專利名稱：抑制腫瘤生長(zhǎng)的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)于治療癌癥和HIV疾病具有增強(qiáng)活性的新樺木酸衍生物，一種制備這些新樺木酸衍生物的方法及其用作藥物的用途。同樺木酸一樣，本發(fā)明化合物適于臨床應(yīng)用于人類和動(dòng)物以抑制不同腫瘤(黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、鱗狀細(xì)胞癌和下文提及的其他腫瘤)的生長(zhǎng)，還能夠治療HIV疾病，并且由于它們具有抗炎活性其還可用于治療非特異性炎性疾病。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有通式(I)結(jié)構(gòu)的新樺木酸衍生物 其中R1代表羥基、氨基、被保護(hù)羥基或被保護(hù)氨基。適合的保護(hù)基團(tuán)在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，例如“Protective Groups in OrganicSynthesis”，T.W.Greene and P.G..M.Wuts，3rdEdition，John Wiley &Sons，Inc.(1999)第2章和第7章所公開的內(nèi)容，這些公開的內(nèi)容在此引用作為參考；和R2＝ 特別是，本發(fā)明涉及具有上文所述通式(I)結(jié)構(gòu)的新樺木酸衍生物，其中R1代表羥基、氨基或下述被保護(hù)羥基或被保護(hù)氨基之一 R2如上文所述。
本發(fā)明化合物是新的樺木酸衍生物，它們具有增強(qiáng)的活性并且在極性溶劑中具有更好的溶解性，因此顯著提高了應(yīng)用選擇性。當(dāng)然地，本發(fā)明化合物任何可能的鹽及包合物均被涵蓋在前述通式(I)的范圍內(nèi)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種制備通式(I)化合物的方法，其中被取代基R1適當(dāng)保護(hù)的樺木酸鹵化物，特別是樺木酸氯化物，與被適當(dāng)取代的醇或胺反應(yīng)以獲得取代基R2。如果需要，制得的通式(I)化合物可以通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法對(duì)選擇的保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行去保護(hù)，以獲得其中R1基團(tuán)代表羥基或氨基的通式(I)化合物，其中所述通式(I)化合物中的R1基團(tuán)本來(lái)代表被保護(hù)的羥基或氨基。
用作本發(fā)明化合物起始和對(duì)照化合物的天然樺木酸是上世紀(jì)初就被分離出的一種三萜烯。名字起源于作為樺樹成分的醇樺木素，其在樺樹中的數(shù)量很多。樺木酸具有抗瘧疾、抗炎、抗HIV和抗腫瘤作用，這在很多不同的出版物中已經(jīng)被報(bào)道過了。作為一種化學(xué)治療劑，樺木酸誘導(dǎo)了各種器官腫瘤細(xì)胞(例如黑素瘤細(xì)胞)中所謂的程序性細(xì)胞死亡，也稱作細(xì)胞調(diào)亡。在人和小鼠模型中，體內(nèi)和體外均檢測(cè)到了對(duì)黑素瘤中的抗增殖作用。特別是在黑素瘤細(xì)胞中，雖然黑色素細(xì)胞對(duì)這種物質(zhì)具有很強(qiáng)的抵抗性，樺木酸仍能夠特異性誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞中毀滅。對(duì)于數(shù)據(jù)，幾乎沒有獲得任何數(shù)據(jù)能夠證明樺木酸和其他細(xì)胞抑制劑之間存在可能的協(xié)同作用。S.Fulda(兒童醫(yī)院，Ulm)研究組特別詳細(xì)地研究了初期腫瘤(尤因肉瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤)和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的分子作用機(jī)理。
