專(zhuān)利名稱(chēng)：雌激素受體α調(diào)節(jié)劑在治療多發(fā)性硬化癥中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及治療自身免疫疾病的療法，更具體地說(shuō)，涉及具有雌激素受體α(ERα)激動(dòng)劑活性的化合物在治療自身免疫疾病中的用途。具體而言，本發(fā)明涉及選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMS)在治療自身免疫疾病中的用途。此外，本發(fā)明涉及選擇適用于治療自身免疫疾病的化合物的方法。
背景技術(shù)：
多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，簡(jiǎn)稱(chēng)為MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的自身免疫疾病，其中免疫系統(tǒng)對(duì)髓磷脂成分作出不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)。其特征為CNS發(fā)炎以及髓磷脂損傷。CD4+輔助T-細(xì)胞-1(TH-1)細(xì)胞及其產(chǎn)物(例如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(TNF-γ)以及金屬蛋白酶)在很大程度上介導(dǎo)了該免疫病理過(guò)程。
與很多自身免疫疾病相同，多發(fā)性硬化癥在女性中的發(fā)病率(2至3倍)高于男性1。雌激素在MS中的免疫調(diào)節(jié)作用已被證實(shí)。例如，在懷孕期間臨床病癥得以改善，此時(shí)雌激素水平較高；而在產(chǎn)后階段則惡化2-4。此外，已經(jīng)報(bào)道給予雌二醇的MS患者的癥狀得以改善5。雌激素可能直接影響T細(xì)胞的功能，來(lái)自MS患者的T細(xì)胞克隆的細(xì)胞因子生產(chǎn)的調(diào)節(jié)已被證實(shí)6-8。此外，在這些細(xì)胞中，雌三醇對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制已被證實(shí)8。
也已證明雌激素調(diào)節(jié)鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)中的疾病活性，該模型是用于多發(fā)性硬化癥的成熟模型9-13。該模型用于測(cè)試采用SERMS/組織選擇性雌激素(TSEs)和雌激素受體α選擇性激動(dòng)劑的治療方法。
SERMS是一類(lèi)與雌激素受體結(jié)合并表現(xiàn)出組織選擇性作用的藥物。例如，SERM雷洛昔芬(raloxifene)對(duì)骨、脂質(zhì)和凝血因子具有雌激素激動(dòng)作用，對(duì)乳房和子宮具有雌激素拮抗作用19。SERMS可能包括1)此前被認(rèn)為是抗雌激素的試劑，例如16-表雌三醇、乙胺氧三苯醇、氯米芬及他莫昔芬(tamoxifen)；2)19-去甲睪酮衍生物、替勃龍；3)雷洛昔芬及其類(lèi)似物；以及4)新的三苯乙烯衍生物，例如屈落昔芬(droloxifene)、妥瑞咪芬(toremifene)、艾多昔芬(idoxifene)和levomeloxifene19。SERMS與內(nèi)源性雌激素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體，并可能激活或阻斷雌激素的作用19。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供通過(guò)給予具有雌激素受體α活性的試劑特別是SERMS來(lái)治療自身免疫疾病(pathology)的新方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種治療哺乳動(dòng)物中的自身免疫疾病的方法，包括給予所述哺乳動(dòng)物至少一種具有雌激素受體α激動(dòng)劑活性的試劑，所述試劑的量足以減少TH-1和/或TH-2細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
本發(fā)明提供了一種治療哺乳動(dòng)物中的自身免疫疾病的方法，包括給予所述哺乳動(dòng)物選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，所述選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑的量足以減少TH-1和/或TH-2細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
本發(fā)明還提供了一種篩選適用于治療多發(fā)性硬化癥的化合物的方法，包括選擇具有雌激素受體α激動(dòng)劑活性的化合物。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明在閱讀了詳細(xì)說(shuō)明和附圖之后，可以更充分地理解本發(fā)明，其中附圖形成了本申請(qǐng)的一部分。


圖1A示出了ER拮抗劑ICI對(duì)雌激素介導(dǎo)的疾病抑制的作用。
圖1B示出了雷洛昔芬相對(duì)于化合物A對(duì)EAE的作用。
圖2示出了ER選擇性配體對(duì)EAE的作用。
圖3A示出了體內(nèi)給予ER選擇性配體對(duì)EAE小鼠脾細(xì)胞TNF-α的產(chǎn)生的作用。
圖3B示出了體內(nèi)給予ER選擇性配體對(duì)EAE小鼠脾細(xì)胞IL-4的產(chǎn)生的作用。
圖3C示出了體內(nèi)給予ER選擇性配體對(duì)EAE小鼠脾細(xì)胞IFN-γ的產(chǎn)生的作用。
圖3D示出了體內(nèi)給予ER選擇性配體對(duì)EAE小鼠脾細(xì)胞IL-5的產(chǎn)生的作用。
圖3E示出了體內(nèi)給予ER選擇性配體對(duì)EAE小鼠脾細(xì)胞IL-2的產(chǎn)生的作用。
