USA)。小鼠ES細(xì)胞用作SSEA-1的陽(yáng)性對(duì)照，新鮮大鼠骨髓細(xì)胞用于其它標(biāo)志物。細(xì)胞表面標(biāo)志物分析的結(jié)果列于下表1。
表1


如上表1所示，MRPC對(duì)CD90和CD44呈陽(yáng)性，從而與骨髓來(lái)源的MAPC區(qū)分開(kāi)來(lái)。缺少M(fèi)HC I和II類分子進(jìn)一步支持這些細(xì)胞是原始未分化細(xì)胞。
實(shí)施例3.大鼠MRPC的DNA分析和細(xì)胞遺傳學(xué)分析大鼠MRPC培養(yǎng)超過(guò)200次群體倍增，同時(shí)維持其起始表型和外觀。用FACS進(jìn)行的DNA分析確認(rèn)200次群體倍增時(shí)所述MRPC是100％二倍體，沒(méi)有多倍體(圖7)和細(xì)胞遺傳學(xué)異常的跡象。
另外，在90和160次群體倍增時(shí)檢查端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性(圖8)。為檢測(cè)端粒長(zhǎng)度，用標(biāo)準(zhǔn)方法制備細(xì)胞DNA。將2μgDNA用HinfIII和RsaI消化過(guò)夜。所得片段跑0.6％瓊脂糖凝膠并真空印跡到(+)尼龍膜上。然后用地高辛(DIG)標(biāo)記的六聯(lián)體(TTAGGG)過(guò)夜探測(cè)印跡膜。第二天，洗滌之后，將印跡膜與抗DIG-堿性磷酸酶共同孵育30分鐘。然后借助化學(xué)發(fā)光檢測(cè)端粒片段。沒(méi)有觀察到端?？s短。
為研究端粒酶活性，等量細(xì)胞在1×CHAPS緩沖液中于冰上裂解10分鐘。13,0000×g離心10分鐘沉淀碎片。用Bradford方法定量蛋白質(zhì)。將1-2μg蛋白質(zhì)用于端粒重復(fù)擴(kuò)增方案(TRAP)。根據(jù)制造商說(shuō)明實(shí)施由Roche改編的TRAP方案。該方案使用基于ELISA的檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)確定端粒酶活性。酶數(shù)據(jù)顯示端粒酶活性得以維持。所述數(shù)據(jù)也證明從較早到較晚的時(shí)間區(qū)間獲得30.3倍和15.4倍端粒酶活性。這可能是由于從異源群體中選擇干細(xì)胞。
因此，盡管是200次群體倍增，細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，也沒(méi)有細(xì)胞衰老的跡象。另外，所述細(xì)胞保留了分化成腎細(xì)胞以及所有三種生殖細(xì)胞譜系的細(xì)胞的能力。
實(shí)施例4.體外分化腎祖細(xì)胞上述分離的細(xì)胞可以被誘導(dǎo)分化。MRPC與“腎發(fā)生混合物”(nephrogeniccocktail)一起培養(yǎng)，所述腎發(fā)生混合物包含50ng/ml FGF2、4ng/ml TGF-β和20ng/mlLIF。14天后細(xì)胞表型從單個(gè)紡錘體形細(xì)胞變成細(xì)胞聚集體(圖2A和2B)。缺少腎發(fā)生混合物時(shí)沒(méi)有觀察到細(xì)胞形態(tài)變化。除了形態(tài)變化以外，細(xì)胞還表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物，包括細(xì)胞角蛋白和關(guān)閉帶蛋白-1(ZO-1)(圖3A和3B)。Pax-2是只在腎發(fā)育的特定階段表達(dá)的發(fā)育調(diào)節(jié)基因，在成體腎中幾乎沒(méi)有表達(dá)[37]。當(dāng)來(lái)源于Pax-2-eGFP小鼠的MRPC生長(zhǎng)于培養(yǎng)物中時(shí)，沒(méi)有觀察到Pax-2表達(dá)。當(dāng)這些細(xì)胞與腎發(fā)生混合物一道孵育時(shí)，細(xì)胞聚集并表達(dá)與Pax-2表達(dá)一致的eGFP(圖4A-4D)。需要重要說(shuō)明的是，來(lái)源于成體骨髓的MAPC對(duì)腎發(fā)生性生長(zhǎng)因子應(yīng)答時(shí)不改變形態(tài)，也不表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物，因此MAPC和MRPC不可能是相同的細(xì)胞。
大鼠MRPC表達(dá)Oct-4，它是一種多能性標(biāo)志物。為確定大鼠MRPC是否能分化成其它細(xì)胞譜系，MRPC在促進(jìn)分化成所有三種生殖層細(xì)胞的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，所述三種生殖層即中胚層(內(nèi)皮細(xì)胞)、外胚層(神經(jīng)元)和內(nèi)胚層(肝)(圖5)。通過(guò)使MRPC生長(zhǎng)于含10ng/ml血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的纖連蛋白(FN)包被孔中，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮(中胚層)分化。通過(guò)使MRPC生長(zhǎng)于含100ng/ml bFGF但缺少PDGF-BB和EGF的FN包被孔中，可以誘導(dǎo)神經(jīng)元(外胚層)分化。通過(guò)使MRPC生長(zhǎng)于含10ng/ml FGF-4和20ng/ml肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的MatrigelTM上，可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞(內(nèi)胚層)分化。因此，本發(fā)明人已經(jīng)分離并表征了來(lái)自成體腎的多能祖細(xì)胞。這些細(xì)胞是急性腎衰后再生細(xì)胞的來(lái)源。