樺木酸及其已知衍生物在科技文獻(xiàn)中已報(bào)道的其它已知作用包括能夠抑制HIV病毒復(fù)制、和受體結(jié)合的拮抗HIV病毒的活性，以及具有抗炎作用，這一點(diǎn)例如可以通過小鼠耳炎癥模型進(jìn)行說(shuō)明。由于其抗增殖作用能夠抑制各種腫瘤(黑素瘤、神經(jīng)外胚層瘤、肉瘤)，動(dòng)物試驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)都證明了這一點(diǎn)，因此樺木酸是一種非常令人感興趣的物質(zhì)，它既能夠單獨(dú)使用也可能與其他細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性物質(zhì)以及細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用，例如抑制各種抗細(xì)胞凋亡Bcl-2家族成員特別是Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-2的反義寡核苷酸。
樺木酸對(duì)黑素瘤、尤因肉瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和成神經(jīng)管細(xì)胞瘤的作用機(jī)理的公開表明了，所述作用實(shí)質(zhì)上是由編程性細(xì)胞死亡在線粒體水平的誘導(dǎo)作用所引起的。目前仍不清楚細(xì)胞內(nèi)存在什么樣的攻擊主要點(diǎn)；無(wú)論是對(duì)可能的結(jié)合位點(diǎn)(受體)，還是初始信號(hào)途徑，都還沒有進(jìn)行過充分地研究。然而，本發(fā)明人和其他作者都能夠證明樺木酸在惡性細(xì)胞中誘導(dǎo)了細(xì)胞調(diào)亡，然而人類黑色素細(xì)胞甚至正常細(xì)胞都表現(xiàn)出比惡性細(xì)胞低的敏感性。這種觀察結(jié)果是非常有趣的，尤其是還因?yàn)樾∈蟮膭?dòng)物試驗(yàn)數(shù)據(jù)沒有顯示出任何顯著的毒性。除了在細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的那些數(shù)據(jù)，還暗示了樺木酸在腫瘤組織中比在正常組織中的濃度更高。還對(duì)各種Bcl-2家族成員在黑素瘤細(xì)胞和正常黑色素細(xì)胞中的被誘導(dǎo)情況以及在肉瘤中的被誘導(dǎo)情況進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)樺木酸在數(shù)小時(shí)內(nèi)能夠誘導(dǎo)抗細(xì)胞凋亡蛋白Mcl-1的表達(dá)。該基因組其他被檢查的蛋白尤其是Bcl-2和Bcl-3，以及p53蛋白的表達(dá)在治療條件下保持不變。科技文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)顯示樺木酸的作用不依賴于p53蛋白質(zhì)。既然近期研究表明Bcl-2和Bcl-xL能夠抑制樺木酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這些觀察結(jié)果提示了可以用樺木酸拮抗Bcl-2和/或Bcl-xL，例如通過反義寡核苷酸(ASO)。同樣的考慮也可應(yīng)用于與例如Mcl-1ASOs的可能性聯(lián)合?？赡艿呐c臨床相關(guān)的樺木酸的一個(gè)性質(zhì)在于近期的觀察結(jié)果，即其細(xì)胞毒性在低pH培養(yǎng)基中有所增強(qiáng)。很多腫瘤中的pH值低于正常組織(Noda Y.et al，1997)。同一作者發(fā)現(xiàn)樺木酸抑制靜息細(xì)胞比抑制生長(zhǎng)期中的細(xì)胞活性更強(qiáng)。這一性質(zhì)可能是臨床應(yīng)用中的附加相關(guān)性，雖然很多化學(xué)療法以及放射療法對(duì)抑制靜息和/或酸中毒細(xì)胞群的效果更差。
目前，尤其對(duì)黑素瘤、神經(jīng)外胚層瘤、肉瘤和HIV進(jìn)行了最深入的研究。這些腫瘤特別難以治療，其主要的全身性疾病形式基本上沒有治療選擇性。對(duì)于患有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的患者，治療選擇性極大地受限于數(shù)種物質(zhì)。包括5-(3，3-二甲基-2-三氮烯基)-1-H-咪唑-4-氨甲酰(氮烯唑胺，DTIC)。氮烯唑胺還構(gòu)成了黑素瘤中最有效的單一療法，顯示出約30％的應(yīng)答率。與其他合成物質(zhì)或重組體的聯(lián)合療法在相同的臨床研究中具有更高的應(yīng)答率，所述合成物質(zhì)或重組體例如是BCNU、順鉑、他莫西芬、干擾素-α和白介素-2。然而，這些受限于時(shí)間和隨之而來(lái)提高的毒性。衍生自天然產(chǎn)物的一些物質(zhì)例如阿霉素、博萊霉素、依托泊苷及其他物質(zhì)，對(duì)于其抗黑素瘤活性及其毒性進(jìn)行了研究。然而，在臨床日常工作中這些物質(zhì)最后全部沒有被證明具有上述性質(zhì)。