圖3F示出了體內(nèi)給予ER選擇性配體對(duì)EAE小鼠脾細(xì)胞IL-10的產(chǎn)生的作用。
圖4A示出了化合物對(duì)抗原刺激后CD4-細(xì)胞增殖的作用。
圖4B示出了化合物對(duì)抗原刺激后CD4+細(xì)胞增殖的作用。
圖5A示出了化合物對(duì)抗原刺激后效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)TNF-α的產(chǎn)生的作用。
圖5B示出了化合物對(duì)抗原刺激后效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)IFN-γ的產(chǎn)生的作用。
圖5C示出了化合物對(duì)抗原刺激后效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)IL-4的產(chǎn)生的作用。
圖5D示出了化合物對(duì)抗原刺激后效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)IL-2的產(chǎn)生的作用。
發(fā)明詳述如此處所公開(kāi)的，給予哺乳動(dòng)物具有雌激素受體α激動(dòng)劑活性的試劑降低了自身免疫疾病的嚴(yán)重性。這些效果可能部分地是因?yàn)榇祟?lèi)激動(dòng)劑減少了疾病位點(diǎn)處或其周邊的T細(xì)胞產(chǎn)生的TH1和/或TH-2細(xì)胞因子。
因此，本發(fā)明提供了一種治療哺乳動(dòng)物中的自身免疫疾病的方法，包括給予所述哺乳動(dòng)物具有雌激素受體α激動(dòng)劑活性的試劑，所述試劑的量足以減少TH-1和/或TH-2細(xì)胞因子的產(chǎn)生。本發(fā)明還提供了一種治療哺乳動(dòng)物中的自身免疫疾病的方法，包括給予所述哺乳動(dòng)物選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，所述選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑的量足以減少TH-1和/或TH-2細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
本發(fā)明的方法可以用于多種自身免疫疾病。此類(lèi)疾病是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于多發(fā)性硬化癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、自身免疫性甲狀腺炎、葡萄膜炎(uvetis)、重癥肌無(wú)力、炎癥性腸病和Sjgren’s綜合征。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物可以是雌性、雄性、人類(lèi)或非人類(lèi)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，具有雌激素受體α激動(dòng)劑活性的試劑通過(guò)選自口服、經(jīng)皮、呼吸、皮下及靜脈內(nèi)給藥的途經(jīng)給藥。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述TH-1細(xì)胞因子選自TNF-α、IFN-γ和IL-2，所述TH-2細(xì)胞因子選自IL-4、IL-5和IL-10。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，TH-1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的特征在于前炎癥細(xì)胞因子的分泌，包括TNF-α、IFN-γ和IL-2。TH-2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的特征在于抗炎細(xì)胞因子例如IL-4、IL-5和IL-10的分泌。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，TH-1細(xì)胞因子的產(chǎn)生被給予的試劑所抑制。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，TH-1和TH-2細(xì)胞因子的產(chǎn)生被抑制。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，TH-1細(xì)胞因子的產(chǎn)生被抑制，而TH-2細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加。
作為一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，ERα激動(dòng)劑表現(xiàn)出抗炎活性，例如NF-κB活性的降低。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，ERα激動(dòng)劑是非甾族的。
在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，SERM選自雷洛昔芬、他莫昔芬、拉索昔芬、艾多昔芬、屈落昔芬、bazedoxifene、妥瑞咪芬及其衍生物和類(lèi)似物。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑對(duì)腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生生物學(xué)作用。