實(shí)施例5.大鼠MRPC的轉(zhuǎn)染和體外分化大鼠MRPC用MSCV-eGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染，通過(guò)FACS選擇表達(dá)高水平GFP表達(dá)的細(xì)胞。這些細(xì)胞被稱為eMRCP。如圖9所示，eGFP容易借助直接熒光和抗GFP抗體檢測(cè)。用處處所述選擇培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染eGFP的細(xì)胞也能分化成其它細(xì)胞類型。例如，圖9表示分化成內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的eMRPC的形態(tài)。因此，MRPC可以被有效轉(zhuǎn)染并在轉(zhuǎn)染后仍維持分化成不同細(xì)胞譜系的能力。
實(shí)施例6.腎祖細(xì)胞的體內(nèi)定位收獲來(lái)自O(shè)ct-4β-Geo轉(zhuǎn)基因大鼠的腎，并通過(guò)免疫組化和原位β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)確定成體腎中是否存在表達(dá)Oct-4的細(xì)胞。因?yàn)镺ct-4是多能干細(xì)胞的標(biāo)志物，在腎中發(fā)現(xiàn)表達(dá)Oct-4的細(xì)胞將提供支持MRPC存在于腎中的細(xì)胞分離研究的證據(jù)。在該轉(zhuǎn)基因大鼠中，Oct-4基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件驅(qū)動(dòng)lacZ報(bào)告基因的表達(dá)。用Invitrogen提供的β-gal染色試劑盒在pH7.4染色組織切片的β-半乳糖苷酶活性。間隙中的細(xì)胞染成藍(lán)色，這指示β-半乳糖苷酶活性(圖6A)。用HRP標(biāo)記的、以DAB顯色的抗β-半乳糖苷酶抗體進(jìn)行免疫組化，觀察到相似定位(圖6B)。來(lái)自非轉(zhuǎn)基因大鼠的對(duì)照腎是陰性。
因此，分離表現(xiàn)為腎干細(xì)胞的獨(dú)特腎細(xì)胞(MRPC)。MRPC具有與骨髓來(lái)源MAPC相似的形態(tài)特征和標(biāo)志物，但如上述，對(duì)腎發(fā)生性生長(zhǎng)因子有不同反應(yīng)。這些細(xì)胞可被誘導(dǎo)成上皮細(xì)胞表型和所有三種生殖細(xì)胞層的細(xì)胞。
實(shí)施例7.未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)MRPC的基因表達(dá)模式進(jìn)行另外的研究以表征小鼠和大鼠MRPC，集中于未分化和分化條件下細(xì)胞的基因表達(dá)模式，以及MRPC和骨髓來(lái)源MAPC的基因表達(dá)模式。這些研究的主要目的是確定未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)MRPC中表達(dá)什么基因，以進(jìn)一步表征所述細(xì)胞并將它們與其它干細(xì)胞尤其是MAPC進(jìn)行比較。
對(duì)未分化條件下和用“腎發(fā)生性混合物”誘導(dǎo)7天后的分離大鼠和小鼠MRPC進(jìn)行微陣列基因分析，所述腎發(fā)生性混合物中含F(xiàn)GF2(50ng/ml)、TGF-β(0.67ng/ml)和LIF(20ng/ml)。這種因子組合已證明可引起后腎間充質(zhì)中的腎小管發(fā)生[38-43]。如上所述，這種因子組合誘導(dǎo)MRPC的表型變化，包括凝縮、細(xì)胞角蛋白和ZO-1表達(dá)以及Pax-2的表達(dá)。從三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中從未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)小鼠與大鼠MRPC分離RNA，并在Affymetrix Mouse U74Av2 GeneChip上進(jìn)行表達(dá)分析，或?qū)τ诖笫蠹?xì)胞在Affymetrix GeneChip Rat Expression Set 230上進(jìn)行表達(dá)分析。通過(guò)用Agilent Bioanalyzer 2100 LabOnChip系統(tǒng)測(cè)定28S∶18S比值＞2.0評(píng)價(jià)RNA樣品質(zhì)量。用Affymetrix方法制備用于微陣列分析的探針。對(duì)陣列進(jìn)行整體信號(hào)強(qiáng)度、背景信號(hào)、內(nèi)標(biāo)性能和缺少表面缺陷方面的評(píng)分。用Affymetrix MieroArraySuite 5.0用靶強(qiáng)度為1500的All Probe Sets評(píng)分表分析所得芯片圖像。在Silicon Genetics的GeneSpring v4.2.1中分析數(shù)據(jù)。
實(shí)施例8.MRPC分化為成體腎不同細(xì)胞譜系所需的因子還進(jìn)行了確定誘導(dǎo)MRPC的細(xì)胞譜系變化所需要的必要因子是什么的研究。本發(fā)明人已經(jīng)證明FGF-2、TGF-β和LIF的組合導(dǎo)致上皮細(xì)胞表型。按不同順序和濃度測(cè)試了不同候選分子誘導(dǎo)MRPC表型變化的能力，主要關(guān)注因子誘導(dǎo)腎小管發(fā)生或特定腎小管細(xì)胞形成的能力。
