專利名稱：用于肝再生和預(yù)防肝衰竭的hip/pap多肽組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類肝癌-腸-胰腺/胰相關(guān)蛋白質(zhì)(HIP/PAP)用于刺激肝再生和預(yù)防肝衰竭的用途。
領(lǐng)域背景肝衰竭發(fā)生于大量急性和慢性臨床疾病，包括藥物引起的肝毒性、病毒感染、血管損傷、自身免疫病或鈍傷。另外，患有先天性代謝缺陷的患者也有發(fā)展成肝衰竭的危險(xiǎn)。作為這些臨床疾病的結(jié)果而發(fā)生的肝衰竭癥狀包括例如爆發(fā)性急性肝炎、慢性肝炎或肝硬化，并且在許多情況下，正常肝功能的恢復(fù)對(duì)于患者存活是至關(guān)重要的。例如，在年齡在25-44之間的人群中，肝硬化是第七位死亡原因并且是第四位的與死亡原因相關(guān)的疾病(來(lái)源美國(guó)肝臟基金會(huì)(American Liver Foundation))。
在急性肝疾病中，肝臟在受到損傷后能夠再生。如果疾病進(jìn)展超過(guò)了肝臟再生新細(xì)胞的能力，則機(jī)體整個(gè)新陳代謝將受到嚴(yán)重影響。肝功能損失可能導(dǎo)致與基本機(jī)體功能(即能量供應(yīng)、酸堿平衡和體溫調(diào)節(jié))結(jié)合在一起的代謝不穩(wěn)定性。如果不迅速逆轉(zhuǎn)這種情況，將發(fā)生諸如不受控制出血和膿毒病的并發(fā)癥，并且由于毒性副產(chǎn)物或者因?yàn)楦尾辉俸铣芍匾臓I(yíng)養(yǎng)物，依賴器官如腦和腎將停止行使功能。大量肝細(xì)胞損傷之后，肝組織失去其再生和代謝功能，并且肝移植成為通常使用的治療策略。然而，肝移植的臨床應(yīng)用受到人肝細(xì)胞、肝組織的可得性和能夠在同時(shí)安全移植的肝細(xì)胞的數(shù)量的限制。而且，手術(shù)前和手術(shù)后并發(fā)癥的潛伏期對(duì)于抵抗肝衰竭急性期可能是關(guān)鍵的。另一個(gè)治療策略在于肝切除(去除部分肝)。肝切除的最典型適應(yīng)癥是惡性腫瘤、肝細(xì)胞癌或者包括膽管癌的增生性膽疾病。腫瘤可以是原發(fā)性的(發(fā)生于肝)或者轉(zhuǎn)移的(發(fā)生于其它器官，然后轉(zhuǎn)移至肝)。大多數(shù)肝轉(zhuǎn)移來(lái)自于結(jié)腸。單一腫瘤或者限于肝左側(cè)或右側(cè)的一個(gè)以上腫瘤能夠被成功切除，且5年存活率高達(dá)60％。對(duì)患有肝外疾病的患者進(jìn)行肝切除可以緩解由腫瘤引起的癥狀，但在存活方面改善很小。肝良性腫瘤(腺瘤和局灶性結(jié)節(jié)性增生)也能夠通過(guò)適當(dāng)肝切除得到成功處理。也可以對(duì)愿意捐贈(zèng)其部分肝的人進(jìn)行肝切除。
考慮到肝移植和肝切除的重要性，已經(jīng)提出了幾種策略以便在肝切除或肝移植情況下刺激肝再生并抑制或限制肝衰竭。
相信可以通過(guò)自分泌和旁分泌來(lái)源的各種生長(zhǎng)刺激和生長(zhǎng)抑制細(xì)胞因子控制肝細(xì)胞，然而，這些生長(zhǎng)因子的確切作用和作用機(jī)制還遠(yuǎn)沒(méi)有全部理解。細(xì)胞因子是分泌的肽或蛋白質(zhì)，它們調(diào)節(jié)氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類、脂類和礦物質(zhì)的中間代謝。細(xì)胞因子包括對(duì)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)起作用的肽或蛋白質(zhì)，并且它們參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的細(xì)胞內(nèi)通訊和將炎癥細(xì)胞粘附于血管壁和細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞因子對(duì)于肝和肝外位點(diǎn)之間以及肝自身內(nèi)部的通訊是必要的。細(xì)胞因子與激素如糖皮質(zhì)激素相互作用，導(dǎo)致形成相互控制的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。許多細(xì)胞因子除了具有其特異性促炎癥反應(yīng)效應(yīng)外還行使生長(zhǎng)活性。肝是細(xì)胞因子合成的重要位點(diǎn)和幾種細(xì)胞因子的主要清除器官。在肝疾病中，細(xì)胞因子參與肝內(nèi)免疫反應(yīng)的起始、肝再生和肝纖維化和肝硬化形成。
相信肝細(xì)胞也受到多種生長(zhǎng)因子的控制。生長(zhǎng)因子對(duì)于調(diào)節(jié)發(fā)育事件是必需的或者對(duì)于調(diào)節(jié)編碼其它分泌蛋白質(zhì)的基因表達(dá)是必需的，這些分泌蛋白質(zhì)可能參與細(xì)胞內(nèi)通訊和協(xié)調(diào)發(fā)育并且包括胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和II(IGF I和II)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、a型和b型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-α和TGF-β)、血小板來(lái)源生長(zhǎng)因子(PDGF)。
已經(jīng)顯示，在體外(in vitro)可以通過(guò)生長(zhǎng)因子如TGF-α或EGF來(lái)刺激分離肝細(xì)胞中的DNA合成。已經(jīng)顯示，命名為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的另一種蛋白質(zhì)是原代肝細(xì)胞的促細(xì)胞分裂源。
基于這些發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)提出這些因子可能是肝再生重要的介導(dǎo)物。因此，已經(jīng)表明在肝再生的治療中生長(zhǎng)因子如TGFα、EGF或HGF具有生長(zhǎng)因子樣活性。然而，建議刺激肝再生并抑制肝衰竭的這些治療策略還沒(méi)有驗(yàn)證其具有功效而不具有毒性和有害效應(yīng)。也就是說(shuō)，這些生長(zhǎng)因子促進(jìn)腫瘤進(jìn)程(Gang-Hong等，1992；Lee，1992；Horiguchi等，2002)。
因此，在本領(lǐng)域中仍然需要這樣一種有效的方法，該方法應(yīng)該可以刺激肝再生、預(yù)防肝衰竭并去除有害的毒性和致腫瘤發(fā)生作用。該需要存在于已經(jīng)誘發(fā)肝損傷的任何患者群體中。該需要不僅存在于移植患者并且還存在于捐贈(zèng)者和已進(jìn)行肝切除的患者。另外，在本領(lǐng)域中還需要新的在治療上有用的可刺激肝再生的化合物。
另外，考慮到供者器官的難以獲得性，活供者部分肝移植被認(rèn)為是克服器官缺乏的措施，并且有助于部分肝移植。然而，由于供者可切除的肝重量通常小于受者必需肝重量，所以對(duì)于代表絕大多數(shù)移植患者的成年人而言，部分肝移植不能認(rèn)為是安全手術(shù)。因此需要一種小移植物安全且快速肝再生的方法。
因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供在部分肝切除后刺激肝再生的方法。本發(fā)明的目標(biāo)還在于提供在肝移植(諸如部分肝移植)之后以及誘發(fā)肝衰竭的疾病(如肝硬化、急性肝炎和慢性肝炎)發(fā)生之后能夠促進(jìn)肝再生或肝細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物。
對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言這些目標(biāo)和更多目標(biāo)將是顯而易見(jiàn)的。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明基于HIP/PAP在體外對(duì)原代培養(yǎng)物中肝細(xì)胞具有促有絲分裂和抗凋亡作用的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)。而且，HIP/PAP是肝衰竭和肝再生期間肝細(xì)胞的體內(nèi)(in vivo)促有絲分裂分子和抗凋亡分子。本發(fā)明還基于HIP/PAP在哺乳動(dòng)物中不具有有害效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明的第一個(gè)目標(biāo)在于用于體內(nèi)刺激肝再生的藥物組合物，其中所述的藥物組合物包含與至少一種生理可接受賦形劑相組合的有效量的多肽，該多肽含有與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列所組成的多肽具有90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
另一方面，本發(fā)明涉及用于體內(nèi)刺激肝再生的藥物組合物，其中所述的藥物組合物包含與至少一種生理可接受賦形劑相組合的有效量的序列SEQ ID NO 1人肝癌-腸-胰腺/胰相關(guān)蛋白質(zhì)(HIP/PAP)。
本發(fā)明還涉及對(duì)肝壞死具有有限有害效應(yīng)的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含(i)治療有效量的肝毒性化合物，(ii)肝損傷有效量的如上所定義的多肽。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.轉(zhuǎn)基因圖示小鼠白蛋白基因調(diào)控區(qū)的增強(qiáng)子(2kb)和啟動(dòng)子(0.3kb)用虛線表示。人HIP/PAP基因(1.6kb)的外顯子II、III、IV、V及VI和內(nèi)含子分別用黑盒和虛線表示。牛生長(zhǎng)激素polyA片段(1021-1235)pcDNA 3.1用虛線表示。質(zhì)粒DNA用實(shí)線表示。有關(guān)限制性酶切位點(diǎn)用箭頭標(biāo)明。
圖2.HIP/PAP蛋白質(zhì)的免疫檢測(cè)。
A.免疫組織化學(xué)原放大倍數(shù)×20，1野生型肝，2HIP/PAP轉(zhuǎn)基因肝，3野生型肝細(xì)胞，4HIP/PAP肝細(xì)胞。
B.用HIP/PAP和肌動(dòng)蛋白抗體雜交的Western印跡，分別顯示預(yù)期大小為16kDa和45kDa的帶。泳道1純化的HIP/PAP蛋白質(zhì)(10ng)，泳道2、3和4分別為野生型肝、HIP/PAP轉(zhuǎn)基因肝27和24號(hào)純合系，泳道5、6和7分別為分離后的野生型、HIP/PAP 27和24號(hào)肝細(xì)胞。
圖3.部分肝切除術(shù)后體內(nèi)肝再生的時(shí)間過(guò)程A.在野生型(1、2、3、4)和HIP/PAP轉(zhuǎn)基因肝(5、6、7、8)中BrU陽(yáng)性細(xì)胞核的免疫檢測(cè)；1和5肝切除術(shù)后24小時(shí)，2和6肝切除術(shù)后36小時(shí)，3和7肝切除術(shù)后46小時(shí)，4和8肝切除術(shù)后55小時(shí)。
B.包含五個(gè)水平線的箱圖，其顯示了變量的第10、第25、第50、第75百分位數(shù)。對(duì)于超過(guò)第90百分位數(shù)和低于第10百分位數(shù)的變量的所有數(shù)值分別劃分，以致于箱圖在突出離群值上是有價(jià)值的。野生型小鼠(n＝9)，且HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠(n＝10)(p＝0.0014)。
C.在正常非肝切除小鼠中測(cè)量的肝重量。計(jì)算了肝重/體重比率并表示為平均百分?jǐn)?shù)±SD。在兩組之間該比率沒(méi)有差異(對(duì)于野生型和HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠分別為0.0460±0.0064，n＝12和0.0489±0.0035，n＝16)。部分肝切除術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的野生型(○)和HIP/PAP(■)小鼠正常肝重恢復(fù)的平均百分?jǐn)?shù)(±sd)顯示在HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠存在刺激恢復(fù)(對(duì)于每一組的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)有5-9只小鼠進(jìn)行肝切除)。在48小時(shí)(p＜0.001)、60小時(shí)(p＜0.003)和96小時(shí)(p＜0.002)時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖4.野生型和HIP/PAP轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞中的DNA合成A.60小時(shí)時(shí)BrU陽(yáng)性肝細(xì)胞的免疫檢測(cè)，野生型(a)，HIP/PAP(b)(原放大倍數(shù)×200)。所顯示數(shù)值是來(lái)自每種基因型12只小鼠的獨(dú)立培養(yǎng)物的平均值±SD。
B.EGF (30ng.ml-1)刺激的肝細(xì)胞內(nèi)DNA合成的時(shí)間過(guò)程。野生型(○)，HIP/PAP(■)。
C.平板接種60小時(shí)后所培養(yǎng)肝細(xì)胞內(nèi)的DNA合成在細(xì)胞貼壁后加入生長(zhǎng)因子(EGF 30ng ml-1，HIP/PAP 40ng ml-1)。在最后16小時(shí)內(nèi)加入毛喉素(Forskolin)。來(lái)自4-20次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。(□)野生型，(■)HIP/PAP。
圖5.HIP/PAP抑制培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞中TNF-α+ActD誘導(dǎo)的凋亡A.在野生型(□)和HIP/PAP(■)轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞中細(xì)胞生存力的TNF-α劑量依賴性降低。數(shù)據(jù)表示為來(lái)自每種基因型五只小鼠的四次重復(fù)試驗(yàn)的獨(dú)立培養(yǎng)物的平均值±s.e.m。