本發(fā)明還提供了一種篩選適用于治療多發(fā)性硬化癥的化合物的方法，包括選擇具有雌激素受體α激動(dòng)劑活性的化合物。采用受體例如熒光素酶的用于檢測(cè)體外激動(dòng)劑活性的傳統(tǒng)檢測(cè)方法是本領(lǐng)域公知的。下列出版物中給出了示例性的激動(dòng)劑檢測(cè)，這些出版物以引用的方式被包括在本文中，可用于參考其中的ERα激動(dòng)劑檢測(cè)Lyttle CR，Damian-Matsumura P.，Juul H.，Butt TR，Human estrogen receptorregulation in a yeast model system and studies on receptor agonistsand antagonists，J.Steroid Biochem Mol Biol 42677-685(1992)；Katzenellenbogen BS，Bhardwaj B，F(xiàn)ang H，Ince BA，Pakdel F，Reese JC，Schodin D，Wrenn CK，Hormone binding and transcriptionactivation by estrogen receptorsanalyses using mammalian and yeastsystems，J Steroid Biochem Mol Biol 4739-48(1993)；PCT國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 00/37681；Webb P，Lopez GN，Greene GL，Baxter JD，KushnerPJ，1992，The limits of the cellular capacity to mediate an estrogenresponse，Mol Endocrinology，6(2)157-67。優(yōu)選地，在此類(lèi)檢測(cè)中，“雌激素受體α激動(dòng)劑”被定義為在選定的雌激素活性試驗(yàn)中，基本模擬了17-β雌二醇的ER-α活性的化合物。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述化合物是SERM。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物降低了TNF-α的產(chǎn)量至少約20％-100％，如實(shí)施例2中所述。在可供選擇的實(shí)施方案中，所述的降低可以是至少30％、40％、50％、60％或80％。
縮寫(xiě)和術(shù)語(yǔ)的定義下面提供的定義是為了充分理解說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所使用的術(shù)語(yǔ)和縮寫(xiě)。
此處及所附的權(quán)利要求中所使用的單數(shù)形式“a”、“an”、“the”也包括復(fù)數(shù)，除非上下文中有明確的其它說(shuō)明。因此，例如，“雌激素受體α激動(dòng)劑”包括多種此類(lèi)激動(dòng)劑。
說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所使用的縮寫(xiě)對(duì)應(yīng)于測(cè)量、技術(shù)、性質(zhì)或化合物的單位，如下所述“μg”是指微克，“ml”是指毫升，“μM”是指微摩爾，“mM”是指毫摩爾，“s.c.”是指皮下，“i.p.”是指腹腔，“p.o.”是指每次口服。
“多發(fā)性硬化癥”簡(jiǎn)寫(xiě)為MS。
“中樞神經(jīng)系統(tǒng)”簡(jiǎn)寫(xiě)為CNS。
“輔助T細(xì)胞-1”和“輔助T細(xì)胞-2”分別簡(jiǎn)寫(xiě)為T(mén)H-1和TH-2。
“腫瘤壞死因子-α”簡(jiǎn)寫(xiě)為T(mén)NF-α。
“干擾素-γ”簡(jiǎn)寫(xiě)為IFN-γ。
“核因子(Nuclear Factor)-κB”簡(jiǎn)寫(xiě)為NF-κB。
“實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎”簡(jiǎn)寫(xiě)為EAE。
“選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑”簡(jiǎn)寫(xiě)為SERMS。
“組織選擇性雌激素”簡(jiǎn)寫(xiě)為T(mén)SEs。
“雌激素受體”簡(jiǎn)寫(xiě)為ER。
“白細(xì)胞介素”簡(jiǎn)寫(xiě)為IL。
“蛋白脂質(zhì)蛋白肽(proteolipid protein peptide)”簡(jiǎn)寫(xiě)為PLP。
“完全弗氏佐劑”簡(jiǎn)寫(xiě)為CFA。
“轉(zhuǎn)移后”簡(jiǎn)寫(xiě)為PT。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“自身免疫疾病”是指由有害的自身免疫反應(yīng)所介導(dǎo)的疾病。在大多數(shù)自身免疫疾病中，T細(xì)胞將一種或多種組織中的宿主成分識(shí)別為外來(lái)物，并攻擊該組織。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“治療(treatment)”包括預(yù)防性(例如預(yù)防疾病的)、治療性或緩解性治療，“治療(treating)”也包括預(yù)防性、治療性或緩解性治療?！爸委煛?，當(dāng)用于自身免疫疾病時(shí)，是指任何可以觀(guān)察到的治療效果。有益效果可以由易感哺乳動(dòng)物中臨床癥狀的延遲發(fā)作、疾病的某些或全部臨床癥狀嚴(yán)重性的降低、疾病發(fā)展的延緩、疾病復(fù)發(fā)數(shù)的降低、疾病位點(diǎn)處或循環(huán)系統(tǒng)中致病T細(xì)胞數(shù)量或活性(例如細(xì)胞因子分泌)的降低、個(gè)體的總體健康狀況或舒適度的改善或者本領(lǐng)域公知的對(duì)該特定疾病具有特異性的其它參數(shù)來(lái)佐證。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“具有雌激素受體α激動(dòng)劑活性的試劑”是指表現(xiàn)出ERα活性的試劑，包括但不限于選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑和組織選擇性雌激素。