大鼠和小鼠MRPC與不同候選分子如FGF-2、TGF-β和LIF、HGF、Wnt-4、TIMP-2共同孵育；或與大鼠輸尿管芽細(xì)胞系(RUB-1)處理的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)，已經(jīng)證明這種培養(yǎng)基誘導(dǎo)腎的后腎間充質(zhì)中形成腎單位[40]；或與RUB-1細(xì)胞、后腎間充質(zhì)細(xì)胞或表達(dá)不同wnt蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果表現(xiàn)為形態(tài)變化和特異性腎小管細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。在不同時(shí)間加入不同的候選分子以優(yōu)化分化結(jié)果。例如，可以在加入其它生長(zhǎng)因子后0或24h、48h或72h加入TGF-β?！胺只旌衔铩钡钠渌煞挚梢宰兓鏗GF、EGF和TGF-α的誘導(dǎo)腎小管發(fā)生的組合。另外，細(xì)胞外基質(zhì)可以變化，包括將細(xì)胞培養(yǎng)在纖連蛋白、IV型膠原、matrigel或I型膠原上，以誘導(dǎo)腎小管發(fā)生或其它期望的分化。另外，可以使用條件培養(yǎng)基，如泌尿芽細(xì)胞系RUB1條件處理的培養(yǎng)基，其已經(jīng)證明可以誘導(dǎo)后腎間充質(zhì)中形成腎小管[40]。
實(shí)施例9.MRPC存在于成體腎中并能在急性腎衰后分化成不同細(xì)胞譜系如上所述，本發(fā)明人已經(jīng)證明他們能從成體小鼠和大鼠腎分離MRPC。在Oct-4β-Geo轉(zhuǎn)基因大鼠中，在間隙中檢測(cè)到表現(xiàn)出β-半乳糖苷酶免疫活性和酶活性的細(xì)胞，表明這些細(xì)胞表達(dá)Oct-4并且它們是成體腎中存在的多能祖細(xì)胞。這些細(xì)胞負(fù)責(zé)ATN后受破壞腎小管的再生。
以下研究在未損傷小鼠和大鼠腎中進(jìn)行。對(duì)于大鼠研究，通過(guò)幾種方法檢查來(lái)源于Oct-4β-Geo轉(zhuǎn)基因大鼠的腎的冷凍切片中的Oct-4表達(dá)。因?yàn)镺ct-4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)β-半乳糖苷酶報(bào)告基因表達(dá)，用FITC或德克薩斯紅標(biāo)記的兔抗β-半乳糖苷酶多克隆抗體(Rockland)檢查相同或連續(xù)切片中的β-半乳糖苷酶免疫活性；用Invitrogen的β-gal染色試劑盒在pH7.4檢查β-半乳糖苷酶活性。此外，根據(jù)制造商方法(GeneDetect，Aukland，New Zealand)，用GreenStarTM FITC標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行β-半乳糖苷酶mRNA的原位雜交。用抗Oct-4抗體(Active Motif)進(jìn)行免疫組化，作為Oct-4表達(dá)的另外證據(jù)。最后，用地高辛標(biāo)記的反義核糖核酸探針進(jìn)行原位雜交，所述探針以小鼠cDNA序列為模板合成。具體的說(shuō)，用對(duì)應(yīng)GenBank登錄號(hào)X52437的951-489位核苷酸的Stu1片段使用Buehr等人所述的方案[36]。檢查來(lái)源于Oct4ΔPEGFP小鼠的小鼠腎中表達(dá)Oct-4的細(xì)胞，其中綠色熒光蛋白在截短型Oct-4啟動(dòng)子控制下表達(dá)[44]。經(jīng)熒光顯微鏡(450nm)和使用抗eGFP抗體(Rockland)的免疫組化檢測(cè)GFP表達(dá)。確認(rèn)性研究包括如上述對(duì)Oct-4的免疫組化和原位雜交。
然后在誘導(dǎo)急性腎衰后檢測(cè)Oct4ΔPEGFP小鼠中Oct-4的表達(dá)。研究?jī)煞N模型。1)缺血/再灌注，其中夾住兩根腎動(dòng)脈維持30分鐘，然后在6、18、24和48小時(shí)后收獲腎(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n＝3)。對(duì)照是偽手術(shù)小鼠。2)第二種模型是腹膜內(nèi)注射葉酸(125mg/kg)誘導(dǎo)的葉酸腎病，在6、18、24和48小時(shí)后收獲腎(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n＝3)。對(duì)照是注射NaHCO3賦形劑的小鼠。用上述技術(shù)確認(rèn)Oct-4表達(dá)是否上調(diào)。此外，通過(guò)檢測(cè)eGFP表達(dá)跟蹤來(lái)源于表達(dá)Oct-4細(xì)胞的細(xì)胞譜系，因?yàn)閑GFP在來(lái)源于表達(dá)Oct-4細(xì)胞的后代細(xì)胞中表達(dá)并在細(xì)胞中持續(xù)幾周。為確定來(lái)源于Oct-4細(xì)胞的腎單位節(jié)段，使用下表2所述的一系列腎小管細(xì)胞標(biāo)志物。在所有研究中通過(guò)測(cè)量一系列血清肌酸酐水平確認(rèn)急性腎衰。
表2

表達(dá)Oct-4的細(xì)胞在成體腎中發(fā)現(xiàn)，表明成體腎中存在多能祖細(xì)胞。在急性腎衰之后出現(xiàn)這些細(xì)胞的上調(diào)，并且來(lái)源于表達(dá)Oct-4細(xì)胞(MRPC)的細(xì)胞產(chǎn)生不同的腎小管細(xì)胞譜系，這是受損傷腎再生應(yīng)答的一部分。