B.如所指出，將肝細(xì)胞處理17小時(shí)。野生型(□)，HIP/PAP(■)。直方圖代表三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的四次重復(fù)的平均值±s.e.m。
C.使用Hoechst 33258染色仍然貼壁的肝細(xì)胞的固縮核(放大倍數(shù)×400)。箭頭指出通過(guò)TNF-α誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡的凋亡小體特征，凋亡小體組織成了“玫瑰花結(jié)”特征。野生型(1、3、5)，HIP/PAP(2、4、6)，對(duì)照培養(yǎng)物不添加(1和2)，TNF-α2ng ml-1+ActD(3和4)，TNF-α20ngml-1+ActD(5和6)。
圖6.用來(lái)自野生型或HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠的肝細(xì)胞移植的SCID小鼠內(nèi)肝再生的刺激A.目視評(píng)價(jià)用來(lái)自野生型或HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞進(jìn)行移植并在肝切除術(shù)后7天處死的SCID小鼠的肝。
B.在肝切除術(shù)后7天，肝細(xì)胞移植的SCID小鼠肝重箱圖。通過(guò)使用Mann-Whitney檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)野生型肝細(xì)胞移植的SCID小鼠相對(duì)HIP/PAP肝細(xì)胞移植的SCID小鼠之間具有顯著性差異(p＝0.0008)。
圖7.通過(guò)HIP/PAP蛋白質(zhì)對(duì)SCID小鼠中肝再生的刺激在行部分肝切除術(shù)后36小時(shí)脾內(nèi)注射HIP/PAP蛋白質(zhì)(600ng/小鼠)或磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(100μL)的SCID小鼠肝重的箱圖。在肝切除術(shù)后7天處死小鼠。通過(guò)使用Mann-Whitney檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)注射HIP/PAP蛋白質(zhì)的SCID小鼠相對(duì)注射PBS的SCID小鼠間具有顯著性差異(p＝0.0022)。
圖8.在C57小鼠中注射HIP/PAP蛋白質(zhì)刺激肝再生已經(jīng)比較了向部分肝切除后C57BI6小鼠立即注射HIP/PAP蛋白質(zhì)相對(duì)鹽水對(duì)部分肝切除后46小時(shí)肝質(zhì)量恢復(fù)、BrdU摻入和有絲分裂的作用。顯示為代表肝質(zhì)量、BrdU摻入和有絲分裂的箱圖。已經(jīng)進(jìn)行了Mann-Whitney檢驗(yàn)，并且認(rèn)為p＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖9.根據(jù)BrdU和有絲分裂對(duì)小鼠種群進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)分析各組之間的分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這是根據(jù)部分肝切除術(shù)后46小時(shí)BrdU摻入和有絲分裂的組合的中位數(shù)確定的。
圖10.在肝切除術(shù)后移植小鼠肝內(nèi)的肝細(xì)胞因子表達(dá)已經(jīng)比較了用HIP/PAP肝細(xì)胞相對(duì)對(duì)照肝細(xì)胞移植的SCID小鼠中在PHX(部分肝切除術(shù))的T0時(shí)刻和46小時(shí)后肝臟內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)。核糖核酸酶保護(hù)方法允許在同一實(shí)驗(yàn)中比較4種肝提取物組中淋巴毒素-β(LT-β)、TNF-α和TGF-β。其中4種肝提取物為T(mén)0時(shí)刻(泳道a和c)和PHX后T46小時(shí)(泳道b和d)HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠(泳道a和b)和SCID小鼠(泳道c和d)的提取物。密度測(cè)量分析定量信號(hào)，該信號(hào)已經(jīng)相對(duì)兩種看家基因(L32和GAPDH)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。還測(cè)量了肝提取物中的mRNA水平。圖表表示各組小鼠的L32和GAPDH mRNA含量的平均值。
圖11.肝切除術(shù)后Stat 3活化在部分肝切除術(shù)后的第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)測(cè)量了HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠相對(duì)C57BI6小鼠中核內(nèi)磷酸化STAT3的積累/降解時(shí)間過(guò)程(圖11)。PHX后1小時(shí)，在HIP/PAP小鼠而不是在C57BI6小鼠中立即檢測(cè)到活化作用(p＝0.02)。而且，一旦達(dá)到12小時(shí)，HIP/PAP小鼠中STAT3活化降低到比C57BI6小鼠中更低的水平(p＝0.04)。通過(guò)使用抗磷酸化STAT3抗體的western印跡分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證且顯現(xiàn)出來(lái)。
圖12.HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠可抵抗醋氨酚(APAP)誘導(dǎo)的急性肝衰竭已經(jīng)將通過(guò)致死劑量APAP(醋氨酚)(1000mg.kg-1)處理的雌性HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg HIP雌性)和雄性HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg HIP雄性)的存活率和通過(guò)APAP或PBS處理的C57BI6對(duì)照小鼠(CT C57BI6雄性和雌性)的存活率進(jìn)行了比較。在用APAP注射的HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠相對(duì)用APAP注射的C57BI6對(duì)照小鼠之間觀察到存活率的顯著性差異。HIP/PAP還具有針對(duì)APAP中毒的預(yù)防作用。
圖13.在體內(nèi)長(zhǎng)期追蹤觀察期間HIP/PAP表現(xiàn)為無(wú)毒性效應(yīng)將HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠(金屬硫蛋白啟動(dòng)子)與WHV/c-myc小鼠雜交，在WHV/c-myc小鼠中，由旱獺肝炎(WHV)調(diào)控序列驅(qū)動(dòng)的c-myc肝特異性表達(dá)在所有動(dòng)物中引起肝癌。存活率曲線顯示W(wǎng)HV/c-myc腫瘤易感小鼠T50為42周(n＝39只小鼠)，雙轉(zhuǎn)基因小鼠的T50為60周(n＝87只小鼠)。對(duì)于HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩幼仔的陰性對(duì)照小鼠，存活率曲線是相同的。因此，首先，在這些小鼠的壽命內(nèi)還沒(méi)有檢測(cè)到HIP/PAP蛋白質(zhì)的毒性并且在攜帶兩個(gè)基因(即WHV/c-myc和HIP/PAP)的小鼠中延緩了HCC的發(fā)病。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HIP/PAP在體外對(duì)原代培養(yǎng)物中的肝細(xì)胞具有促有絲分裂和抗細(xì)胞凋亡作用。而且，在肝衰竭和肝再生期間，HIP/PAP在體內(nèi)對(duì)于肝細(xì)胞是促有絲分裂分子和抗細(xì)胞凋亡分子。
由于其在25％人肝細(xì)胞癌中增加的表達(dá)，通過(guò)Northern印跡分析鑒定了人肝癌-腸-胰腺/胰相關(guān)蛋白質(zhì)(HIP/PAP)基因(Lasserre等，1992)。已經(jīng)顯示在正常受試者的腸(帕內(nèi)特細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞)和胰腺(腺泡胰腺細(xì)胞和郎格漢島)內(nèi)檢測(cè)到HIP/PAP蛋白質(zhì)。在正常肝入口區(qū)周?chē)囊恍撛谧娓渭?xì)胞中也檢測(cè)到HIP/PAP蛋白質(zhì)(Christa等，1999)。在胰腺炎急性期期間HIP/PAP快速過(guò)表達(dá)。對(duì)于大鼠肝細(xì)胞它還可以作為粘附分子起作用并且與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)如層粘連蛋白-1和纖連蛋白相互作用。根據(jù)Drickamer分類和結(jié)構(gòu)分析，該蛋白質(zhì)包含假定信號(hào)肽，并且因此屬于C-型凝集素家族VII組(Abergel等，1999)。
目前，發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在表達(dá)人HIP/PAP基因的小鼠中，肝切除術(shù)后刺激了體內(nèi)肝再生。另外，根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HIP/PAP在體外原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中也具有促有絲分裂作用。另一方面，根據(jù)本發(fā)明還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中HIP/PAP具有抵抗TNF-α結(jié)合放線菌素D誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抗細(xì)胞凋亡作用。根據(jù)本發(fā)明還已經(jīng)顯示，當(dāng)重組表達(dá)HIP/PAP的肝細(xì)胞局部注射入部分肝切除的小鼠時(shí)誘導(dǎo)肝再生。發(fā)明者已經(jīng)顯示，當(dāng)HIP/PAP蛋白質(zhì)注射入已經(jīng)進(jìn)行行部分肝切除術(shù)的小鼠時(shí)誘導(dǎo)肝再生?？紤]到這些觀察，發(fā)明者已經(jīng)顯示，與本領(lǐng)域已知的生長(zhǎng)因子如上面所述的HGF、TGF-α或EGF形成對(duì)比，HIP/PAP蛋白質(zhì)在體內(nèi)提供有效的促有絲分裂和抗細(xì)胞凋亡作用并預(yù)防肝衰竭，HIP/PAP蛋白質(zhì)不具有有害效應(yīng)并且特別是避免任何致癌作用。
綜合在一起，這些結(jié)果證明了HIP/PAP在肝再生中的治療重要性。因此，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)允許發(fā)明者設(shè)計(jì)用于體內(nèi)刺激肝再生的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑相組合的有效量的序列SEQ ID NO 1的人肝癌-腸-胰腺/胰相關(guān)蛋白質(zhì)(HIP/PAP)。
本發(fā)明的第一個(gè)目標(biāo)在于用于包括慢性/急性肝衰竭之后體內(nèi)刺激肝再生的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑相組合的有效量多肽，其中所述多肽包含與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及包含對(duì)于肝再生有效的HIP/PAP多肽片段的藥物組合物。序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的該多肽序列包括HIP/PAP蛋白質(zhì)的生物活性部分，該部分先前已經(jīng)描述為糖識(shí)別域(CRD)序列(Christa等，1994)。
在第一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明藥物組合物包含上述HIP/PAP的生物活性部分，通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)的適當(dāng)純化方案能夠從細(xì)胞或組織來(lái)源分離該活性部分。
在所述藥物組合物的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)重組DNA技術(shù)(如實(shí)施例中所描述)產(chǎn)生HIP/PAP的生物活性部分。根據(jù)第三個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成HIP/PAP的生物活性部分。
所分離或純化的HIP/PAP的生物活性部分基本上不含來(lái)自HIP/PAP所來(lái)源細(xì)胞或組織中的細(xì)胞材料或其它污染蛋白質(zhì)，或者基本上不含化學(xué)前體(在化學(xué)合成情況下)。
為了確定兩條氨基酸序列同一性的百分?jǐn)?shù)，為了最佳比較的目標(biāo)將序列進(jìn)行比對(duì)。例如，為了最佳比對(duì)將缺口引入第一條和第二條氨基酸序列之一或兩者中，并且為了比較的目標(biāo)忽略了非同源序列。