該術(shù)語(yǔ)也可以包括部分激動(dòng)劑、肽、多肽、基因、基因片段、非肽小分子、天然產(chǎn)物、反義DNA及mRNA。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”是指人、非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、犬、貓、牛、羊、豬、鼠或其它獸醫(yī)或?qū)嶒?yàn)室用哺乳動(dòng)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在一種哺乳動(dòng)物中降低免疫疾病嚴(yán)重性的療法可以預(yù)測(cè)其效果在另一種哺乳動(dòng)物中也存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員也知道，人類(lèi)免疫疾病的可靠動(dòng)物模型是已知的，包括EAE，其為多發(fā)性硬化癥的可靠動(dòng)物模型。
術(shù)語(yǔ)“減少TH-1和/或TH-2細(xì)胞因子產(chǎn)生的有效量”是指，就劑量和必需時(shí)間段而言，對(duì)于獲得治療自身免疫疾病的預(yù)期效果來(lái)說(shuō)有效的量?？梢岳斫?，在本發(fā)明的方法中，雌激素受體α激動(dòng)劑的減少TH-1和/或TH-2細(xì)胞因子產(chǎn)生的有效量將隨著個(gè)體的不同而變化，其不僅取決于所選擇的特定激動(dòng)劑、給藥途經(jīng)以及該激動(dòng)劑在個(gè)體中引發(fā)預(yù)期反應(yīng)的能力，還取決于其它因素例如疾病狀況或待緩解病癥的嚴(yán)重性，個(gè)體的年齡、性別、體重，患者的狀況，以及所治療的疾病癥狀的嚴(yán)重性，同時(shí)服用的藥物或特定個(gè)體隨后所遵循的特種膳食，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其它因素，并且適當(dāng)?shù)膭┝孔罱K是由當(dāng)值醫(yī)生決定的。可以調(diào)整劑量安排以改善治療反應(yīng)。“減少TH-1和/或TH-2細(xì)胞因子產(chǎn)生的有效量”也指在所述量下，該激動(dòng)劑的有益治療效果超過(guò)了該激動(dòng)劑的任何毒性或有害效果。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中給予雌激素受體α激動(dòng)劑，其劑量和時(shí)間使得TH-1和/或TH-2細(xì)胞因子的產(chǎn)量與治療開(kāi)始時(shí)這些細(xì)胞因子的產(chǎn)量相比有所下降。這種治療對(duì)于降低自身免疫疾病癥狀的總體嚴(yán)重程度(相對(duì)于治療開(kāi)始前癥狀的嚴(yán)重程度)來(lái)說(shuō)也可能是有益的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，劑量范圍為5mg/kg/天到500mg/kg/天，或者至少約10、50、100或150mg/kg/天。
實(shí)施例本發(fā)明在下面的實(shí)施例中被進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，雖然這些實(shí)施例中給出了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但提供這些實(shí)施例的目的僅僅是為了說(shuō)明本發(fā)明。從上面的討論以及這些實(shí)施例中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的必要特征，并且在不脫離其精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變和變型，以使其適應(yīng)于各種用途和情況。
實(shí)施例1在多發(fā)性硬化癥動(dòng)物模型中體內(nèi)給予化合物的效果該實(shí)施例表明，在多發(fā)性硬化癥動(dòng)物模型中，體內(nèi)給予雌激素受體α選擇性激動(dòng)劑延遲了疾病的發(fā)作并降低了疾病的發(fā)病率和嚴(yán)重性。
材料和方法動(dòng)物用25只完好無(wú)損的雌性(6-8周齡)SJL小鼠(JacksonLaboratories，Bar Harbor，ME)作為EAE過(guò)繼轉(zhuǎn)移模型(adoptivetransfer model)的供體小鼠。
實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的誘導(dǎo)采用此前描述的方法20的改進(jìn)方法，通過(guò)PLP致敏的脾細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)EAE。用在完全弗氏佐劑(CFA)中乳化的蛋白脂質(zhì)蛋白肽139-151(PLP)對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。每只動(dòng)物接受150μg的PLP，其溶于0.2ml的CFA中，并且CFA中含有4mg/ml熱殺死并干燥的Mycobacteriumtuberculosis(H37RA菌株)。PLP/CFA乳液皮下注射到兩個(gè)位點(diǎn)上(背部和尾巴的根部(base))。每個(gè)位點(diǎn)注射0.1ml。10天后，對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，收集脾臟。由所述脾臟制備單細(xì)胞懸浮液。在紅血球溶解后，以5×106細(xì)胞/ml的濃度，在75cm2組織培養(yǎng)瓶中的RPMI-10(RPMI培養(yǎng)基，其中含有10％熱失活的胎牛血清、100U/ml的青霉素、100μg/ml鏈霉素、2mM谷氨酰胺、50μM 2-巰基乙醇)中培養(yǎng)細(xì)胞3天。加入PLP至終濃度為5μg/ml。在5％的CO2中于37℃培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)之后，收獲PLP刺激的效應(yīng)細(xì)胞，用磷酸緩沖液沖洗，并腹腔注射到切除卵巢的雌性(6-8周齡)SJL小鼠(1.5×107細(xì)胞/小鼠)中。疾病發(fā)作通常在細(xì)胞轉(zhuǎn)移后(PT)7-14天發(fā)生。