實(shí)施例在下文中，本發(fā)明方法將通過一些實(shí)施例進(jìn)行更加詳細(xì)地說(shuō)明，但本發(fā)明的公開并不受限于這些實(shí)施例。
1)乙酰樺木酸-2-氨基-3-羥基-2-羥基甲基丙基酯IV(化合物B) 乙酰樺木酸-2-氨基-3-羥基-2-羥基甲基丙基酯IV通過下述步驟進(jìn)行合成樺木酸先生成中間體乙酰樺木酸II，然后得到相應(yīng)的酸氯化物III，將酸氯化物III與氨基丁三醇反應(yīng)。
a)乙酰樺木酸(MW 498.74)II將含有2g樺木酸I(MW 456.70)的50ml醋酸酐加熱回流2小時(shí)。冷卻后，劇烈攪拌下將反應(yīng)液倒入冰水中，過濾，用水洗滌得到的固體物質(zhì)直至乙酸的氣味消失。
然后將固體在70℃乙醇中加熱回流4小時(shí)，整個(gè)過程進(jìn)行攪拌。
冷卻后，過濾反應(yīng)液，輕度濃縮母液，然后在冰浴中進(jìn)行冷卻，再次過濾。收率86％；mp.290℃。
b)乙酰樺木酸氯化物(MW 517.18)III將2g乙酰樺木酸II加入干燥的苯中，然后加入10倍量草酰氯(3.4ml)。冷卻條件下將反應(yīng)混合物攪拌8小時(shí)，隨后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸除溶劑和過量的草酰氯。為了去除任何殘留的草酰氯，再加入另外20ml苯并在真空中蒸發(fā)。
c)乙酰樺木酸-2-氨基-3-羥基-2-羥基甲基丙基酯(MW 601.86)IV，(化合物B)對(duì)于通過b)步驟的方法從1g乙酰樺木酸(約0.002mol)制得的酸氯化物不再經(jīng)過另外的純化而直接進(jìn)行下面的反應(yīng)。將其溶解于35ml二噁烷(干燥)中，然后再加入2倍量的氨基丁三醇(0.004mol，0.5g)。加入三勺尖DMAP和3滴吡啶，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2天。
上述步驟之后，過濾出固體，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮溶液并吸入氯仿中。在沒有吡啶的條件下使用1％鹽酸、水和飽和鹽水溶液洗滌氯仿溶液數(shù)次。Na2SO4進(jìn)行干燥，然后移除溶劑，將產(chǎn)品通過硅膠柱或(和)色譜管(chromatotron)進(jìn)行純化。使用10∶1的氯仿-甲醇混合物作為洗脫液。收率20％，mp.156℃。
2)乙酰樺木酸-N-(1，1-二(羥甲基)-2-羥基-乙基)甲酰胺(MW601.86)，(化合物C) 乙酰樺木酸-N-(1，1-二(羥甲基)-2-羥基-乙基)甲酰胺(MW601.86)，(化合物C)的合成與反應(yīng)路線1相似，樺木酸先生成中間體乙酰樺木酸II，然后得到相應(yīng)的酸氯化物III，將酸氯化物III與氨基丁三醇反應(yīng)。
對(duì)于通過1)b)步驟的方法從1g乙酰樺木酸(約0.002mol)制得的酸氯化物不再經(jīng)過另外的純化而直接進(jìn)行下面的反應(yīng)。將其溶于35ml無(wú)水二噁烷中，然后加入等摩爾量的氨基丁三醇(0.002mol，0.25g)。加入1勺尖DMAP和3滴吡啶，然后將反應(yīng)混合物加熱至80℃，并保持8小時(shí)。這些步驟之后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮反應(yīng)溶液，并用氯仿吸收殘留物。在沒有吡啶的條件下使用1％鹽酸、水和飽和鹽水溶液洗滌氯仿溶液數(shù)次。使用Na2SO4進(jìn)行干燥，然后移除溶劑，將產(chǎn)品通過硅膠柱或(和)色譜管進(jìn)行純化。使用10∶1的氯仿-甲醇混合物作為洗脫液。收率15％，mp.184℃。
接下來(lái)，將通過與樺木酸(對(duì)比化合物A)的比較說(shuō)明本發(fā)明化合物在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面的用途。
各種腫瘤的生長(zhǎng)抑制實(shí)施例1和2說(shuō)明了對(duì)比化合物A(樺木酸)和一種新衍生物(化合物B)在成對(duì)生長(zhǎng)測(cè)試(第1天單獨(dú)使用指示濃度的各個(gè)化合物，3天后細(xì)胞計(jì)數(shù)的降低)中的直接對(duì)比結(jié)果。
實(shí)施例148小時(shí)后化合物(A)(樺木酸)與化合物(B)(經(jīng)保護(hù)的樺木酸三酯)對(duì)黑素瘤細(xì)胞518A2(來(lái)自Perter Schrier，Leiden，TheNetherlands)生長(zhǎng)抑制的對(duì)照。X軸代表的是化合物A和B的濃度(μg/ml)，相應(yīng)地，Y軸是相對(duì)于未處理對(duì)照組的細(xì)胞存活百分率。