為了最佳比較目標(biāo)，使用CLUSTAL W(版本1.82)采用以下參數(shù)能夠獲得兩條氨基酸序列同一性的百分?jǐn)?shù)參數(shù)為(1)CPU模式＝ClustalW mp；(2)比對(duì)＝《全部》；(3)輸出格式＝《aln w/數(shù)字》；(4)輸出次序＝《排列的》；(5)顏色比對(duì)＝《否》；(6)KTUP(字大小)＝《默認(rèn)》；(7)窗口長(zhǎng)度＝《默認(rèn)》；(8)分值類型＝《百分?jǐn)?shù)》；(9)TOPDIAG＝《默認(rèn)》；(10)PAIRGAP＝《默認(rèn)》；(11)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)/樹(shù)類型＝《無(wú)》；(12)矩陣＝《默認(rèn)》；(13)缺口開(kāi)口＝《默認(rèn)》；(14)缺口結(jié)束END GAPS＝《默認(rèn)》；(15)缺口延伸＝《默認(rèn)》；(16)缺口距離＝《默認(rèn)》；(17)樹(shù)類型＝《進(jìn)化樹(shù)》；(18)樹(shù)GRAP距離＝《隱藏》。
HIP/PAP的生物活性部分包括包含與SEQ ID NO 1的HIP/PAP全長(zhǎng)氨基酸序列充分同源的氨基酸序列的肽，其包括與全長(zhǎng)HIP/PAP相同數(shù)目標(biāo)氨基酸并且顯示出至少與HIP/PAP相同的生物活性。
HIP/PAP的生物活性部分還包括包含與SEQ ID NO 1的HIP/PAP全長(zhǎng)氨基酸序列充分同源的氨基酸序列的肽，其包括比全長(zhǎng)HIP/PAP更多的氨基酸并且顯示出至少與HIP/PAP相同的生物活性。
對(duì)于“相同生物活性”，如應(yīng)用于與HIP/PAP同源的生物活性肽，此處意思是指以與全長(zhǎng)HIP/PAP相同級(jí)別體內(nèi)誘導(dǎo)肝再生的肽，這是本領(lǐng)域每個(gè)技術(shù)人員通過(guò)例如測(cè)量肝細(xì)胞BrdU摻入和肝質(zhì)量恢復(fù)(如在實(shí)施例2中所示)容易確定的。
如文中所使用，HIP/PAP的生物活性部分包括含有與序列SEQ ID NO1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的序列的多肽具有90％同一性的氨基酸序列的多肽。根據(jù)本發(fā)明，與第二氨基酸序列具有至少90％同一性的第一氨基酸序列包含與所述第二氨基酸序列至少90％，并且優(yōu)選至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明的多肽還包含變體，例如來(lái)自不同哺乳動(dòng)物的CRD序列，并且例如Orelle等所述的牛胰線蛋白(BPTP)或來(lái)自大鼠的胰相關(guān)蛋白質(zhì)1(PAP1)。
除了在哺乳動(dòng)物中存在的HIP/PAP序列生物活性部分的天然存在等位基因變體以外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還將意識(shí)到可以通過(guò)突變將變化引入SEQ ID NO 1的核苷酸序列中，由此導(dǎo)致HIP/PAP氨基酸序列的改變而不改變HIP/PAP的生物活性。
另外，在相應(yīng)于HIP/PAP的序列中可以進(jìn)行非必需氨基酸的替換?！胺潜匦琛卑被釟埢悄軌蚋淖僅IP/PAP野生型序列而不改變生物活性的氨基酸殘基，而“必需”氨基酸殘基是生物活性所必需的。
本發(fā)明的第二個(gè)目標(biāo)在于用于體內(nèi)刺激肝再生的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑相組合的多肽，所述多肽為序列SEQ ID NO1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是用于體內(nèi)刺激肝再生的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑相組合的有效量多肽，所述多肽包含與由SEQID NO 1中起始于氨基酸殘基27并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)在于按照權(quán)利要求1的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑相組合的有效量多肽，其中所述多肽由SEQ IDNO 1中起始于氨基酸殘基27并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)在于用于體內(nèi)刺激肝再生的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑相組合的有效量的人肝癌-腸-胰腺/胰相關(guān)蛋白質(zhì)(HIP/PAP)。
不希望束縛于任何特定理論，發(fā)明者相信序列SEQ ID NO 1的完整的HIP/PAP蛋白質(zhì)(即包含CRD序列、信號(hào)肽和前肽的多肽)導(dǎo)致所述蛋白質(zhì)的最佳折疊，特別是當(dāng)通過(guò)DNA重組技術(shù)在已經(jīng)用編碼其的表達(dá)盒轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞中產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)時(shí)。順便提及，與僅包含部分蛋白質(zhì)的組合物相比較，治療活性HIP/PAP的正確折疊對(duì)于包含所述蛋白質(zhì)的藥物組合物而言可以導(dǎo)致在肝再生方面的最佳生物效率。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，HIP/PAP具有SEQ ID NO 1中所顯示的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，當(dāng)與序列SEQ ID NO 1的蛋白質(zhì)相比較時(shí)，HIP/PAP基本上與SEQ ID NO 1相同并且對(duì)于肝再生保留有相同生物活性，而氨基酸序列的不同歸因于天然等位基因變異或突變作用。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，HIP/PAP是包含與SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少大約90％，并且優(yōu)選91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還包括HIP/PAP嵌合或融合蛋白質(zhì)。如文中所使用，嵌合蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)包含上面所引用的與非HIP/PAP多肽融合的多肽。在融合蛋白質(zhì)中，HIP/PAP多肽和非HIP/PAP多肽彼此融合。非HIP/PAP多肽可以與HIP/PAP多肽的N末端或C末端融合。
例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白質(zhì)是HIP/PAP序列與GST序列的C末端融合的GST-HIP/PAP融合蛋白質(zhì)。此類融合蛋白質(zhì)可以易于重組HIP/PAP的純化。
在所有情況下，本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)擁有與SEQ ID NO 1的HIP/PAP相同的生物活性。
有兩種不同的途徑可以引發(fā)肝再生，一種是導(dǎo)致部分肝切除術(shù)或膽道結(jié)扎后分化肝細(xì)胞或膽細(xì)胞的復(fù)制(Fausto等，1994，F(xiàn)austo等，2000)。第二個(gè)再生途徑是中毒性損傷后、大塊壞死或癌發(fā)生時(shí)所引發(fā)的，這時(shí)肝細(xì)胞或膽細(xì)胞的增殖由于損傷而受到破壞或減慢(Factor VM等，PetersenB等，(1998)，Akhurst B等)。在這些情況下，已經(jīng)提出“干細(xì)胞樣”細(xì)胞增殖并分化成肝細(xì)胞和膽上皮細(xì)胞并且重新構(gòu)筑形成肝。在嚙齒類中，所謂的卵形細(xì)胞代表異質(zhì)細(xì)胞區(qū)，其中明確定義的亞群仍然必需進(jìn)行分離。在人類中，卵形細(xì)胞區(qū)可能參與急性大塊壞死后肝臟的重新構(gòu)筑，并且在慢性肝疾病中也已經(jīng)進(jìn)行了鑒定(Roskams T等，Sell S等)。如文中所使用，短語(yǔ)“肝再生”涉及“干細(xì)胞樣”細(xì)胞增殖并分化成肝細(xì)胞和膽上皮細(xì)胞且重新構(gòu)筑肝臟的過(guò)程以及肝細(xì)胞和膽細(xì)胞的復(fù)制。
術(shù)語(yǔ)“生物活性量”涉及本發(fā)明組合物足以治療與肝細(xì)胞數(shù)量減少相關(guān)的肝疾病的量，其中由HIP/PAP導(dǎo)致的肝再生能夠恢復(fù)肝功能。
由HIP/PAP導(dǎo)致的肝再生在幾種情況下是有用的，例如外科手術(shù)、移植、疾病，以及暴露于導(dǎo)致肝壞死或部分肝壞死的肝毒性化合物之后。
首先，本發(fā)明的藥物組合物適于治療急性和慢性肝衰竭。
急性肝衰竭通常由肝細(xì)胞大塊細(xì)胞凋亡/壞死引起，并且代表源于病毒或毒素的破壞性狀況。急性肝衰竭主要是由病毒性肝炎(大約70％的病例)、藥物中毒(例如試圖自殺期間使用的醋氨酚)引起的。
本發(fā)明的組合物能夠治療的慢性肝衰竭可以是由乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染或者酒精引起的。不但有慢性乙型肝炎、肝硬化還有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。NAFLD是最近選擇用于描述臨床和病理綜合征的術(shù)語(yǔ)，它涵蓋了從簡(jiǎn)單的脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
因此，本發(fā)明的組合物適于治療如下疾病導(dǎo)致的肝衰竭，例如乙型肝炎、丙型肝炎、尿素循環(huán)不良、家族性高膽固醇血癥、酒精誘導(dǎo)的肝硬化、糖原貯積病、自身免疫性肝炎，、I型原發(fā)性尿草酸鹽過(guò)多、原因不明的肝硬化、I型克-納綜合征、先天性肝纖維化、尼曼病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、家族性淀粉樣變、膽道閉鎖、肝細(xì)胞癌、原發(fā)性硬化性膽管炎、肝母細(xì)胞瘤、阿拉日耶綜合征、血管內(nèi)皮瘤、家族性膽汁郁積、Non-Carciniodneuro-endocrine、藥物誘導(dǎo)的肝衰竭、良性肝腫瘤例如灶性結(jié)節(jié)性增生、肝腫瘤如肝細(xì)胞癌和膽管癌、急性/暴發(fā)性肝衰竭、巴-希綜合征、α1抗胰蛋白酶缺乏癥、威爾遜病、血色素沉著病、酪氨酸血癥、原卟啉癥和囊性纖維化。
本發(fā)明的組合物適于治療由于暴露于肝毒性化合物所造成的所有病理情況。
包括乙醇、病毒如HBV、HCV或HIV、蕈如 amanite、寄生蟲(chóng)如惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodium Falciparum)或者某些治療劑在內(nèi)的許多肝毒性化合物誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和肝壞死。在這些治療劑中，可以包括麻醉劑如安氟烷、神經(jīng)精神藥物如酰肼類、抗驚厥藥如丙戊酸、鎮(zhèn)痛藥如醋氨酚、抗菌劑如兩性霉素B或青霉素、激素類如醋磺己脲、心血管藥物如罌粟堿、免疫抑制劑和抗瘤藥如天冬酰胺酶、抗高血壓藥物、消炎藥和雜項(xiàng)藥物如維生素A、酚丁、碘離子。
盡管肝毒性的確切機(jī)制不清楚，但這些化合物對(duì)肝細(xì)胞代謝具有有害效應(yīng)并且促進(jìn)肝組織壞死和肝衰竭的出現(xiàn)。
特別地，如實(shí)施例9所示本發(fā)明的藥物組合物適于治療醋氨酚引起的肝衰竭且對(duì)醋氨酚中毒具有預(yù)防作用。
本發(fā)明進(jìn)一步的目標(biāo)在于對(duì)肝壞死具有有限有害影響的試劑盒(kit)，其包含(i)治療有效量的肝毒性化合物，
(ii)有效量的多肽，該多肽包含與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
本發(fā)明還包括包含如上所定義的HIP/PAP多肽片段、HIP/PAP的生物活性部分或完整的HIP/PAP蛋白質(zhì)的試劑盒。組合物的肝毒性化合物可以是上面所列舉的那些化合物之一。
本發(fā)明的藥物組合物還適于治療肝切除和肝移植所引起的肝衰竭。本發(fā)明的藥物組合物可以施用于肝移植供者、此種移植受者、肝切除后患者以預(yù)防通過(guò)刺激肝再生所引起的肝衰竭的產(chǎn)生和發(fā)展。
通過(guò)刺激肝再生，本發(fā)明的組合物具有其它有利作用。在這些有利作用中，可以引出的是其可以實(shí)現(xiàn)高效肝移植和部分肝移植的可能性和先體外后體內(nèi)(ex vivo)刺激肝再生的可能性，例如在移植前刺激肝移植物、肝上皮細(xì)胞、肝干細(xì)胞或者經(jīng)HIP/PAP遺傳修飾細(xì)胞的生長(zhǎng)。
特別地，本發(fā)明的藥物組合物可以配制成適于肝移植物保存的草藥劑型(galenic form)，優(yōu)選HIP/PAP溶解或懸浮其中的液體培養(yǎng)基。
短語(yǔ)“肝衰竭”在文中以最廣意義使用并指直接或間接源自肝上皮細(xì)胞(即肝細(xì)胞和膽細(xì)胞)數(shù)量減少的任何結(jié)構(gòu)或功能損傷。
術(shù)語(yǔ)“肝移植”具有本領(lǐng)域的普通含義并包括部分或全部肝移植，其中供者的肝被部分或全部切除并且部分或全部移植給受者。根據(jù)手術(shù)模式可以將部分肝移植分為正位部分肝移植、異位部分肝移植等等，并且本發(fā)明可以應(yīng)用于它們其中的任意一種。在部分肝移植中，一般將來(lái)自供者的對(duì)應(yīng)于受者正常肝體積的大約30-50％的肝移植物或部分肝移植物作為移植物移植給肝臟已被全部切除的受者。但是即使移植物為大約30％或更小，本發(fā)明仍然具有促進(jìn)肝再生或肝細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