根據(jù)表1中所示的等級(jí)，每天對(duì)疾病的嚴(yán)重程度進(jìn)行監(jiān)控。
表1疾病嚴(yán)重程度的等級(jí)0 沒(méi)有明顯的疾病體征1 跛尾(limp tail)2 跛尾/后腿虛弱(通過(guò)蹣跚步態(tài)觀(guān)察到；小鼠后腿掉進(jìn)鐵絲籠頂部)3 后腿部分麻痹(小鼠不能再保持臀部的姿態(tài)，但仍然能在某種程度上移動(dòng)一條或兩條腿)4 后腿完全麻痹(后腿完全不能運(yùn)動(dòng)；動(dòng)物拖著后腿；能夠沒(méi)有困難地抓住欄桿并將自己拖起來(lái))5 后腿完全麻痹和/或輕微的前腿虛弱(仍然能夠抓住欄桿；但在將自己拖起來(lái)方面有些困難)6 后腿完全麻痹，前腿嚴(yán)重虛弱或麻痹；瀕臨死亡為了評(píng)價(jià)化合物對(duì)疾病的作用，按照指明的劑量每天將化合物給予(皮下或口服給藥)受體小鼠，使用10％乙醇/90％玉米油載體。對(duì)照組動(dòng)物只接受載體。在對(duì)供體細(xì)胞進(jìn)行過(guò)繼轉(zhuǎn)移之前5-7天開(kāi)始對(duì)小鼠給藥。
組織學(xué)分析在疾病高峰時(shí)(轉(zhuǎn)移后14天)，用CO2對(duì)小鼠施行安樂(lè)死。在尸體解剖時(shí)移走腦和脊髓，并固定在10％的緩沖福爾馬林中。將腦切成三段(粗略來(lái)說(shuō)，大腦、中腦和小腦)并作為一整塊進(jìn)行包埋。將脊髓在10％HCl中脫鈣，并切成頸、胸和腰(lumber)段，作為一整塊進(jìn)行包埋。由來(lái)自每只小鼠的每一塊組織(腦和脊髓)制備標(biāo)準(zhǔn)H&E(蘇木精和伊紅)載玻片，每只被評(píng)價(jià)的小鼠得到兩塊H&E載玻片。
對(duì)切片進(jìn)行評(píng)價(jià)，針對(duì)存在與否(P＝存在)和/或嚴(yán)重性對(duì)看到的損傷進(jìn)行主觀(guān)評(píng)分。嚴(yán)重性等級(jí)為0＝WNL(在正常范圍內(nèi))，1＝微小或最小，2＝輕微，3＝中等，4＝顯著，5＝嚴(yán)重。發(fā)現(xiàn)的位置(相對(duì)于所述器官)被記為血管周?chē)?、室周?chē)?、室管膜或腦膜，并且也被記為局部(在很小的區(qū)域內(nèi)，或不是整個(gè)切片上都有)或擴(kuò)散(所檢查的整個(gè)切片都有)。局部被定義為非常局部化，并且不影響每個(gè)結(jié)構(gòu)。沒(méi)有被定義為局部的發(fā)現(xiàn)是擴(kuò)散的或影響每一個(gè)結(jié)構(gòu)(例如所有的脈管)?？吹降陌准?xì)胞主要是淋巴細(xì)胞和巨嗜細(xì)胞，偶爾有嗜中性粒細(xì)胞。觀(guān)察到的脊髓白質(zhì)束中的明顯空洞即為脫髓鞘作用。
典型的小鼠EAE模型具有微小至中等大小淋巴細(xì)胞聚集體的彌散分布，很少在受影響的組織中有擴(kuò)散的滲透物。
PLP特異性Recall反應(yīng)分析細(xì)胞因子產(chǎn)生為了檢查體內(nèi)給予的化合物對(duì)EAE小鼠脾細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用，在疾病高峰時(shí)(轉(zhuǎn)移后14天)，用CO2對(duì)小鼠施行安樂(lè)死，收集脾臟。脾臟被分別處理為單細(xì)胞懸浮液。在紅血球溶解后，將細(xì)胞重懸在RPMI-10中，并在24孔組織培養(yǎng)板中以5×106細(xì)胞/ml的濃度進(jìn)行培養(yǎng)。用5μg/mlPLP刺激細(xì)胞。3天后收集上清液并冷凍在-20℃待用。用市售的流式細(xì)胞儀試劑盒(Cytometric Bead Array，Becton DickinsonBioSciences，San Diego，CA)檢測(cè)上清液中的細(xì)胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-5、IL-4、IL-2)。通過(guò)IL-10特異性ELISA試劑盒(BectonDickinson BioSciences)檢測(cè)IL-10。
為了體外檢測(cè)化合物對(duì)PLP誘發(fā)的效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用，利用乳化在CFA中的PLP免疫SJL小鼠。10天后，收集脾臟并制備單細(xì)胞懸浮液。在紅血球溶解后，于37℃5％CO2的條件下，用5μg/ml PLP在化合物存在下刺激脾細(xì)胞3天。對(duì)照樣品不進(jìn)行刺激，僅在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(“培養(yǎng)基”)。加入化合物至終濃度為1μM。在3天的培養(yǎng)之后，收集上清液并保存在-20℃。利用Cytometric BeadArray試劑盒檢測(cè)上清液中的細(xì)胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-5、IL-4、IL-2)。
化合物對(duì)抗原刺激后效應(yīng)T細(xì)胞增殖的作用為了體外檢測(cè)對(duì)響應(yīng)于PLP刺激的效應(yīng)T細(xì)胞增殖的作用，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)按下述試驗(yàn)方法檢測(cè)T細(xì)胞的增殖。利用乳化在CFA中的PLP免疫SJL小鼠。10天后，收集脾臟并制備單細(xì)胞懸浮液。在紅血球溶解后，用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)標(biāo)記脾細(xì)胞。然后，于37℃5％CO2的條件下，用PLP溫育CFSE標(biāo)記的細(xì)胞3天。加入化合物至終濃度為1μM。為了確定分裂的CD4+細(xì)胞的比例，在進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析之前，利用對(duì)CD4標(biāo)記具有特異性的抗體對(duì)CFSE標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行染色。
