專(zhuān)利名稱(chēng)：混合熱休克蛋白/肽肉瘤疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗，尤其涉及一種從肉瘤組織中提取制備的混合熱休克蛋白/肽肉瘤疫苗，屬于蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
熱休克蛋白HSP-70(heat shock protein，HSP)，Gp-96(glycoprotein-96)是一種分子伴侶，具有結(jié)合腫瘤抗原和遞呈抗原的作用，從腫瘤細(xì)胞中分離提取的HSP-70和Gp-96攜帶了廣譜腫瘤抗原，兩者都可誘發(fā)CD4+，CD8+細(xì)胞反應(yīng)，即促進(jìn)了特異性細(xì)胞免疫，可作為疫苗，是誘發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫作用的重要手段。
HSP-60具有活化機(jī)體非特異免疫作用，它可活化吞噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、γδT細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，從而釋放多種細(xì)胞因子，并殺傷腫瘤細(xì)胞。
現(xiàn)有技術(shù)中以熱休克蛋白為成分所制備的疫苗，其組成僅只包括HSP-70或Gp-96，不含HSP-60。目前，進(jìn)入臨床試用的熱休克蛋白疫苗主要有兩種，均由美國(guó)Antigenics Inc生產(chǎn)。一種名稱(chēng)為Oncophage，其成分為Grp-96，美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床3期，所治療的對(duì)象都是癌(腎癌，胰腺癌和黑色素瘤等8種)；另外一種是AG-858，其成分是HSP-70，已進(jìn)入臨床2期試驗(yàn)，主要治療慢性白血病。用基因重組的方法制備HSP-60，再與已知抗原組合制成腫瘤疫苗也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，但該類(lèi)腫瘤疫苗主要是針對(duì)病毒抗原及其誘發(fā)的乳頭狀鱗狀細(xì)胞癌。目前尚未有將含有HSP-60的混合熱休克蛋白/肽制備成肉瘤疫苗的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠有效治療肉瘤的混合熱休克蛋白/肽疫苗。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明混合熱休克蛋白肉瘤疫苗，由以下方法制備而成新鮮的肉瘤組織剪碎后將肉瘤細(xì)胞裂解，將所得的肉瘤細(xì)胞裂解液離心，取上清，所得上清濃縮或透析后上層析柱，截取分子量在50～150KD段，分裝，凍干即得。
上述制備方法中，所述的肉瘤組織可為肉瘤患者手術(shù)切除的新鮮自我瘤組織，包括骨肉瘤、軟骨肉瘤、滑膜肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、巨細(xì)胞肉瘤、尤文氏瘤等，或建株的肉瘤細(xì)胞。
上述制備方法中所述的層析柱為Sephacryl S-200HR。
通過(guò)以上制備方法可將肉瘤組織中具有免疫激活作用的多種熱休克蛋白/肽一次性最大限度的提取出來(lái)，其組成成分以HSP-60為主，同時(shí)含有有Gp-96、HSP-90和HSP-70，而以HSP-70含量最少。本發(fā)明混合熱休克蛋白疫苗較其他疫苗有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗ㄟ^(guò)HSP-70，Gp-96攜帶了大量的多種腫瘤抗原，近似于抗原庫(kù)，從而形成多價(jià)疫苗，活化了特異性免疫，同時(shí)通過(guò)HSP-60、HSP-70、Gp-96也活化了非特異免疫，釋放多種抗腫瘤的細(xì)胞因子，如IL-2，IL-12，TNF-α，IFN-γ等，從而能夠取得較好的抗腫瘤效果。
本發(fā)明肉瘤疫苗不需另外加佐劑，制備簡(jiǎn)便，消除了佐劑可能帶來(lái)的副作用。
本發(fā)明肉瘤疫苗在制備過(guò)程中去除了腫瘤本身可能存在的免疫抑制因子，如TGF-β或可轉(zhuǎn)譯的DNA等，從而使本發(fā)明疫苗的免疫效果進(jìn)一步提高，并避免了可能的副作用。
用法與用量本發(fā)明肉瘤疫苗免疫小鼠的有效劑量范圍為2-30ug，以20ug為最佳。皮下注射，免疫3次為一療程。
以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明的有益效果，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
說(shuō)明書(shū)附1分子篩蛋白流出記錄曲線。其中以BSA為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照，表明F2段為需要收集的目的蛋白。
圖2分子篩凝膠層析后將F2段每30min收集不同時(shí)段流出液進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳。
Lanel分子篩前濃縮混合蛋白，雜蛋白多，背景模糊；Lane 2-10經(jīng)分子篩后每30min所收集流出液，可見(jiàn)目的蛋白集中于3-6道；7-10道為小分子量蛋白，電泳中已跑出膠外。
圖3ConA親和層析后SDS-PAGE電泳圖及Western-blot鑒定。1.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；2.ConA親和層析前，蛋白條帶較多；3.ConA親和層析未結(jié)合部分，以60、70×103分子量蛋白為主；已無(wú)grp96條帶；4.ConA親和層析結(jié)合洗脫部分，在97×103附近有微細(xì)的蛋白條帶；5.抗Gp96 Western-blot染色，條帶顯色弱。