考慮到尸體器官供者明顯短缺以及全世界等待移植的患者數(shù)量的指數(shù)增加以及活體肝移植(LDLT)在兒童受者中的成功，部分肝移植特別重要。實(shí)際上，尸體或大小匹配肝移植物的缺乏已經(jīng)導(dǎo)致產(chǎn)生了減體積、劈離式活體肝移植的發(fā)展。盡管在移植物中很快出現(xiàn)再生，但是經(jīng)歷活體肝移植的患者所接受的肝量要比接受尸體移植患者的小，并且在近些年逐步引發(fā)了小肝綜合征的爭(zhēng)論。小尺寸肝移植物可以通過(guò)公認(rèn)的源自不足夠大功能量肝的移植的臨床綜合征定義，并且代表著成人活體移植的最大障礙(Heaton，2003)。移植物與受者體重的比率小于0.8可削弱靜脈流入，在臨床狀況差的患者體內(nèi)導(dǎo)致門(mén)靜脈高血和增強(qiáng)的代謝需求。將肝劈成右葉和左葉移植物會(huì)在受者內(nèi)增加小尺寸的潛在危險(xiǎn)。這些要點(diǎn)被認(rèn)為是引發(fā)小肝綜合征的主要因素，其引起肝再生受損和小移植物壞死。由于尺寸不匹配是成人活體相關(guān)肝移植的主要障礙，所以通過(guò)使用上述藥物組合物降低SFSS影響將優(yōu)化可得器官的使用并降低整體發(fā)病率和死亡率。
如文中所使用，“肝移植物”意思是通過(guò)上述移植手術(shù)移植入受者的肝，并且還包括對(duì)應(yīng)于由供者部分肝組成的所謂“部分肝移植物”。肝移植意思還指將肝細(xì)胞(經(jīng)遺傳修飾或刺激增殖或分化的肝細(xì)胞)注射入門(mén)靜脈。
如在肝移植情況中所使用，術(shù)語(yǔ)“肝再生”意思是指損失的肝組織由肝移植物或部分肝移植物的肝細(xì)胞生長(zhǎng)所代替而發(fā)生的形態(tài)變化，而且還包括生物化學(xué)變化例如肝功能的改善、恢復(fù)或正?；?。通過(guò)本發(fā)明組合物治療的特定受試者包括例如為了治療由肝臟疾病(例如肝炎；酒精、病毒、藥物或未知原因引起的肝硬化或者肝癌)導(dǎo)致的肝衰竭已經(jīng)全部切除肝臟后接受部分肝移植物的患者。
本發(fā)明的藥物組合物還適于治療肝臟缺血-再灌注(I/R)引起的肝衰竭，肝臟缺血-再灌注仍然是肝切除和肝移植兩者的明顯限制，并且可能造成肝衰竭、肺損傷和死亡。
盡管本說(shuō)明書(shū)以下部分特別涉及包含HIP/PAP蛋白質(zhì)的組合物配方，但其也適用于包含HIP/PAP多肽片段或生物活性部分的治療性組合物。
為了本發(fā)明的目標(biāo)，按照已知方法能夠?qū)IP/PAP按配方制備藥用組合物，由此HIP/PAP與可藥用載體組合成混合物。適宜載體及其配方描述于Oslo等編的Remington′s Pharmaceutical Science(第16版；1980，Mack出版公司)。
“生理可接受賦形劑”意思是指固體或液體充填劑、稀釋劑或物質(zhì)，它們可以安全地用于全身或局部施用。取決于所施用的特定路線，本領(lǐng)域眾所周知的多種可藥用載體包括固體或液體充填劑、稀釋劑、助溶劑、表面活性劑和包封物質(zhì)。
這些組合物一般包含有效量HIP/PAP蛋白質(zhì)(例如從大約6μg/ml至大約10mg/ml)并與適量載體一起制備成適于有效施用于患者的可藥用組合物。
HIP/PAP可以通過(guò)腸胃外方式施用或者通過(guò)其它保證將其以有效形式遞送至血流的方法施用。HIP/PAP優(yōu)選地可以利用肝內(nèi)途徑施用。此類藥物組合物的劑量和預(yù)期藥物濃度依賴于所預(yù)想的特定用途而變化。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，一般有效劑量為大約30μg/kg。以本領(lǐng)域已知的方式(如在Mordenti等，Pharmaceut Res 8第1351頁(yè)(1991)中所公開(kāi))可以進(jìn)行劑量的種間尺度確定。
制劑的pH主要取決于HIP/PAP蛋白質(zhì)的特定類型和濃度，但無(wú)論何處pH范圍優(yōu)選在大約3至大約8范圍內(nèi)。
特別適用于HIP/PAP臨床施用的組合物包括無(wú)菌水溶液或無(wú)菌的可水合粉末如冷凍干燥的蛋白質(zhì)。一般而言，為了使制劑為等滲性的還可以在制劑中使用適量可藥用鹽。
通過(guò)經(jīng)過(guò)膜(0.2微米)的無(wú)菌過(guò)濾容易地實(shí)現(xiàn)無(wú)菌。
HIP/PAP蛋白質(zhì)藥物組合物將以與良好醫(yī)療實(shí)踐相一致的方式進(jìn)行配制、給藥和施用。在該情況下考慮的因素包括所治療的特定疾病、所治療的特定哺乳動(dòng)物、各個(gè)患者的臨床狀況、病因、試劑的遞送部位、施用方法、施用方案以及醫(yī)療從業(yè)者已知的因素。
欲施用HIP/PAP蛋白質(zhì)的治療“有效量”將通過(guò)此類考慮來(lái)控制，并且是誘導(dǎo)或者備選地促進(jìn)肝再生并預(yù)防肝衰竭所必需的最小量。此量?jī)?yōu)選低于對(duì)哺乳動(dòng)物具有毒性或者使哺乳動(dòng)物對(duì)感染明顯更加敏感的量。
如文中關(guān)于HIP/PAP蛋白質(zhì)所使用的術(shù)語(yǔ)“施用”或“被施用”是指在肝切除或肝移植之前、之中或者之后進(jìn)行的HIP/PAP蛋白質(zhì)的施用。
根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞組合物本發(fā)明的目標(biāo)是包含與多肽相組合的分裂肝細(xì)胞的組合物，其中所述多肽包含與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是包含已經(jīng)用驅(qū)動(dòng)多肽表達(dá)的表達(dá)盒轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞的組合物，其中所述多肽包含與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
例如，如在標(biāo)題為“在肝臟中表達(dá)HIP/PAP的轉(zhuǎn)基因小鼠”部分中所描述可以獲得上述的驅(qū)動(dòng)多肽表達(dá)的表達(dá)盒。
如文中所使用的肝細(xì)胞是直接從肝臟收集得到的，或者從干細(xì)胞并且具體而言是已經(jīng)分化為肝細(xì)胞的骨髓干細(xì)胞獲得。Petersen等(1999)和Mitchell等已經(jīng)報(bào)道了骨髓干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化。依靠此類骨髓干細(xì)胞能夠避免為了獲得體外肝細(xì)胞培養(yǎng)物而對(duì)肝切除術(shù)的依賴。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是包含與多肽相組合的有效量骨髓干細(xì)胞的組合物，其中所述多肽包含與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
不希望被任何特定理論所束縛，發(fā)明者相信將用HIP/PAP處理的骨髓干細(xì)胞施用于患者可以加速肝再生過(guò)程。
上述細(xì)胞組合物可以用于例如為了體外細(xì)胞分析的目標(biāo)而進(jìn)行的肝細(xì)胞長(zhǎng)期體外培養(yǎng)。上面細(xì)胞組合物的可得性避免了為了得到體外肝細(xì)胞培養(yǎng)物而對(duì)肝切除術(shù)的再次依賴。本發(fā)明還包含用于體內(nèi)刺激肝再生的藥物組合物，其包含有效量的上面所定義組合物。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，來(lái)自上面所述組合物的多肽由本說(shuō)明書(shū)中所定義的HIP/PAP多肽片段、HIP/PAP的生物活性部分或完整的HIP/PAP蛋白質(zhì)所替代。
根據(jù)本發(fā)明的過(guò)程本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是體外刺激肝細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程，其包括(a)收集肝細(xì)胞；(b)在適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述肝細(xì)胞；(c)用促有絲分裂量的多肽處理所述肝細(xì)胞，其中所述多肽包含與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
通過(guò)“促有絲分裂量”意思是指當(dāng)加入到肝細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)之前，使用足夠量的文中所定義多肽處理肝細(xì)胞。通常，如上面所指定的“促有絲分裂量”由能誘導(dǎo)所培養(yǎng)肝細(xì)胞增殖的所述多肽的量組成，該量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)例如實(shí)施例中所公開(kāi)的BrdU摻入法容易地確定。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是體外刺激肝細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程，其包括(a)收集肝細(xì)胞；(b)在適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述肝細(xì)胞；(c)用驅(qū)動(dòng)HIP/PAP蛋白質(zhì)在所述肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的轉(zhuǎn)染所述肝細(xì)胞。
根據(jù)公開(kāi)于實(shí)施例5中的技術(shù)并根據(jù)“材料和方法”部分中的相應(yīng)部分可以助于進(jìn)行步驟(a)-(c)。
如文中所使用，術(shù)語(yǔ)“收集肝細(xì)胞”意思是指直接從肝臟收集肝細(xì)胞，或者是指或者從干細(xì)胞并且具體而言是已經(jīng)分化為肝細(xì)胞的骨髓干細(xì)胞獲得。Petersen等(1999)和Mitchell等已經(jīng)報(bào)道了骨髓干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化。依靠此類骨髓干細(xì)胞能夠避免為了獲得體外肝細(xì)胞培養(yǎng)物而對(duì)肝切除術(shù)的依賴。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是體外刺激肝細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程，其包括(a)收集骨髓干細(xì)胞；(b)在適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述骨髓干細(xì)胞；(c)用促有絲分裂量的多肽處理所述骨髓干細(xì)胞，其中所述多肽包含與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
不希望被任何特定理論所束縛，發(fā)明者相信上述處理可增強(qiáng)骨髓干細(xì)胞再生成肝臟的能力。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，來(lái)自上面所述過(guò)程的多肽由本說(shuō)明書(shū)中所定義的HIP/PAP多肽片段、HIP/PAP的生物活性部分或完整的HIP/PAP蛋白質(zhì)所替代。
根據(jù)本發(fā)明的用途本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)在于多肽在制造用于體內(nèi)刺激肝再生的藥物組合物中的用途，其中所述多肽包含與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)在于多肽在制造用于在處于發(fā)展成肝衰竭危險(xiǎn)中或已診斷為肝衰竭的患者體內(nèi)預(yù)防肝衰竭產(chǎn)生或發(fā)展的藥物組合物中的用途，其中所述多肽包含與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
本發(fā)明還包含如上所定義的來(lái)自HIP/PAP的多肽片段和HIP/PAP的生物活性部分的用途。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，肝衰竭是肝切除、肝移植或肝炎的結(jié)果。
在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的用途涉及處于發(fā)展成肝衰竭危險(xiǎn)中或已診斷為肝衰竭的患者的用途，其中所述肝衰竭由選自下列疾病中的一種疾病引起的乙型肝炎、丙型肝炎、尿素循環(huán)不良、家族性高膽固醇血癥、酒精誘導(dǎo)的肝硬化、糖原貯積病、自身免疫性肝炎，、I型原發(fā)性尿草酸鹽過(guò)多、原因不明的肝硬化、I型克-納綜合征、先天性肝纖維化、尼曼病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、家族性淀粉樣變、膽道閉鎖、肝細(xì)胞癌、原發(fā)性硬化性膽管炎、肝母細(xì)胞瘤、阿拉日耶綜合征、血管內(nèi)皮瘤、家族性膽汁郁積、Non-Carciniod neuro-endocrine、藥物誘導(dǎo)的肝衰竭、良性肝腫瘤例如灶性結(jié)節(jié)性增生、肝腫瘤如肝細(xì)胞癌和膽管癌、急性/暴發(fā)性肝衰竭、巴-希綜合征、α1抗胰蛋白酶缺乏癥、威爾遜病、血色素沉著病、酪氨酸血癥、原卟啉癥和囊性纖維化。
根據(jù)本發(fā)明的方法本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是刺激肝再生的方法，其包括向患者施用有效量的多肽，其中所述多肽包含與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括這樣一種方法，即其包括施用有效量的本說(shuō)明書(shū)中所定義的來(lái)自HIP/PAP的多肽片段、HIP/PAP的生物活性部分或完整的HIP/PAP蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是使用對(duì)于預(yù)防或治療疾病或病理生理狀況有效的肝毒性治療劑治療患者的方法，其包括(a)同時(shí)或者以任選順序?qū)⑸镉行┝康乃鲋委焺┖皖A(yù)防有效量的多肽施用于所述患者，其中所述多肽包含與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是用于預(yù)防作為肝切除、肝移植或肝炎的結(jié)果的肝衰竭形成或發(fā)展的方法，其包括將有效量的多肽施用于患者，其中所述多肽包含與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