實(shí)施例10.囊下注射后大鼠MRPC的體內(nèi)分化在兩種不同模型中將eMRPC(轉(zhuǎn)染MSCV-eGFP的MRPC)注射入Fisher大鼠。第一個(gè)模型中，eMRPC注射到腎囊下。三周后，收獲腎并用共聚焦顯微鏡檢測(cè)。如圖10A所示，在注射部位的囊下形成GFP陽(yáng)性的細(xì)胞結(jié)節(jié)，還包括囊樣結(jié)構(gòu)。此外，圖10B證明一些GFP陽(yáng)性細(xì)胞被摻入腎小管中。因此，腎囊下注射后MRPC摻入腎小管中，這提示這些細(xì)胞遷移到更遠(yuǎn)位點(diǎn)并參與腎小管細(xì)胞的正常更替。
實(shí)施例11.注射的MRPC參與急性腎衰后的腎修復(fù)這些研究表明急性腎衰后注射MRPC導(dǎo)致這些細(xì)胞歸巢到腎，還表明這些細(xì)胞參與腎修復(fù)應(yīng)答。本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室和其它實(shí)驗(yàn)室的研究已經(jīng)證明腎外細(xì)胞有助于ATN后的腎小管再生。研究?jī)蓚€(gè)已建立的ATN模型(缺血/再灌注和葉酸腎病)以獲得關(guān)于損傷特異性應(yīng)答的信息。使用鑒定注射細(xì)胞的多種方法來(lái)減少假陽(yáng)性結(jié)果。
通過(guò)腹膜內(nèi)注射葉酸(125mg/kg)或通過(guò)雙側(cè)腎動(dòng)脈夾持30分鐘誘導(dǎo)ATN。如下注射干細(xì)胞。連續(xù)測(cè)量血清肌酸酐以確認(rèn)ATN。損傷后6、24和48小時(shí)對(duì)大鼠進(jìn)行安樂(lè)死，收獲腎并檢測(cè)MRPC和從其來(lái)源的細(xì)胞譜系的存在。在雌性Fisher大鼠中誘導(dǎo)ATN以避免與注射細(xì)胞相關(guān)的組織相容性問(wèn)題。選擇雌性大鼠是因?yàn)槿菀阻b定注射的Y染色體陽(yáng)性的MRPC。
如上述分離來(lái)源于雄性O(shè)ct-4β-Geo轉(zhuǎn)基因大鼠的MRPC，并經(jīng)尾靜脈注射或直接注射到腎動(dòng)脈。接受尾靜脈注射的大鼠中，在誘導(dǎo)ATN后6小時(shí)或誘導(dǎo)ATN后6、24和48小時(shí)給予106細(xì)胞。對(duì)于腎動(dòng)脈注射，損傷后6小時(shí)給予106細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)目基于初步劑量-效應(yīng)曲線。
用幾種方法鑒定再生腎中的MRPC，包括Y染色體FISH、β-半乳糖苷酶基因FISH以及β-半乳糖苷酶和新霉素基因的定量PCR。泛細(xì)胞角蛋白免疫組化染色鑒定上皮細(xì)胞，同時(shí)用上述標(biāo)志物檢測(cè)特異性腎小管節(jié)段。
MRPC標(biāo)志物在再生腎小管中的存在表明MRPC在再生腎中重新形成群體。
實(shí)施例12.大鼠MRPC在腎缺血/再灌注后的體內(nèi)分化Fisher大鼠接受雙側(cè)腎動(dòng)脈夾持誘導(dǎo)缺血40分鐘。40分鐘結(jié)束時(shí)，松開(kāi)夾子，向腎上大動(dòng)脈注射1×106eMRPC(轉(zhuǎn)染MSCV-eGFP的MRPC)，暫時(shí)夾住遠(yuǎn)端大動(dòng)脈以確保將細(xì)胞遞送到腎。缺血后10天收獲腎并用共聚焦顯微鏡檢測(cè)。通過(guò)測(cè)量血清肌酸酐確認(rèn)腎損傷和恢復(fù)。如圖11A和B所示，一些GFP陽(yáng)性細(xì)胞(MRPC)作為細(xì)胞管型被發(fā)現(xiàn)，而一些細(xì)胞駐留在腎小球。注射MRPC摻入腎小管的證據(jù)在腎的很多區(qū)域可見(jiàn)，實(shí)例表示于圖11C-F。在一些區(qū)域，腎小管的所有細(xì)胞都是GFP陽(yáng)性，而在另一些區(qū)域僅一些細(xì)胞呈陽(yáng)性。
這些細(xì)胞對(duì)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)染色陽(yáng)性(圖12)。所述細(xì)胞也染上緊密連接蛋白關(guān)閉帶蛋白-1(ZO-1)，這是分化的標(biāo)志物(圖13)。間隙中染成綠色的細(xì)胞呈波形蛋白陽(yáng)性，所述波形蛋白是一種間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(圖14)。摻入腎小管后所述MRPC喪失波形蛋白表達(dá)，這提供上皮細(xì)胞分化的證據(jù)(圖14)。摻入后的細(xì)胞染上近端腎小管標(biāo)志物PHE-A(圖15)，有些情況下也染上遠(yuǎn)端腎小管標(biāo)志物凝集素(PNA)(圖16)和THP(圖17)，這提供注射細(xì)胞進(jìn)一步分化的證據(jù)。
因此，缺血/再灌注以后，發(fā)生了MRPC的廣泛摻入和分化，證明MRPC能參與腎損傷后的再生應(yīng)答。這對(duì)MRPC在腎病細(xì)胞治療方面的應(yīng)用提供支持。
實(shí)施例13.腎來(lái)源干細(xì)胞在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用腎來(lái)源的干細(xì)胞用于篩選具有促進(jìn)損傷腎再生能力的藥劑。認(rèn)為腎來(lái)源的干細(xì)胞存在于腎中并且在損傷時(shí)或需要細(xì)胞更替時(shí)被動(dòng)員。然后這些未分化的干細(xì)胞分化成腎的不同細(xì)胞譜系。這些干細(xì)胞分化成腎小管細(xì)胞的能力可用于藥物發(fā)現(xiàn)。這種快速藥物發(fā)現(xiàn)的模型示于圖18。