結(jié)果I.SERMs/組織選擇性雌激素對(duì)PLP誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移所誘導(dǎo)的EAE的作用如前所示，用17-β雌二醇(E2)進(jìn)行治療延遲了疾病的發(fā)作并降低了疾病的發(fā)病率和嚴(yán)重性(圖1A)。為了確定該模型中雌激素的保護(hù)作用是否是雌激素受體介導(dǎo)的，用E2和雌激素受體拮抗劑ICI182，780共同治療小鼠。ICI破壞了E2對(duì)疾病的作用(圖1A)。
用E2或SERMs雷洛昔芬或化合物A[2-(羥基苯基)-3-甲基-1-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)苯甲基]-1H-吲哚-5-醇鹽酸一水合物]進(jìn)行治療延遲了疾病的發(fā)作并降低了疾病的發(fā)病率和嚴(yán)重性(圖1B及表II)。與這些化合物對(duì)疾病的臨床體征的作用一致，與其它治療組小鼠相比，用化合物A治療過(guò)的小鼠中透過(guò)脊髓和腦的炎癥細(xì)胞數(shù)量降低了。此外，用化合物A治療過(guò)的小鼠中，在脊髓上沒(méi)有檢測(cè)到脫髓鞘作用。
表II組織學(xué)發(fā)現(xiàn)

II.雌激素受體選擇性激動(dòng)劑對(duì)PLP誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移所誘導(dǎo)的EAE的作用用E2或ERα選擇性激動(dòng)劑PPT(丙基吡唑三醇)進(jìn)行治療延遲了疾病的發(fā)作并降低了疾病的發(fā)病率和嚴(yán)重性(圖2)。此外，與用載體或ERβ選擇性激動(dòng)劑治療的小鼠相比，用PPT治療的小鼠在腦和脊髓中的炎癥減少(圖3)。組織學(xué)檢查表明，與載體對(duì)照小鼠相比，給予PPT的小鼠具有最多的正常組織。所有四只小鼠都在腦膜中有微小的白細(xì)胞滲透，但只在腦的基部(僅在腹面的后腦/小腦/腦橋/髓質(zhì)附近)。這些小鼠中沒(méi)有一只有脊髓損傷；這些小鼠的脊髓都在正常范圍內(nèi)。
表III

III.ER選擇性激動(dòng)劑對(duì)PLP特異性Recall反應(yīng)的作用細(xì)胞因子生產(chǎn)與ERα選擇性激動(dòng)劑PPT對(duì)疾病的作用一致，用PPT治療小鼠降低了在體外用PLP刺激脾細(xì)胞之后的細(xì)胞因子的產(chǎn)生(圖3)。Th1/前炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-2)和Th2/抗炎癥(IL-4、IL-5、IL-10)細(xì)胞因子被PPT的體內(nèi)治療所抑制，這表明PPT可能通過(guò)抑制T細(xì)胞活化而抑制疾病，而不是通過(guò)由致病的Th1反應(yīng)向保護(hù)性Th2反應(yīng)的免疫偏離來(lái)抑制疾病。與此相反，ERα選擇性激動(dòng)劑對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生沒(méi)有效果(*，p＜0.05，與載體組相比)。
實(shí)施例II化合物體外對(duì)抗原特異性免疫反應(yīng)的效果組織選擇性雌激素(化合物A)和ERα選擇性配體(PPT)對(duì)抗原特異性免疫反應(yīng)的效果在體外進(jìn)行了檢測(cè)。
A.化合物對(duì)抗原刺激后效應(yīng)T細(xì)胞增殖的作用用組織選擇性雌激素化合物A或ERα選擇性激動(dòng)劑PPT治療PLP誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞減少了抗原特異性T細(xì)胞的增殖(圖4)。CD4+和CD4細(xì)胞群的增殖都被抑制。這些結(jié)果表明這些化合物中的每一種可能部分地通過(guò)限制抗原特異性T細(xì)胞克隆的擴(kuò)大而起作用。
B.化合物對(duì)抗原刺激后效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用用組織選擇性雌激素化合物A或ERα選擇性激動(dòng)劑PPT治療PLP誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞減少了抗原刺激后的細(xì)胞因子產(chǎn)生(圖5)。兩種化合物都抑制了前炎癥(TH-1)細(xì)胞因子TNF-α的產(chǎn)生。化合物A和ERα選擇性激動(dòng)劑PPT也都抑制了IFN-γ的產(chǎn)生。將這些細(xì)胞與組織選擇性雌激素化合物A溫育也同時(shí)增加了抗炎癥細(xì)胞因子IL-4，但其它化合物沒(méi)有作用。這些結(jié)果表明ERα選擇性激動(dòng)劑(PPT)可能與組織選擇性雌激素在對(duì)抗原特異性細(xì)胞因子的生產(chǎn)上具有不同的作用。前者可能通過(guò)抑制前炎癥(TH-1)細(xì)胞因子的生產(chǎn)而抑制EAE，而組織選擇性雌激素可能還促進(jìn)了向保護(hù)性抗炎癥/TH-2免疫反應(yīng)的免疫偏離。
結(jié)論用SERMs/TSEs雷洛昔芬和化合物A以及ERα選擇性激動(dòng)劑PPT進(jìn)行治療，抑制了EAE，延遲了疾病的發(fā)作并降低了疾病的發(fā)病率和嚴(yán)重性。在用這些化合物治療過(guò)的小鼠中，疾病臨床體征的抑制與腦及脊髓中的病理和白細(xì)胞滲透的減少有關(guān)。這表明這些化合物可能通過(guò)限制致病細(xì)胞向腦及脊髓中轉(zhuǎn)移而緩解疾病，例如，通過(guò)減少粘附分子的表達(dá)和/或通過(guò)影響趨化因子/趨化因子受體的表達(dá)。