根據(jù)上面的方法，在肝切除或肝移植之前、之中或之后施用多肽。為了避免如手術(shù)后并發(fā)癥，也可以將多肽施用于肝移植的供者或者受著。根據(jù)上面的方法，所使用的多肽是如本說(shuō)明書(shū)中所定義的HIP/PAP的片段、HIP/PAP的生物活性部分或完整的HIP/PAP蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是在患者體內(nèi)刺激肝再生的方法，其包括(a)從所述患者收集肝細(xì)胞；(b)在適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述肝細(xì)胞；(c)使用促有絲分裂量的多肽處理所述肝細(xì)胞，其中所述多肽包含與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列；和
(d)將所述細(xì)胞注射入所述患者。
通過(guò)“促有絲分裂量”意思是指當(dāng)注射入患者誘導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)之前，使用足夠量的文中所定義多肽處理肝細(xì)胞。通常，如上面所指定的“促有絲分裂量”由能誘導(dǎo)所培養(yǎng)肝細(xì)胞增殖的所述多肽的量組成，該量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)例如實(shí)施例中所公開(kāi)的BrdU摻入法容易地確定。
根據(jù)公開(kāi)于實(shí)施例5中的技術(shù)并根據(jù)“材料和方法”部分中的相應(yīng)部分可以助于進(jìn)行步驟(a)-(c)。
根據(jù)公開(kāi)于實(shí)施例5中的技術(shù)并根據(jù)“材料和方法”部分中的相應(yīng)部分能夠有助于進(jìn)行步驟(a)-(d)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括額外步驟(e)監(jiān)測(cè)所述患者的肝衰竭的指征，和(f)按照步驟(d)持續(xù)注射直到所述肝再生足夠。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是在患者體內(nèi)刺激肝再生的方法，其包括(a)從所述患者收集肝細(xì)胞；(b)在適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述肝細(xì)胞；(c)使用驅(qū)動(dòng)HIP/PAP蛋白質(zhì)在所述肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的表達(dá)盒轉(zhuǎn)染所述肝細(xì)胞；和(d)將所述細(xì)胞注射入所述患者。
例如，如在標(biāo)題為“在肝臟中表達(dá)HIP/PAP的轉(zhuǎn)基因小鼠”部分中所描述可以獲得上述的驅(qū)動(dòng)多肽表達(dá)的表達(dá)盒。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是在患者體內(nèi)刺激肝再生的方法，其包括(a)從所述患者收集骨髓干細(xì)胞；(b)在適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述骨髓干細(xì)胞；(c)使用促有絲分裂量的多肽處理所述肝細(xì)胞，其中所述多肽包含與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列；(d)將在步驟(c)得到的細(xì)胞注射入所述患者。
上述方法的可用性避免為了獲得體外肝細(xì)胞培養(yǎng)物而對(duì)肝切除術(shù)的再次依賴。不希望被任何特定理論所束縛，發(fā)明者相信將用HIP/PAP處理的骨髓干細(xì)胞施用于患者可以加速肝再生過(guò)程。
根據(jù)公開(kāi)于實(shí)施例5中的技術(shù)并根據(jù)“材料和方法”部分中的相應(yīng)部分可以助于進(jìn)行步驟(a)-(d)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括額外步驟(e)監(jiān)測(cè)所述患者的肝衰竭的指征，和(f)按照步驟(e)持續(xù)注射直到所述肝再生足夠。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在處于發(fā)展成肝衰竭危險(xiǎn)中或已診斷為病毒性肝炎或自身免疫性肝炎或者肝硬化的患者體內(nèi)預(yù)防肝衰竭產(chǎn)生或發(fā)展的方法，其包括向所述患者施用肝衰竭預(yù)防量的多肽，其中所述多肽包含與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
在上面方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所使用的多肽是如本說(shuō)明書(shū)中所定義的HIP/PAP的片段、HIP/PAP的生物活性部分或完整的HIP/PAP蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還涉及作為用于體內(nèi)刺激肝再生的組合物活性成分的HIP/PAP，其中所述組合物包含與至少一種生理可接受賦形劑相組合的有效量的多肽，其中所述多肽包含與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
本發(fā)明的進(jìn)一步細(xì)節(jié)在以下非限制性實(shí)施例中圖解說(shuō)明。
材料和方法HIP/PAP的產(chǎn)生和純化如發(fā)明者先前所描述，HIP/PAP產(chǎn)生于轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中，其中轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶有能夠驅(qū)動(dòng)HIP/PAP基因在乳腺中表達(dá)的兔WAP基因(Christa等，2000)。
通過(guò)顯微注射入C57BI/6xCBA雜交系的單細(xì)胞小鼠受精卵產(chǎn)生了攜帶WAP/HIP構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因小鼠。通過(guò)Southern印跡上的尾部DNA分析鑒定這些小鼠。用SacI消化小鼠DNA，并且將所產(chǎn)生片段在1％瓊脂糖凝膠上分離并轉(zhuǎn)移至Nytran 13N。利用來(lái)自兔WAP基因上游區(qū)域的4.4-kbXhoI片段檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的存在。
按照法國(guó)農(nóng)業(yè)部指導(dǎo)方針(頒布于1988年4月19日)開(kāi)展全部實(shí)驗(yàn)，包括處死之前用于動(dòng)物處理的動(dòng)物福利和條件。
-乳汁樣品在分娩后13天從麻醉小鼠收集乳汁，為了刺激射乳預(yù)先給小鼠注射0.05U催產(chǎn)素。將小鼠乳汁稀釋(1/10)于10mM Tris/HCl pH7.5，100mMCaCl2，并在40000g離心30分鐘。棄去沉淀并將上清液在相同條件下再次離心。上清液或乳清立即用于HIP/PAP純化或在20℃保持冰凍。
-從轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中純化HIP/PAP蛋白質(zhì)通過(guò)在0℃攪拌30分鐘加入乙酸(1M)將所得到的抗乳血清(見(jiàn)上)酸化至pH 4.6。通過(guò)在Beckman 50.2Ti轉(zhuǎn)子(Gagny，法國(guó))上以110000g離心1小時(shí)去除沉淀物質(zhì)。將上清液用1L的20mM醋酸鈉緩沖液pH4.8在4℃透析過(guò)夜，通過(guò)如上的高速離心使其澄清并在Millex 0.22μm濾膜(Millipore，Guyancourt，法國(guó))上過(guò)濾，然后加載到預(yù)先用70mM醋酸鈉緩沖液pH4.8平衡的Mono S HR5/5陽(yáng)離子交換柱上。棄除流出液，并且當(dāng)吸光度返回至基線時(shí)開(kāi)始使用工作液中0-500mM NaCl的20mL梯度。柱流速為1mL/分鐘并且收集1mL的級(jí)分。混合含HIP/PAP的級(jí)分，稀釋于5倍體積的pH4.0的140mM醋酸鈉緩沖液中并重新應(yīng)用于使用140mM醋酸鈉緩沖液pH4.0平衡的Mono S HR5/5柱。棄除流出液并使用工作緩沖液中范圍為0-400mM NaCl的20mL梯度洗脫柱。柱流速為1mL/分鐘并且收集1mL的級(jí)分。混合含HIP/PAP的級(jí)分，稀釋于1倍體積的甘油中并貯于20℃。
使用Peterson蛋白質(zhì)測(cè)定法測(cè)定樣品中的蛋白質(zhì)濃度。按照Laemmli的方法進(jìn)行十二烷基硫酸鈉變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(12.5％丙烯酰胺，SDS/PAGE)。使用imagemaster掃描并定量考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠。
動(dòng)物
-在肝臟中表達(dá)HIP/PAP的轉(zhuǎn)基因小鼠如圖1中所述，將小鼠白蛋白基因18的調(diào)控區(qū)克隆入HIP/PAP基因片段上游以驅(qū)動(dòng)人HIP/PAP基因在肝臟中特異性表達(dá)。在轉(zhuǎn)基因部門(mén)(Villejuif，法國(guó))進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，將完整的NotI/KpnI線性化構(gòu)建體顯微注射入雜交系的單一細(xì)胞的小鼠受精卵中。從遺傳背景獨(dú)立的建立者培育得到24和27個(gè)純合轉(zhuǎn)基因品系。處死之前用于動(dòng)物處理的動(dòng)物福利、條件和全部實(shí)驗(yàn)操作保證與法國(guó)農(nóng)業(yè)部指導(dǎo)方針相一致(頒布于1988年4月19日)。
-對(duì)照小鼠C57BL/6小鼠由IFFA CREDO(L′Arbresle，法國(guó))提供并用作HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠的對(duì)照。
-所分離肝細(xì)胞的受者為了使任何的細(xì)胞排異反應(yīng)危險(xiǎn)最小化，6周齡雌性重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合癥(SCID)小鼠(IFFA-CREDO，L′Arbresle，法國(guó))用作從雄性HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠或雄性C57BL/6小鼠(IFFA-CREDO，L′Arbresle，法國(guó))所分離的肝細(xì)胞的受者。
部分肝切除術(shù)和體內(nèi)BrdU摻入如Higgins和Anderson(Higgins等)所描述，肝切除代表2月齡小鼠中總肝臟質(zhì)量的70％。在切除前2小時(shí)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行單次腹腔內(nèi)注射溶于0.9％NaCl的BrdU(60mg/kg體重)。在肝切除術(shù)后24、36、46和55小時(shí)處死動(dòng)物。對(duì)動(dòng)物和肝臟進(jìn)行稱重并且在用抗BrdU抗體(克隆Bu 2OA)孵育之后計(jì)數(shù)BrdU標(biāo)記的細(xì)胞核，并且利用Universal LSAB2辣根過(guò)氧化物酶試劑盒(Dako)進(jìn)行顯色，對(duì)于每張肝臟切片觀察至少20個(gè)低放大倍數(shù)(×10)顯微鏡視野(Olympus BX60)。對(duì)于每張切片篩查1600個(gè)以上的細(xì)胞核。
原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞如先前所描述(Klaunig等，Renton等)，使用酶Liberase Blendzyme從2-3月齡的小鼠分離原代小鼠肝細(xì)胞。如Kreamer等所描述，使用低速等密度珀可(Percoll)離心法純化存活肝細(xì)胞。在Primaria板中將細(xì)胞以2×105和4×105(分別對(duì)于增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn))的密度重懸于含有青霉素、鏈霉素、兩性酶素、牛血清白蛋白(0.1％)和胎牛血清(10％)的199培養(yǎng)基中。將細(xì)胞維持于37℃潮濕環(huán)境中并且當(dāng)細(xì)胞貼附于板2和3小時(shí)后更換培養(yǎng)基。貼壁后，洗滌細(xì)胞一次并使用不含血清的相同培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，并且然后將細(xì)胞暴露于ActD(0.05μg/ml)和濃度范圍為0.2-40ng/ml的TNF-α中17-18小時(shí)，除非在圖例中另外指定。對(duì)于增殖實(shí)驗(yàn)，向培養(yǎng)基添加5×10-8M 3，5，3′-三碘甲腺原氨酸、10-7M地塞米松、10μg/ml胰島素、2×10-6M、5.5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、7ng/ml硒、20mM丙酮酸鹽和5％胎牛血清。
原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的DNA合成為了測(cè)量DNA合成，在評(píng)價(jià)之前的最后16小時(shí)加入BrdU(20mM)。肝細(xì)胞用PBS洗滌、固定并于-20℃在30∶70乙酸/乙醇溶液透化30分鐘。使用BrdU標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒II定位所摻入BrdU。通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品計(jì)數(shù)至少10個(gè)低放大倍數(shù)顯微鏡視野(Olympus CK2)中BrdU標(biāo)記細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)測(cè)量復(fù)制DNA合成。每孔篩查1000個(gè)以上肝細(xì)胞。