在此模型中，用不同基因的啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)染MRPC，選擇的基因在腎單位形成過(guò)程中依序激活。每種啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)不同顏色報(bào)告基因的表達(dá)，包括GFP(綠色)、YFP(黃色)和RFP(紅色)。以適當(dāng)密度將細(xì)胞鋪于96孔板上。單獨(dú)、組合或依次向細(xì)胞中加入不同藥劑，并培養(yǎng)細(xì)胞約3小時(shí)-約24小時(shí)的不同時(shí)間段。如果所述藥劑激活啟動(dòng)子，則對(duì)應(yīng)基因的顏色將被誘導(dǎo)并用熒光微板閱讀儀檢測(cè)到。該系統(tǒng)允許利用MRPC能分化成腎小管的能力高通量篩選多種藥劑。也可以使用逆向策略，其從分化的腎小管細(xì)胞開(kāi)始，并檢測(cè)這些細(xì)胞脫分化成更原始細(xì)胞的能力。
因此，這種篩選工具的應(yīng)用將導(dǎo)致鑒定能動(dòng)員或促進(jìn)駐留于腎中干細(xì)胞分化的藥物化合物，或鑒定促進(jìn)成熟細(xì)胞脫分化的藥物化合物，然后這些脫分化細(xì)胞繼續(xù)增殖并再分化成多種腎小管細(xì)胞。
參考各種具體和優(yōu)選的實(shí)施方案和技術(shù)描述了本發(fā)明。然而，應(yīng)該明白，可以進(jìn)行很多變化和修改，而仍保持它們位于本發(fā)明范圍內(nèi)。所有引用的出版物、專利和專利文獻(xiàn)都通過(guò)引用并入此處，就象通過(guò)引用獨(dú)自并入一樣。
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1.分離或純化的哺乳動(dòng)物多能腎祖細(xì)胞(MRPC)，所述細(xì)胞對(duì)波形蛋白和Oct-4呈抗原陽(yáng)性，對(duì)關(guān)閉帶、細(xì)胞角蛋白和主要組織相容性I與Il類分子呈抗原陰性。
2.權(quán)利要求1的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞對(duì)CD90和CD44呈抗原陽(yáng)性。
3.權(quán)利要求1或2的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞對(duì)SSEA-1、NCAM、CD11b、CD45、CD31和CD106呈抗原陰性。
4.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的分離或純化的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是非胚胎的、非生殖細(xì)胞系的細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞有能力被誘導(dǎo)分化形成中胚層、外胚層和內(nèi)胚層起源的至少一種分化細(xì)胞類型。
6.權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞有能力被誘導(dǎo)分化形成至少腎、內(nèi)皮、神經(jīng)元或肝細(xì)胞類型的細(xì)胞。
7.權(quán)利要求5或6的分離的細(xì)胞，其中分化在體內(nèi)或活體外誘導(dǎo)。
8.權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是小鼠細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是大鼠細(xì)胞。
11.權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞來(lái)自胎兒、新生兒、兒童或成體。
12.權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞來(lái)自新生兒、兒童或成體。
13.權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞表達(dá)高水平端粒酶并在體外繼續(xù)培養(yǎng)以后維持長(zhǎng)端粒。
14.權(quán)利要求13的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在體外繼續(xù)培養(yǎng)以后維持長(zhǎng)約23Kb的端粒。
15.包含成群的權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)的MRPC和培養(yǎng)基的組合物，其中所述MRPC在所述培養(yǎng)基中擴(kuò)張。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述培養(yǎng)基包含血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因了(PDGF-BB)、表皮生長(zhǎng)因了(EGF)和白血病抑制因了(子IF)。
17.權(quán)利要求15或16的組合物，其中所述MRPC能分化形成中胚層、外胚層和內(nèi)胚層起源的至少一種分化細(xì)胞類型。
18.從權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)的分離MRPC獲得的分化后代細(xì)胞，其中所述后代細(xì)胞是腎、內(nèi)皮、神經(jīng)元或肝細(xì)胞。
19.權(quán)利要求18的分化的后代細(xì)胞，其中所述腎細(xì)胞是腎小管細(xì)胞。