對(duì)照化合物(A)的ED50值約為5μg/ml，化合物(B)約為0.7μg/ml。
化合物(B) 由此可見，化合物(B)比化合物(A)具有更強(qiáng)的活性，即增強(qiáng)了7倍。
在肉瘤中也觀察到了相似的增強(qiáng)活性，下文實(shí)施例將進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例2對(duì)比化合物(A)(樺木酸)與化合物(B)(經(jīng)保護(hù)的樺木酸三酯)對(duì)于脂肉瘤(ATCC HTB-92)的功效對(duì)照。X軸代表化合物A和B的濃度(μg/ml)，相應(yīng)地，Y軸是相對(duì)于未處理對(duì)照組的細(xì)胞存活百分率。
對(duì)照化合物(A)的ED50值約為2.5μg/ml，化合物(B)約為0.9μg/ml。
實(shí)施例3本發(fā)明不同樺木酸衍生物和對(duì)比化合物(樺木酸)對(duì)于各種黑素瘤-肉瘤的功效對(duì)照。每個(gè)數(shù)值指的是相對(duì)于未處理細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞存活百分率(平均值)。
3a)對(duì)照化合物(A)(樺木酸)-對(duì)脂肉瘤ATCC HTB-92的作用濃度μg/ml 存活率％0.398.00.692.81 92.31.25 79.52.549.35 20.810 15.73b)化合物(B)(經(jīng)保護(hù)的樺木酸三酯)-對(duì)脂肉瘤ATCC HTB-92的作用濃度μg/ml存活率％0.3 89.50.6 70.71 12.01.25 2.92.5 3.05 0.0100.03c)化合物(B)(經(jīng)保護(hù)的樺木酸三酯)-對(duì)黑素瘤518A2的作用濃度μg/ml存活率％0.3 83.00.6 56.31 11.31.25 10.32.5 2.85 0.0100.03d)化合物(C)(經(jīng)保護(hù)的樺木酸三酯)-對(duì)黑素瘤518A2和脂肉瘤ATCC HTB-92的作用化合物(C)
濃度μg/ml 黑素瘤中的存活率％0.25 960.5 93167.5濃度μg/ml 脂肉瘤中的存活率％0.3 960.6 821.0 81實(shí)施例4化合物(B)(經(jīng)保護(hù)的樺木酸三酯)在HBC(2-羥丙基-β-環(huán)糊精，Sigma，cat.No.H-107)或HGC(2-羥丙基-γ-環(huán)糊精，Sigma，cat.No.H-125)中的包合物的制備。
化合物(B) 各種用于進(jìn)一步稀釋的母液將在下文中進(jìn)行描述。50或100mg/ml的化合物(B)分別溶于EtOH中。HBC單獨(dú)溶解在水或者水加EtOH中。操作步驟的更多模型基本上與Sigma提供的數(shù)據(jù)圖表所公開的內(nèi)容一致。沒有嘗試去調(diào)節(jié)pH?；衔?B)在水溶液中的溶解性通過包合在HBC或類似化合物例如γ-環(huán)糊精中得到了進(jìn)一步的提高。
測(cè)試#1化合物(B)50mg/ml照常溶于EtOH中測(cè)試#2化合物(B)5.9mg/ml在266mg/ml的HBC水溶液中測(cè)試#3化合物(B)20mg/ml在266mg/ml的HBC50％EtOH/50％水溶液中測(cè)試#4化合物(B)25mg/ml在200mg/ml的HGC50％EtOH/50％水溶液中上文所述母液使用EtOH稀釋至1mg/ml，然后直接加入培養(yǎng)基中。
4a)作為HBC(2-羥丙基-β-環(huán)糊精)或HGC(2-羥丙基-γ-環(huán)糊精)包含物的化合物(B)(經(jīng)保護(hù)的樺木酸三酯)-對(duì)于黑素瘤系518A2的作用單獨(dú)使用藥物后第3天細(xì)胞培養(yǎng)的存活率及所有其他數(shù)據(jù)測(cè)試#1濃度μg/ml 黑素瘤中的存活率％1.0502.00.53.00.04.00.0測(cè)試#2濃度μg/ml 黑素瘤中的存活率％1.0652.0253.00.04.00.0
測(cè)試#3濃度μg/ml 黑素瘤中的存活率％1.0772.0243.00.04.00.0測(cè)試#4濃度μg/ml 黑素瘤中的存活率％1.0592.043.00.04b)作為HGC(2-羥丙基-γ-環(huán)糊精)包合物的化合物(B)(經(jīng)保護(hù)的樺木酸三酯)在小鼠模型中的耐受性方法論將溶于水中的HGC/化合物(B)復(fù)合物靜脈注射入無(wú)病原體的雌性C.B.-17scid/scid(SCID)小鼠(4-6周齡，Harlan Winkelmann，Borchen，Germany)的尾部靜脈。包合物根據(jù)實(shí)施例4的方法進(jìn)行制備。冷凍干燥混合物除去乙醇，隨后重新溶于水中。用于下述試驗(yàn)的注射液總體積為200μl。