原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的細(xì)胞存活率和細(xì)胞凋亡評(píng)價(jià)加入TNF-α17小時(shí)后，用4％多聚甲醛于室溫下固定單細(xì)胞層20分鐘，并用Hoechst 33258(0.5μg/ml)染色。使用Olympus BX60倒置熒光顯微鏡(Olympus America Inc.)在350和460nm波長(zhǎng)之間檢查凋亡細(xì)胞。使用MTT測(cè)定法定量細(xì)胞存活率的損失用新鮮溶于培養(yǎng)基的xμl(0.5mg/ml)MTT溶液于37℃下處理96孔微孔滴定板中每孔30,000個(gè)細(xì)胞1小時(shí)。然后吸出培養(yǎng)基并加入100μl DMSO以溶解染料。使用Dynex MRX96孔微量培養(yǎng)板閱讀儀(Dynex Technologies，法國(guó))在570nm處測(cè)量吸光度。對(duì)于放置于同一塊板上的HIP/PAP和野生型肝細(xì)胞，每次測(cè)量重復(fù)進(jìn)行四次。通過(guò)接受特定處理的細(xì)胞的光密度讀數(shù)除以未處理對(duì)照細(xì)胞的OD值讀數(shù)然后乘以100來(lái)計(jì)算細(xì)胞存活的百分?jǐn)?shù)。將結(jié)果與使用Hoechst33258觀察到的凋亡細(xì)胞數(shù)相比較驗(yàn)證MTT測(cè)定法的精確性。
肝細(xì)胞分離和移植如先前Klaunig和Renton所描述，使用酶Liberase Blendzyme，從兩月齡雄性HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠和雄性C57BL/6小鼠分離肝細(xì)胞。如Kreamer所描述，使用低速等密度珀可離心法純化活的肝細(xì)胞。用溶于0.9％NaCl的甲苯噻嗪(Bayer，Leverkusen，德國(guó))和氯胺酮(Biomérieux，Lyon，法國(guó))將雌性SCID小鼠麻醉，穿過(guò)小的左側(cè)切口將脾臟移至腹外，并且使用帶有26-gauge針頭的注射器注射懸于Williams培養(yǎng)基(Gibco/BRL)中的100μl細(xì)胞懸液(0.75×106個(gè)活的肝細(xì)胞)。進(jìn)行部分肝切除術(shù)前，將受者SCID小鼠養(yǎng)30天以便有足夠時(shí)間使得供者肝細(xì)胞增殖并再組織成肝實(shí)質(zhì)。
肝再生的評(píng)價(jià)在切除之前2小時(shí)，動(dòng)物接受一次腹膜內(nèi)注射60mg/kg體重的溶于0.9％NaCl的BrdU。在肝切除術(shù)后24、36、46和55小時(shí)處死動(dòng)物。將動(dòng)物和肝臟稱重并且在用抗BrdU抗體(克隆Bu 20A)孵育之后計(jì)數(shù)BrdU標(biāo)記的細(xì)胞核，并且使用Universal LSAB2辣根過(guò)氧化物酶試劑盒(Dako)進(jìn)行顯示，對(duì)于每張肝臟切片觀察至少20個(gè)低放大倍數(shù)(×10)顯微鏡視野(Olympus BX60)。每張切片篩查1600個(gè)以上細(xì)胞核。
肝切除術(shù)后HIP/PAP純化蛋白質(zhì)注射如先前所描述(Christa等，2000)產(chǎn)生并純化重組HIP/PAP蛋白質(zhì)，并將其以6μg/ml稀釋于0.9％NaCl。在部分肝切除術(shù)后36小時(shí)，將100μlHIP/PAP蛋白質(zhì)或PBS(磷酸緩沖鹽)注射入重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠脾臟。部分肝切除術(shù)后8天處死動(dòng)物。
通過(guò)RT-PCR分析檢測(cè)移植的肝細(xì)胞按照TRIZOL試劑(Life Technologies)提供的說(shuō)明書(shū)從冰凍肝臟組織提取RNA。在10U Rnasin、隨酶提供的1×緩沖液、40mmol l-1四種脫氧核苷酸存在下，通過(guò)200單位莫洛尼鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)并以400ng隨機(jī)引物(Invitrogen)引發(fā)，于42℃反應(yīng)45分鐘從1μg總RNA合成CDNA。通過(guò)使用純的TaqTMReady-To-GoTMPCR珠(AmershamBiosciences)，在溫度94℃、60℃和72℃下各1分鐘進(jìn)行40輪擴(kuò)增循環(huán)從1/8cDNA中開(kāi)展PCR。使用引物19/101檢測(cè)人HIP/PAP轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。使用來(lái)自Itoh和Terakoa的小鼠公開(kāi)序列的104/105引物檢測(cè)內(nèi)源性HIP/PAP/Mo基因的表達(dá)。
19 正義5′cgc ccc gggatgctg cct ccc atg gcc ctg101反義5′cgc gaa tcc gcc cat gat gag ttg cac acc aaa c 3′104正義5′cgc gga ttc atg ctg cct cea aca gcc tgc t 3′105反義5′cgc aag ctt tta acc agt aaa ttt gca gac ata 3′HIP/PAP測(cè)定法western印跡分析、免疫組織化學(xué)和ELISA測(cè)試如上面所描述并按照Christa等，2000的方法從泌乳的轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中產(chǎn)生并純化HIP/PAP蛋白質(zhì)。如先前所描述(Christa等，1999)，使用pre-HIP抗體進(jìn)行Western印跡分析和免疫組織化學(xué)。按照制造商的說(shuō)明書(shū)(Dynabio，La Gaude，法國(guó))使用夾心ELISA測(cè)試分析血清HIP/PAP水平。
轉(zhuǎn)錄因子STAT3的活化通過(guò)TramsAM試劑盒(活性基序)并通過(guò)如先前所述開(kāi)展的Western印跡分析(Simon等，2003)，使用總的抗STAT3抗體和抗磷酸化STAT3抗體(Santa Cruz)研究轉(zhuǎn)錄因子STAT3的活化。
肝臟細(xì)胞因子表達(dá)通過(guò)如先前所述的RNA酶保護(hù)測(cè)定法(Tralhao JG，2002)評(píng)價(jià)肝臟細(xì)胞因子的表達(dá)。
APAP中毒如Bedda等，2003或Ferret P.J.等，2001所描述，通過(guò)致死劑量APAP(1000mg/kg)使HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠和C57BI6小鼠中毒。在向C57BI6小鼠腹膜內(nèi)注射APAP之前1小時(shí)，將重組HIP/PAP蛋白質(zhì)(600ng或1200ng)靜脈注射入小鼠。監(jiān)測(cè)動(dòng)物24小時(shí)，并且利用Kaplan-Meier方法計(jì)算存活率。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的結(jié)果表示為平均值±SD，并使用非配對(duì)Student′s檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)顯著性(P＜0.05)。由于數(shù)據(jù)分布不是正態(tài)分布，所以利用使用箱框和細(xì)線表示法通過(guò)摻入BrdU的細(xì)胞核的百分?jǐn)?shù)表示體內(nèi)肝再生，并且通過(guò)Mann-Whitney U檢驗(yàn)(P＜0.05)確定HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠之間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(Statview 5′，Abacus Concepts，Berkeley，CA)。
結(jié)果實(shí)施例1人HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠的特征HIP/PAP轉(zhuǎn)基因特異表達(dá)于肝臟，并且在接著的兩年之后表達(dá)HIP/PAP的小鼠沒(méi)有形成肝臟腫瘤。免疫組織學(xué)定位分析檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中HIP/PAP蛋白質(zhì)為彌散性肝細(xì)胞內(nèi)免疫染色，其占據(jù)了肝細(xì)胞的絕大部分細(xì)胞質(zhì)(圖2A，1和2)。染色是異質(zhì)的并且陽(yáng)性區(qū)域或者定位于小葉中心或者定位于肝腺泡的門(mén)管區(qū)。該種異質(zhì)分布可能反映了HIP/PAP的分泌作用，因此在HIP/PAP分泌之前或之后肝細(xì)胞分別是陽(yáng)性的或陰性的。HIP/PAP蛋白質(zhì)分泌到純合子轉(zhuǎn)基因系24和27的血清中(250ng/ml-700ng/ml)，并且分泌到原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)基中(對(duì)于每2×105個(gè)細(xì)胞為30-120ng/ml)。通過(guò)組織學(xué)檢查檢測(cè)到表達(dá)HIP/PAP肝細(xì)胞和對(duì)照肝細(xì)胞之間在形態(tài)學(xué)和倍數(shù)性沒(méi)有差異(如先前Leist等所描述，貼壁后80％的小鼠肝細(xì)胞是雙核的)。對(duì)培養(yǎng)的肝細(xì)胞的HIP/PAP免疫組織化學(xué)觀察顯示50％以上的肝細(xì)胞是HIP/PAP標(biāo)記的(圖2A、3和4)。對(duì)來(lái)自HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟提取物和原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的Western印跡分析檢測(cè)到HIP/PAP為16kDa的蛋白質(zhì)(圖2B)。在野生型小鼠中未檢測(cè)到HIP/PAP蛋白質(zhì)。肌動(dòng)蛋白雜交允許精確估算對(duì)于肝臟和肝細(xì)胞所加載的50μg蛋白質(zhì)(50μg對(duì)應(yīng)于大約50,000個(gè)肝細(xì)胞)。
實(shí)施例2在表達(dá)人HIP/PAP基因的小鼠中刺激肝再生為了測(cè)試體內(nèi)HIP/PAP對(duì)肝細(xì)胞增殖的效應(yīng)，檢測(cè)了通過(guò)部分肝切除術(shù)所誘導(dǎo)的肝再生。在部分肝切除術(shù)后24、36、46和55小時(shí)的低放大倍數(shù)(×20)圖顯示于圖3A。在所指定的時(shí)間，HIP/PAP轉(zhuǎn)基因肝臟中的陽(yáng)性BrdU細(xì)胞百分?jǐn)?shù)高于野生型肝臟，盡管兩組中摻入BrdU的細(xì)胞核的整體頻率低。部分肝切除術(shù)46小時(shí)后，HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠中摻入BrdU的核的百分?jǐn)?shù)(中位數(shù)33％，范圍20-42％)顯著高于野生型小鼠(中位數(shù)18％；范圍11-27％)(P＝0.0014)(圖3B)。為了補(bǔ)充在肝再生期間HIP/PAP蛋白質(zhì)可以作為生長(zhǎng)因子起作用這一假說(shuō)，在肝切除術(shù)后確立了野生型小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠中肝質(zhì)量恢復(fù)的時(shí)間過(guò)程(圖3C)。測(cè)量正常的非肝切除小鼠的動(dòng)物重量和肝臟重量。計(jì)算肝重/體重比率并表示為平均百分?jǐn)?shù)±SD。兩組之間該比率沒(méi)有差異對(duì)于野生型小鼠和HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠分別為0.0460±0.0064，n＝12和0.0489±0.0035，n＝16。在HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠中肝臟恢復(fù)比在野生型小鼠中的更高，并且在48小時(shí)(p＜0.001)、60小時(shí)(p＜0.003)和96小時(shí)(p＜0.002)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在120小時(shí)時(shí)，在野生型小鼠和HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠中肝臟重量均恢復(fù)至同一百分?jǐn)?shù)。