20.包含權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)的分離MRPC的分離或純化的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物多能腎祖細(xì)胞(MRPC)，其中通過(guò)插入預(yù)選的分離DNA、通過(guò)用預(yù)選的分離DNA替換所述細(xì)胞基因組的節(jié)段、或通過(guò)刪除或滅活所述細(xì)胞基因組的至少一部分而改變所述細(xì)胞的基因組。
21.權(quán)利要求20的分離的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中所述基因組通過(guò)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)而被改變。
22.權(quán)利要求20的分離的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中所述基因組通過(guò)病毒載體整合插入DNA而被改變。
23.權(quán)利要求21或22的分離的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中所述基因組通過(guò)使用DNA病毒、RNA病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體而被改變。
24.權(quán)利要求20的分離的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中使用序列與待滅活細(xì)胞基因組的所述部分的序列互補(bǔ)的反義核酸分了滅活細(xì)胞基因組的所述部分。
25.權(quán)利要求20的分離的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中使用針對(duì)待滅活細(xì)胞基因組的所述部分的序列的核酶序列滅活細(xì)胞基因組的所述部分。
26.權(quán)利要求20的分離的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中使用針對(duì)待滅活細(xì)胞基因組的所述部分的序列的siRNA序列滅活細(xì)胞基因組的所述部分。
27.權(quán)利要求20-26中任意一項(xiàng)的分離的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中所述改變的基因組含有編碼選擇或篩選標(biāo)志物的基因序列，所述標(biāo)志物的表達(dá)使得具有改變基因組的祖細(xì)胞或其后代能與具有未改變基因組的祖細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。
28.權(quán)利要求27的分離的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中所述標(biāo)志物是綠色、紅色或黃色熒光蛋白、β-半乳糖苷酶、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT)、二氫葉酸還原酶(DHFRm)或潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)。
29.權(quán)利要求20-28中任意一項(xiàng)的分離的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中所述細(xì)胞表達(dá)能被誘導(dǎo)型啟動(dòng)了或調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、酶或其它細(xì)胞產(chǎn)物表達(dá)的其它控制機(jī)制調(diào)節(jié)的基因。
30.分離多能腎祖細(xì)胞(MRPC)的方法，包括(a)在水性培養(yǎng)基中培養(yǎng)腎細(xì)胞約四周，所述培養(yǎng)基基本由DMEM-LG、MCDB-201、胰島素—轉(zhuǎn)鐵蛋白—硒(ITS)、地塞米松、抗壞血酸2-磷酸、青霉素、鏈霉素和胎牛血清(FCS)以及血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因了(PDGF-BB)、表皮生長(zhǎng)因了(EGF)與白血病抑制因了(LIF)組成。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)約4-6周。
32.權(quán)利要求30或31的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)在纖連蛋白上。
33.權(quán)利要求30-32中任意一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞維持于約2-5×102細(xì)胞/cm2的濃度。
34.由權(quán)利要求30-33中任意一項(xiàng)的方法分離的腎細(xì)胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求30-33中任意一項(xiàng)的方法分離的哺乳動(dòng)物多能腎祖細(xì)胞的培養(yǎng)的克隆群體。
36.活體外分化MRPC的方法，包括在預(yù)選分化因了存在下培養(yǎng)通過(guò)權(quán)利要求30-33中任意一項(xiàng)的方法獲得的細(xì)胞。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述分化因了選自FGF2、TGF-β、LIF、VEGF、bFGF、FGF-4、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因了或其組合。