測(cè)試#1首先，每三天對(duì)兩只小鼠使用100μg HGC/化合物(B)復(fù)合物治療三次。在良好耐受性的例子中，下一對(duì)小鼠使用如下方案中的更高劑量進(jìn)行治療。
方案A組3次100μg HGC/化合物(B)復(fù)合物B組3次200μg HGC/化合物(B)復(fù)合物
C組3次400μg HGC/化合物(B)復(fù)合物然后從A組開始繼續(xù)進(jìn)行治療A組3次800μg HGC/化合物(B)復(fù)合物B組3次1500μg HGC/化合物(B)復(fù)合物由于出現(xiàn)局部刺激現(xiàn)象，隨后停止了試驗(yàn)。
由于兩只小鼠中的一只出現(xiàn)了強(qiáng)烈的局部刺激現(xiàn)象，在1500μgHGC/化合物(B)復(fù)合物處中斷了試驗(yàn)，但沒有產(chǎn)生任何顯著的系統(tǒng)毒性?？傊?，每只小鼠注射使用800μg HGC/化合物(B)復(fù)合物不會(huì)產(chǎn)生顯著毒性。在更高濃度時(shí)(每只小鼠大約＞1.5mg HGC/化合物(B)復(fù)合物)，觀察到了局部刺激現(xiàn)象?？梢灶A(yù)料到的是，更低的輸注率可以幫助避免此類副作用。
測(cè)試#2在3只小鼠試驗(yàn)組中，每三天對(duì)每一只小鼠使用800μg HGC/化合物(B)復(fù)合物，6次一組。同樣地，沒有顯示出任何顯著的臨床毒性作用。隨后的尸體檢驗(yàn)沒有發(fā)現(xiàn)任何肉眼可見的器官變化。
權(quán)利要求
1.具有通式(I)結(jié)構(gòu)的新樺木酸衍生物及其鹽和包合物 其中R1代表羥基、氨基、被保護(hù)羥基或被保護(hù)氨基，并且R2＝
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1代表羥基、氨基或下述被保護(hù)的羥基或氨基之一 并且R2如上文定義。
3.一種制備權(quán)利要求1或2所述化合物的方法，其特征是將被取代基R1適當(dāng)保護(hù)的樺木酸鹵化物，與被適當(dāng)取代醇或胺反應(yīng)以制得取代基R2，從而使得到所得到通式(I)化合物中R1所代表的被保護(hù)的羥基或氨基已經(jīng)被托保護(hù)，如果需要，制得通式(I)中R1基團(tuán)代表羥基或氨基的化合物。
4.權(quán)利要求1或2的化合物作為藥物的用途。
5.權(quán)利要求1或2的化合物在制備用于抑制腫瘤例如黑素瘤和神經(jīng)外胚層瘤生長(zhǎng)，和/或治療哺乳動(dòng)物肉瘤和HIV疾病的藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1或2的化合物在制備與其他細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性物質(zhì)和細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用的藥物中的用途，所述細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性物質(zhì)和細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)物質(zhì)例如是抑制各種抗細(xì)胞凋亡Bcl-2家族成員，特別是Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1的反義寡核苷酸。
7.一種包括權(quán)利要求1或2所述任一化合物的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)于治療癌癥和HIV疾病具有增強(qiáng)活性的新樺木酸衍生物，一種制備這些新樺木酸衍生物的方法及其用作藥物的用途。
文檔編號(hào)A61K31/56GK1747964SQ200480003907
公開日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2004年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月11日
發(fā)明者布克哈德·揚(yáng)森, 賴因哈德·帕施克, 埃德加·澤爾策 申請(qǐng)人:諾瓦利克斯制藥公司