實(shí)施例3HIP/PAP在原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中的促有絲分裂作用為了進(jìn)一步研究在HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠肝切除術(shù)后在體內(nèi)所觀察到的增強(qiáng)肝再生作用，使用原代培養(yǎng)肝細(xì)胞來(lái)評(píng)價(jià)HIP/PAP的促有絲分裂作用。當(dāng)用EGF刺激時(shí)，在平板接種后60和84小時(shí)，來(lái)源于HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的肝細(xì)胞呈現(xiàn)出兩個(gè)DNA合成高峰(圖4A和B)。在60小時(shí)時(shí)，在轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠中BrdU陽(yáng)性肝細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)分別為31±7％(n＝19)和16±4％(n＝20)(p＜0.0001)。當(dāng)用HGF刺激細(xì)胞時(shí)，盡管差異未達(dá)到顯著水平，但是HIP/PAP肝細(xì)胞中的DNA合成也高于野生型肝細(xì)胞(在60小時(shí)后分別為41±14％，n＝4對(duì)31±11％，n＝4)。當(dāng)不用生長(zhǎng)因子刺激肝細(xì)胞時(shí)，在轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞和野生型肝細(xì)胞中BrdU摻入分別為11％±3(n＝8)和6％±3(n＝7)，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＝0.0146)。HIP/PAP是分泌蛋白質(zhì)，并且因此測(cè)試了HIP/PAP蛋白質(zhì)是否可以作為旁分泌促有絲分裂因子起作用。當(dāng)HIP/PAP蛋白質(zhì)(40ng.ml-1)加入到野生型肝細(xì)胞時(shí)，EGF誘導(dǎo)的DNA合成從16±4％增加至24±7％(p＝0.0168；n＝8；圖4C)。這些結(jié)果顯示HIP/PAP是原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的促有絲分裂因子。因此在體內(nèi)和體外都證明了HIP/PAP對(duì)肝細(xì)胞增殖的促有絲分裂作用。
實(shí)施例4HIP/PAP在原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中抵抗TNF-α+ActD所誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗細(xì)胞凋亡作用接下來(lái)檢測(cè)了HIP/PAP促有絲分裂作用是否與HIP/PAP抗細(xì)胞凋亡作用相關(guān)。原代培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞對(duì)于TNF-α單獨(dú)處理引起的細(xì)胞死亡不敏感。相反，暴露于TNF-α和低劑量ActD組合后，它們通過(guò)細(xì)胞凋亡而死亡(22)。小鼠肝細(xì)胞的細(xì)胞死亡可以由TNF-α和劑量低至0.05μg/ml的ActD組合誘導(dǎo)，盡管ActD(0.05μg ml-1)單獨(dú)不能誘導(dǎo)生活力的任何損失(圖5B)。已經(jīng)顯示(圖5A)表達(dá)HIP/PAP的肝細(xì)胞抵抗TNF-α+ActD處理16-17小時(shí)后所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。對(duì)于2ng ml-1TNF-α細(xì)胞存活率達(dá)到75％對(duì)43％(p＜0.0001)，并且對(duì)于20ng ml-1TNF-α細(xì)胞存活率達(dá)到60％對(duì)27％(p＜0.0001)。在HIP/PAP和野生型肝細(xì)胞中TNF-α的LD50分別超過(guò)40ng ml-1和1ng ml-1。使用泛caspase抑制劑z-VAD-fmk(50μM)預(yù)處理細(xì)胞完全防止了TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，因此表明該過(guò)程通過(guò)肝細(xì)胞的細(xì)胞凋亡而發(fā)生。還檢查了瀕死細(xì)胞是否呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的典型特征。當(dāng)使用Hoechst 33258染色時(shí)，非存活細(xì)胞表現(xiàn)出凝集的染色質(zhì)、片段化細(xì)胞核和凋亡小體，而活細(xì)胞不表現(xiàn)出這些特征。通過(guò)TNF-α誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡的凋亡小體特征為組織成“玫瑰花結(jié)”(圖5C)。當(dāng)將HIP/PAP蛋白質(zhì)(40ng ml-1)加入到野生型肝細(xì)胞時(shí)，抗20ng ml-1TNF-α+ActD的保護(hù)作用從27％增加至47％(p＜0.0001)。這些數(shù)據(jù)證明在原代肝細(xì)胞中HIP/PAP部分地消除了TNF-α所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
實(shí)施例5通過(guò)從HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠分離的肝細(xì)胞在小鼠內(nèi)刺激肝再生為了測(cè)試在少數(shù)肝臟細(xì)胞中的HIP/PAP表達(dá)對(duì)整個(gè)肝再生的作用，建立了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。因此開(kāi)展了從HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠和C57BL/6小鼠所分離肝細(xì)胞的肝細(xì)胞移植，并且然后在SCID受者小鼠中測(cè)試部分肝切除術(shù)后肝再生的程度。
使用兩種互補(bǔ)的方法評(píng)價(jià)肝細(xì)胞移植。第一，人HIP/PAP轉(zhuǎn)基因表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)在于可以通過(guò)使用HIP/PAP抗體的免疫組織化學(xué)方法監(jiān)測(cè)移植肝細(xì)胞的命運(yùn)。半定量測(cè)定表明移植的細(xì)胞僅構(gòu)成受者肝臟的1/1000以下。而且，顯示HIP/PAP表達(dá)于在肝臟切片中并不優(yōu)先分布的有限數(shù)量的肝細(xì)胞中(門(mén)管區(qū)或小葉中心區(qū))。第二，利用人HIP/PAP序列的存在以進(jìn)行RT-PCR。部分肝切除術(shù)之前，確實(shí)在受者SCID肝臟中檢測(cè)到人HIP/PAP的表達(dá)，因此證實(shí)了肝細(xì)胞移植。而且，在肝切除術(shù)后不同時(shí)間的肝切片中，人HIP/PAP持續(xù)表達(dá)。這些結(jié)果證明了移植的細(xì)胞持續(xù)刺激受者肝再生并保持基因表達(dá)。
然后評(píng)價(jià)了肝細(xì)胞的肝內(nèi)植入關(guān)于在部分肝切除術(shù)后肝再生程度的作用。對(duì)部分肝切除術(shù)后8天的肝臟的目視評(píng)價(jià)顯示用來(lái)自轉(zhuǎn)基因HIP/PAP小鼠的肝細(xì)胞移植的受者小鼠中肝臟質(zhì)量顯著增加(圖6A)。而且，通過(guò)肝臟重量測(cè)量也證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)，那就是用來(lái)自轉(zhuǎn)基因HIP/PAP小鼠的肝細(xì)胞移植的受者小鼠中肝臟質(zhì)量顯著更高(圖6B)。在部分肝切除術(shù)后48小時(shí)進(jìn)行的BrdU摻入分析確實(shí)證實(shí)了當(dāng)移植表達(dá)人HIP/PAP的肝細(xì)胞時(shí)細(xì)胞內(nèi)DNA合成顯著增加。因此750000個(gè)活肝細(xì)胞的移植足以增加肝再生。對(duì)肝臟的標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)檢查沒(méi)有顯示出任何明顯的形態(tài)學(xué)改變。
實(shí)施例6通過(guò)施用HIP/PAP在小鼠體內(nèi)刺激肝再生測(cè)試了注射純化HIP/PAP是否與移植一樣對(duì)肝再生具有作用。比較了部分肝切除術(shù)后8天SCID小鼠中剩余肝臟的重量，其中SCID小鼠已經(jīng)在部分肝切除術(shù)后36小時(shí)注射了100μl純化HIP/PAP(每只小鼠600ng)。圖7中顯示的結(jié)果表明，與注射PBS的小鼠相比注射HIP/PAP的小鼠中肝臟重量增加10％。該觀察證明了HIP/PAP蛋白質(zhì)的體內(nèi)促有絲分裂的旁分泌作用。
實(shí)施例7通過(guò)施用HIP/PAP在C57BI6小鼠中刺激肝再生和有絲分裂已經(jīng)比較了在C57BI6部分肝切除術(shù)后立即注射HIP/PAP蛋白質(zhì)對(duì)立即注射鹽水對(duì)部分肝切除術(shù)后46小時(shí)的肝質(zhì)量恢復(fù)、BrdU摻入和有絲分裂的作用(圖8)。部分肝切除術(shù)后46小時(shí)觀察到肝臟質(zhì)量恢復(fù)增加，盡管可能由于46小時(shí)在時(shí)間上太早而不能觀察到肝臟質(zhì)量的一致增加而導(dǎo)致該差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＝0.08)。無(wú)論如何，在HIP/PAP注射小鼠中存在BrdU摻入(p＜0.02)和有絲分裂數(shù)量(p＜0.04)的增加。
如通過(guò)每組小鼠平均數(shù)和中位數(shù)間的差異所估計(jì)，BrdU摻入和有絲分裂的分布是異質(zhì)的。通過(guò)使用中位數(shù)檢驗(yàn)(其是Ficher精確檢驗(yàn)的應(yīng)用)，已經(jīng)驗(yàn)證了注射HIP/PAP的小鼠代表了與注射N(xiāo)aCl的小鼠具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的一組小鼠(表1)表1
為了描繪HIP/PAP對(duì)肝再生的益處，已經(jīng)使用中位數(shù)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ陀脕?lái)根據(jù)BrdU和有絲分裂的組合中位數(shù)將小鼠分成四個(gè)名義上的組(圖9)。根據(jù)與有絲分裂相關(guān)的BrdU，對(duì)小鼠種群的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析已經(jīng)顯示與鹽水注射小鼠相比更多的HIP/PAP注射小鼠對(duì)于BrdU細(xì)胞核和有絲分裂肝細(xì)胞(處于細(xì)胞周期的S/M期的肝臟)都是陽(yáng)性的(p＝0.01)，這表明HIP/PAP能夠通過(guò)細(xì)胞周期加速肝細(xì)胞進(jìn)程。
實(shí)施例8肝再生時(shí)間過(guò)程期間肝臟細(xì)胞因子的表達(dá)和STAT3轉(zhuǎn)錄因子的活化為了使肝細(xì)胞起始進(jìn)入細(xì)胞周期的G1期，必須通過(guò)TNF-α和IL-6細(xì)胞因子引發(fā)肝再生。在IL-6控制下，STAT3轉(zhuǎn)錄因子被磷酸化活化并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核。然而，TNF-α/IL6表達(dá)和STAT3活化的持續(xù)性是有害的并且延遲再生的時(shí)間過(guò)程。已經(jīng)研究了HIP/PAP對(duì)肝臟細(xì)胞因子表達(dá)和STAT3活化的影響。在本上下文中，已經(jīng)比較了用HIP/PAP肝細(xì)胞對(duì)用對(duì)照肝細(xì)胞移植的SCID小鼠在PHX(部分肝切除術(shù))的T0和46小時(shí)后肝臟中的細(xì)胞因子的表達(dá)。RNA酶保護(hù)方法允許在一組4種提取物的同一實(shí)驗(yàn)中比較淋巴毒素-β(LT-β)、TNF-α和TGF-β((圖10；在PHX后T0(泳道a和c)和T46小時(shí)(泳道b和d)的HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠泳道a和b；SCID小鼠道c和d)。光密度分析將信號(hào)定量，其中信號(hào)已經(jīng)對(duì)兩個(gè)看家基因(L32和GAPDH)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果顯示當(dāng)使用HIP/PAP或?qū)φ崭渭?xì)胞進(jìn)行移植時(shí)TGF-β的肝臟表達(dá)沒(méi)有差異在PHX后46小時(shí)，TGF-β以相同程度增加。相反，在用HIP/PAP肝細(xì)胞移植的SCID肝臟中LTβ和TNF-α(兩種細(xì)胞因子屬于同一功能家族)的表達(dá)被抑制。這些結(jié)果顯示HIP/PAP抑制SCID肝臟中肝TNF-α的表達(dá)。
RNA酶保護(hù)方法不允許在SCID的肝再生期間檢測(cè)IL6的表達(dá)。然而，已經(jīng)在HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠和C57BI6小鼠中研究了轉(zhuǎn)錄因子STAT3活化的動(dòng)力學(xué)。在PHX后第一個(gè)24小時(shí)期間，相對(duì)于C57BI6小鼠在HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠中活化了細(xì)胞核磷酸化STAT3的積累/降解時(shí)間過(guò)程(圖11)。PHX后1小時(shí)就在HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠中檢測(cè)到活化作用，而在C57BI6小鼠中未檢測(cè)到(p＝0.02)。而且，一到12小時(shí)，HIP/PAP小鼠體內(nèi)的STAT3活化返回到比C57BI6小鼠中更低的水平(p＝0.04)。通過(guò)使用抗STAT3磷酸化抗體的western印跡分析驗(yàn)證并顯示了這些結(jié)果(圖11)。
實(shí)施例9HIP/PAP是抗APAP誘導(dǎo)急性肝衰竭的保護(hù)性藥物通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型能夠模擬人急性肝衰竭誘導(dǎo)，包括APAP(醋氨酚)中毒。APAP過(guò)量導(dǎo)致NAPQ1產(chǎn)量增加，NAPQ1是消耗細(xì)胞內(nèi)GSH庫(kù)的高反應(yīng)性代謝產(chǎn)物，GSH是具有氧化劑清除劑和氧化還原作用調(diào)節(jié)能力的非蛋白硫醇。因此，在小鼠APAP中毒期間，產(chǎn)生毒素活性氧(ROS)，導(dǎo)致急性肝衰竭。如在人類中一樣，在小鼠中單次大劑量APAP能夠引起大量小葉中心實(shí)質(zhì)破壞和肝細(xì)胞死亡。已經(jīng)研究了在APAP誘導(dǎo)的急性肝衰竭的小鼠模型中HIP/PAP蛋白質(zhì)的治療活性。為了該目的，已經(jīng)測(cè)試了HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)在野生型小鼠中所注射的致死劑量APAP的抗性。通過(guò)腹膜內(nèi)注射稀釋于200μL無(wú)菌磷酸緩沖鹽的致死劑量1000mg/ml(APAP1000)，在24只HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠和24只C57/bl6小鼠(每組中12只雄鼠和12只雌鼠)中實(shí)現(xiàn)了藥物誘導(dǎo)的急性肝衰竭。