38.由權(quán)利要求36或37的方法獲得的分化細(xì)胞。
39.權(quán)利要求38的分化細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是外胚層、中胚層或內(nèi)胚層細(xì)胞。
40.權(quán)利要求38的分化細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是腎、內(nèi)皮、神經(jīng)元或肝細(xì)胞類型的。
41.權(quán)利要求40的分化細(xì)胞，其中所述腎細(xì)胞是腎小管細(xì)胞。
42.體內(nèi)分化MRPC的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求30-33中任意一項(xiàng)的方法分離MRPC，體外擴(kuò)張所述細(xì)胞并將所擴(kuò)張細(xì)胞給予對(duì)象，其中所述細(xì)胞被移植并體內(nèi)分化成組織特異性細(xì)胞，從而使由于損傷或疾病而有缺陷的細(xì)胞或器官的功能第一次被提高、重構(gòu)或提供。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述組織特異性細(xì)胞是腎、內(nèi)皮、神經(jīng)元或肝細(xì)胞類型的。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述組織特異性細(xì)胞是腎細(xì)胞類型的。
45.由權(quán)利要求42-44中任意一項(xiàng)的方法獲得的分化細(xì)胞。
46.治療方法，包括向需要治療的對(duì)象給予治療有效量的權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)的細(xì)胞或其后代。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述后代能進(jìn)一步分化。
48.權(quán)利要求46的方法，其中所述后代是終末分化的。
49.權(quán)利要求46的方法，其中所述MRPC或其后代歸巢到所述對(duì)象的一種或多種器官并被移植到其中或其上，從而使由于損傷或疾病而缺陷的所述器官的功能第一次被提高、重構(gòu)或提供。
50.使用權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)的分離細(xì)胞的方法，包括宮內(nèi)移植成群的所述細(xì)胞以形成細(xì)胞或組織的嵌合體，從而在移植后的出生前或出生后人或動(dòng)物中產(chǎn)生人細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在所述人或動(dòng)物中產(chǎn)生治療產(chǎn)物以治療遺傳缺陷。
51.使用權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)的分離細(xì)胞對(duì)需要治療處理的對(duì)象進(jìn)行基因治療的方法，包括(a)通過(guò)將編碼期望基因產(chǎn)物的分離的預(yù)選DNA導(dǎo)入所述細(xì)胞中從而遺傳改變所述細(xì)胞，(b)培養(yǎng)擴(kuò)張所述細(xì)胞；和(c)將所述細(xì)胞給予所述對(duì)象以產(chǎn)生期望基因產(chǎn)物。
52.修復(fù)需要這種修復(fù)的對(duì)象中的損壞組織的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)擴(kuò)張權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)的分離MRPC；和(b)將有效量的所述擴(kuò)張細(xì)胞給予所述具有損壞組織的對(duì)象。
53.權(quán)利要求51或52的方法，其中在給予外源分了后內(nèi)源性MRPC被刺激增殖并分化成腎的不同細(xì)胞譜系。
54.修復(fù)需要這種修復(fù)的對(duì)象中的損壞組織的方法，包括將外源分了給予對(duì)象使得內(nèi)源性MRPC被刺激增值并分化成腎的不同細(xì)胞譜系。
55.在對(duì)象中誘導(dǎo)對(duì)傳染性因了的免疫應(yīng)答的方法，包括(a)提供遺傳改變的、培養(yǎng)擴(kuò)張的權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)的多能腎祖細(xì)胞的克隆群體以表達(dá)一種或多種預(yù)選抗原性分了，所述抗原性分了引起抗傳染性因了的保護(hù)性免疫應(yīng)答，和(b)向所述對(duì)象給予有效誘導(dǎo)所述免疫應(yīng)答的量的所述遺傳改變的細(xì)胞。
56.使用MRPC鑒定與生理異常相關(guān)的遺傳多態(tài)性的方法，包括(a)從統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的、可獲得表型數(shù)據(jù)的個(gè)體群中分離MRPC，(b)培養(yǎng)擴(kuò)張來(lái)自所述統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的個(gè)體群的MRPC以建立MRPC培養(yǎng)物，(c)在培養(yǎng)的MRPC中鑒定至少一種遺傳多態(tài)性，(d)誘導(dǎo)所述培養(yǎng)的MRPC分化，和(e)通過(guò)比較具有正?；蛐偷腗RPC表現(xiàn)的分化模式與具有鑒定的遺傳多態(tài)性的MRPC表現(xiàn)的分化模式，表征與所述至少一種遺傳多態(tài)性相關(guān)的異常代謝過(guò)程。