SERMs/TSEs以及ERα選擇性激動(dòng)劑對(duì)PLP誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移所誘導(dǎo)的疾病的抑制作用表明，這些化合物具有改變致腦炎的效應(yīng)細(xì)胞活性的能力。這些發(fā)現(xiàn)與原有的看法相反，此前認(rèn)為，與初生細(xì)胞相比，分化的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)雌激素的作用更遲鈍。
此處所提供的體外數(shù)據(jù)表明，ERα選擇性激動(dòng)劑，優(yōu)選SERMS或ER-抗炎癥配體，可能對(duì)抗原特異性T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生有直接作用，從而限制了致病T細(xì)胞的擴(kuò)增和分化。所有三種類(lèi)型的配體都有效地抑制了前炎癥(TH-1)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。但是，組織選擇性雌激素可能還促進(jìn)了保護(hù)性抗炎癥(TH-2)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這表明這些分子可能對(duì)PLP特異性免疫反應(yīng)具有不同的作用。
我們觀(guān)察到SERMs/TSEs能夠改變?cè)撃Ｐ椭械募膊〔〕?，基于SERMs和雌激素拮抗劑在鼠系統(tǒng)性紅斑狼瘡(狼瘡的小鼠模型)中已知的作用，這多少有些令人吃驚。業(yè)已證明SERMs對(duì)狼瘡具有有益的治療效果，狼瘡是一種自身免疫疾病，雌激素會(huì)使該疾病惡化14-18。由于SERMs可能以拮抗劑的方式作用于狼瘡，因此可以預(yù)期SERMs將對(duì)EAE有類(lèi)似的拮抗劑活性。因此，可以預(yù)測(cè)SERMs或者對(duì)EAE沒(méi)有作用，或者將惡化EAE。正相反，SERMs表現(xiàn)出了疾病抑制活性。
參考文獻(xiàn)1.Whitacre C.C.2002.Sex differences in autoimmune disease.NatImmunol.2777-780.
2.Abramsky O.1994.Pregnancy and multiple sclerosis.Ann Neruol.36(suppl)S38-S41.
3.Confavreux C，Hutchinson M，Hours M.M.et al.1998.Rate of preganacy-related relapse in mupltiple sclerosis.Pregnancy in Multiple SclerosisGroup.N Engl J Med.339285-291.
4.Damek D.M.，Shuster E.A.1997.Pregnancy and multiple sclerosis.MayoClin Proc.72977-989.
5.Sicotte N.L.，Liva S.M.，Klutch R.et al.2002.Treatment of multiplesclerosis with the pregnancy hormone estriol.Ann Neurol.52421-428.
6.Gilmore W.，Weiner L.P.，Correale J.1997.Effect of estradiol on cytokinesecretion by proteolipid protein-specific T cell clones isolated from multiplesclerosis patients and normal control subjects.J.Immunol.158446-451.
7.Correale J.Arias M.，Gilmore W.1998.Steroid hormone regulation ofcytokine secretion by proteolipid protein-specific CD4+ T cell clonesisolated from multiple sclerosis patients and normal oontrol subjects.J.Immunol.1613365-3374.
8.Zang Y.C.Q.Halder J.B.，Hong，J.Rivera V.M.，Zhang J.Z.2002.Regulatory effects of estriol on T cell migration and cytokine profileinhibition of transcription factor NF-κB.J.Neuroimmunol.124106-114.
9.Jansson L.，Olsson T.，Holmdahl R.1994.Estrogen induces a potentsuppression of experimental autoimmune encephalomyelitis and collagen-induced arthritis in mice.J Neuroimmunol.53203-207.
10.Kim S.，Liva S.M.，Dalal M.A.，Verity M.A.，Voskuhl R.R.1999.Estriolameliorates autoimmune demylinating disease.lmplications for multiplesderosis.Neurol.521230-1238.
11.Offner H.，Adlard K.，Zamora A.，Vandenbark A.A.2000.Estrogenpotentiates treatment with T-cell receptor protein of female mice withexperimental encephalomyelitis.J Clin lnvest.1051465-1472.