存活時(shí)間顯示80％的HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠(雄性或雌性)存活超過(guò)24小時(shí)，在野生型對(duì)照組中僅為25％。這些結(jié)果表明雖然HIP/PAP蛋白質(zhì)作用于肝細(xì)胞的再生和生活狀態(tài)，但是對(duì)于以預(yù)防和治療肝衰竭為目標(biāo)的臨床治療應(yīng)用，HIP/PAP蛋白質(zhì)是好的候選藥物(圖12)。
為了研究HIP/PAP蛋白質(zhì)對(duì)APAP中毒的預(yù)防性旁分泌保護(hù)作用，在施用APAP之前1小時(shí)已經(jīng)通過(guò)C57BI6小鼠尾部靜脈注射入HIP/PAP蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示了HIP/PAP蛋白質(zhì)的劑量依賴性預(yù)防保護(hù)作用對(duì)于600ng，分別有4/10的HIP/PAP注射小鼠和2/10的鹽水注射小鼠存活；對(duì)于1200ng，分別有8/10的HIP/PAP注射小鼠和2/10的鹽水注射小鼠存活。
實(shí)施例10在長(zhǎng)期體內(nèi)跟蹤表達(dá)HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠期間，HIP/PAP蛋白質(zhì)為表現(xiàn)出毒性效應(yīng)能夠刺激肝細(xì)胞增殖的任何藥物具有引起癌癥的潛能，以致于在任何施用之前必須確定形成HCC的危險(xiǎn)性。已經(jīng)研發(fā)出或者處于小鼠白蛋白基因啟動(dòng)子下(兩個(gè)品系)或者處于小鼠金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子(兩個(gè)品系)控制下表達(dá)人HIP/PAP基因的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠模型。兩個(gè)模型都靶向肝臟中HIP/PAP基因表達(dá)和血中HIP/PAP蛋白質(zhì)的分泌。在兩年的追蹤后，沒(méi)有一個(gè)HIP/PAP表達(dá)小鼠發(fā)展成肝臟腫瘤(或其它腫瘤)。
實(shí)施例11HIP/PAP使易感染轉(zhuǎn)基因小鼠中HCC形成延遲已經(jīng)研究了HIP/PAP蛋白質(zhì)對(duì)來(lái)自雙轉(zhuǎn)基因小鼠長(zhǎng)期追蹤的肝臟致癌作用模型的影響。HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠(金屬硫蛋白啟動(dòng)子)與WHV/c-myc小鼠雜交，其中由旱獺肝炎(WHV)調(diào)控序列驅(qū)動(dòng)的c-myc的肝臟特異性表達(dá)在所有動(dòng)物中引起肝癌(Terradillos等，1997)。存活曲線顯示雙轉(zhuǎn)基因小鼠的T50是60周(n＝87只小鼠)，WHV/c-myc癌小鼠的T50為42周(n＝39只小鼠)，這是由Terradillos等(1997)公開(kāi)的中位數(shù)。對(duì)于HIP/PAP轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩幼仔陰性對(duì)照小鼠，存活曲線是相同的。因此，首先，在這些小鼠的壽命期間內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到HIP/PAP蛋白質(zhì)的毒性，并且其次，已經(jīng)顯示在攜帶兩個(gè)轉(zhuǎn)基因(即WHV/c-myc和HIP/PAP)的小鼠中延緩了HCC的發(fā)病(圖13)。
沒(méi)有證據(jù)表明長(zhǎng)期施用HIP/PAP具有毒性。而且，已經(jīng)觀察到在c-myc誘導(dǎo)肝癌的轉(zhuǎn)基因小鼠中HCC發(fā)病延緩。
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序列表<110>國(guó)立健康與醫(yī)學(xué)研究所勒內(nèi)德卡爾特大學(xué)<120>用于肝再生和預(yù)防肝衰竭的HIP/PAP多肽組合物<130>Q087FR-INSERM<140>
<141>
<160>1<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>175<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Leu Pro Pro Met Ala Leu Pro Ser Val Ser Trp Met Leu Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Met Leu Leu Ser Gln Val Gln Gly Glu Glu Pro Gln Arg Glu20 25 30Leu Pro Ser Ala Arg Ile Arg Cys Pro Lys Gly Ser Lys Ala Tyr Gly35 40 45Ser His Cys Tyr Ala Leu Phe Leu Ser Pro Lys Ser Trp Thr Asp Ala50 55 60Asp Leu Ala Cys Gln Lys Arg Pro Ser Gly Asn Leu Val Ser Val Leu65 70 75 80Ser Gly Ala Glu Gly Ser Phe Val Ser Ser Leu Val Lys Ser Ile Gly85 90 95
Asn Ser Tyr Ser Tyr Val Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly100 105 110Thr Glu Pro Asn Gly Glu Gly Trp Glu Trp Ser Ser Ser Asp Val Met115 120 125Asn Tyr Phe Ala Trp Glu Arg Asn Pro Ser Thr Ile Ser Ser Pro Gly130 135 140His Cys Ala Ser Leu Ser Arg Ser Thr Ala Phe Leu Arg Trp Lys Asp145 150 155 160Tyr Asn Cys Asn Val Arg Leu Pro Tyr Val Cys Lys Phe Thr Asp165 170 17權(quán)利要求
1.用于包括在慢性/急性肝衰竭之后體內(nèi)刺激肝再生的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑相組合的有效量的多肽，其中所述多肽包含與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑相組合的有效量的多肽，其中所述多肽由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑相組合的有效量的多肽，其中所述多肽包含與由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基27并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑相組合的有效量的多肽，其中所述多肽由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸殘基27并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑相組合的有效量的序列SEQ ID NO 1的人肝癌-腸-胰腺/胰相關(guān)蛋白質(zhì)(HIP/PAP)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，其用于治療已經(jīng)接受肝切除的患者。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，其用于治療部分肝臟移植的患者和因諸如肝炎；酒精、病毒、藥物或未知原因引起的肝硬化或者肝癌的肝臟疾病所引起肝衰竭的患者。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，其用于治療患有選自以下疾病的患者乙型肝炎、丙型肝炎、尿素循環(huán)不良、家族性高膽固醇血癥、酒精誘導(dǎo)的肝硬化、糖原貯積病、自身免疫性肝炎，、I型原發(fā)性尿草酸鹽過(guò)多、原因不明的肝硬化、I型克-納綜合征、先天性肝纖維化、尼曼病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、家族性淀粉樣變、膽道閉鎖、肝細(xì)胞癌、原發(fā)性硬化性膽管炎、肝母細(xì)胞瘤、阿拉日耶綜合征、血管內(nèi)皮瘤、家族性膽汁郁積、Non-Carciniodneuro-endocrine、藥物誘導(dǎo)的肝衰竭、良性肝腫瘤例如灶性結(jié)節(jié)性增生、肝腫瘤如肝細(xì)胞癌和膽管癌、急性/暴發(fā)性肝衰竭、巴-希綜合征、α1抗胰蛋白酶缺乏癥、威爾遜病、血色素沉著病、酪氨酸血癥、原卟啉癥和囊性纖維化。
9.對(duì)肝臟壞死具有有限有害效應(yīng)的藥物組合物，其包含(i)治療有效量的肝毒性化合物，和(ii)有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的多肽。
10.組合物，其包含與權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述多肽相組合的分裂肝細(xì)胞。
11.包含已經(jīng)用表達(dá)盒轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞的組合物，其中所述表達(dá)盒驅(qū)動(dòng)根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述多肽在所述的轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞中表達(dá)。
12.組合物，其包含與根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述多肽相組合的有效量的骨髓干細(xì)胞。
13.用于體內(nèi)刺激肝再生的藥物組合物，其包含有效量的根據(jù)權(quán)利要求10-12中任意一項(xiàng)所述的組合物。
14.體外刺激肝細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程，其包括(a)收集肝細(xì)胞；(b)在適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述肝細(xì)胞；和(c)用促有絲分裂量的根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的多肽處理所述肝細(xì)胞。
15.體外刺激肝細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程，其包括(a)收集肝細(xì)胞；(b)在適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述肝細(xì)胞；和(c)用驅(qū)動(dòng)HIP/PAP蛋白質(zhì)在所述轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)盒轉(zhuǎn)染所述肝細(xì)胞。
16.體外處理骨髓干細(xì)胞的過(guò)程，其包括(a)收集骨髓干細(xì)胞；(b)在適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述骨髓干細(xì)胞；和(c)用促有絲分裂量的根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的多肽處理所述骨髓干細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的多肽的用途，其用于制造用于體內(nèi)刺激肝再生的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明基于HIP/PAP對(duì)原代培養(yǎng)肝細(xì)胞具有體外促有絲分裂作用和抗細(xì)胞凋亡作用的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)。而且，在肝衰竭和肝再生期間，HIP/PAP是肝細(xì)胞的體內(nèi)促有絲分裂分子和抗細(xì)胞凋亡分子。本發(fā)明還基于HIP/PAP的施用在哺乳動(dòng)物中沒(méi)有有害效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明涉及包括慢性/急性肝衰竭后用于體內(nèi)刺激肝再生的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑相組合的有效量的多肽，其中所述多肽包含與由序列SEQ ID NO1中起始于氨基酸殘基36并終止于氨基酸殘基175的氨基酸序列組成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
文檔編號(hào)A61P1/16GK1835764SQ200480023661
公開(kāi)日2006年9月20日 申請(qǐng)日期2004年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月18日
發(fā)明者L·克里斯塔, C·布雷紹, M－T·西蒙－加熱－蘇夫洛, A·波盧安, J·G·特拉良 申請(qǐng)人:國(guó)立健康與醫(yī)學(xué)研究所, 勒內(nèi)德卡爾特大學(xué)