57.治療對(duì)象中癌癥的方法，包括(a)提供表達(dá)殺腫瘤蛋白、抗血管生成蛋白或與刺激抗原免疫應(yīng)答相關(guān)蛋白一起在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白的、遺傳改變的權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)的多能腎祖細(xì)胞，和(b)向?qū)ο蠼o予有效抗癌量的所述遺傳改變的多能成體干細(xì)胞。
58.使用MRPC表征對(duì)生物或藥理因了的細(xì)胞應(yīng)答的方法，包括(a)培養(yǎng)擴(kuò)張從統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的個(gè)體群分離的MRPC以建立多種MRPC培養(yǎng)物，(b)使所述MRPC培養(yǎng)物與一種或多種生物或藥理因子接觸，(c)鑒定對(duì)所述一種或多種生物或藥理因子的一種或多種細(xì)胞應(yīng)答，和(d)比較來(lái)自所述統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著群體中個(gè)體的MRPC培養(yǎng)物的所述一種或多種細(xì)胞應(yīng)答。
59.生物人工腎裝置，其包含權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)的分離MRPC或從其分化的細(xì)胞和裝置。
60.從對(duì)象血液中除去毒素的方法，包括使血液在活體外與權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)的分離的MRPC或從其分化的細(xì)胞接觸，其中所述細(xì)胞內(nèi)襯于中空纖維基裝置。
61.權(quán)利要求42或49的方法，其中所述損傷是腎損傷。
62.權(quán)利要求42、45、51-52、55和57中任意一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的基質(zhì)一起給予。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述基質(zhì)是可生物降解的。
64.權(quán)利要求62或63的方法，其中所述基質(zhì)植入物提供另外的遺傳物質(zhì)、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子或促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的其它因子。
65.權(quán)利要求42、45、51-52、55、57和64-66中任意一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞在給予之前被膠囊化。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述膠囊化的細(xì)胞包含于聚合物膠囊中。
67.權(quán)利要求42、45、51-52、55、57和64-68中任意一項(xiàng)的方法，其中所述給予是經(jīng)過(guò)局部注射、全身注射、口服給予或?qū)m內(nèi)注射給胚胎。
68.權(quán)利要求42、46、51-52、54-55、57和62中任意一項(xiàng)的方法，其中所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
70.鑒定促進(jìn)腎細(xì)胞譜系進(jìn)程的藥物因子的方法，包括以下步驟(a)用在腎單位形成過(guò)程中被活化的基因的啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)染權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)的MRPC，其中所述啟動(dòng)子區(qū)可操作的連接到受體基因；(b)使(a)中的轉(zhuǎn)染細(xì)胞與藥物因子接觸；和(c)檢測(cè)表達(dá)的、由所述標(biāo)志物基因編碼的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的檢測(cè)鑒定藥物因子是否能促進(jìn)腎細(xì)胞譜系進(jìn)程。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所述受體基因編碼綠色、紅色或黃色熒光蛋白、β-半乳糖苷酶、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT)、二氫葉酸還原酶(DHFRm)或潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)。
全文摘要
本發(fā)明大體涉及分離和培養(yǎng)腎干細(xì)胞的方法、由所述方法分離的細(xì)胞及所述細(xì)胞的治療用途。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1845987SQ200480024990
公開(kāi)日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2004年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月29日
發(fā)明者馬克·E·羅森堡, 桑迪普·古普塔 申請(qǐng)人:明尼蘇達(dá)大學(xué)董事會(huì)