12.Ito A.，Bebo B.F.，Jr.，Matejuk A.，Zamora A.，Silverman M.，F(xiàn)yfe-JohnsonA.，Offner H.2001.Estrogen treatment down-regulates TNF-αproduction and reduces the severity of experimental autoimmuneencephalomyelitis in cytokine knockout mice.J Immunol.167542-552.
13.Bebo B.F.，Jr.，F(xiàn)yfe-JohnsonA.，Adlard K.，Beam A.G.，Vandenbark A.A，Offner H.2001.Low-dose estrogen therapy ameliorates experimentalautoimmune ensephalomyelitis in two different inbred mouse strains.JImmunol.1662080-2089.
14.Duvic M.，Steinberg A.D.，Klassen L.W.1978.Arthritis and Rheumatism.21414417.
15.Sturgess A.D.，Evans D.T.P.，Mackay I.R.，Riglar A.1984.Effects of theoestrogen antagonist tamoxifen on disease lndices in sytemic lupuserythematosus.J.Clin.Lab.Immunol.1311-14.
16.Sthoeger Z.M.Bentwich Z.，Zinger H.，Mozes E.1994.The beneficialeffect of the estrogen antagonist.Tamoxifen，on experimental lupuserythematosus.J.Rheumatol.212231-2238.
17.Apelgren L.D.，Bailey D.L.，F(xiàn)outs R.L.，Short L.，Bryan N.，Evans G.F.，Sandusky G.E.，Zuckerman S.H.，Glasebrook A.，Bumol T.F.1996.Theeffect of a selective estrogen receptor modulator on the progression ofspontaneous autoimmune disease in MRL lpr/lpr mice.Cell.Immunol.17355-63.
18.Wu W-M.，Lin B-F.，Su Y-C.，Suen J-L.，Chiang B-L.，2000.Tamoxifendecreases renal inflammation and alleviates disease severity inautoimmune NZB/W F1 mice.Scand.J.Immunol. 52393-400.
19.Kankaanpaa JTJ.October，1999.Raloxifene-a muiltifunctionalmedicinereview.APIMALL General Practice Issue 1.0.
20.Leonard，J.P.，Waldburger K.E，Goldman S.J.，1995.J.Exp.Med.181P381-386.
權(quán)利要求
1.一種治療哺乳動(dòng)物自身免疫疾病的方法，包括給予所述哺乳動(dòng)物至少一種具有雌激素受體α激動(dòng)劑活性的試劑，所述試劑的量足以減少TH-1和/或TH-2細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的自身免疫疾病選自多發(fā)性硬化癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、自身免疫性甲狀腺炎、葡萄膜炎、炎癥性腸病和Sjgren’s綜合征。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物為雌性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物為雄性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物為人。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物為非人類(lèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的試劑通過(guò)選自口服、經(jīng)皮、呼吸、皮下及靜脈內(nèi)給藥的途經(jīng)給藥。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的TH-1細(xì)胞因子選自TNF-α、IFN-γ和IL-2。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的TH-2細(xì)胞因子選自IL-4、IL-5和IL-10。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的試劑降低了核因子-κB的活性。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的試劑是非甾族的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的試劑是選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，以足以減少TH-1和TH-2胞因子的產(chǎn)生的量給藥。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述的自身免疫疾病選自多發(fā)性硬化癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、自身免疫性甲狀腺炎、葡萄膜炎、炎癥性腸病和Sjgren’s綜合征。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物為雌性。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物為雄性。
16.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物為人。
17.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物為非人類(lèi)。
18.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑通過(guò)選自口服、經(jīng)皮、呼吸、皮下及靜脈內(nèi)給藥的途經(jīng)給藥。
19.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述的TH-1細(xì)胞因子選自TNF-α、IFN-γ和IL-2。
20.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述的TH-2細(xì)胞因子選自IL-4、IL-5和IL-10。
21.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑降低了核因子-κB的活性。
22.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑選自雷洛昔芬、他莫昔芬、拉索昔芬、艾多昔芬、屈落昔芬、bazedoxifene和妥瑞咪芬。
23.一種篩選適用于治療多發(fā)性硬化癥的化合物的方法，包括選擇具有雌激素受體α激動(dòng)劑活性的化合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述的化合物是選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述的化合物降低了TNF-α的產(chǎn)量至少約20％。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療哺乳動(dòng)物中的自身免疫疾病的方法，包括給予所述哺乳動(dòng)物具有雌激素受體α激動(dòng)劑活性的試劑，特別是選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，所述試劑的量足以減少TH－1和/或TH－2細(xì)胞因子的產(chǎn)生。本發(fā)明還提供了一種篩選適用于治療多發(fā)性硬化癥的化合物的方法，包括選擇具有雌激素受體α激動(dòng)劑活性的化合物。
文檔編號(hào)A61K31/55GK1723013SQ200480001876
公開(kāi)日2006年1月18日 申請(qǐng)日期2004年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月6日
發(fā)明者M·M·埃羅索, R·米切爾, D·C·哈尼什, S·J·阿德?tīng)柭?申請(qǐng)人:惠氏公司