圖4ADP親和層析后SDS-PAGE電泳圖及Western-blot鑒定。
1.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；2.ADP未結(jié)合部分，以HSP60為主；3.ADP結(jié)合洗脫部分，為純化HSP70；4.抗HSP60 Westem-blot染色；5.抗HSP70 Western-blot染色；具體實(shí)施方式
[實(shí)施例1]本發(fā)明骨肉瘤疫苗的制備一、材料和方法1、材料來(lái)源小鼠S180肉瘤細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)ATCC公司)。
2、疫苗的制備步驟1)剪碎肉瘤組織，將肉瘤細(xì)胞在體外42℃加溫6小時(shí)，研磨，加10倍體積細(xì)胞裂解液(30mM NaHCO3，0.5mM PMSF，pH 7.1)，搖震破膜，2)將上述所得的細(xì)胞裂解液4℃，25000rpm(75000g)超速離心2.5h，棄沉淀，蛋白測(cè)定，3)上清冷凍干燥至約2ml，分子篩洗脫液(0.05M Tris-HCl，0.15MNaCl，pH7.2)透析，4)牛清白蛋白預(yù)流為標(biāo)準(zhǔn)參照牛清白蛋白(68KD)上層析柱SephacrylS-200HR，柱長(zhǎng)100cm，流速21.6/h，記錄流出時(shí)間及圖形，見(jiàn)

圖1。
5)將透析后的樣品上清上層析柱Sephacryl S-200HR(購(gòu)自Pharmacia公司)，同前，柱長(zhǎng)100cm，流速21.6/h，加樣濃度約100-150mg/ml，樣品完全進(jìn)入分子篩后，加入分子篩洗脫液，每30min分部收集一瓶，在紫外監(jiān)測(cè)下，根據(jù)紫外監(jiān)測(cè)圖形，截取分子量在50～150KD段(約相當(dāng)于牛清白蛋白流出峰)，即收集第2段的3、4、5、6瓶，混合后即為本疫苗，見(jiàn)圖2。
6)分裝，凍干待用。
3、鑒定1)分子篩收集第2段的3、4、5、6瓶，混合后，適當(dāng)濃縮，用con A洗脫液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，0.15M NaCl，10mM MgCl2，10mM CaCl2，15mM巰基乙醇)透析3h，上Con A柱(購(gòu)自Pharmacia公司)，室溫放置30min，洗脫，收集未結(jié)合部分，再用10％甲基甘露糖洗脫，洗脫液經(jīng)SDS-PAGE，Westernblot鑒定(見(jiàn)圖3)。
2)Con A未結(jié)合部分，適當(dāng)濃縮，用ADP柱平衡液(20mMTris-HCl，pH7.5，20mMNaCl，3mM MgCl2，15mM巰基乙醇，0.5mM PMSF)透析3h，上ADP柱(購(gòu)自Sigma公司)，室溫放置30min，用ADP柱洗脫液(20mMTris-HCl，pH7.5，500mM NaCl，3mM MgCl2，15mM巰基乙醇，0.5mM PMSF)洗脫，流速30min/h，分別收集洗脫部分及未結(jié)合部分，分別進(jìn)行SDS-PAGE，Westernblot鑒定(見(jiàn)圖4)。
3)將上述提取所得分別進(jìn)行SDS-PAGE，Western blot鑒定，鑒定結(jié)果證明包括HSP-70，-60，，-96。
SDS-PAGE堆積膠4％，分離膠10％，電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，約90min，分別用抗HSP-70，-60，-96抗體進(jìn)行酶聯(lián)染色。結(jié)果見(jiàn)圖2、3。
4、收率Lowry法測(cè)蛋白含量.每克腫瘤濕重可制備20～25mg本發(fā)明肉瘤疫苗。
試驗(yàn)例1本發(fā)明疫苗預(yù)防性免疫的最佳及有效劑量試驗(yàn)試驗(yàn)材料1、供試樣品本發(fā)明實(shí)施例1所制備的疫苗。
2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Balb/C小鼠，體重18-20g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，S-180肉瘤細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)ATCC公司)。
試驗(yàn)方法本發(fā)明疫苗分別配制為2ug、5ug、10ug、20ug、30ug五個(gè)劑量組，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為六個(gè)組，即對(duì)照組(不給予藥物治療)、2ug劑量組、5ug劑量組、10ug劑量組、20ug劑量組、30ug劑量組；將以上五個(gè)劑量的本發(fā)明疫苗用皮下注射的方式，免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3次。免疫2次后第7天接種S-180肉瘤細(xì)胞于背部皮下，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。
試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明疫苗預(yù)防性免疫小鼠劑量的有效范圍為2-30ug，以20ug為最佳。
表1本發(fā)明疫苗預(yù)防性免疫的最佳及有效劑量試驗(yàn)結(jié)果

注帶*為2次實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)例2本發(fā)明疫苗預(yù)防性免疫效果試驗(yàn)一、試驗(yàn)材料1、供試樣品本發(fā)明實(shí)施例1所制備的疫苗。
2、陽(yáng)性對(duì)照樣品HSP-70、HSP-60及S-180肉瘤細(xì)胞裂解上清(瘤苗)。(由本發(fā)明人從同一腫瘤中提取)，3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Balb/C小鼠，體重18-20g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，S-180肉瘤模型(購(gòu)自美國(guó)ATCC公司)。
二、試驗(yàn)方法及結(jié)果本發(fā)明疫苗20ug/次/只，皮下注射，免疫3次，與陽(yáng)性對(duì)照組(20ug/次/只，皮下注射，免疫3次)比較，陰性對(duì)照組注射生理鹽水，結(jié)果見(jiàn)表2。
表2本發(fā)明疫苗預(yù)防性免疫效果試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果陰性對(duì)照組動(dòng)物于30～40天全部死亡。本發(fā)明肉瘤疫苗免疫注射小鼠后，全身及局部無(wú)任何副作用，小鼠的成瘤致死率為59.6％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照的成瘤致死率；本發(fā)明肉瘤疫苗的抑瘤生長(zhǎng)率83.6％，高于陽(yáng)性對(duì)照HSP-70、HSP-60的抑瘤生長(zhǎng)率，說(shuō)明本發(fā)明疫苗的預(yù)防性免疫效果要優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照疫苗。本發(fā)明肉瘤疫苗免疫小鼠，存活鼠2個(gè)月后再接種腫瘤細(xì)胞，仍無(wú)瘤生長(zhǎng)，表明本發(fā)明肉瘤疫苗一療程免疫后有效期起碼大于2個(gè)月。
試驗(yàn)例3本發(fā)明疫苗治療性免疫效果試驗(yàn)一、試驗(yàn)材料供試樣品本發(fā)明實(shí)施例1所制備的疫苗。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠，S-180肉瘤模型(購(gòu)自美國(guó)ATCC公司)。
二、試驗(yàn)方法及結(jié)果將S180肉瘤種植于小鼠體內(nèi)3天后注射本發(fā)明實(shí)施例所制備的疫苗，采用皮下注射的方式，用量為20ug/只，免疫3次。
試驗(yàn)結(jié)果平均成瘤率為80％，平均抑瘤生長(zhǎng)率為70.1％，免疫注射后，全身及局部無(wú)任何副作用，小鼠活動(dòng)正常；對(duì)照組(不給予治療)100％死亡。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明肉瘤疫苗能夠有效治療各類(lèi)肉瘤且無(wú)任何副作用。
權(quán)利要求
1.一種混合熱休克蛋白/肽肉瘤疫苗，主要由下述方法制備而成新鮮的肉瘤組織剪碎，將肉瘤細(xì)胞裂解，裂解液離心，取上清，所得上清濃縮或透析后上層析柱，截取分子量在50～150KD段，分裝，凍干即得。
2.按照權(quán)利要求1所述的混合熱休克蛋白/肽肉瘤疫苗，其特征是所述的肉瘤組織為肉瘤患者手術(shù)切除的新鮮自我瘤組織，包括骨肉瘤、軟骨肉瘤、滑膜肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、巨細(xì)胞肉瘤、尤文氏瘤或建株的肉瘤細(xì)胞。
3.按照權(quán)利要求1所述的混合熱休克蛋白/肽肉瘤疫苗，其特征是由Sephacryl S-200HR層析柱分離獲得。
4.按照權(quán)利要求1所述的混合熱休克蛋白/肽肉瘤疫苗，其特征是該肉瘤疫苗的組成成分以HSP-60為主，同時(shí)含有Gp-96、HSP-90和HSP-70，以HSP-70含量為最少。
5.權(quán)利要求1～4所述的任一混合熱休克蛋白/肽肉瘤疫苗在制備治療或預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移藥物中的用途。
6.按照權(quán)利要求5所述的用途，其特征是在制備治療或預(yù)防肉瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新的用于治療或預(yù)防肉瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的疫苗，該疫苗由下述方法制備而成新鮮的肉瘤組織剪碎，將肉瘤細(xì)胞裂解，裂解液離心，取上清，所得上清濃縮或透析后上層析柱，截取分子量在50～150KD段，分裝，凍干即得。本發(fā)明肉瘤疫苗的組成成分以HSP－60為主，同時(shí)含有Gp－96、HSP－90、HSP－70，以HSP－70含量為最少。動(dòng)物模型試驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明肉瘤疫苗對(duì)于肉瘤具有顯著的防治作用。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1799628SQ20041010398
公開(kāi)日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2004年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月31日
發(fā)明者袁玫, 盧世璧, 湯宇, 崔雪梅, 孫明學(xué) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院